Summary
이 절차는 신경 돌기를 유도하는 마이크로 피펫에 고정 된 폴리 -D- 라이신 - 코팅 된 비드를 사용하여 마이크로 유체 챔버에서 조직화 된 신경을 신속하게 개시, 연장 및 연결하는 방법을 설명합니다.
Abstract
뇌와 척수 손상은 장거리에서 뉴런을 재생성하고 적절한 표적으로 정확하게 다시 연결할 수 없기 때문에 영구적 인 장애와 죽음을 초래할 수 있습니다. 여기서는 장거리에서 새로운 기능적 신경 회로를 신속하게 시작, 연장 및 정확하게 연결하는 절차가 설명됩니다. 달성 된 신장율은 말초 신경계에서 가장 빠르게 성장하는 축색 돌기의 생체 내 속도 (0.02-0.04mm / h)보다 30-60 배 빠르고 1.2mm / h를 초과하고 이전에보고 된 것보다 10 배 더 빠릅니다 발달의 초기 단계에서의 연결 유형 4 . 첫째, 쥐 hippocampal 뉴런의 고립 된 인구는 microfluidic 장치에서 2-3 주 동안 세포를 정확하게 위치시키기 위해 성장되어 쉽게 미세 조작과 실험적 재현성을 가능하게한다. 다음으로, poly-D-lysine (PDL)으로 코팅 된 비드를 신경 돌기에 위치시켜 접착 성 cont행동 및 피펫 micromanipulation 결과 비드 - 신경 자극 단지를 이동하는 데 사용됩니다. 비드가 움직일 때 수백 마이크로 미터 이상으로 확장되고 1 시간 이내에 목표 세포에 기능적으로 연결된 새로운 신경 돌기가 빠져 나옵니다. 이 과정은 실험 재현성과 조작의 용이성을 가능하게하면서 느린 화학적 전략을 우회하여 신경 돌기 성장을 유도합니다. 여기에 제시된 예비 측정은 생리 학적 성장 속도를 훨씬 초과하는 연결 성장 속도를 보여줍니다. 이러한 혁신을 결합하면 전례없는 수준의 제어력으로 문화의 신경 네트워크를 정확하게 구축 할 수 있습니다. 뉴런 네트워크의 신호 전송과 의사 소통에 대한 많은 정보와 통찰력뿐만 아니라 연결 성장의 한계를 탐구하는 놀이터이기도 한 새로운 방법입니다. 잠재적 인 응용 및 실험은 신경 세포를 다시 연결하는 것을 목표로하는 치료법에 직접적인 영향을 미치며 널리 퍼져있다외상 후 또는 신경 퇴행성 질환에서 l 회로.
Introduction
성인 중추 신경계 (CNS)에 부상을 입으면 축삭 재성장을 제한하는 여러 메커니즘으로 인해 영구적 인 장애가 발생할 수 있습니다 1 . 손상 후 많은 CNS 축색 돌기가 새로운 성장 원추를 형성하지 못하고 효과적인 재생 반응 2를 일으키지 못합니다. 또한, CNS 병변을 둘러싼 손상 및 흉터 조직은 axonal 성장을 크게 억제 1,2,3 . 손상 후 CNS 재생을 촉진시키는 현재의 치료법은 부상당한 뉴런의 본질적인 성장 잠재력을 높이고 myelin 파편과 glial scar 1 , 3 과 관련된 axonal extension의 억제제를 마스킹하는 데 초점을 맞추고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 먼 축삭을 먼 표적으로 재생시키고 적절한 기능 시냅스를 형성하는 능력은 심각하게 제한되어있다 . 5 , 6 , 7 .
현재 연구에서, 마이크로 비드, 피펫 마이크로 조작 및 마이크로 유체 장치는 장거리에서 새로운 기능적 신경 회로를 신속하게 개시, 연장 및 정확하게 연결하는 데 사용됩니다. 이전 연구는 poly-D-lysine-coated beads (PDL- 비드)가 시냅스 소포 복합체의 클러스터링과 기능적인 시냅스 전처리 8의 형성에 이어 막 접착을 유도한다는 것을 보여 주었다. PDL- 비드가 시냅스 전 분화 후에 기계적으로 제거되면 시냅스 단백질 군집이 비드를 따라 가면서 새로운 신경 돌기 9를 시작한다는 것도 보여 주었다. 다음 절차는 polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic 장치를 사용하여 coverslip에 조직화 된 영역으로 쥐의 배아 hippocampal 뉴런을 배양하여 신경 세포를 정확하게 재 연결하는 능력과 함께이 사실을 이용합니다회로.
이러한 PDMS 마이크로 유체 장치는 무독성이며 광학적으로 투명하며 마이크로 채널 시스템으로 연결된 두 개의 챔버로 구성됩니다. 일단 coverslip에 조립, 각 장치는 연결 성장을 유도 하고 체외에서 4 주 이상에 대한 정확한 패턴에 건강한 연결의 문화를 유지하기 위해 금형 역할을합니다.
여기, 새로운 신경 돌기의 확장과 기능의 한계를 조사하는 프레임 워크가 제시됩니다. 새로운 기능성 신경 돌기가 만들어져 신경 세포 네트워크를 제어 가능하게 (재) 배선 할 수 있습니다. 달성 된 확장 속도는 밀리미터 - 스케일 거리에서 20 μm / min보다 빠르며 기능적 연결이 확립됩니다. 이러한 결과는 예기치 않게 길항에 대한 이들 신경 돌기의 내재적 능력이 이전에 생각했던 것보다 훨씬 빠르다는 것을 보여준다. 이 제안 된 기계적 접근법은 느린 화학 전략을 우회하고 특정 타겟에 대한 제어 된 연결을 가능하게합니다. Th기술은 손상 후 신경 연결성을 복원하기위한 새로운 치료법에 대한 in vitro 연구를위한 새로운 방법을 제시합니다. 그것은 또한 시험 관내에서 신경 신호 처리 및 연결 기능의 근본적인 측면을 조사하기 위해 신경 네트워크의 조작 및 재배 선을 가능하게합니다.
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Protocol
아래에 설명 된 모든 절차는 McGill 대학의 동물 관리위원회 (Animal Care Committee)의 승인을 얻었으며 캐나다 동물 보호 협회 (Council of Animal Care)의 가이드 라인을 준수했습니다.
1. Microfluidic 장치를 사용하여의 연결 문화의 표준화 : 장치 조립
- 원하는 실험에 적합한 마이크로 유체 장치를 선택하십시오. 동일한 집단 내에서 뉴런을 연결하려면 Neuro Devices ( 그림 1 )를 사용하고 다른 집단의 뉴런을 연결하려면 Co-Culture Devices ( 그림 6 )를 사용하십시오.
- 멸균 된 커버 슬립이나 유리 바닥 접시를 깨끗하게 준비하십시오. 플라스틱 표면의 최상의 결과를 얻으려면 35mm 접시, 유리 사용시 25mm 커버 슬립 또는 35mm 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 이미징 시스템을 기준으로 유리 두께를 선택하십시오 (예 : 0.15 mm).
- 접시 또는 coverslips를 2 시간 또는 밤새 실온에서 100 μg / ML PDL 0.5-1 ML와 코트ature.
참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지하고 필요할 경우 다음 날에 다시 시작할 수 있습니다. 또한, 붕산염 완충액으로 희석 된 PDL, Poly-L-Lysine (PLL), 라미닌 또는 기타 세포 접착 분자로 식탁을 코팅 할 수 있습니다. - 접시를 물로 두 번 씻으십시오 (소금 결정이 채널을 차단할 수 있으므로 인산염 완충 용액을 사용하지 마십시오). 모든 액체를 제거하고 바이오 안전성 캐비닛과 같은 살균 환경에서 5 ~ 10 분 동안 건조시킵니다 표면이 완전히 건조합니다.
참고 : 잔여 액체가 미세 유체 시스템의 부착을 방해하므로 커버 슬립이 완전히 건조되도록주의하십시오. - 멸균 환경 (biosafety 캐비닛)에서 10 분 동안 자외선 아래 패턴을 향한 미세 유체 장치를 놓습니다. 바이오 안전성 캐비닛에서 작업 할 때 무균 절차를 따르십시오 10 .
- 핀셋을 사용하여 깨끗한 coversl와 접촉 패턴을 아래로 향하게 microfluidic 장치를 놓으십시오ip / dish. 핀셋을 사용하여 장치를 부드럽게 눌러 유리에 달라 붙지 않도록하십시오.
참고 : 빛을 바라 볼 때 접착 된 영역의 투명도가 보입니다. 모든 모서리가 유리에 닿아 있는지 확인하십시오. 모든 마이크로 유체 장치에이 작업을 수행하십시오. 그림 1a를 참조하십시오. - 단일 모집단 장치를 매체로 채우려면 피펫을 채널쪽으로 향하게하고 혈청이없는 B-27 (체적 비율 1:50)과 500 μg / mL 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 글루타민 (보편적으로 보충 된 50 μL의 완전한 세포 배지를 첨가하십시오 NBM이라고 함)을 오른쪽 상단에 넣은 다음 대각선 방향으로 우물에 50 μL를 더합니다. 모든 장치에 대해 이것을 수행하고, 매질이 우물 사이를 흐르도록하십시오. 다음, 남아있는 2 개의 우물에 매체 50 μL를 추가합니다. 그림 2a를 참조하십시오.
- 매체가있는 여러 개의 모집단 장치를 채우려면 피펫을 채널쪽으로 향하게하고 30 μL완전한 우물에 대한 완전한 NBM의 그림 6a를 참조하십시오. 모든 장치에 대해 이것을 수행하고, 매질이 우물 사이를 흐르도록하십시오. 다음, 나머지 4 우물에 매체 50 μL를 추가합니다.
- 세포 배양을 준비하는 동안 1-2 시간 동안 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도)에 autoclaved 물 (습식 챔버)와 장소와 오픈 접시와 함께 더 큰 접시에 장치를 놓으십시오. 그림 2b를 참조하십시오.
2. Microfluidic 체계에있는 뉴런의 도금
- Ref. 8 , Sprague Dawley 쥐 배아 (성별)에서 해리 된 해마 또는 피질 뉴런을 얻는다.
- NBM에서 1 ~ 2 백만 뉴런 / mL의 농도로 배아 뉴론을 Resuspend. hemocytometer 및 참조 8 다음과 현미경에서 세포 농도를 확인합니다. 세포 농도 조절g을 원하는 세포 밀도로 증가시킨다. 채널당 단일 해마 축삭을 얻는 기회를 높이려면 장치 당 10,000 뉴런을 준비하십시오. 동일한 채널에 여러 개의 축색 돌기를 갖기 위해서는 장치 당 60,000 개의 뉴런이 있어야합니다.
참고 :이 숫자는 사용 된 연결 유형에 따라 다릅니다. - 우물을 비우지 않고 microfluidic 장치에서 매체를 제거합니다. 각각 약 5 μL를 남겨 둡니다.
- 단일 모집 장치에 세포를 플레이트하려면 우 하단에 NBM 50 μL를 잘 넣으십시오. 이 시점에서 매체는 다른 하부 우물을 채우기 위해 그 자체로 흐릅니다. 그림 1b 에 표시된 대로 microfluidic 장치의 오른쪽 상단에 농축 세포 솔루션 20 μL를 추가합니다.
- 여러 개의 모집단 장치에 세포를 정돈하려면 그림 6a 의 오른쪽 우물 각각에 20 μL의 농축액 솔루션을 추가하십시오.
- 세포가 현미경에 있는지 확인하십시오.챔버 내부에 있으며 15 ~ 30 분 동안 인큐베이터에 장치를 배치하여 세포에 세포 부착을 촉진합니다.
- 챔버에 세포가 충분한 지 현미경으로 확인하십시오. 더 필요한 경우 2.4 및 2.5 단계를 반복하십시오.
- 세포가 여러 인구 장치에 주입되었다 같은 우물에 단일 인구 장치와 NBM 20 μL의 2 우물에 50 μL의 NBM을 추가합니다. 미디어는 약간 돌출되어 웰스에게 머핀 상단면을 제공하는 긍정적 인 반월 상 연골을 형성합니다. 다시, 그림 2a 를 참조하십시오.
- 37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도에서 세포를 유지하십시오.
3. 신경 세포 배양 유지
- 세포에서 NBM (피펫으로 약 30 μL)을 제거하고 장치에 도입 한 다음 날 (즉, 2 단계 후에 1 d)에 새로운 예열 된 NBM을 적용하십시오.
- 각 채널에 매체가 충분한 지 2 일 간격으로 확인하십시오. 머핀 Top가 낮 으면 맨 위 웰에 매체를 추가하십시오.
- microfluidic 장치의 제거하기 전에 최소한 7 일 동안 문화 세포. 세포는 몇 주 동안이 장치에서 생존 할 수 있습니다. 샘플을 실험하기 1-2 일 전에 장치를 제거하십시오.
4. 미세 유체 장치의 제거
- microfluidic 장치의 제거하기 전에 1 - 2 d, 챔버에 범람하고, 인큐베이터에 장치를 유지 각 샘플 접시 37 ° C에 prewarmed NBM 2 ML을 추가합니다.
- 살균 핀셋과 하나의 팁을 사용하여 뉴런의 패턴 구성을 남긴 coverslips에서 microfluidic 장치를 제거합니다. 팁을 사용하여 커버 슬립을 제자리에 고정하고 핀셋을 사용하여 우물의 왼쪽 하단 모서리에있는 장치의 가장자리를 고정시킵니다. 섬세하게 비틀림을 가하여 장치를 핀셋으로 들어 올리면 덮개가 벗겨집니다. 그림 2c - 2d를 참조하십시오.
- 2 ~ 3 일마다 하를 교체하십시오.샘플이 실험에 사용될 때까지 NBM.
- 샘플의 재배 선 실험을 수행하기 전에, 단일 모집단 채널의 신경 돌기 및 다중 모집단 장치의 연결 인구가 현미경에서 이들 사이의 틈을 조사하여 고립되어 연결 인구를 연결하는 필라멘트가 없는지 확인하십시오.
5. PDL 코팅 비드 준비
- PDL (100 μg / ML) 1 ML에 물 (1 : 500)로 희석 4, 10 또는 20 μm의 폴리스티렌 구슬의 2 X 50 μL 방울을 추가합니다. 실온에서 최소 2 시간 동안 방치하십시오.
참고 : 여기서 프로토콜을 일시 중지하고 다음 날에 다시 시작할 수 있습니다. - 용액을 8,820 xg에서 1 분간 원심 분리한다. 조심스럽게 용기 바닥에 쌓인 구슬을 방해하지 않고 뜨는 제거.
- 구슬을 멸균 10 MM HEPES pH 8.4 용액 1 mL로 두 번 씻으십시오.
- 10 MM HEPES pH 8.4 200 ML에 PDL 코팅 구슬을 Resuspend해결책.
6. 준비 Micropipettes
- 수평 전극 풀러를 사용하여 유리 모세관 튜브 (내경 1mm, 외경 1.5mm)에서 피펫을 준비합니다. 뽑아 낸 마이크로 피펫의 바깥 쪽 끝 부분이 ~ 2-5 μm가되도록 설정을 조정하십시오. 잡아 당기기 전에 유리관이 깨끗한 지 확인하십시오.
- 피펫을 고정 용 유리 슬라이드에 고정시키고 팁이 깨지기 쉽기 때문에 팁이 슬라이드 표면에 닿지 않도록하십시오. 먼지로부터 보호하기 위해 덮여있는 용기에 실온에서 보관하십시오. 그들이 당겨지는 날 피펫을 사용하십시오.
7. 뉴런에 대한 PDL 비드 접착
- 4 단계에서 준비된 세포 배양에 5 단계에서 준비한 40-60 μL의 PDL 코팅 비즈를 추가합니다. 커버 슬립에 희미하게 보이는 뉴런 위에 피펫 팁을 놓고 비즈를 추가하십시오 ( 그림 3 참조).
- sy의 형성을 촉진하기 위해 1 시간 동안 인큐베이터로 시료를 되돌려주십시오.naptic 접촉 8 , 9 .
- 배양 후 예열 된 NBM으로 배양액을 부드럽게 씻어서 부착되지 않은 비드를 제거합니다.
8. 생리 식염수 용액 준비 (실내 온도 실험 용)
- 참고 문헌 7 , 8 에 열거 된 성분을 혼합하여 생리 식염수 용액을 준비한다. 이것은 인큐베이터 외부 의 세포 환경을 조절하는 것입니다.
- 참고 문헌 7 , 8 에 표시된대로 삼투압과 pH 수준을 확인하십시오.
- 실험을 수행하면서 pH 변동을 최소화하기 위해 지속적으로 용액에 O 2 를 주입합니다.
- 상온으로 가열.
- 플라스틱 튜브 (선택 사항)의 한쪽 끝을 O 2가 주입 된 생리 용액에 넣고 다른 쪽을 고정하여 관류 시스템을 설정하십시오.샘플 홀더에 삽입 된 바늘에. 튜빙과 용액을 샘플보다 높게 위치시킵니다 ( 그림 4 참조).
- 튜브를 바늘에서 분리하고 주사기에 연결하십시오. 주사기를 사용하여 압력을 가하고 액체를 흡입하여 튜브를 채 웁니다. 롤러 클램프로 봉인하고 바늘을 다시 연결하십시오.
9. 비드 미세 조작
- 거꾸로 된 광학 현미경의 40X 상 대물 렌즈 (개구 수 0.6)를 사용하여 micromanipulators에 장착 된 두 개의 마이크로 피펫으로 위에서 접근 할 수 있고 아래에서 광학적으로 접근 할 수 있도록 실험 배열에 샘플을 설치하십시오. 이 구성에서 현미경의 측면 포트에 이미지 캡처를위한 CCD 카메라를 탑재하십시오. 플라스틱 튜브를 통해 1mL 주사기에 각 피펫을 연결합니다. 이 단계에서 NBM을 생리 식염수 (1-2 mL)로 교체하십시오 ( 그림 4 참조).
- 체험 도중단계 8에서 제조 한 생리 식염수 용액을 0.5-1 mL / min의 속도로 연속적으로 세포를 관류시킨다.
- 시야에서 뉴런에 붙어 있지 않은 PDL 비드를 선택하십시오. 비드를 마이크로 피펫까지 초점을 맞추어 마이크로 피펫 팁과 정렬시킵니다. 현미경을 통해 그것을 모니터링하여 가능한 한 팁을 비드에 가능한 가깝게 가져 오십시오.
- 비드를 데리러 피펫에 연결된 1 ML 주사기와 부정적인 압력을 적용합니다. 실험 전반에 걸쳐 부정적인 압력을 유지하십시오.
10. 이빨 꾸는 자
- 시야에서 뉴런에 붙어있는 PDL - 비드를 선택하고 9.3-9.4 단계에 설명 된대로 흡인을 사용하여 두 번째 micropipette에 붙이십시오.
- PDL - 비드 - 뉴런 복합체를 천천히 (~ 0.5 μm / min) 당겨서 마이크로 조작기 또는 시료 스테이지를 1 μm 이동시키고 5 분간 멈추어 신경 돌기 시작을 허용하십시오.
- 10.2 단계를 두 번 반복하십시오.
참고 : 처음 3 &실험적 성공을 보장하기 위해 매우 천천히 잡아 당겨야하는데, 이는 시간의 95 % 이상 발생합니다. - PDL - 비드 - 뉴런 복합체를 서서히 (~ 0.5 μm / 분) 끌어 당기고 micromanipulator 또는 샘플 스테이지를 2 μm 이동시키고 신경 돌기 연장을 허용하기 위해 5 분 동안 정지시킨다.
- 처음 5 μm의 성공적인 개시 및 신경 돌기 확장 후, mm 거리 규모 이상의 20 μm / min에서 신경 돌을 당겨.
참고 : 당기기는 연속적으로 또는 단계적으로 그리고 다양한 속도로 수행 될 수 있습니다. 그림 5b -5c를 참조하십시오.
11. 뉴런 연결하기
- 신경 돌기가 많은 부위를 선택하고 PDL- 비드 - 신경 돌기 복합체를 낮추어 물리적으로 접촉시킵니다. 다른 구슬을 사용하여 coverslip 표면 위의 팁 높이를 측정합니다. 그림 5d를 참조하십시오.
- 두 번째 micropi를 조작하면서 PDL - 비드 - 신경 자극 복합체를 대상 신경 돌과 접촉 상태로 두십시오쁘띠. 두 번째 PDL 비드와 함께 새로 형성된 신경 돌기의 상단에 약 20 μm의 형태로 첫 번째 비드를 놓습니다. 두 번째 PDL - 비드를 사용하여 새로운 신경 자극 필라멘트를 대상 세포쪽으로 밀어냅니다.
- 적어도 1 시간 동안 두 구슬을 제자리에 두십시오. 현미경으로 비드와 접촉하는 신경 돌기가 두꺼워지는 것을 확인하십시오.
- 이 시간 동안 재관류를 사용하여 시료의 배지를 생리 식염수에서 예열 된 CO 2 평형 NBM으로 서서히 변경하십시오.
- 흡입을 해제하여 두 번째 피펫에서 비드를 놓습니다. 새로운 신경 돌기가 붙어 있으면 첫 번째 비드도 놓습니다. 그림 5e를 참조하십시오.
- 부드럽게 식염수를 제거하고 NBM (~ 2 ML)로 바꿉니다.
- 조심스럽게 미래 실험을위한 연결을 강화하기 위해 인큐베이터에 샘플을 다시 놓습니다. 이 연결은 24 시간 이상 안정적 임
12. 전체 셀 페어링 된 패치 클램프 녹음을 통해 새 연결 의 기능 확인
- 참고 문헌 7 , 18 , 19를 따른다. 전기 생리학 셋업
- 참고 문헌 7을 따른다. 사전 및 postsynaptic 전극 준비.
- 참고 문헌 18 , 19에 따라 패치 클램프 데이터를 수집하십시오.
- 결과를 자연스럽게 발생하는 신호 7 과 비교하여 연결 유형을 결정하십시오.
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Representative Results
배아 쥐 hippocampal 뉴런은 세포, PDL - 비즈 및 micromanipulators의 정확한 위치를 수 있도록 microfluidic 장치에서 교양 있습니다. 첫 번째 단계는 유리 coverslip이나 접시에 microfluidic 장치를 제대로 조립하는 것입니다. 챔버가 챔버에서 나와 밀봉되어야하는 장치의 부품 아래로 이동하는 것을 피하려면 마이크로 유체 장치가 기판에 잘 부착되어야합니다 ( 그림 1a ). 몇 주 동안 건강한 문화를 유지하기 위해서는 매 2-3 일마다 세포 배지를 확인하고 배양액의 양성 반월 상 연골을 보존하여 배지를 막는 것이 중요합니다 ( 그림 2a ). 중간 증발은 또한 더 큰 판 ( 그림 2b ) 안에 물과 셀을 모두 열어 놓음으로써 피할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치는 언제든지 제거 할 수 있습니다. 최적의 결과를 얻으려면 NBM을 cell-de에 추가해야합니다.장치 분리 전 최소한 1 일 이상. 이것은 뉴런이 장치를 제거 할 때 이상적인 온도와 pH에서 매체와 접촉 할 때 세포 스트레스를 최소화합니다. 미세 유체 장치가 접시에서 천천히 벗겨 질 때 ( 그림 2c 및 2d ) 세포는 패턴 화 된 위치에 남아있을 것이다 ( 도 3 및 도 5a ).
두 가지 유형의 미세 유체 장치가 사용됩니다 : 신경 장치 및 공동 문화 장치. 첫 번째는 축색 돌기, 수상 돌기 및 세포체를 쉽게 식별 할 수 있습니다. soma는 축삭 챔버와 축색 돌기가 축삭 챔버쪽으로 microfluidic 채널 ( 그림 5a )을 따라 성장하면서 상단 soma 챔버에 남아 있습니다.
PDL- 비드를 10 : 1의 비율로 세포에 첨가하고, 대부분의 비드가1 시간 배양 한 후 NBM으로 세포를 한 번 씻어 냄으로써 배양 물에 달라 붙지 않게됩니다 ( 그림 3 ). PDL- 비드가 신경 돌기에 접착 된 후, PDL- 비드 - 신경 돌기 복합체는 당겨지고 먼 거리까지 연장 될 수있다. 새로 형성된 신경 돌기는 신경 돌기 또는 soma 밀리미터와 정확하게 연결될 수 있습니다 ( 그림 5b -5e ). 1 μm / min보다 낮은 속도에서 처음 3 μm에서 새로운 신경 돌을 잡아 당기는 성공률은 95 % 이상 (n = 206)입니다. 새로운 신경 돌기를 다른 세포에 연결하는 성공률은 70 % (n = 30)입니다. 새로운 신경 돌기가 10 μm PDL-bead에 고정 된 직경 1 μm 미만의 필라멘트이기 때문에 처음 18 시간에는 연결이 매우 약해졌습니다. 접촉 후 첫 번째 분 동안 접시가 빠르게 움직 인 경우, 결과적으로 매체의 난류로 인해 비드가 굴러 올라 결과적으로 접착력이 손실 될 수 있습니다. 그러나 샘플이 sha가 아닌 경우ken, 30 분 안에 구슬이 접시의 신경 돌기에 붙어서 새로운 연결부가 적어도 48 시간 동안 남아 있습니다. 셋업의 개략도는 그림 4 를 참조하십시오.
배양 물상의 PDL- 비드 위치는 또한 연결된 신경 돌기의 위치를 쉽게 확인하는데 사용될 수있다 ( 도 6d-6e ). 시작 후, 새로운 신경 돌기의 확장과 연결, micromanipulator를 통해 픽업 한 두 번째 비 접착 성 PDL 비드를 사용하여 개시된 신경 돌기와 두 번째 신경 세포 집단 사이에 두 번째 접착 부위를 만듭니다. 두 번째 PDL- 비드는 새로운 신경 돌층의 맨 위에 위치하여 새로운 신경 돌기가 단지 두 번째 연결 인구 11 과 접촉하도록 압축합니다. 이것은 두 번째 연결 인구 ( 그림 5f )와의 접착을 촉진합니다.
다중 모집단 장치 enab동일한 접시에 4 개의 고립 된 연결 인구의 성장. 각 연결 인구는 100 또는 200 μm 간격 ( 그림 6a )에 의해 다른 연결 인구에서 분리 4 x 7mm 사각형에 국한됩니다. 건강한 뉴런은 몇 주 동안 장치 내부에서 성장할 수 있습니다. 일반적으로, 신경 개체군은 장치를 제거한 후 최대 48 시간 동안 격리되어 있습니다. 이 48 시간 후에 뉴런은 인접한 연결 인구로 성장하여 자연스러운 연결 고리를 형성하는 경향이 있습니다. 두 개의 고립 된 인구를 연결하기 전에, 두 개의 연결 인구 ( 그림 6b ) 사이에 링크가 없다는 것을 확인하기 위해 현미경으로 전체 간격을 검사하여 인구가 참으로 정말로 고립되어 있는지 확인해야합니다.
연결 후, 시료를 24 시간 동안 배양하고 전기적 전체 세포 쌍을 이룬 패치 클램프 기록을 수행하여 새롭게두 개의 분리 된 연결 개체군을 연결하는 데 사용되는 형성된 신경 돌기는 기능적이었고 전기 신호를 전송할 수있었습니다. 유도 된 신경 돌기가 시작된 부위로부터 반경 100μm 미만인 집단 1의 뉴런은 시냅스 활동 전위 (PAPs)를 기록하기 위해 선택되었다. 이 뉴런은 시냅스 전 세포로 간주되었습니다. 시냅스 후 흥분성 또는 억제 성 활동은 마이크로 매니퓰 레이팅 된 연결부의 반경 100μm 미만에있는 갭의 다른쪽에있는 인구 2의 뉴런에서 기록되었다 ( 그림 7a- 7c ). 기계적으로 유도 된 연결에서 유래 한 기록을 분석하고 자연적으로 연결된 연결 집단 및 연결되지 않은 집단의 기록과 비교했습니다 ( 그림 7 ). 자연적으로 그리고 미세 조작에 의해 연결된 뉴런으로부터 기록 된 PAP 후의 전기적 반응은 현저히 높고 시간적으로 시냅스 전과 관련이있다활동 ( 그림 7 ).
도표 1 : Microfluidic 장치를 사용하는의 연결 문화의 표준화 7 . ( a ) 장치 조립 : 미세 유체 장치가 건조한 표면에 적절히 조립되면 모든 챔버가 보입니다. ( b ) 세포 도금 : 오른쪽 상단에 세포를 플레이트하고 세포는 왼쪽 우물쪽으로 이동해야합니다. ( c ) 세포 밀도 : 도금 직후 세포의 농도가 적절한 지 현미경으로 확인한다. ( d ) 배양 1 일 후에, 해마 뉴런은 마이크로 채널에 잘 밀착되어 신경 돌기 형성을 시작한다. larg를 보려면 여기를 클릭하십시오. 이 그림의 어 버전입니다.
그림 2 : 몇 주 동안 건강한 연결 문화의 유지 보수 7 . ( a ) 매 2-3 일마다 매질을 첨가하고 미세 유체 챔버의 상부 우물에 양수 반상 물을 유지하여 세포가 일정한 양분을 공급하도록하십시오. ( b ) 중간 증발을 줄이기 위해 물을 담은 접시로 세포를 더 큰 판에 보관하십시오. ( c ) 멸균 팁과 핀셋을 사용하여 마이크로 장치를 쉽게 떼어냅니다 ( d ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 3 : 비드를 문화에 넣는 피펫의 위치. 일단 microfluidic 장치가 제거되면, 뉴런은 coverslip에 표시됩니다. 구슬을 입금 때, 그것이 세포의 중심에 있도록 피펫 팁을 위치. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : 전형적인 신경 돌기 설정의 개략도. 샘플은 (piezo-actuated) 스테이지에 올려 져 있으며, 마이크로 조작자 (microromanipulators)에 들어있는 2 개의 마이크로 피펫으로 위에서 접근 할 수 있으며 플라스틱 튜빙을 통해 1 mL 주사기에 연결됩니다. 샘플은 CCD 카메라에 연결된 대물 렌즈를 통해 아래로부터 광학적으로 액세스됩니다.이미지를 CPU에 전송합니다. 입구 튜브는 샘플에 산소가 공급 된 생리 식염수 용액을 시료에 공급하며, 시료는 주사기에 연결되어 배출 튜브가 넘치면 용액을 회수 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 뉴런 및 피펫 미세 조작에 대한 PDL- 비드 접착 7 . ( a ) 뉴런은 체세포 및 신경 돌기를 쉽게 식별 할 수 있도록 미세 유체 챔버를 제거한 후에 패턴으로 조직되어있다. ( b ) 신경 돌기에 접착 된 PDL- 비드의 미세 조작은 신경 돌기 개시, 신장 ( c ) 및 연결 ( d )을 가능하게하고,피펫 ( e )에서 PDL- 비드가 방출되었다. ( f ) 두 개의 격리 된 연결 개체 (하단 화살표)를 접촉 한 후 두 번째 PDL- 비드 및 피펫 마이크로 조작자 (위 화살표)를 사용하여 두 번째 점착 지점을 만들고 첫 번째 접점을 형성하는 수백 마이크론 간격을두고 기능을 보장합니다 사이. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 . 다 인구 집단 및 Micromanipulation를 사용하여 2 개의 고립 된 인구를 연결하는 새로운 신경 돌기의 개시, 연장 및 연결 7 . ( a )이 장치는 4 개의 연결 인구를 분리합니다.100 또는 200 μm의 간격 3 개 사이. ( b ) 장치를 제거한 후에 하나의 간격을 선택하고 두 개의 개별 개체를 연결하는 신경 돌기가 없다는 것을 확인합니다. 광학 현미경에서 볼 수 있어야 실험 설정의 도식은 두 micropipettes의 위치와 PDL - 코팅 구슬의 존재를 나타냅니다. ( d ) 피펫에 부압을가함으로써, 하나의 연결 인구에 부착 된 PDL- 비드가 피펫 팁으로 당겨져 새로운 신경 돌기가 시작된다. 피펫에 부정적인 압력을 유지함으로써, PDL - 구슬 - 신경 자극 복합체 (녹색)는 뽑아서 신경 돌기를 연장시킬 수 있습니다. ( e ) 피펫 micromanipulation 새로운 틈새의 확장을 안내하고 새로운 연결 인구와 연결의 형성. 두 번째 집단에 대한 새로운 신경 돌기의 접착을 보장하기 위해, PDL- 비드 (적색)는 신장 된 신경 돌기와 신경 모두의 상부에 두 번째 피펫과 함께 배치됩니다인구. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7 : 새로 유도 된 길고 연결된 신경 자극은 두 개의 격리 된 연결 인구 사이의 정보를 전달할 수 있습니다 . 7 . 고립 된 연결 개체군은 PDMS 마이크로 장치에서 100 μm 간격으로 분리 배양되었다. 페어링 된 패치 클램프 기록은 두 집단이 기계적 조작 ( a )을 통해 연결되었을 때 집단 1의 뉴런과 집단 2의 뉴런 (뉴런 간격)에서 전체 세포 구성으로 수행되었으며 자연적으로 갭 ( b )을 유지하거나 maint간격 ( c )를 유지함. 쌍으로 된 녹음의 대표적인 흔적이 각 조건 ( df )에 대해 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
표준 micromanipulation과 혁신적인 microfluidic 장치를 사용하여, 새로운 기술은 빠른 거리에서 새로운 기능적 신경 회로를 신속하게 시작, 연장 및 연결하기 위해 개발되었습니다. 피펫 micromanipulation은 대부분의 신경 과학 연구소 4 , 13 에서 일반적인 도구입니다. 재현성 있고 신뢰할 수있는 결과를 얻기위한 실질적인 과제는 마이크로 미터 정밀도의 세포 배양을 구성하는 마이크로 유체 장치의 개발을 통해 실험 기간 동안 (수 주일 수 있음) 건강하고 정확한 위치의 연결 문화를 표준화하는 것이 었습니다. 고품질 세포 배양은 데이터 검증의 초석입니다. 이것은 쉽고 빠른 현미경 이미징 및 문화와 결과의 표준화에 기여합니다. microfluidic 장치는 생체 내 에서 비슷한 조직으로 체외에서 세포를 배양하기 위해 설계되었습니다. 단일 모집 장치로긴 신경 돌기의 성장과 축삭, 신경 돌기 및 soma의 쉬운 확인. microfluidic 챔버에 도금 세포의 숫자는 연결 밀도를 결정합니다. 따라서 장치 당 더 적은 셀을 도금함으로써 채널에 가까운 단일 뉴런을 식별하기 쉽습니다. 하나의 단일 뉴런의 축색 돌기와 복수의 수상 돌기가 하나의 채널에서 자랍니다. 수상 돌기는 축색 6 , 17 보다 적어도 5 배 이상 성장하고 시험 관내에서 2-3 주 후에 채널에서의 성장은 일반적으로 200 μm로 제한되며 급속 성장하는 축색 돌기는 2 mm를 초과 할 수있다. 따라서 샘플에 PDL- 비즈를 첨가 한 후에는 비드가 축삭이나 축삭 및 수상 돌기에 붙어 있는지 추정하기가 상대적으로 쉽습니다 ( 그림 5b - 5f ). 200 μm보다 짧은 신경 돌기에 부착 된 PDL- 비드를 당길 때 새로운 축색 돌기 및 수상 돌기를 당길 확률이 더 높습니다.500 μm보다 긴 신경 돌기에 부착 된 PDL- 비드를 당길 때 새로운 축색 돌기 만 당길 확률이 더 큽니다. 다중 모집단 장치는 몇 주 동안 건강한 이산 모집단을 재현 가능하게 성장시키는 데 유용합니다. 이 채널 시스템은 최대 4 가지 세포 유형을 연구하거나 동일한 세포를 다른 치료법과 비교하는 데 유용합니다.
또한, 제어 및 재현 가능한 세포 배양 환경은 세포 분석 및 조작을위한 이상적인 틀을 제공합니다. 접시에 세포의 정확한 위치를 지정하면 신경 영역의 시작 부위를 전례없이 제어 할 수 있으므로 이러한 관심 영역을 통해 방향 및 탐색뿐만 아니라 관심 영역을 쉽게 식별 할 수 있습니다. 제어 된 세포 분포는 새로 형성된 연결을 쉽게 시각화 할 수 있으며 부화 후 며칠간 현미경으로 새로운 연결을 찾을 수 있습니다. 또한, 세포의 재현 가능한 구성소마 (soma), 수상 돌기 또는 축색 돌기에 PDL이 코팅 된 구슬과 같은 화학적 단서를 쉽고 정확하게 위치시킬 수 있습니다. 함께, microfluidic 장치에서 성장 세포의 이미징 및 분석은 표준 세포 조직이 모든 요리에 재현되어 있기 때문에 더 빠릅니다. 또한이 장치는 생체 적합성, 투명성 및 제거 가능 물질로 만들어져 수 주 동안 모든 가시 파장 및 장치 내에서의 세포 생존을 가능하게합니다. 세포 분석의 소형화는 적은 세포로 더 많은 데이터를 수집하는 데에도 도움이됩니다. 마이크로 유체 장치의 소량 소비는 실험 당 필요한 세포의 수를 줄이고 실험 효능을 증가시킵니다. 예를 들어, 접시에 1 ~ 2 개의 분리 된 축삭을 현미경으로 검색하는 데 몇 시간을 소비하는 대신, 단일 모집단 장치를 사용하여 세포 샘플 당 100 개가 넘는 축색 돌기에 즉시 액세스 할 수 있습니다. 마이크로 유체 장치는 소형화 된 신뢰성과 제어 기능을 제공합니다.희소 한 표본의 분석에 유리한 세포 배양 환경.
이 기법의 잠재적 인 변형은 비드를 마이크로 피펫에 직접 부착하는 것을 포함합니다. 현재의 프로토콜에서, 비드를 흡입을 통해 팁에 부착하는 방법이 기술되어 있지만, 비드는 팁에 접착 될 수도있다. 예를 들어 피펫을 센서로 사용하거나 PDL과 신경 돌기 사이의 접착력을 조사하는 것이 주요 실험 목적 인 경우 팁과 비드 사이의 매우 안정한 연결이 바람직 할 경우 접착제를 사용하는 것이 좋습니다. 또 다른 맥락에서 흡입은 신경 돌기 - 비드 복합체를 절단하지 않고 배치 후 비드의 방출을 허용하여 여러 개의 연결을 병렬로 만들 수 있으므로 유리하다. 석션은 높은 처리량 재배 선 실험을위한 수단을 제공하며, 원자력 현미경 (AFM)과 같은 다른 조작 기법보다 개선되었습니다 7 </ sup> , 16 . 이 방법의 두 가지 변형은 신경 돌기 시작 부위가 수상 돌기와 접촉하여 비드를 유지함으로써 시냅스가 형성되도록 선택하게합니다. 그러나, 7 단계에서 설명한대로 여러 비즈를 incubating의 전략은 조작 단계에서 시간을 절약하고 초기 사이트에 대한 정확한 제어가 실험에 필요하지 않은 경우 권장됩니다.
향후 연구는 온도 제어 및 표본 접근성과 같은 다양한 도구 적 한계를 해결할 수 있습니다. 세포막의 기계적 성질은 온도에 따라 크게 달라질 수 있습니다 27 . 이상적으로 모든 실험은 연결 매체 및 적절한 조건 (올바른 CO 2 압력 및 습도 조절)에서 37 ° C에서 수행해야합니다. 그러나 닫힌 세포 배양기를 사용할 수 없었습니다. 왜냐하면 맨 위의 시료에 대한 접근은 마이크로 조작자,현미경의 바닥과 무대를 움직이는 측면. 따라서 실온에서 관류가 사용되었다. 비슷한 맥락에서, 셋업은 2 개의 micromanipulator를 수용하기에 충분한 공간을 가지고 있으며, 단일 연결을 설정하는 데 거의 1 시간이 걸리므로 수행 할 수있는 실험 횟수에 제한이 있습니다. 이 문제는 한 번에 둘 이상의 비드를 가져 오는 조작자로 해결할 수 있습니다. 이 프로토콜의 또 다른 잠재적 개선점은 샘플 표면에서 비드 - 피펫 콤플렉스의 높이를 등록 할 수 있다는 것입니다. 이렇게하지 못하면 두 번째 구슬을 내리고 유도 된 신경 돌기에 고정시켜 부정확 할 수 있습니다. 비드는 새로운 신경 돌기와 그 신경 돌기가 같은 초점 평면에 놓일 때까지 신경 돌기가 풍부한 영역에서 새로운 신경 돌기의 꼭대기로 내려 가게됩니다. 새로운 신경 돌기는 비드와 접시 사이에 있지 않지만 항상 세포 물질과 비드 사이에 있으므로 압축이 감소됩니다.새로운 신경 돌기가 구슬 근처에서 형성되는지 여부를 평가하기 위해 현미경에서 10 분 동안 관찰된다. 참고 문헌 16 에 기술 된 바와 같이, 팽윤의 존재는 신경 돌 변성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고 축색에 다양한 양의 압력을 가하면 생리 학적 변화가 생길 수 있기 때문에 향후 연구에서는 AFM 방법으로 반사체를 고정하고 시료 표면에 수직으로 변위를 모니터링하여 피펫 - 프로브를 적용하는 데 집중할 수있다. 마지막으로, 아마도이 프로토콜에 대한 가장 큰 도전은 조작 된 연결의 기능을 테스트하는 것입니다. 가장 직접적이고 신뢰할 수 있으며 잘 확립 된 기술은 쌍을 이루는 전체 셀 패치 클램프 녹음입니다. 그러나 정기적 인 쌍으로 된 패치 클램프 기록의 성공률은 매우 낮습니다 (<25 %). 전체 셀 패치 클램프에는 긴 셋업 시간, 제한된 실험 횟수 / 일, 제한된 레코딩 시간 (~ 30분), 쌍을 이루는 패치 클램프 기록에 대한 낮은 실험 수율 및 측정 후 세포 사멸. 이러한 기술적 과제로 인해 미세 조작 후 전체 세포 패치 클램프 쌍 녹음의 실험적 수율이 매우 낮습니다. 더 정밀한 자극과 기록 및 자연 및 미세 운동 연결에서의 신경 세포 활동을 비교하기 위해서는 더 나은 플랫폼과 기술이 필요합니다.
axonal 성장에 긴장의 중요성은 neuroanatomy의 초기부터 알려져왔다 - 패시브 스트레칭으로 20 참조 . 초기 배아 발달 동안 신경 돌기는 작은 거리를 통해 이동하여 목표물에 도달합니다. 대부분의 세포가 분열하고 복제하기 때문에, 축삭은 배아 성장 20 , 21 까지 길이를 조정하고 길이를 조정하는 연속적인 힘을 받게됩니다. 몇몇 그룹은 neu에 화학적 단서 및 / 또는 기계적 인장을가함으로써 신경 돌기 성장의 한계를 시험해 보려고 시도했다론 ( 검토를 위해 참조 22 참조). 이러한보고 23 , 24 , 25 , 26 뿐만 아니라 생리적 성장 동안, 신경 돌기는 기질에 붙어있는 동안 잡아 당겨진다. 우리의 설정과의 주요 차이점은 현재의 기술에서 새로운 신경 돌기는 두 개의 접착 접촉 만 갖는다는 것입니다. 기저부에서 신경 돌기가 뉴런에 부착되고 팁에서 신경 돌기가 구슬에 부착됩니다. 신장 과정 중에 새로운 신경 돌기의 구성 요소는 당기는 힘을 수용 할 수있는 가장 효율적인 방법으로 자유롭게 분산됩니다. 더 중요한 것은,이 프로토콜은 시냅스 접촉 8 의 형성에 대한 이전 연구와 마이크로와 나노 도구를 사용하는 방법을 보여주는 압력에 대한 축삭의 저항에 기초하여 신경 돌기 파열이나 변성을 일으키지 않고 이러한 실험을 재현하는 방법을 설명합니다적절한 힘으로 지속적으로 신경 돌을 잡아 당긴다. 여기에 설명 된 신경 돌기 속도 (1.2 mm / h)는 말초 신경계 (0.02-0.04 mm / h)에서 가장 빠르게 성장하는 축색 돌기의 생체 내 속도보다 30-60 배 빠릅니다. 시험 관내에서 동일한 연결 유형과 비교할 때, 여기에 기술 된 축삭 확장 률은 다른 발달 단계 (0.1 mm / h)의 초기 단계에서 다른 저자에 의해 기술 된 성장 속도보다 7.5 배 빠릅니다 4 . 뉴런의 다른 유형은 몇 배로 변화하는 다른 내재 속도에서 axons를 확장하는 것으로 발견되었습니다 29 . 또한, 중추 신경계 축삭 돌연변이 는 생체 내에서 29 , 3 배 배양 된 표적 신경 분포 후에 축삭 돌기의 높은 비율을 잃는다. 따라서 현재의 axonal 확장 기술은 th를 더 잘 이해하기 위해 다른 연결 유형으로 테스트해야합니다신경 돌기 연장의 한계.
피펫 micromanipulation 및 microfluidic 장치는 새로운 기능성 신경 돌을 생성하고 제어 할 수있게 연결 네트워크를 (재) 배치하는 기술입니다. 이 플랫폼은 체계적이고 표준화 된 측정에 이상적입니다. 그것은 뉴런의 복잡한 네트워크 에서 실험으로 재현성과 생체 내 제어를 도입합니다. 달성 된 확장 속도는 밀리미터 - 스케일 거리에서 20 μm / min보다 빠르며 기능적 연결이 확립됩니다. 이러한 결과는 예기치 않게, 세포 골격 성분을 포함한 신장에 대한 축삭의 내재적 능력이 이전에 생각했던 것보다 훨씬 빠르다는 것을 보여준다. 10 , 11 , 12 . 이 제안 된 기계적 접근법은 느린 화학 전략을 우회하므로 부상 후 신경 연결성을 복구하기위한 치료 개발을위한 패러다임 전환을 나타냅니다인공 신경망의 미세 신경 공학을위한 시험 관내 연구. 이 결과는 외상 후 또는 신경 퇴행성 질환에서 신경 회로를 재 연결하려는 치료법에 직접적인 영향을 미치는 재생 의학 및 신경 공학 접근법에도 큰 영향을 미칩니다. 이 플랫폼은 뉴런 통신, 신호 변조 및 성장 및 재생성에 대한 데이터를 얻는 문을 엽니 다. 이는 CNS를 기계적으로 재생하는 새로운 방법이며 유사한 기술을 사용하면 부상 후 기능을 복원 할 수 있습니다. 또한,이 기술은 마약 발굴 및 표적 검증을위한 새로운 생물 분석 플랫폼으로 체계적으로 설계된 신경 네트워크를 만드는 데 사용될 수 있습니다. 강력한 뇌 - 기계 인터페이스의 직접 배선에 대한 전조입니다.
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Disclosures
저자 인 Margaret H Magdesian은 본 기사에서 사용 된 도구를 생산하는 Ananda Devices의 CEO입니다.
Acknowledgments
많은 도움이되는 토론과 통찰력을 얻으려는 요요이 미야하라 (Yoichi Miyahara)에게 감사드립니다. MA와 PG는 NSERC로부터 자금 지원을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
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