Summary
Denne procedure beskriver, hvordan man hurtigt initierer, udvider og forbinder neuritter organiseret i mikrofluidiske kamre ved anvendelse af poly-D-lysin-coatede perler fastgjort til mikropipetter, som styrer neuritforlængelse.
Abstract
Hjerne- og rygmarvsskade kan føre til permanent invaliditet og død, fordi det stadig ikke er muligt at regenerere neuroner over lange afstande og nøjagtigt genoprette dem med et passende mål. Her beskrives en procedure for hurtigt at indlede, forlænge og tilslutte netop nye funktionelle neuronalkredsløb over lange afstande. De opnåede forlængelseshastigheder når over 1,2 mm / time, 30-60 gange hurtigere end in vivo- hastighederne for de hurtigst voksende axoner fra det perifere nervesystem (0,02 til 0,04 mm / t) 28 og 10 gange hurtigere end tidligere rapporteret for det samme Neuronaltype på et tidligere udviklingsstadium 4 . For det første dyrkes isolerede populationer af rottehippocampale neuroner i 2-3 uger i mikrofluidiske indretninger for præcist at positionere cellerne, hvilket muliggør nem mikromomanipulation og eksperimentel reproducerbarhed. Derefter anbringes perler overtrukket med poly-D-lysin (PDL) på neuritter for at danne klæbemiddelkontHandlinger og pipette mikromanipulation anvendes til at bevæge det resulterende perle-neurit-kompleks. Efterhånden som perlen er flyttet, trækker den ud en ny neurit, der kan udvides over hundredvis af mikrometer og funktionelt forbundet til en målcelle på mindre end 1 time. Denne proces muliggør eksperimentel reproducerbarhed og nem manipulation, mens man omgår langsommere kemiske strategier til at fremkalde neurit vækst. Preliminære målinger fremlagt her viser en neuronal vækst, der langt overstiger fysiologiske. Kombination af disse innovationer muliggør den nøjagtige etablering af neuronale netværk i kultur med en hidtil uset grad af kontrol. Det er en roman metode, der åbner døren for en overflod af information og indsigt i signaloverførsel og kommunikation inden for neuronalt netværk samt at være en legeplads for at undersøge grænserne for neuronal vækst. De potentielle anvendelser og eksperimenter er udbredt med direkte konsekvenser for terapier, der sigter mod at genoprette neuronaL kredsløb efter traumer eller i neurodegenerative sygdomme.
Introduction
Skader på det voksne centralnervesystem (CNS) kan føre til permanent invaliditet på grund af flere mekanismer, der begrænser axonal genvækst 1 . Efter skader danner mange CNS-axoner ikke en ny vækstkegle og undgår at montere et effektivt regenerativ respons 2 . Desuden hæmmer skader og arvæv omkring CNS læsioner signifikant axonal vækst 1 , 2 , 3 . Nuværende terapier til fremme af CNS-regenerering efter skade har fokuseret på at forøge det skadelige neurons intrinsiske vækstpotentiale og på maskering af inhibitorerne af axonal forlængelse forbundet med myelinrester og glialæren 1 , 3 . På trods heraf forbliver kapaciteten til at regenerere lange axoner til fjerne mål og til at danne passende funktionelle synapser fortsat alvorligt begrænset 4 , 5 , 6 , 7 .
I det nuværende arbejde anvendes mikrobeyler, pipette mikromanipulation og mikrofluidiske indretninger til hurtigt at initiere, forlænge og tilslutte netop nye funktionelle neuronalkredsløb over lange afstande. Tidligere arbejde har vist, at poly-D-lysin-coatede perler (PDL-perler) inducerer membranadhæsion efterfulgt af clustering af synaptiske vesikelkomplekser og dannelse af funktionelle presynaptiske bolte 8 . Det blev også vist, at når PDL-perlen mekanisk trækkes væk efter presynaptisk differentiering, følger den synaptiske proteinklynge perlen, idet en ny neurit 9 initieres. Den følgende fremgangsmåde udnytter denne kendsgerning sammen med evnen til at dyrke embryonale hippocampale neuroner af rotter i organiserede regioner på en dækslip ved anvendelse af polydimethylsiloxan (PDMS) mikrofluidiske indretninger til præcist at omdirigere en neuronalkredsløb.
Disse PDMS mikrofluidiske indretninger er ikke-toksiske, optisk transparente og består af to kamre forbundet med et system af mikrokanaler. Når de er monteret på en dæksel, tjener hver enhed som en form til at styre neuronal vækst og opretholde sunde neuronkulturer på præcise mønstre i længere end 4 uger in vitro .
Her præsenteres der en ramme for at undersøge grænserne for udvidelse og funktionalitet af den nye neurit. Nye, funktionelle neuritter skabes og positioneres til styrbart (re) wire neuronale netværk. De opnåede forlængelseshastigheder er hurtigere end 20 μm / min over millimeterskalaafstande, og funktionelle forbindelser etableres. Disse resultater viser uventet, at disse neurites indre kapacitet til forlængelse er meget hurtigere end tidligere antaget. Denne foreslåede mekaniske tilgang omgår langsomme kemiske strategier og muliggør styret forbindelse til et specifikt mål. thEr teknik åbner nye veje til in vitro- undersøgelsen af nye terapier for at genoprette neuronal forbindelse efter skade. Det muliggør også manipulation og omlægning af neuronale netværk til at undersøge grundlæggende aspekter af neuronal signalbehandling og neuronal funktion in vitro .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedurer, der er beskrevet nedenfor, blev godkendt af McGill University's Animal Care Committee og er i overensstemmelse med retningslinjerne fra det canadiske råd for dyrepleje.
1. Standardisering af neuronale kulturer ved anvendelse af mikrofluidiske enheder: Enhedssamling
- Vælg en passende mikrofluidisk enhed til det ønskede eksperiment. For at forbinde neuroner inden for samme population, brug Neuro Devices ( Figur 1 ) og til at forbinde neuroner i forskellige populationer bruge Co-Culture Devices ( Figur 6 ).
- Rengør og tilbered det ønskede antal sterile dækglas eller glasbundsskål. For de bedste resultater på plastoverfladerne brug 35 mm skåle, på glasbrug 25 mm dækslip eller 35 mm glasbund. Vælg glastykkelse baseret på billeddannelsessystemet, for eksempel 0,15 mm.
- Belæg opvasken eller dækslip med 0,5-1 ml 100 μg / ml PDL i 2 timer eller natten over ved stuetemperaturratur.
Bemærk: Protokollen kan pauses her og genoptages den følgende dag, hvis det ønskes. Desuden kan skåle belægges med boratbuffer-fortyndet PDL, Poly-L-Lysin (PLL), laminin eller et hvilket som helst andet celleadhæsionsmolekyle. - Vask opvasken to gange med vand (brug ikke fosfatbufret saltvand (PBS), da saltkrystaller kan blokere kanalerne), fjern al væske og lad den tørre i et sterilt miljø som f.eks. Et biosikkerhedsskabe i 5-10 minutter eller indtil Overfladen er helt tør.
Bemærk: Pas på at sikre, at dækslipene er helt tørre, da enhver resterende væske vil forstyrre vedhæftningen af de mikrofluidiske systemer. - Placer mikrofluidiske enheder med mønstre opad under UV-lys i et sterilt miljø (biosikkerhedskabinet) i 10 minutter. Sørg for at følge sterile procedurer, når du arbejder i biosikkerhedskabinet 10 .
- Ved hjælp af pincet placeres en mikrofluidisk enhed med mønster nedad i kontakt med de rene dækip / skål. Brug pinceterne til at trykke let på enheden, så den klæber til glasset.
Bemærk: Gennemsigtigheden i den klæbte region vil være synlig, når man ser mod lyset. Sørg for at alle hjørner er i kontakt med glasset. Gør dette til alle mikrofluidiske enheder. Se figur 1a . - For at fylde den enkelte befolkningsenhed med medium, pip pipetten mod kanalerne og tilsæt 50 μl komplet cellemedium suppleret med serumfri B-27 (volumenforhold 1:50) og 500 μg / ml penicillin / streptomycin / glutamin (kollektivt Kaldet NBM) til højre øvre brønd, og derefter tilsæt en anden 50 μL til brønden liggende diagonalt til den. Gør dette for alle enheder, og sørg for, at mediet strømmer mellem brønde. Derefter tilsættes 50 μL medium til de resterende 2 brønde. Se figur 2a .
- For at udfylde flere befolkningsenheder med medium, pip pipetten mod kanalerne og tilsæt 30 μLAf komplet NBM til højre brønde, se figur 6a . Gør dette for alle enheder, og sørg for, at mediet strømmer mellem brønde. Derefter tilsættes 50 μL medium til de resterende 4 brønde.
- Placer apparaterne i en større plade med en åben skål med autoklaveret vand (vådt kammer) og anbring kubuskulturen i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed) i 1-2 timer. Se figur 2b .
2. Plating Neurons i mikrofluidiske systemer
- Efter protokollen skitseret i Ref. 8 , opnå dissocierede hippocampale eller kortikale neuroner fra Sprague Dawley-rotteembryoer (enten køn).
- Resuspender embryonale neuroner i NBM ved en koncentration på 1-2 millioner neuroner / ml. Kontroller cellekoncentrationer i mikroskopet ved hjælp af et hæmocytometer og efterfølgende reference 8 . Juster cellekoncentrationen i overensstemmelseG til den ønskede celletæthed. For at øge chancerne for at opnå enkelte hippokampale axoner pr. Kanal, skal du pladen 10.000 neuroner pr. Enhed. For at have flere axoner i samme kanal, skal du pladen 60.000 neuroner pr. Enhed.
Bemærk: Disse tal varierer afhængigt af den anvendte neuronal type. - Fjern mediet fra de mikrofluidiske enheder uden at tømme brøndene. Forlad ca. 5 μL i hver.
- Til pladeceller i den enkelte befolkningsenhed skal der tilsættes 50 μL NBM til den nederste højre brønd. På dette tidspunkt strømmer mediet i sig selv for at fylde den anden nedre brønd. Tilsæt 20 μl koncentratcelleopløsningen i den øverste højre brønd af den mikrofluide anordning som angivet i figur 1b .
- Til pladeceller i den multiple befolkningsindretning tilsættes 20 μl koncentratcelleopløsningen i hver af de højre brønde i figur 6a .
- Tjek mikroskopet, hvis cellerneEr inde i kamrene og anbring enhederne i inkubatoren i 15-30 minutter for at fremme cellefastgørelse til substratet.
- Tjek mikroskopet, hvis der er nok celler i kamrene. Hvis flere er nødvendige, skal du gentage trin 2.4 og 2.5.
- Tilsæt 50 μL NBM til de to topbrønde i enkeltpopulationen og 20 μl NBM i samme brønd, som cellerne blev injiceret i multipelpopulationen. Mediet stikker lidt ud for at danne en positiv menisk, der giver brøndene et muffin top aspekt. Igen se figur 2a .
- Vedligehold cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 og 95% fugtighed.
3. Vedligeholdelse af neurokulturer
- Fjern NBM (ca. 30 μL med pipette) fra cellerne og anbring ny forvarmet NBM dagen efter introduktionen til enhederne (det vil sige 1 d efter trin 2).
- Tjek hver 2 dage, hvis der er nok medium i hver kanal. Hvis muffinen tOp er lav, tilføj kun mere medium til de øverste brønde.
- Kulturceller i mindst 7 d før fjernelse af de mikrofluidiske indretninger. Cellerne kan overleve i disse enheder i flere uger. Fjern enhederne 1-2 dage før eksperimenter udføres på prøver.
4. Fjernelse af mikrofluidiske enheder
- 1 - 2 d før fjernelse af mikrofluidiske indretninger, tilsæt 2 ml NBM forvarmet til 37 ° C til hver prøvekål, oversvømmelse af kamrene og vedligeholdelse af enhederne i inkubatoren.
- Brug sterile pincet og et tip til at fjerne de mikrofluidiske enheder fra dækglasene, der efterlader en mønstret konfiguration af neuroner. Brug spidsen til at holde dækslet på plads og pincettene for at låse kanten af enheden i nederste venstre hjørne af brønden. Påfør torsion delvist, hæv enheden op med pincetet, så det skrælmer af dækslet. Se figur 2c - 2d .
- Hver 2-3 dage udskiftes haHvis NBM anvendes, indtil prøven anvendes til forsøg.
- Før du udfører genskabelsesforsøg på prøven, skal du kontrollere, at neuritter i enkeltpopulationskanalerne og neuronpopulationerne i den multiple populationenhed isoleres ved at undersøge mellemrummene mellem dem i mikroskopet for at sikre, at der ikke er filamenter, der forbinder neuronpopulationer.
5. Forberedelse af PDL-belagte perler
- Tilsæt 2 x 50 μL dråber af enten 4, 10 eller 20 μm polystyrenkugler fortyndet i vand (1: 500) til 1 ml PDL (100 μg / ml). Lad i mindst 2 timer ved stuetemperatur.
Bemærk: Protokollen kan pauses her og genoptages den følgende dag. - Centrifug opløsningen ved 8.820 xg i 1 min. Fjern forsigtigt supernatanten uden at forstyrre perlerne akkumuleret i bunden af beholderen.
- Vask perlerne to gange med 1 ml steril 10 mM HEPES pH 8,4 opløsning.
- Resuspender de PDL-belagte perler i 200 ml 10 mM HEPES pH 8,4løsning.
6. Forberedelse af mikropipetter
- Klargør pipetter fra glaskapillarrør (1 mm indvendig diameter, 1,5 mm ydre diameter) ved hjælp af en vandret elektrodeudtræk. Juster indstillingerne, så den ydre spids af den trukkede mikropipette er ~ 2-5 μm. Før du trækker, skal du sørge for at glasrørene er rene.
- Fastgør pipetter til glasskinner til opbevaring, og sørg for, at spidsen ikke kommer i kontakt med glidens overflade, da spidsen er skrøbelig. Opbevares ved stuetemperatur i en overdækket beholder for at beskytte mod støv. Brug pipetter samme dag de trækkes.
7. PDL-perle adhæsion til neuroner
- Tilsæt 40-60 μL PDL-overtrukne perler fremstillet i trin 5 til en cellekultur fremstillet i trin 4. Centrér pipettespidsen over neuronerne, der er svagt synlige på dækpladen, og tilføj perlerne (se figur 3 ).
- Ret prøven til inkubatoren i 1 time for at fremme dannelsen af syNaptiske kontakter 8 , 9 .
- Efter inkuberingen fjernes eventuelle un-adhered perler ved forsigtigt at vaske kulturen med forvarmet NBM.
8. Forberedelse af fysiologisk saltopløsning (til rumtemperaturforsøg)
- Forbered fysiologisk saltopløsning ved at kombinere ingredienserne anført i referencerne 7 , 8 . Dette er at regulere cellemiljøet udenfor inkubatoren.
- Kontroller osmolaritet og pH-niveauer som angivet i referencerne 7 , 8 .
- Kontinuerligt infiltrer opløsning med O2 for at minimere pH-udsving under udførelse af forsøg.
- Varm til stuetemperatur.
- Opsæt perfusionssystemet ved at indsætte den ene ende af et plastrør (valgfri dimensioner) i O2-inficeret fysiologisk opløsning og fastsættelse af den anden eNd til en nål indsat i prøveholderen. Placer slangen og opløsningen højere end prøven (se figur 4 ).
- Afbryd røret fra nålen og tilslut det til en sprøjte. Brug sprøjten til at udøve tryk og træk væske, fylder røret. Tæt på en rulleklemme og tilslut nålen igen.
9. Bead Micromanipulation
- Installer prøve i en eksperimentel opsætning, så cellerne kan fås ovenfra af to mikropipetter monteret i mikromanipulatorer og fås optisk nedenfor, fx med 40X-fasens mål (numerisk apertur på 0,6) af et inverteret optisk mikroskop. I denne konfiguration skal du montere et CCD-kamera til billedoptagelse på mikroskopets sideport. Tilslut hver pipette til 1 ml sprøjter via plastrør. På dette trin erstattes NBM med fysiologisk saltopløsning (1-2 ml) (se figur 4 ).
- Under experiKontinuerlige perfusionsceller med den fysiologiske saltvandsløsning fremstillet i trin 8 med en hastighed på 0,5-1 ml / min.
- Vælg en PDL-perle, IKKE knyttet til en neuron i synsfeltet. Juster perlen med en mikropipettespids ved at fokusere på perlen og derefter op til mikropipetten. Tag tipet så tæt som muligt på perlen ved at overvåge det gennem mikroskopet.
- Påfør negativt tryk med 1 ml sprøjten forbundet til pipetten for at afhente perlen. Bevar negativt tryk gennem hele eksperimentet.
10. Træk Neurites
- Vælg en PDL-perle fastgjort til en neuron i synsfeltet og fastgør den til den anden mikropipette ved hjælp af sugning som beskrevet i trin 9.3-9.4.
- Træk PDL-perle-neuronkomplekset langsomt (~ 0,5 μm / min), der bevæger enten micromanipulatoren eller prøvefasen med 1 μm og pause i 5 min for at tillade neuritinitiering.
- Gentag trin 10.2 to gange.
Bemærk: Den første 3 &# 181; m skal trækkes meget langsomt for at garantere eksperimentel succes, hvilket forekommer over 95% af tiden. - Træk PDL-perle-neuronkomplekset langsomt (~ 0,5 μm / min), der bevæger enten micromanipulatoren eller prøvefasen med 2 μm og pause i 5 minutter for at tillade neuritlengning.
- Efter vellykket initiering og neurit forlængelse for de første 5 μm trækkes neuritten ved 20 μm / min over millimeter-skalaafstande.
Bemærk: Træk kan udføres kontinuerligt eller i trin og i varierende hastigheder. Se figur 5b -5c .
11. Tilslutning af neuroner
- Vælg en region rig på neuritter og sænk PDL-bead-neurit-komplekset, så det fysisk kontakter det. Brug andre perler til at måle spidshøjden over dækslipfladen. Se figur 5d .
- Lad PDL-perle-neurit-komplekset komme i kontakt med målneuritten, mens man manipulerer den anden mikropiPette. Sænk den anden pipette med den anden PDL-perle oven på den nydannede neurit omkring 20 μm fra den første vulst. Brug den anden PDL-perle til at skubbe den nye neuritfilament mod målcellen.
- Hold begge perler på plads i mindst 1 time. Kontroller fraværet af fokal hævelse, en fortykkelse af neuritterne, der kontakter perlen, med mikroskopet 16 .
- I løbet af denne tid skal du bruge perfusion til langsomt at ændre middelværdien af prøven fra fysiologisk saltopløsning til forvarmet, CO2-ækvilibreret NBM.
- Slip perlen fra den anden pipette ved at frigive sugningen. Hvis den nye neurit forbliver vedhæftet, frigør du også den første perle. Se figur 5e .
- Fjern forsigtigt saltopløsning og erstat med NBM (~ 2 ml).
- Placer prøven forsigtigt tilbage i inkubatoren for at styrke neuronal forbindelsen til fremtidige forsøg. Denne forbindelse er stabil i> 24 timer 7
12. Bekræft funktionaliteten af den nye forbindelse via hele celleparret patch-optagelser
- Følg referencerne 7 , 18 , 19 . At samle en elektrofysiologi opsætning.
- Følg henvisninger 7 . At forberede præ- og postsynaptiske elektroder.
- Saml patch clamp data, igen efter referencer 18 , 19 .
- Sammenlign resultaterne med naturligt forekommende signaler 7 for at bestemme forbindelsestypen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hippocampale neuroner af embryonale rotter dyrkes i mikrofluidiske indretninger for at muliggøre præcis positionering af celler, PDL-perler og mikromanipulatorer. Det første skridt er at samle den mikrofluidiske enhed korrekt på en glasdæksel eller skål. Det er vigtigt, at den mikrofluidiske enhed er godt fastgjort til substratet for at undgå, at celler forlader kamrene og bevæger sig under de dele af enheden, som skal forsegles ( figur 1a ). For at opretholde sunde kulturer i flere uger er det vigtigt at forhindre mediuminddampning ved at kontrollere cellemediet hver 2-3 dage og bevare en positiv menisk medie ( figur 2a ). Medium fordampning undgås også ved at holde både cellerne og en åben skål med vand inde i en større plade ( figur 2b ). De mikrofluidiske indretninger kan fjernes til enhver tid. For optimale resultater bør NBM tilføjes til cell-deStyresystem mindst 1 d før fjernelse af enheden. Dette minimerer cellulær stress, da neuronerne er i kontakt med medium ved ideel temperatur og pH, når enhederne fjernes. Når de mikrofluidiske indretninger langsomt afskales fra skålen ( figur 2c Og 2d ) celler forbliver i den mønstrede position ( figur 3 og figur 5a ).
Der anvendes to typer mikrofluidiske enheder: Neuro Device og Co-Culture Device. Den første gør det let at identificere axoner, dendritter og cellekroppe. Soma forbliver i topkammeret, mens axoner og dendritter vokser langs de mikrofluidiske kanaler ( figur 5a ) mod aksonalkammeret.
Det anbefales, at PDL-perler tilsættes til celler i et forhold på 10: 1 og at de fleste perler, der harVe ikke overholdt kulturen fjernes ved at vaske cellerne en gang med NBM efter 1 timers inkubation ( figur 3 ). Efter PDL-perleadhæsion til neuritter trækkes PDL-perle-neurit-komplekset og kan udvides over store afstande. Den nydannede neurit kan være netop forbundet med neuritter eller soma millimeter væk ( figur 5b -5e ). Succesraten for at trække en ny neurit for de første 3 μm ved hastigheder lavere end 1 μm / min er> 95% (n = 206). Succesraten for at forbinde den nye neurit til en anden celle er 70% (n = 30). Forbindelsen er meget skrøbelig i de første 18 timer, hovedsageligt fordi den nye neurit er en filament med mindre end 1 μm i diameter forankret af en 10 μm PDL-perle. Hvis skålen bevæges hurtigt under de første minutter af kontakt, kan den resulterende turbulens af mediet forårsage, at perlen ruller og følgelig adhæsionen taber. Men hvis prøven ikke er shaKen, i 30 minutter fastgøres perlen til neuritterne på fadet, og den nye forbindelse forbliver i mindst 48 timer. Se figur 4 for en skematisk af opsætningen.
PDL-perlepositionen på kulturen kan også anvendes til nemt at identificere placeringen af den tilsluttede neurit ( fig. 6d-6e ). Efter initiering er udvidelse og tilslutning af en ny neurit, en anden, ikke-adhærerende PDL-perle, optaget via micromanipulatoren, brugt til at skabe et andet adhæsionssted mellem den initierede neurit og den anden neuronale population. Den anden PDL-perle er placeret oven på den nye neurit, komprimerer den sådan, at den nye neurit kun kontakter den anden neuronale befolkning 11 . Dette vil fremme vedhæftning med den anden neuronale population ( figur 5f ).
Den flere befolkningsenhed enabLes væksten af 4 isolerede neuronpopulationer på samme skål. Hver neuronal population er begrænset til et 4 x 7 mm rektangel adskilt fra andre neuronpopulationer med 100 eller 200 μm huller ( figur 6a ). Friske neuroner kan vokse i enhederne i flere uger. Normalt forbliver neuronpopulationerne isoleret i op til 48 timer efter fjernelse af anordningen. Efter denne 48 timers periode har neuroner en tendens til at vokse hen imod nabostaterne og danner naturlige forbindelser. Før man forbinder to isolerede populationer, bør det verificeres, at befolkningerne faktisk er isoleret, ved at undersøge hele spaltet med mikroskopet for at fastslå, at der ikke er nogen forbindelse mellem de to neuronpopulationer ( figur 6b ).
Efter tilslutning blev prøver inkuberet i 24 timer, og elektriske hele celleparret patch clamp-optagelser blev udført for at undersøge, om den nyligeDannet neurit, der bruges til at forbinde to isolerede neuronpopulationer, var funktionel og i stand til at transmittere elektriske signaler. En neuron i populationen 1, der var lokaliseret mindre end 100 μm radius fra stedet, hvor den inducerede neurit blev initieret, blev valgt til registrering af presynaptiske virkningspotentialer (PAP'er). Denne neuron blev betragtet som den præsynaptiske celle. Postsynaptisk excitatorisk eller hæmmende aktivitet blev registreret fra en neuron i population to på den anden side af spaltet, der ligger i mindre end 100 μm radius af den mikromanipulerede forbindelse ( figur 7a- 7c ). Optagelser afledt af de mekanisk inducerede forbindelser blev analyseret og sammenlignet med dem fra naturligt forbundne neuronpopulationer og ikke-forbundne populationer ( Figur 7 ). De elektriske reaktioner efter PAP optaget fra neuroner forbundet naturligt og ved mikromanipulation er signifikant højere og temporært korrelere med presynaptiskAktivitet ( figur 7 ).
Figur 1: Standardisering af neuronale kulturer ved anvendelse af mikrofluidiske enheder 7 . ( A ) Enhedssamling: Når de mikrofluidiske indretninger er korrekt monteret på en tør overflade, er alle kamre synlige. ( B ) Cellplating: Plad cellerne øverst til højre og cellerne skal bevæge sig mod venstre brønd. ( C ) Celltæthed: Straks efter plating skal du kontrollere mikroskopet, hvis koncentrationen af celler er tilstrækkelig. ( D ) Efter 1 d i dyrkning er hippocampale neuroner godt klæbet tæt på mikrokanalerne og begynder at danne neuritter. Klik her for at se en stor Er version af denne figur.
Figur 2 : Vedligeholdelse af sunde neuronkulturer i flere uger 7 . ( A ) Tilføj medium hver 2-3 d og hold en positiv menisk i de øvre brønde i mikrofluidkamrene, så cellerne vil have en konstant tilførsel af næringsstoffer. ( B ) Hold celler inde i en større plade med en skål, der indeholder vand for at reducere medium fordampning. ( C ) Brug sterilt spids og pincet til ( d ) let afskal microdevices. Klik her for at se en større version af denne figur.
P_upload / 55697 / 55697fig3.jpg "/>
Figur 3 : Placering af pipette Deponering af perler i kulturer. Når den mikrofluidiske enhed er blevet fjernet, er neuroner synlige på dækslet. Når du sætter perler på plads, skal du placere pipettespidsen så den er i midten af cellerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Skematisk af en typisk Neurite-pulling-opsætning. Prøven hviler på et (piezoaktiveret) trin og kan nås ovenfra med 2 mikropipetter indeholdt i mikromekanipulatorer og forbundet til 1 ml sprøjter via plastrør. Prøven fås optisk nedenunder af et objektiv, der er forbundet med et CCD-kamera, der senderS billeder til en CPU. Et indløbsrør føder oxygeneret fysiologisk saltvandsløsning til prøven, som ligger under den, og et udløbsrør forbundet til en sprøjte muliggør tilbagetrækning af opløsningen i tilfælde af overløb. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5 : PDL-perleadhæsion til neuroner og pipette-mikromanipulation 7 . ( A ) Neuroner forbliver organiseret i mønstre efter fjernelse af mikrofluidiske kamre, der muliggør nem identifikation af soma og neuritter. ( B ) Micromanipulation af PDL-perler klæbet til neuritter muliggør neuritinitiering, forlængelse ( c ) og forbindelse ( d ),Efterfulgt af frigivelse af PDL-perlen fra pipetten ( e ). ( F ) Efter at have kontaktet to isolerede neuronpopulationer (nederste pil) anvendes en anden PDL-perle og pipette mikromanipulator (øverste pil) til at etablere et andet adhæsionspunkt, nogle få hundrede mikrometer fra hinanden udgør det første kontaktpunkt og garantere funktionel forbindelser. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6 . Initiering, forlængelse og tilslutning af nye neurorer til at forbinde to isolerede populationer ved brug af flere befolkningsenheder og mikromanipulation 7 . ( A ) Apparatet isolerer 4 neuronpopulationerMellem 3 huller på 100 eller 200 μm hver. ( B ) Efter fjernelse af anordningen, vælg et hul og bekræft, at ingen neuritter forbinder de 2 individuelle populationer. ( C ) Skematisk af den eksperimentelle opstilling som skal være synlig i det optiske mikroskop, angiver placeringen af to mikropipetter og tilstedeværelsen af PDL-belagte perler. ( D ) Ved at påføre et negativt tryk på en pipette trækkes en PDL-perle, der klæber til en neuronal population, med pipettespidsen og derved initierer en ny neurit. Ved at opretholde det negative tryk i pipetten kan PDL-bead-neurit-komplekset (grønt) trækkes, forlænger neuritten. ( E ) Pipette mikromanipulation styrer forlængelse af den nye neurit over gapet og dannelsen af en forbindelse med en ny neuronal population. For at sikre adhæsionen af den nye neurit til den anden befolkning, er en PDL-perle (rød) placeret med en anden pipette oven på både textende neurit og neuroNal population. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Den nyligt inducerede, forlængede og forbundne neurur kan overføre information mellem to isolerede neuronale populationer 7 . Isolerede neuronpopulationer blev dyrket adskilt af et 100 μm hul i PDMS mikrodevice. Paired patch clamp optagelser blev udført i hele celle konfiguration fra en neuron i population en og en neuron i population to (på den anden side af gapet), da de to populationer var forbundet via mekanisk manipulation ( a ), loves at naturligvis forbinde på tværs af Mellemrum ( b ) eller forbliver ikke forbundet med maintAining mellemrummet ( c ). Repræsentative spor af parrede optagelser vises for hver tilstand ( df ). Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af standard mikromanipulation og innovative mikrofluidiske indretninger blev der udviklet en ny teknik til hurtigt at indlede, forlænge og netop forbinde nye funktionelle neuronalkredsløb over store afstande. Pipette mikromanipulation er et fælles redskab i de fleste neurovidenskab labs 4 , 13 . Den reelle udfordring for at opnå reproducerbare og pålidelige resultater var standardisering af sunde, nøjagtigt positionerede neuronkulturer i eksperimentets varighed (som kan være i størrelsesordenen af uger) ved udvikling af mikrofluidiske indretninger til at organisere cellekulturer med mikrometerpræcision. Højkvalitetscellekulturer er hjørnestenen i data validering. Dette bidrager til lettere og hurtigere mikroskopi billeddannelse og standardisering af kulturer og resultater. De mikrofluidiske indretninger blev designet til at dyrke celler in vitro med lignende organisation som in vivo . Enkeltbefolkningsenheden muliggørVæksten af lange neuritter og nem identifikation af axoner, neuritter og soma. Antallet af celler udpladet i de mikrofluidiske kamre bestemmer neuronal tætheden. Ved at pletter færre celler pr. Enhed er det derfor let at identificere enkelte neuroner tæt på kanalerne. Axon og multiple dendritter af en enkelt neuron vokser inde i en kanal. Dendritter vokser mindst 5 gange langsommere end axoner 6 , 17 og efter 2-3 uger in vitro er deres vækst i kanalerne normalt begrænset til 200 μm, mens hurtigt voksende axoner kan nå ud over 2 mm 17 . Derfor er det relativt let at estimere, om perlerne i det væsentlige klæber til axoner eller til axoner og dendritter ( Figur 5b - 5f ) efter at have tilføjet PDL-perler til prøverne. Der er større chancer for at trække nye axoner og dendritter, når man trækker PDL-perlerne fastgjort til neuritter kortere end 200 μm, whIle er der større sandsynlighed for at trække kun nye axoner, når man trækker PDL-perler fastgjort til neuritter længere end 500 μm. Multiplikationsindretningen er nyttig til reproducerbar vækst af sunde adskilte populationer i flere uger. Dette system af kanaler er nyttigt til at studere op til 4 forskellige celletyper eller sammenligne de samme celler med forskellige behandlinger.
Desuden er et kontrolleret og reproducerbart cellekulturmiljø et ideelt grundlag for celleanalyse og manipulation. Præcis positionering af celler på en skål letter identifikation af områder af interesse såvel som orientering og navigation gennem disse områder af interesse, hvilket i sidste ende giver mulighed for hidtil uset kontrol over neurite-initiationsstedet. En styret cellefordeling gør det lettere at visualisere den nydannede forbindelse og meget hurtigere for at finde den nye forbindelse med mikroskopet i dagene efter inkubation. Derudover kan reproducerbare konfigurationer af cellerMuliggør nem og præcis placering af kemiske signaler, såsom PDL-belagte perler, på soma, dendritter eller axoner 8 . Samlet set er billeddannelse og analyse af celler dyrket i mikrofluidiske enheder hurtigere på grund af standard cellulær organisation gengivet i alle retter. Desuden er indretningerne fremstillet af biokompatibelt, gennemsigtigt og aftageligt materiale, der muliggør afbildning ved alle synlige bølgelængder og celleoverlevelse inden for enhederne i adskillige uger. Miniaturisering af cellulære analyser hjælper også med at samle flere data med færre celler. Lavvolumenforbruget af de mikrofluidiske indretninger reducerer antallet af celler, der kræves pr. Eksperiment og øger forsøgsvirkningen. For eksempel kan i stedet for at bruge flere timer på at søge med et mikroskop til måske 1 eller 2 isolerede axoner i en skål, kan den enkelte befolkningsenhed bruges til øjeblikkeligt at få adgang til over 100 isolerede axoner pr. Celleprøve. De mikrofluidiske enheder tilbyder en miniatureret pålidelig og kontrolleretCellekultur miljø favoriserer analysen af sjældne prøver med tiden til at udføre flere tests.
Potentielle variationer af teknikken involverer direkte tilknytning af perlen til mikropipetten. I den nuværende protokol er der beskrevet en metode til fastgørelse af perlen til spidsen via sugning, men perlen kan også limes til spidsen. Lim er den bedre mulighed, hvis en stærk stabil forbindelse mellem spidsen og perlen er ønskelig, for eksempel hvis der udføres kraftmålinger ved hjælp af pipetten som en sensor eller hvis undersøgelse af vedhæftning mellem PDL og neuritten er det primære eksperimentelle mål. I en anden vene er sugning fordelagtig, da det tillader frigivelsen af perlen efter placering uden at adskille neurit-perlekomplekset, således at flere forbindelser kan laves parallelt. Sugning tilvejebringer midler til omdrejningsforsøg med høj gennemstrømning, en forbedring i forhold til andre manipulationsteknikker såsom atomkraftmikroskopi (AFM) 7 </ Sup> , 16 . Begge modifikationer af denne metode tillader, at neuritinitiationsstedet vælges ved simpelthen at opretholde en perle i kontakt med en dendrit, så synapser dannes. Strategien med inkubering af flere perler som beskrevet i trin 7 sparer imidlertid tid på manipulationsfasen og anbefales, hvis præcis kontrol over initieringsstedet er unødvendigt i eksperimentet.
Fremtidig forskning kan forsøge at tackle forskellige instrumentelle begrænsninger, nemlig temperaturstyring og prøveadgang. Mekaniske egenskaber af den cellulære membran kan variere betydeligt ved forskellige temperaturer 27 . Ideelt set bør alle forsøg udføres ved 37 ° C i neuronmedium og tilstrækkelige betingelser (korrekte CO 2 -tryk og fugtighedskontrol). Det var imidlertid ikke muligt at anvende en lukkede celler inkubator, fordi adgang til prøverne fra toppen er påkrævet for micromanipulatorerne, fraBunden til mikroskopet og fra siden for at flytte scenen. Derfor blev perfusion ved stuetemperatur anvendt. På samme måde, da opsætningen kun har plads nok til at rumme 2 mikromanipulatorer, og det tager næsten 1 time at oprette en enkelt forbindelse, er der en grænse for antallet af eksperimenter, man kan udføre. Dette problem kan løses med en manipulator, der trækker mere end en perle ad gangen. En anden potentiel forbedring af denne protokol er evnen til at registrere højden af perle-pipette komplekset fra prøveoverfladen. Manglende evne til at gøre dette kan føre til upræcisioner, når vi bringer ned den anden perle og placerer den på den inducerede neurit for at rette den. Perlen sænkes oven på den nye neurit i en neuritrig region, indtil den nye neurit og de på skålen ligger i samme brændpunktsplan. Den nye neurit er aldrig mellem perlen og skålen, men altid mellem en pude af cellemateriale og perlen, derfor er kompressionen reduceret.Den nye neurit observeres i 10 minutter i mikroskopet for at vurdere, om neurit-fokale hævelser dannes nær perle. Som beskrevet i reference 16 indikerer tilstedeværelsen af hævelser neurit degenerering. Ikke desto mindre kan anvendelsen af varierende mængder tryk på axoner føre til fysiologiske forandringer 16 , idet fremtidige undersøgelser kunne fokusere på at tilpasse pipetteproberne ved at fastgøre reflektorer til dem og overvåge forskydning vinkelret på prøveoverfladen med AFM-metoder. Endelig er den største udfordring for denne protokol måske at teste funktionaliteten af den manipulerede forbindelse. Den mest direkte, pålidelige og veletablerede teknik er parret i hele celle patch clamp-optagelser. Succesfrekvensen for den regelmæssige indspilning af paraplyklemmer er imidlertid meget lav (<25%) 18 . Hele-celle patch klemme har flere ulemper, herunder lang opsætningstid, begrænset antal eksperimenter / dag, begrænset optagetid (~ 30Min), lavt eksperimentelt udbytte for parret patch clamp optagelser og celledød efter målinger. På grund af disse tekniske udfordringer er det eksperimentelle udbytte af hele celle patch clamp parret optagelser efter mikromanipulation meget lav. Bedre platforme og teknikker er nødvendige for mere præcist at stimulere, registrere og sammenligne neuronaktivitet i naturlige og mikromanipulerede forbindelser.
Betydningen af spændinger i axonal vækst har været kendt siden de tidlige dage af neuroanatomi - der henvises til det som passiv strækning 20 . Under tidlig embryonal udvikling migrerer neuritter gennem små afstande for at nå deres mål. Da de fleste celler opdeles og duplikeres, bliver axoner udsat for kontinuerlige kræfter for at forlænge og justere deres længde til embryonal vækst 20 , 21 . Flere grupper har forsøgt at teste grænserne for neuritvækst ved at anvende kemiske signaler og / eller mekaniske spændinger til neuRons (for anmeldelse se referencenummer 22 ). I disse rapporter 23 , 24 , 25 , 26 såvel som under fysiologisk vækst trækkes neuritterne, mens de er bundet til et substrat. Den væsentligste forskel for vores opsætning er, at i den foreliggende teknik har de nye neuritter kun to vedhæftningskontakter; Ved basen er neuritten bundet til neuronen, og ved tippet er neuritten fastgjort til perlen. Under forlængelsen har komponenterne i den nye neurit friheden til at sprede sig på den mest effektive måde for at imødekomme trækkræfterne. Endnu vigtigere beskriver denne protokol, hvordan man reproducerer disse forsøg uden at forårsage neuritbrud eller degeneration baseret på tidligere undersøgelser af dannelsen af synaptiske kontakter 8 og på resistens af axoner til tryk 16, der viser, hvordan man bruger mikro- og nanotoler til atTræk neuritterne løbende med den rette kraft. De neuritilførselshastigheder, der er beskrevet her (1,2 mm / h), er 30-60 gange hurtigere end in vivo- hastighederne for de hurtigst voksende axoner fra det perifere nervesystem (0,02 til 0,04 mm / h) 28 . Sammenlignet med den samme neuronale type in vitro er de her beskrevne axonale forlængelseshastigheder 7,5 gange hurtigere end vækstraterne beskrevet af andre forfattere ved et tidligere udviklingsstadium (0,1 mm / h) 4 . Forskellige typer af neuroner har vist sig at udvide axoner ved forskellige iboende satser, der varierer med flere gange 29 . Desuden taber axonsystemer i centralnervesystemet normalt den høje hastighed af aksonal vækst efter målinventering in vivo 29 og 3 d af kulturen in vitro 6 . Derfor bør den nuværende aksonal forlængelsesteknik testes med forskellige neurontyper for bedre at forstå thE grænser for neurit forlængelse.
Pipette mikromanipulation og mikrofluidiske indretninger er teknikker demonstreret for at skabe nye funktionelle neuritter og styrbart positionere eller (re) wire neuronale netværk. Denne platform er ideel til systematiske, standardiserede målinger. Det introducerer reproducerbarhed og in vivo kontrol i forsøg på komplekse netværk af neuroner. De opnåede forlængelseshastigheder er hurtigere end 20 μm / min over millimeterskalaafstande, og funktionelle forbindelser etableres. Disse resultater viser uventet, at den indre kapacitet af aksoner til forlængelse, herunder deres cytoskeletalkomponenter, er meget hurtigere end tidligere antaget 10 , 11 , 12 . Denne foreslåede mekaniske tilgang omgår langsomme kemiske strategier og repræsenterer således et paradigmeskift for terapeutiske udviklinger for at genoprette neuronal forbindelse efter skadeOg til mikro-neuroengineering af kunstige neurale netværk til deres kontrollerede undersøgelse in vitro . Disse resultater har også stor indflydelse på regenerativ medicin og neurotekniske tilgange med direkte implikation for terapier, der sigter mod at genoprette neuronalkredsløb efter traumer eller i neurodegenerative sygdomme. Denne platform åbner døren for at indhente data om neuronkommunikation, signalmodulation samt vækst og regenerering. Det er en ny måde at mekanisk regenerere CNS på, og lignende teknikker kan muliggøre genoprettelse af funktion efter skade. Desuden kan denne teknik bruges til at skabe systematisk udviklede neuronale netværk som nye bioassay platforme til narkotika opdagelse og mål validering. Det er en forløber for de direkte ledninger af robuste hjernemaskins grænseflader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatteren Margaret H Magdesian er administrerende direktør for Ananda Devices, der producerer instrumenter anvendt i denne artikel.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Yoichi Miyahara for mange nyttige diskussioner og indsigter. MA og PG anerkender finansiering fra NSERC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Co-culture devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| Neuro devices | Ananda Devices | Commercially available at http://www.anandadevices.com | |
| No. 1 Glass Coverslip 25 mm Round | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 mm Glass Bottom Dishes #0, Uncoated, Gamma-Irradiated | MatTex Incorporation | P35G-0-20-C | |
| 35 mm cell culture dish, Non-Pyrogenic, Sterile | Corning Inc | 430165 | |
| 95 mm x 15 mm Petri Dish, Slippable Lid, Sterile Polystyrene | Fisherbrand | FB0875714G | |
| 50 mL Centrifuge tubes with printed graduations and flat caps | VWR | 89039-656 | |
| 15 mL Polypropylene Conical Tube, 17 x 120 mm style, Non Pyrogenic, Sterile | Falcon | 352097 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | Extracellular solution |
| B-27 Supplement (50X), serum free | B-27 Supplement (50X), serum free | 17504044 | Extracellular solution |
| Pennicilin, Streptomyocin, Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 11995-065 | Extracellular solution |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μL Pipettors | Aerosol Resistant Tips | 2149P | |
| BD Falcon 3mL Transfer Pipettes [Non-sterile] | BD Falcon | 357524 | |
| Glucose | Gibco | 15023-021 | Extracellular solution |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | Extracellular solution/Beads |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | Extracellular solution |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | Extracellular solution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | Extracellular solution |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | Extracellular solution |
| #5 Dumont Dumostar Tweezers 11 cm | World Precision Instruments | 500233 | |
| Dissection tools | Braun, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| Micro particles based on polystyrene, 10 μm | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| Borosilicate tubes | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| Horizontal Pipette Puller | Sutter Instruments | Brown-Flaming P-97 | |
| Micromanipulators, PCS-5000 Series | SD Instruments | MC7600R | |
| 1 mL Syringe | BD Luer-Lok | 309628 | |
| Inverted Microscope | Olympus | IX71 | |
| Objective | Olympus | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD Camera | Photometrics | Cascade II: 512 | |
| Leibovitz's (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), Phenol red | Life Technologies | 25300054 | Rat Dissection |
| DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4.5 g/L D-Glucose, + L-Glutamine, + 110 mg/L Sodium Pyruvate] | Life Technologies | 11995-065 | Rat Dissection |
| HBSS (1x) Hank's Balanced Salt Solution [- Calcium Chloride, - Magnesium Chloride, - Magnesium Sulfate] | Life Technologies | 14170-112 | Rat Dissection |
References
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
- Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
- Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
- Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
- Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
- Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
- Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
- Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
- General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
- Strober, W.
- Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
- Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
- Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
- Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925 (2010).
- Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
- Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358 (2015).
- Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
- Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
- Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
- Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
- Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
- Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
- Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E.
- Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
- Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
- Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
- Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).
