Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55698
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension, Mayo Clinic College of Medicine

Summary

תחבורה יון הסלולר לעתים קרובות יכול להיות מוערך על ידי ניטור pH תאיים (pHאני). גנטית Encoded pH-אינדיקטורים (GEpHIs) לספק אופטי כימות תאיים pH בתאים ללא פגע. פרוטוקול זה פרטים כימות של החומציות תאיים באמצעות הסלולר שמחוץ לחיות-הדמיה של בקוריאנית Malpighian של דרוזופילה melanogaster עם pHerry, פסאודו-רציומטרי גנטית מקודד ה-pH-מחוון.

Abstract

יון אפיתל תחבורה חיוני יון מערכתית הומאוסטזיס, כמו גם התחזוקה של מעברי צבע אלקטרוכימי הסלולר חיוני. החומציות תאיים (pHאני) מושפע על ידי מובילי יון רבים, ובכך ניטור pHאני כלי שימושי עבור הערכת פעילות המשלח. מודרני גנטית מקודד ה-pH-אינדיקטורים (GEpHIs) לספק כימות אופטי של pHאני בתאים שלמים בסולם סלולרית ו- subcellular. פרוטוקול זה מתאר כימות בזמן אמת של pH הסלולראני תקנה ב Malpighian בקוריאנית (MTs) של דרוזופילה melanogaster דרך שמחוץ לחיות הדמיה של pHerry, GEpHI פסאודו-רציומטרי עם pK מתאים היטב כדי לעקוב אחר שינויים pH ציטוזול. לעוף למבוגרים שחולצו MTs מורכבים חלקים נפרדים מורפולוגית והן מבחינה תפקודית של שכבה חד-תא epithelia, ו יכול לשמש מודל נגיש, צייתן גנטית לחקירה התחבורה אפיתל. GEpHIs מציעים כמה יתרונות על פני צבעי פלורסנט קונבנציונלי רגיש pH ואלקטרודות יון סלקטיבי. GEpHIs יכול תווית אוכלוסיות תאים נפרדים בתנאי מקדם המתאים רכיבים זמינים. תיוג זה שימושי במיוחד ב- ex-vivo ויוו, בחיי עיר ההכנות, אשר מטבעו הטרוגנית. GEpHIs גם היתר כימות של pHi ברקמות תקין לאורך זמן ללא צורך לצבוע חוזרות טיפול או רקמות הוצאתו. החיסרון העיקרי של GEpHIs הנוכחי הוא נטייה לצבור ב תכלילים cytosolic בתגובה נזק לרקמות ולבנות ביטוי יתר. חסרונות אלה הפתרונות שלהם, את היתרונות של GEpHIs הם הפגינו את פרוטוקול זה דרך הערכת התחבורה פרוטון (H.+) basolateral בתאי stellate ועקרוני נפרדים פונקציונלית של זבוב שחולצו MTs. טכניקות וניתוח תיאר בקלות להתאמה למגוון רחב של חוליות, הגעה ההכנות, ניתן לשנות את התחכום של וזמינותו של מעבדות להגדרה הסבוך של יון השטף דרך שנאים ספציפי.

Introduction

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את כימות של החומציות תאיים (pHi) שימוש בקידוד גנטית pH-מחוון (GEpHI), להדגים כיצד ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להעריך basolateral H+ תחבורה חרק מודל (נפטר ב- melanogaster) מבנה הכליות, צנורית Malpighian (MT). MTs לשמש הריקון של זבוב הפירות, דומים מבחינה תפקודית נפרון בתרבית של כבוד מפתח מספר1. MTs מסודרים 2 זוגות של בקוריאנית (anterior ואת אחורי) בית החזה, הבטן של הזבוב. הצינור אפיתל בתא יחיד של כל הר מורכב סמויה הפעיל העיקרי תאים עם ברורים הפסגה (luminal), basolateral (hemocoel) קוטביות, כמו גם תאי stellate intercalated. MTs הקדמי מורכבות 3 מורפולוגית, פונקציונלי, ומורחבים מקטעים נפרדים נכה, ובייחוד הראשונית קטע, קטע המעבר ואת הפרשה קטע הראשי, אשר מצטרף שופכן2 את המשקל הסלולר תחבורה טרנס-אפיתל יון לתוך לומן מושגת על ידי של קרום פלזמה הפסגה V-ATPase3 ו מחליף אלקלי-מתכת/H+ , כמו גם של basolateral Na+-K+-ATPase4, K פנימה-יישור+ ערוצי5, Na+-מונע Cl−/HCO3− מחליף (NDAE1)6ו- Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, ואילו תאי stellate לתווך Cl– ולהעביר מים8,9. מערכת הפיזיולוגיות זו מורכבת אך נגיש מספקת הזדמנויות מצוינות עבור חקירת מנגנוני הובלה יון אנדוגני בשילוב עם toolsets גנטיות והתנהגותיות מגוונות של דרוזופילה.

הרציונל עבור פרוטוקול זה היה לתאר מערכת גנטית חמרן ללמוד יון אפיתל תחבורה עם פוטנציאל לשילוב מתא כדי התנהגות וייצוא של כלים למערכות אחרות מודל. הביטוי של pHerry10GEpHI נגזר מן שילוב של ירוק מישור המילקה סופר רגיש pH pHluorin11,12 (ע) ו אדום mCherry pH-רגישות13, ב- MTs מאפשרת כימות של תחבורה H+ תאים בודדים MT דרך גבוהה K+/nigericin כיול טכניקה14. מובילי יון רבים עובר H+ מקבילות, כימות של החומציות תאייםאני משמש ייצוג פונקציונלי של יון תנועה באמצעות מגוון רחב של שנאים. מערכת מודל דרוזופילה MT מציע גם כלים רבי-עוצמה גנטי רקמות ספציפיות transgene15 ו RNA הפרעה (RNAi)16 הביטוי, אשר יכול להיות משולב עם הדמיה הסלולר ואת מבחני כולו אורגן17 , 18 , 19 של פונקציה צנורית כדי ליצור ערכת כלים חזקים עם אינטגרציה אנכית ממולקולות להתנהגות. זה סתירותיה מציבה ניגוד לחיים פרוטוקולים רבים אחרים עבור הערכת ביולוגיה אפיתל, כמו מדידות היסטורית כאלה צריכים לסמוך על מורכבות, מרתיעה אלקטרודות יון סלקטיבי ניתוח מיקרו, מתוחכם20,21, רגיש pH יקר צבענים22 עם דרישות הטעינה מגבילות וספציפיות הסלולר המסכן ברקמות הטרוגנית. GEpHIs היו בשימוש נרחב למדידת pHאני במגוון סוגי תאים23. בתחילת העבודה מנוצלת הגלום pH-הרגישות של ירוק ניאון חלבון (GFP) כדי לפקח על pHאני בתרבית תאים אפיתל24 , אבל בשני העשורים לראות GEpHIs משמש נוירונים25, עכשיו, דונלד26, פטריות27 , צמח תאי28. השילוב של הפוטנציאל של פילוח הסלולר של מבנים גנטיים באמצעות המערכת את הביטוי GAL4/UAS15 הנגישות הפיזיולוגיות של דרוזופילה MT שזה הכנה אידיאלית של חקירות של pHאני תקנה ותעבורה יון אפיתל.

pHאני תקנה נחקר במשך עשרות שנים, והוא חיוני לחיים. הכנת MT מציע מודל חזקים כדי ללמד את הפיזיולוגיה של pHאני רגולציה, אבל גם לבצע מתוחכם חקירות של pHi לתקנה ex-vivo ו vivo בתוך. פרוטוקול זה מתאר כימות של H+ תנועה על פני קרום basolateral של תאי אפיתל של דרוזופילה MT באמצעות ה NH4Cl הדופק חומצה טעינה טכניקה21, אבל כמו מחוון ה-pH היא גנטית מקודד, שיטות אלה ומסגרת תיאורטית שלהם ניתן ליישם כל הכנה נוטה transgenesis, הדמיה לחיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השלבים פרוטוקול זה לעמוד בהנחיות שימוש בבעלי חיים מאיו קליניק (רוצ'סטר, MN).

1. גידול לעוף

  1. העלאה זבובים, ערכת צלבים על פי בעלי תקן29.
    הערה: הביטוי פלורסנט כתב על ידי מערכת GAL4/UAS פרופורציונליים לטמפרטורה, ובכך לגידול טמפרטורה יכול להיות מותאם כדי לשנות את רמת הביטוי. ואילו רמות הביטוי גבוהה לעיתים קרובות להוביל יחס אות לרעש טוב יותר במצב זה קשורה גם אגרגטים cytosolic, אבחון מוגבר כאשר משתמש GFP כדי פיוז'ן חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) בונה כגון pHerry10, 30,31. אם צבירת הוא בלתי נמנע, כימות היא עדיין אפשרי על ידי ביצוע הצבע ולידציות כל נתוני הניסוי, נורמליזציה כזה יחס זריחה של 1.0 מקביל pHאני 7.0 (ראה שלב 7.4 הערה על כיול להלן).
  2. סט חוצה של הזכרים32 homozygous capaR-GAL4homozygous UAS-pHerry10 בתולה נקבות וזכרים homozygous c724-GAL42 homozygous לנשים בתולה UAS-pHerry להתיר הדמיה של pHאני תאים עיקריים, תאי stellate MT, בהתאמה. מניחים 6 נקבות UAS-pHerry עם 3 זכרים GAL4 טריים צלוחיות של מזון ולהשאיר להזדווג ב 28 º C.
    הערה: הזחלים צריך להיות בולט בתוך 4 d, מבוגרים יתחיל eclose סביב יום 10.
  3. לאסוף זבובים הנשי על וגיחתו, להפריש גיל 10 י ב 28 º C.
    הערה: העיתוי של ניסויים יכול להיות מותאם כדי שיתאימו בכל מבחני התנהגות מגבילים (כגון רמזי הפרשת assay17,19) אשר יקושרו ל pH בשידור חי תאיים הדמיה. זבובים זכרים יכולים לשמש אך בקוריאנית מן הנקבות לעיתים גדול ועוצמתי יותר.

2. הכנת שקופיות פולי-L-ליזין.

  1. צייר גבול 40 x 20 מ מ עם עט PAP הידרופובי סביב החלק העליון של שקופיות תקן 75 x 25 ממ, מניחים בצד לייבוש למשך 15 דקות על coverslips גדול RT. שימוש אם השקופיות אינן תואמות הדמיה אופטיקה.
  2. העברת 2 מ"ל של 0.01% מניות פולי-L-ליזין (PLL) פתרון על גבי כל שקופית, להפריש עבור 1 h-RT.
  3. להסיר את עודף PLL עם פיפטה. שמור את הפתרון בקבוקון חרוט 50 מ ל לשימוש עתידי. חנות ב 4 º C.
  4. תשאף כל פתרון הנותרים עם קו ואקום. הפעל את שורת ואקום על פני כל השקופית כדי להבטיח שאין פתרון יישאר בשקופיות.
  5. להגדיר את השקופיות בצד לשעה נוספת RT לפני השימוש. לאחסן את השקופיות יבש ב RT במשך עד חודש בספר שקופית רגילה.

3. הכנת לנתח מאכל ומוטות זכוכית

  1. להוסיף 0.5 מ של הסוכן ריפוי elastomer 4.5 מ של אלסטומר מהבסיס פוליסטירן 35 x 10 מ"מ פטרי-RT לייצר לעומק של 5 מ מ. מערבבים עם טיפ פיפטה חד פעמיות. לאפשר elastomer לרפא O/N-RT.
    הערה: Elastomer צריך להיות ברור, ללא בועות. חישוף של בועות עשוי להקל על ידי שמירה על צלחות elastomer בתוך צנצנת ואקום למשך 10-15 דקות לאחר שמזג.
  2. להחזיק מוט זכוכית בקוטר 5 מ מ בין הידיים, להמיס את המרכז של המוט מעל מבער בונזן מואר תוך משיכת לגזרים את הקצוות. כמו הכוס נמס למשוך יותר מהר כדי לייצר דק (0.1 מ מ) בעלת מחודדות פיר (איור 1).
    הערה: בזווית של 45 °-הדוקרן לעיתים קרובות שימושי בטיפול בקוריאנית. זו יכולה להיות מושגת על-ידי הורדת יד אחת כמו הסכין נמשך (ראה איור 1).
  3. לשבור את מוט דק באמצע עם הצד הקהה של תער סיף פחמן פלדה. לבדוק את הסוף דק של המוט תחת טווח ויבתר כדי להבטיח שמעבר נקי.

Figure 1
איור 1: בדיית זכוכית מוטות לטיפול Malpighian בקוריאנית.
A - E. תהליך של חימום ומושך מוט זכוכית לייצר להתחדד, זווית מתאימה לטיפול MTs. חצים מציינות כיוון ובהיקף של כוח כדי להחיל. F. צילום של כלי זכוכית כראוי מפוברק. סרגל קנה מידה = 10 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

4. הכנת פתרונות ומערכת זלוף

הערה: מערכות זלוף שונים על-ידי יצרן. פרוטוקול זה בנויה סביב הכבידה-fed 8 ערוצים פתוחים מאגר עם הרגולטור קצב זרימה קלט, יצוא מונחה ואקום, אבל השיטה של הרכבה ש-mts כפי שמתואר כאן יכול להיות מותאם לעבודה עם כל מערכת זלוף.

  1. הכן את הפתרונות הבאים:
    1. בינונית (40 מ"ל לתוך מבחנות חרוט 50 מ ל) של שניידר aliquot וחנות ב 4 º C.
    2. להכין פתרונות (קרי חרק מלוחים Phosphate-Buffered (iPBS), iPBS עם NH4Cl) ב RT כנדרש על פי טבלה 1). פתרונות חמים RT לפני השימוש ביום של הניסוי.
      הערה: iPBS ו- iPBS עם 40 מ מ NH4Cl ניתן להכין בכמויות גדולות (1 ליטר או יותר), המאוחסנים ב 4 º C.
    3. להכין פתרונות כיול 8 כרכים 500 מ"ל ב- pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 ו- 9.0 כמצוין בטבלה 1 , חנות ב 4 º C. להתאים את ה-pH של כל פתרון באמצעות טיטור עם N-מתיל-D-glucamine (NMDG) ו- HCl.
    4. ביום של ניסויים, לחמם aliquots מ של פתרונות כיול RT ולהוסיף nigericin מניות פתרון (20 מ"מ דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד)) כדי לייצר ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
      התראה: לטפל nigericin עם כפפות. פנקו את כל הציוד שבא במגע עם nigericin כמו חד פעמיות. Nigericin נשאר על זכוכית ופלסטיק, תסכן את ההכנות ביולוגי אם ציוד שימוש חוזר.
  2. זלוף מערכת:
    1. ראש מערכת זלוף על-ידי מילוי כל המאגרים ב- ddH2O (איור 2). לפתוח את הערוצים אחד בכל פעם כדי לאפשר את כל הקווים מקורב אל המתקן קצב זרימה כדי למלא.
      הערה: זה עשוי להיות נחוץ לנקות את האוויר שורות על-ידי פתיחת הערוץ מושבת ושימוש פומפה לזרימה נסיעה מן המאגר.
    2. לפתוח 2 ערוצים ולאפשר ddH2O לנקז. ברגע המאגרים הם כמעט ריק מאדם, למלא המאגר הראשון iPBS, המאגר השני עם NH4iPBS פעמו Cl. להגדיר קצב הזרימה למקסימום עם הרגולטור קצב זרימה לאפשר פתרון לזרום עבור 1 דקות למלא את השורות הדיסטלי, ולאחר מכן לעצור את הזרם (איור 2).
    3. מיקום 2 ערכות של הלחמה מלחציים "עזרה ידיים" על הבמה מיקרוסקופ הדמיה. מניחים מהדק אחד בכל צד של פלטפורמת הדמיה.
    4. בזהירות לחמם את 0.5 אינצי'ם דיסטלי של פיסת זכוכית נימי (הקוטר הפנימי 1.5 מ מ, הקוטר החיצוני 0.86 מ מ, אורך 100 מ מ) מעל מבער בונזן. ליצור עיקול 45 ° על-ידי ומאפשר הסוף דיסטלי לכופף המשיכה והסרה הזכוכית מהאש ברגע הזווית הרצויה מושגת. חזור על תהליך זה עם חתיכת זכוכית נימי השני.
    5. הכנס הנימים זכוכית כיפוף בזרימה קו, קו יצוא המחוברים ואקום, בהתאמה והר אותם בידיו"עוזר" כדי ליישר אותם עם השלב הדמיה של המיקרוסקופ (איור 3).

Figure 2
איור 2: מערכת זלוף והדמיה של תצורה.
הרכיבים הנחוצים פיזיולוגיים להערכת תפקוד התחבורה basolateral MT דרך בו זמנית חיים פלורסצנטיות הדמיה ומהירה פתרון exchange. קווי הגז המוצגות הן אופציונליות ו היתר הרחבת סדרת ניסויים ההערכה התחבורה HCO3– . אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: זרימה סכמטית זלוף מכשירי NH4Cl הדופק ניסויים.
חצים מתארים זרימת והנתיב שסתום מיתוג נקודות. פתרון עובר מן המאגר הדגימה על ידי זרימת הכבידה, מצויר מן החדר הדגימה הבקבוקון פסולת ביניקה ואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

5. ניתוח למבוגרים דרוזופילה Anterior Malpighian בקוריאנית.

  1. לאסוף את המנה הקרע משך זכוכית רוד ממקטע 3, שקופית מצופים PLL מהסעיף 2, קו מפריד דבק של זלוף-. טוב, גריז ואקום, 4 x 2" רצועת אטימה סרט, 2 זוגות #5 משובחים מלקחיים, aliquots 40 מ"ל של שניידר כקרח בינוני ו RT iPBS.
  2. מורחים משחה ואקום בקלטת איטום והקש על המפריד זלוף-ובכן דבק על גבי הקלטת. מעיל התחתון עם גריז. לקלף את המפריד זלוף-ובכן דבק ולמקם אותו גריז לצד השני על גבי שקופית PLL מצופה. הסרה של הקו המפריד זלוף-טוב לעזוב את הדגימה בודדים בארות איתרו בגריז הידרופובי.
  3. במקום 200 µL של iPBS RT ב כיתרו גריז. ובכן בשקופית מצופה PLL ולהעביר השקופית תחת סטריאוסקופ.
  4. המקום UAS-pHerry/capaR-GAL4 זבובים זבוב ריק בקבוקון, עזים ומתנגד אותם על קרח למשך 10 דקות.
    הערה: שיטה זו של הרדמה, בניגוד CO2, מבטיחה הזבובים לא מייבשים.
  5. שופכים את המדיום של שניידר קר כקרח לתוך המנה ויבתר ולהשתמש מלקחיים בסדר להעביר זבוב אחד נקבה anesthetized לתוך המנה תחת סטריאוסקופ ויבתר.
  6. להחזיק את הזבוב על ידי בית החזה עם סט של מלקחיים ולהשתמש השני כדי לאחוז בעדינות. הצד האחורי של הבטן. מושכים. הצד האחורי של הזבוב עם המלקחיים בקיצור, תנועות מכוונות. לאחר hindgut גלוי, לאחוז בקצה הדיסטלי, לשחרר את הבטן ואת MTs tracheoles הבסיסית על ידי משיכת את hindgut מן הגוף דרך גוררות חוזרים, קצר.
    הערה: MTs anterior ואת אחורי יהיה גלוי הם נפגשים בצומת של פיתול, hindgut דרך השופכן. זוג הנעליים הראשון של MTs להיות רצון חופשי סביר להיות בקוריאנית האחוריים הם להקיף את hindgut. אלה ניתן להתעלם (איור 4A).
  7. לצבוט את MTs הקדמי על השופכן עם מלקחיים בסדר, ברגע הסט השני של MTs חינם של הבטן. זה להפריד את MTs הקדמי מהמעיים וסגור השופכן.
  8. לאסוף את MTs הקדמי חינם עם מוט זכוכית משך על-ידי הזזת המוט מתחת השופכן כך בקוריאנית ליפול לצדדים. הרם את MTs ישר החוצה הפתרון.
  9. הפעל את מוט זכוכית כך MTs של שופכן הם דבקו בחלקו התחתון של המוט, ורד השופכן ישר על השקופית. מוספית השופכן, חותם את הקצוות דיסטלי של MTs על ידי לחיצה על השופכן למטה על גבי השקופית זכוכית (איור 4B). לא לתמרן את MTs יותר מהדרוש. MTs אמור. לרחף למעלה בפתרון עם השופכן מעוגן לשקופית.
  10. השתמש בסדר סוף מוט זכוכית בעדינות לסחוף כל צנורית פני שקופיות. הכינו את המוט נגד השקופית כדי להימנע מוחצת את צנורית והחלק את המוט מעל צנורית, העברת דיסטלי צינתור, לצרף באורך מלא של כל צנורית אל פני השטח של השקופית מצופים PLL (איור 4C).
  11. מקם את המפריד זלוף-ובכן דבק בחזרה על השקופית כדי ליצור קטן מלאות נוזל גם יותר צנורית הנטען.
  12. מקם את הדגימה על הבמה מיקרוסקופ. מקם מהזרימה, יצוא נימים על כניסת ועל פתיחת לשקע זלוף טוב, בהתאמה.
    הערה: המפריד טוב יכול להיות הפסקת אם תא זלוף פתוח רצוי. במקרה זה ניתן ליישר הנימים תזרים, יצוא אל צידי לדימות היטב.

6. אימות של הדמיה פרוטוקול ובריאות צנורית

הערה: פרוטוקול זה מתבצע על מיקרוסקופ פלורסנטי רחב-שדה הפוך עם GFP (ע), מערכות סינון RFP (mCherry) (470/40 ננומטר עירור (לשעבר), nm 515 longpass פליטה (em), 500 ננומטר ודיקרואיק זוהר, 546/10 ננומטר לשעבר, 590 nm longpass em, 565 nm ודיקרואיק זוהר), 10 X / 0.45 אוויר המטרה, מצלמה מונוכרומטי עבור לכידת תמונה חיה, ותוכנת הדמיה. הפרוטוקול ניתן להתאים עבור כל זקוף או הפוכה מיקרוסקופ עם מסנן אוטומטי מעבר בין GFP ו- RFP אופטיקה ותמונה רכישת תוכנה, אף פעמים חשיפה אופטימלית, עוצמת האור ופרמטרים binning משתנים. בניתוח כל, עוצמת קרינה פלואורסצנטית צריך להיות מנותח כמו עוצמת פיקסל רע באזור של הריבית (ROI), לאחר חיסור רקע בכל אחד מהערוצים באמצעות רועי עם מכיל אין קרינה פלואורסצנטית סמוכים לאות ROI.

  1. הפעל את המיקרוסקופ, מקור אור ומערכת הדמיה.
  2. תוכנת הדמיה פתוח המשויך.
  3. דרך העיינית של המצלמה ולהתאים באופן ידני המוקד עד לומן של MT ברור תחת אור המשודרת.
  4. לחץ על הכרטיסייה "רכישת" תוכנת ניתוח התמונה ובחר "2 x 2" בתפריט הנפתח "Binning" במדור "רכישת מצב".
  5. להוסיף 5% דחיסות נייטרלית מסנן לתוך נתיב האור כדי להפחית את אור תאורה ולצמצם את photobleaching.
  6. לחץ על הערוץ GFP (ע) בתפריט "ערוצים" ולאחר מכן לחץ על "לחיות" כדי לבחון את האות פלורסנט דרך המצלמה.
  7. כוונן את המחוון "זמן" כדי להגדיר את זמן החשיפה כך שהערכים פיקסל המבריקים בהיסטוגרמה בעוצמה מהווים כ 40% של הערך המרבי ולאחר מכן לחץ על "Stop" כדי לעצור את ההארה.
  8. חזור על השלבים 6.6-6.7 RFP (mCherry) ערוץ, לאשר הנוכחות של החלק הראשוני מורחבים של MT הקדמי וכן העדר cytosolic mCherry אגרגטים (מעידה על נזק לרקמות או ביטוי) (איור 4D).
    הערה: קטע פתיחה צריך להיות גלוי כמו זה המקטע proximal ביותר של צנורית הקוטר של לומן הפנימי של קטע זה הוא ~ 20 מיקרומטר גדול מזה של המגזר המעבר סמוכים. 2 x 2 פיקסל binning לעיתים קרובות מספיקה אך ניתן להגדיל כדי לצמצם עוד יותר את עוצמת תאורה הנדרש. פעמים חשיפה טיפוסית הם בין 150 & 800 ms/ערוץ. להשתמש אור קטן ככל האפשר כדי למזער את photobleaching. מזעור photobleaching היא חיונית לשימוש של אינדיקטורים כפול-fluorophore כגון pHerry כמו fluorophores שני יכול להלבין באופן עצמאי, ובכך לפסול כל כיול יחס.
  9. להפעיל פרוטוקול הדמיה בצילום מואץ על ידי לחיצה על תיבת הסימון "זמן סדרה".
  10. להתאים את "משך" בתפריט הנפתח במדור "זמן סדרה" 10 דקות, את המחוון "מרווח זמן" 0 כדי לקבוע את הזמן הכולל לכידת עם קצב רכישת התמונה המרבי. קצב הרכישה הכולל של הרץ 0.2 מספיקה לעתים קרובות.
  11. בדוק GFP (ע) והן RFP (mCherry) בתיבות בסעיף "ערוצים".
  12. לפתוח את הקו iPBS של מערכת זלוף על ידי הפעלת הבקר שסתום מתאים ולהתחיל פרוטוקול הדמיה על ידי לחיצה על "התחל ניסוי." לאחר 1 דקות, לעבור NH-4פתרון הדופק Cl 20 s על ידי השסתום המתאים וסוגר את הקו iPBS, ואז לחזור iPBS על ידי סגירת NH4קו Cl פותחים מחדש את השסתום iPBS. לאפשר את פרוטוקול הדמיה מלאה להשלים לפני הפסקת מערכת זלוף.
    הערה: ניתוח זמן לשגות צריך לחשוף אות mCherry יציב, אות ע אשר מגביר בנוכחות NH4קלרנית, המרווה על שטיפה, והוא מתאושש בהדרגה.
  13. לבצע כיול של 2 נקודות.
    1. הסרה של הקו המפריד היטב על ידי פילינג זה מן השקופית הבסיסית, הסר את נימי הדם זלוף ואת מלחציים ההדמיה היטב.
    2. µL 200 כיול iPBS (pH 7.4, nigericin 10 מיקרומטר) חלות על ההדמיה היטב עם פיפטה 200 µL. להסיר את הפתרון של ההדמיה היטב עם פיפטה ולאחר מכן החלף עם עוד 200 µL של כיול פתרון. חזור על תהליך זה 4 פעמים כדי להבטיח פתרון מלא exchange.
    3. דגירה הכנת תמיסת כיול למשך 30 דקות לפני הדמיה. חזור על פרוטוקול הדמיה באמצעות אותם פרמטרים נקבע בשלבים 6.6-6.11, עם השינוי של רק 1 דקות של התמונה ללכוד.
      הערה: זלוף ומערכת נימים אין צורך בשלב זה, לא צריכה להיות מחוברת אל ההדמיה היטב כדי למנוע חשיפת הנימים אל nigericin.
    4. להוסיף 200 µL כיול iPBS (pH 9.0, nigericin 10 מיקרומטר) ההדמיה היטב עם פיפטה 200 µL. להסיר את הפתרון של ההדמיה היטב עם פיפטה ולאחר מכן החלף עם עוד 200 µL של כיול פתרון. חזור על תהליך זה 4 פעמים כדי להבטיח פתרון מלא exchange.
    5. דגירה לקראת בפתרון כיול השני 10 דקות לפני הדמיה. חזור על פרוטוקול הדמיה כמו שלב 6.13.3.
    6. סקירה של אוסף התמונות שנתפסו בתוכנת ניתוח תמונה כדי לוודא כי אין פיקסלים בכל אחד מהערוצים רוויים על ידי לחיצה על "רועי אומר" גלילה למרות של אוסף התמונות בעזרת המחוון "מסגרת" תוך כדי התבוננות שדיווח ערכים בהיסטוגרמה בעוצמה להגיע לזיהוי הערך המרבי. אם לכל המסגרות מכילות פיקסלים להגיע את העוצמה המקסימלית לזיהוי, להפחית את עוצמת תאורה או חשיפה ואת החזרה סעיף 6.
      הערה: לאחר הוקם ללא שינוי פרמטרים הדמיה בין ניסויים או כיול אלא אם נקודת הכיול כדי לשמש כהכנה כל (ראה שלב 8.3).
  14. ניתוח של אוסף התמונות כדי להתוות פלורסנט בעוצמה ויחס קרינה פלואורסצנטית (ע/mCherry) כפונקציה של הזמן.
    1. לחץ על "רועי אומר" ובחרו בכלי צורה חופשית. להחזיק השמאלי כדי לעקוב אחר ~ 50 מיקרומטר לאורך של הר. קליק ימני כדי לסיים ציור רועי, ולאחר מכן לחזור באזור הסמוך MT להגדרת רקע ROI (איור 5A).
    2. לחץ על "עוצמת מרושע" תחת "מדידות". ליצור טבלה של ערכי העוצמה על-ידי לחיצה על "ייצוא > טבלת נתונים > יצירה."
    3. לחץ על סמל גלגל השיניים התצורה ובחר מבטל את כל הפרמטרים חוץ "זמן" ואת "מתכוון בעוצמה". באמצעות לחצן העכבר הימני על הכרטיסיה עבור טבלת הנתונים החדש שנוצר, בחר "שמירה בשם" ולאחר לייצא את הנתונים כקובץ csv.
      הערה: מדידות דומות יכולים להתבצע גם באמצעות תוכנות חינם כגון ImageJ.
    4. לפתוח טבלה גיליון אלקטרוני ולייבא את טבלת הנתונים על-ידי בחירה בכרטיסיה "נתונים" ואחריו "של טקסט".
    5. להשתמש בפונקציות בגיליון כדי להפחית את עוצמת רקע ע מ עוצמת האות ע בכל נקודה בזמן. חזור על תהליך זה עבור האות mCherry.
    6. העלילה כל עוצמת ערוץ כפונקציה של זמן על ידי בחירת העמודות המכילות את הזמן ואת מתוקן-רקע עוצמת נתונים ולאחר מכן לחיצה "הוסף > פיזור (תרשימים) > פיזור עם קווים ישרים" (איור 5B).
    7. להשתמש בפונקציות גיליון אלקטרוני לחישוב היחס פלורסצנטיות ע/mCherry בכל נקודה בזמן.
    8. מגרש יחס פלורסצנטיות כפונקציה של זמן על ידי בחירת העמודות המכילות את יחס וזמן נתונים ולאחר מכן לחיצה על "הוסף > פיזור (תרשימים) > פיזור עם קווים ישרים" (איור 5C).

7. כיול מלאה של pHerry ב Malpighian בקוריאנית Vivo לשעבר.

  1. לנתח והר קבוצה חדשה של MTs הקדמי כפי שמתואר בסעיף 5.
  2. חילופי iPBS עבור iPBS כיול (pH 7.4, nigericin 10 מיקרומטר) כפי שמתואר בשלב 6.13.2. תקופת דגירה של 30 דקות.
  3. לאתר של MTs ולאסוף זוגות של תמונות ע/mCherry כמתואר בצעדים 6.1-6.11. החלף את הפתרון מלאי נוסף של כיול iPBS כפי שמתואר בשלב 6.13.4, המתן 10 דקות, ולאחר התמונה שוב. חזור על תהליך זה עד היחס ע/mCherry עם תמונה, כל הפתרונות. להשיג את ה-pH תמונות 9.0 להימשך כמו הדגימה והשיחזור לעיתים רחוקות pH גבוה.
  4. זוממים פלורסצנטיות יחס של ע mCherry מ ולידציות ב 8 דגימות כפונקציה של pH שנכפה עליואני כפי שמתואר בשלב 6.14.9. להתאים את נתוני כיול עם עקומה בולצמן להשיג כיול מלא פונקציה על פי משוואה 1 (איור 5D). אם הנתונים אינם עקביים, מגרש כיול ערכות לכל דגימה מנורמל כזה יחס זריחה של 1.0 מקביל pHi 7.0 ולנתח מחדש (איור 5E).
    הערה: אם התהליך האחרון הוא הכרחי ניסויים בודדים יהיה עליך משלהם ולידציות נקודה פנימית33 (ראה כימות בהליך הבא (שלב 8.3)).
  5. משוואה 1
    Equation 1
    שבו R = יחס ע/mCherry,1,2, xoוכן dx הם עקומת התאמה פרמטרים המייצגים יחס מינימלי פלורסצנטיות, יחס פלורסצנטיות המרבי, pKרוחב של הפונקציה בהתאמה. xo = לכאורה pK של pHerry, אשר יכול להשתנות בין 7.1 ו- 7.4 בהתאם סוג התא והתנאים כיול מדויק.

8. כימות של חומצה Basolateral שחול מ לשעבר Vivo צנורית Malpighian Epithelia.

  1. התמונה לבטא pHerry תאי stellate ומנהלת לבטא pHerry תאים בו זמנית.
    1. לנתח MTs הקדמי מחבצלת UAS-pHerry/capaR-GAL4 , כמתואר בסעיף 5, אבל לא להעביר MTs בינוני של שניידר ויבתר ההדמיה היטב.
    2. לנתח MTs הקדמי מחבצלת UAS-pHerry/c724-GAL4 בצלחת ויבתר אותם באמצעות ההליך המפורטים בסעיף 5.
    3. להעביר את 2 סטים של MTs הדמיה באותו טוב כמתואר בצעדים 5.8-5.11.
      הערה: כאשר גורף סמל MTs אל השקופית, למקם את MTs של UAS-pHerry/c724-GAL4 , את בקוריאנית UAS-pHerry/capaR-GAL4 אחד ליד השני כדי לבטא pHerry ועקרוני stellate התאים להיות visualized ב (זהה שדה איור 6A).
  2. להחיל את NH4prepulse לקלרנית כפי שמתואר בשלב 6.12.
    הערה: אם לא ניתן להשיג עקבי כיול (איור 4B), לבצע כיול של נקודות על-ידי הגדרת ה-pHi 7.0 בסוף כל ניסוי עם כיול iPBS (pH 7.0, nigericin 10 מיקרומטר, דגירה 30 דקות) לאחר שהדבק זלוף-ובכן המפריד ואת הציוד זלוף הוסרו.
  3. לכייל עקבות של תאי stellate ו העיקרי של חלקים שונים של MT (באמצעות היחס מוחלט או מנורמל בהתאם) עם 2 משוואת ולנתח את שלב ההתאוששות לאחר NH4Cl נסיגה על-ידי החלת פונקציות דעיכה מעריכית באמצעות ניתוח סטטיסטי תוכנה, וציין את קבוע דעיכה (τ) (איור 6B).
    משוואה 2
    Equation 2
    שבו R = יחס ע/mCherry,1,2, xoוכן dx הם עקומת התאמה פרמטרים נקבע על ידי כיול בשלב 7.4 (משוואה 1).
    1. חישוב שיעור ההבלטה חומצה (JH +, ראו משוואה 3) כפונקציה של pHאני להביא בחשבון וריאציות של נח pHאני וחומצה טעינה בין ההכנות34. השתמש בפונקציות מעריכי נגזר בשלב 8.3 כדי לחשב את הנגזרת של pHאני לגבי זמן בכל מרווח זמן.
      משוואה 3
      Equation 3
    2. לחשב את קיבולת חציצה פנימי (βi; משוואה 4) של ציטוזול-ה-pHאני מנקודת ההתחלה של כל מרווח בשלב 8.3.1 בהתבסס על הספרות הקודם (ראה משוואת 4).
      הערה: דרוזופילה, אפיון מעמיק ביותר βאני מגיע עצבים מוטוריים זחל מסופי35 , נתונים אלה ניתן להניח להחזיק עבור תאים MT בהיעדר נתונים זמינים אחרים.
      משוואה 4
      Equation 4
    3. לחשב את המוצר של βT (מתוך שלב 8.3.2)ו dpHאני/dt (מתוך שלב 8.3.1) כדי לקבוע JH + (משוואה 3).
      הערה: בתחום פתרונות נומינלית ביקרבונט-חופשית כמו אלה שתוארו ב פרוטוקול זה, ביקרבונט-derived אגירה קיבולת (βb) ההנחה היא ~ מ מ 0. סה כ אגירה קיבולת (βT) הוא הסכום של βאני ו-βb, ובכך βאני = βT בהיעדר HCO3–/CO236.
    4. מגרש JH + כפונקציה של ה-pHאני בתחילתו של כל מרווח הזמן כמתואר בשלב 6.14.9.
    5. דעיכה מעריכית פונקציות חלות על החלק של כל datasets אשר חופפים ב pHאני משתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי. להשוות בין המחירים של שינוי של הפונקציות וכתוצאה מכך להשוות מחירים ההבלטה חומצה בין התאים ואת מקטעי MT (איור 6C).
      הערה: הפונקציה המתאימה ביותר המשמש פריסטלטיות תמיד ייתכן יחיד מעריכית. . הרבה פונקציות אחרות אם הם משפרים מטיב ההתאמה.
    6. לחשב חומצה שטף (ראה משוואת 5) כפונקציה של pHאני להביא בחשבון וריאציות תא בגודל ובצורה.
      משוואת 5
      Equation 5
      הערה: תא מידות ניתן למדוד ישירות בתמונות או לקרב את ערכיהן. התאים העיקריים יכול להיות מיוצג כפי חצאי צינור חלול בעל הממדים הבאים: מיקרומטר הקוטר הפנימי 24; מיקרומטר הקוטר החיצוני 48; גובה 50 מיקרומטר. stellate תאי המעבר משתנה אבל יכול להיות מיוצג בערך כמו צילינדרים עם גבהים של 50 מיקרומטר, קטרים של 10 מיקרומטר. ראה הפיסקה האחרון של התוצאות נציג להלן.
    7. דעיכה מעריכית פונקציות חלות על החלק של כל datasets חופפים ב pHאני משתמש בתוכנת ניתוח סטטיסטי. להשוות בין המחירים של שינוי של הפונקציות שנוצר כדי להשוות פלקסים חומצה בין התאים ואת מקטעי MT (6D איור).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

רקמות בריאים וזיהוי נאותה של MTs הקדמי הכרחיים להצלחה של פרוטוקול זה. במהלך ניתוח, כדאי לשים לב למגע לא ישיר של MTs, לטפל רק אותם על ידי השופכן כמו מרתק של MTs ישירות יוביל שבירה (איור 4A– B). כאשר MTs נסחפים השטוח אותן לשקופית, בקוריאנית חייב להיות נגע מעט ככל האפשר, עודף תנועה כמו זה יגרום נזק שכבת האפיתל של תא בודד (איור 4C). גזור כראוי MTs הקדמי יראה אפילו חלוקת פלורסצנטיות אדום וירוק דרך ציטוזול של תאים אפיתל ואת מקטעי צנורית מורפולוגית ברורים. בקוריאנית פגום על-ידי זלוף פסולים או הנזק יציג צבירה של פלואורסצנטי אדום עם אין אגרגטים ירוק לזווג ולא טעינו בזיהוי MTs האחורי יראה מורפולוגיה אחיד מהקצה עיוור מקורב אל השופכן הדיסטלי (איור 4D) . 

וחייבות להיות מאושרות לתפקוד תקין של pHerry הערכת למרות הפיזיולוגיות, כמו גם מורפולוגיה. השיטה הכי מועיל של המאשר חישה pH נכונה היא להחיל NH4הדופק Cl. בתנאים אלה ע ירוק האות צריך לדווח את השינויים הצפויים pH (עלייה ב- pHאני במהלך הדופק NH3 חודרים לתא, ירידה הדרגתית במהלך הדופק כמו NH4+ נכנס דרך מובילי K+ , ערוצי, ו acidification מהיר התאוששות הדרגתית על NH4Cl נסיגה21, ואילו האות mCherry אדום יישאר קבוע (איור 5A– B). השינויים בתוך האות ע ישתנו עם פרוטוקול והם סוג התא, אך האות mCherry צריך להיות יציב בכל המקרים. שינויים בתוך האות mCherry במהלך הניסויים בודדים מציינים תנועה חפצים או דור מתקדם של חיישן אגרגטים עקב נזק לתאים. האחרון תמנע כימות של pHאני , עליך להימנע. לאחר סיום NH4Cl דופק חשוב לבצע כיול של 2 נקודות (כיול iPBS, pH 7.4 ו- 9.0, nigericin 10 מיקרומטר) כדי לאשר את מנוחתו pHאני ליד 7.4 ולהבטיח כי הפרמטרים הדמיה הנוכחיים ואינן להוביל הרוויה של קרינה פלואורסצנטית הזיהוי כאשר קרינה פלואורסצנטית מוגדל ב- pH 9.0 (איור 5C). אם נח pH נמוך משמעותית מאשר 7.4, הפרוטוקול יש לחזור עם MTs בריא; אם רוויה מתרחשת ב- pH 9.0, הפרוטוקול יש לחזור עם הזמן בעוצמה או חשיפה אור נמוכה יותר. ברגע נקבעים פרמטרים הדמיה נאותה, הם אין לשנות בין ניסויים או ולידציות אם היחס פלורסצנטיות מוחלטת כדי לשמש. ואילו הטבע פסאודו-רציומטרי של pHerry יכול לספק שיטה של התנועה תיקון בהכנות נוטה תנועה או שינויים בקוטר תא, כימות מוחלטת של pHאני דורש מתאם מלא שיטתית של pHerry ע / mCherry יחס החומציותאני דרך הטכניקה K+ nigericin/גבוהה. הכיול של pHerry בהכנות בריא צריך לייצר עקומות כיול עקבית עם נראית לעין pK של 7.1-7.4 בהתאם תא סוג וכיול לתנאים (איור 5D). על ההכנות צבירת איזה mCherry הוא בלתי נמנע, נורמליזציה של ערכים יחס כזה יחס זריחה של 1.0 מקביל pHאני 7.0 אמור להניב תוצאות דומות (איור 5E). אם נקודת הכיול ועיקולים מנורמל משמשים, ניתן למטב הדמיה פרמטרים עבור כל הכנה. 

PH מכוילתאני עקבות יכול לשמש כדי להשוות בין מנגנון רגולטורי pH בין סוגי תאים. מערכת GAL4/UAS ביטוי דרוזופילה ניתן לבטא pHerry תאים עיקריים, תאי stellate הר הקדמי (איור 6A). pHאני רגולציה יכול להיות מוערך על ידי חומצה העמסה תאים עם הקצב של pHאני שחזור NH4Cl פולסים וכימות. זה יכול להתבצע על ידי התאמת פונקציות מעריכי לשלב התאוששות בתנאי ניסוי שונים כדי לחלץ את קבוע דעיכה (τ) כמו תאים עם מהירה יותר בזרימת H+ יציג החלמה מהירה יותר (וערכים נמוכים יותר ובכך של τ). בהתבסס על ניתוח זה, תאי stellate הר מופיעים יש הבלטה חומצה חזקים יותר מאשר תאים עיקריים (איור 6B). ניתוח זה תקיים כל עוד מנוחתו pHאני, מידת הטעינה חומצה, אגירה קיבולת דומים בין קבוצות הניסוי. עם זאת, כאשר לא מתקיימים תנאים אלה, יש צורך להסביר התצפית כי קיבולת חציצה פנימי של ציטוזול (βi) של תאים רבים היא עצמה תלויי-pH35,37,38 ולכן קצב pHאני השינוי ב pH שוניםi אולי לא ישתווה ישירות. במקרים כאלה, עקומות אקספוננציאליות מתאים לגורמים הבאים שלב חומצה ההבלטה של NH4הדופק קלרנית והערכות בעבר נחושה של קיבולת חציצה פנימי (βi) יכול לשמש כדי להתוות את שיעור ההבלטה חומצה (JH +) פונקציה של pHאני ולקבוע שיעור מדובבים של חומצה שחול (משוואות 3 & 4). ברגע הבדלים חומצה וטעינה נח pHאני ספורים עבור, זה ברור ההבלטה חומצה בתאים העיקרי של המקטע המעבר לחרוג כי תאי stellate (איור 6C). בעוד משכנע, ניתוח זה אינו מתייחס למדידה pHאני הוא פונקציה של עוצמת הקול בזמן ההבלטה חומצה על פני קרום פלזמה היא פונקציה של שטח הממברנה. חלוקת JH + מאת פני השטח יחס נפח התא עניין תניב הערכים שומות מקבילות חומצה ליחידת שטח פני יחידת הזמן (משוואת 5), ובכך מאפשר תיקון עבור הבדלי גודל תא, מורפולוגיה. כ שני התאים העיקריים המרכיבים את היקף MT בקטעים המעבר, ובכך יכול להיות הדגם תאים בודדים כמו חצי צינור (מיקרומטר הקוטר הפנימי 24; מיקרומטר 48 הקוטר החיצוני; גובה 50 מיקרומטר). תאי stellate הם קטנים יותר, נוטים להיות בצורת בר קטע המעבר של MT2. כימות מדויק של פני השטח והנפח קשה אבל הערכות שמרניות אפילו צורת המעבר תאי stellate (גליל לגובה של 50 מיקרומטר, קוטר של 10 מיקרומטר) מצביעים על פני שטח האחסון יחס לפחות 2 x של תאים עיקריים. לוקח את זה בחשבון מגלה כי שטף חומצה תאי stellate באופן משמעותי מתחת לזה של תאי המעבר העיקרי, והוא למעשה מתקרבת לזו של התאים העיקריים קטע הראשונית (6D איור).

Figure 4
איור 4: ניתוח למבוגרים דרוזופילה Anterior Malpighian בקוריאנית.
א. ייצוג סכמטי של הסרת MT הקדמי עם 2 זוגות של מלקחיים בסדר במדיום של שניידר צוננת. "א צנורית" = הר הקדמי "עמ' צנורית" = הר האחורי B. תהליך אחזור של הרכבה MTs חילוץ באמצעות מוטות זכוכית. ג. תהליך של הקפדה באורך מלא של חילוץ MTs לשקופית להערכת הדמיה, הפיזיולוגיות. D. נציג widefield תמונות של ע (470/510 ננומטר ex / em) ו mCherry (556/630 ננומטר ex / em) מרכיבי UAS-pHerry מונע על ידי capaR-GAL4 המתארים בריא הקדמי MTs, MTs קדמי פגום על-ידי לא מספיקות זלוף, ו טעינו בזיהוי האחורי MTs. הערה כי MTs הקדמי בריא להציג ברור מורחבים עיוור הראשונית קטע, קטע המעבר מכווץ עם ביטוי מוגבר יחסית UAS-pHerry כאשר מונע על ידי capaR-GAL4, ואת צינור ראשי הדיסטלי פלח. נזק MTs מורגש התצוגה מצבורי mCherry זריחה עם פלורסצנטיות ע המתאימים אין. MTs האחורי הם מדים בקוטר אין מקטעים נפרדים מורפולוגית. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: אימות וכיול של pHerry ב Malpighian בקוריאנית.
א. נציג widefield תמונות של ע (470/510 ננומטר ex / em) ו mCherry (556/630 ננומטר ex / em) רכיבים של UAS-pHerry מונע על ידי capaR-GAL4 המתארים MTs. anterior בריא "רועי" סימני אותות לאזור עניין. "BG" אזור רקע סימני עניין אשר היה לאחר מכן שהוחסר את האות רועי ב- אותו ערוץ. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. B. קרינה פלואורסצנטית יחסית לשינויים אותות ע ו mCherry של pHerry בתגובה 20 s 40 מ מ NH4הדופק Cl. שימו לב כי האות mCherry הינה יציב בעוד האות ע מציג עלייה אופיינית במהלך הדופק (מעיד על alkalization, דהיינו גדל pHאני), ירידה חדה על שטיפה (מצביע על כך acidification, קרי ירד pHאני). ג. יחס זריחה של pHerry (ע/mCherry) מחושב מנתונים ב' עם נתונים נוספים לאחר דגירה 30 דקות ב- iPBS כיול (10 מיקרומטר nigericin, 130 מ מ K+, pH 7.4 ו- 9.0). ד. עקומת כיול בנוי יחס pHerry המוחלט (ע / mCherry) כפי פונקציה של הטיל pHאני במהלך חשיפה iPBS כיול buffered לאחד ערכי pH 8. עיגולים אפורים הם הערכים הבודדים טופס 8 ההכנות. ריבועים שחורים וברים ±SD מרושע. עקומת בולצמן מתאים. E. אותם נתונים כמו D מנורמל כזה יחס זה זריחה ב- pH 7.0 הוא 1.0. עקומת השתנה עקומת sigmoidal מתאים (ראה שלב 7.4, משוואה 1). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: כימות של חומצה ההבלטה בתוך צנורית Malpighian Epithelia.
א. Widefield התמונה של זריחה ע (מתוך pHerry) בתאים העיקרי של MT הקדמי (משמאל, מונחה על-ידי מנהל capaR-GAL4 ), תאי stellate הר הקדמי (נכון, מונע על ידי c724-GAL4). שימו לב כי תאי stellate הם בצורת בר במגזר הראשוני, משתנה, קטע המעבר, להציג תחזיות הסלולר ברורים בקטע המרכזי. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. B. מכויל pHאני בתגובה לשינויים 20 s 40 מ מ NH4Cl הדופק באזורי עניין מסומן (תאים העיקרי של קטע המעבר, התאים העיקריים של המגזר הראשוני, תאי stellate מעבר מקטע). עקומות מקווקו מציינות מתאים מעריכי יחיד שהוחל שלב ההתאוששות חומצה בעקבות NH4נסיגה Cl שממנה נגזרים ערכי קבוע (τ) דעיכה המוצהרת. ג. שיעור ההבלטה חומצה (JH +) להתוות כפי pH הפונקציהi נגזר המעריך מתאים ראה ב'. ראה שלב 8.3.1 עבור JH + חישוב (משוואה 3). עקומות מקווקווים הם מתאים מעריכי מוחל על כל חלקה נתונים בתוך אזור חופפים pHאני מסומן על ידי התיבה האפורה. ד. חומצה השטף המותווים כפי pH הפונקציהi נגזר המעריך מתאים ב B ו- 5 משוואת. עקומות מקווקווים הם מתאים מעריכי מוחל על כל חלקה נתונים בתוך אזור חופפים pHאני מסומן על ידי התיבה האפורה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

iPBS מלון NH4Cl דופק iPBS כיול iPBS
NaCl 121.5 81.5 0
מלון NH4קלרנית 0 40 0
אשלגן כלורי 20 20 130
גלוקוז 20 20 20
מאגר HEPES; 8.6 HEPES; 8.6 MES, HEPES או ברזים; 8.6
NaHCO3 10.24 10.24 0
NaH2PO4 (1 H2O) 4.5 4.5 0
NMDG 0 0 30.5
ה-pH 6.8 6.8 משתנה
Osmolarity 350 ±5 350 ±5 350 ±5

טבלה 1: פתרונות לטוס ניסיוני.
iPBS פתרונות מוכנים בטמפרטורת החדר, pH מוגדר על-ידי טיטור עם HCl, NaOH. כיול פתרון טיטרציה עם HCl ו NMDG. מאגר של כיול פתרון מגוון המבוסס על ה-pH הרצוי [2-(N-מורפולינו) ethanesulfonic חומצה (MES) עבור pH = 4.0-6.0; חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 4 (HEPES) עבור pH = 6.5-7.5; N-[טריס (hydroxymethyl) מתיל]-3-חומצה aminopropanesulfonic (ברזים) עבור pH = 8.0-9.0]. כל הערכים מ מ, למעט ה-pH (unitless) ו osmolality (mmol/ק ג). Nigericin מניות ב דימתיל סולפוקסיד נוסף לפתרונות כיול כדי ריכוז סופי של 10 מיקרומטר רק לפני השימוש.

GEpHI עירור (אן אם) פליטה (אן אם) pK הערות
Superecliptic pHluorin (ע)11 395, 488 530 7.2 טווח ליניארי גדול, קיפול גדול (50 x) להגדיל ב- pH תלויית קרינה פלואורסצנטית על פני טווח ליניארי
Pt GFP42 390, 475 540 7.3 תוקף לשימוש בתאי צמח
Superecliptic pHluorin - פיוז'ן mCherry31 488, 556 530, 620 7.2 מפיק mCherry אינטראקצית אגרגטים כמה תאים
ClopHensor40 488, 545 525, 590 6.8 pH, חיישן Cl– . Varient30 ClopHensorN מעודכן מראה פחות צבירת בנוירונים
pHerry10 488, 556 530, 620 7.2 מעודכן ע-mCherry פיוז'ן עם מקשר בין ClopHensor
mNectarine44 558 578 6.9 תיקון עבור photobleaching יש לעיתים קרובות צורך
pHluorin245 395, 475 509 6.9 וריאנט של רציומטרי pHluorin12
pHred47 440, 585 610 7.8 Varient מעודכן של משמרת ארוכה-סטוקס mKeima49, תואם עם הדמיה 2-פוטון FLIM ניר
pHuji43 566 598 7.7 Varient של מאפל; נמוך יותר רגישות הצפוי pH בתאים מסוימים
pHtomato46 550 580 7.8 אימות כדי לעקוב אחר אנדוציטוזה vesicular, רגישות pH cytocolic המסכנה
pHoran443 547 561 7.5 רגיש pH משופרת חלבון פלואורסצנטי כתום
SypHer-248 427, 504 525 8.1 גרסה בהירה של רציומטרי SypHer51, במקור למדידות מיטוכונדריאלי

טבלה 2: רשימת שפורסמה GEpHIs Cytosolic
Maxima עירור, פליטה maxima וערכים לכאורה pK מקורבים, יכול להשתנות בהתאם למערכת ביטוי, טכניקת דימות כיול בשיטה. FLIM = קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ. ניר = קרוב אינפרא-אדום.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ההצלחה של כימות של pHאני ב- MTs דרוזופילה תלויה לגמרי הבריאות של MTs שחולצו ואיכות הרכבה, דיסקציה (איור A – C). לכן, טיפול זהיר של רקמות כמו שמתואר הכרחי. שקופיות טרי מצופה PLL באופן משמעותי סיוע MT הרכבה כפי שהם נוטים להיות דבק הרבה יותר מאשר שקופיות אשר נחשפו בעבר לפתרון. הרכבה זהיר יסייע גם בזיהוי של MT ברורים מקטעים (איור D). MTs בריא להקל על כיול pHerry והערכה תפקודית על ידי הפחתת צבירה mCherry מניב כימות עקביים הרבה יותר של חומצה שחול, בהתאמה. במקרים מסוימים, הימנעות צבירה mCherry אינה אפשרית כפי התנאים ניסיוני מטבעו נזק MT epithelia או לייצר משמעותי ביטוי יתר של הכתבת פלורסנט. במקרים אלה, כיול פסאודו-רציומטרי מנורמל כזה יחס פלורסצנטיות 1.0 מקביל pHאני 7.0, נקודת הכיול יאפשר כמת (איור E). כדאי לשים לב בעת ביצוע ולידציות נקודת למנוע חשיפת היסודות קבוע של מערכות הדמיה זלוף כדי nigericin כמו ionophore דוגלים זכוכית ופלסטיק. כיול אפילו פסאודו-רציומטרי אינה אפשרית בנסיבות שבהן מניפולציה ניסויית גורם נזק תאי במהלך ניסוי, דהיינו נזק זה יגרום מתקדמים לעין לודיג mCherry קרינה פלואורסצנטית לאורך כל הניסוי. במקרים אלה מאוחר יותר, האות פלורסצנטיות ע ניתן להשתמש עם עקומת כיול מנורמל והצבע ולידציות, לפרסמה ההדמיה כבר לא לתקן עבור משמרות מוקד והאיורים של התנועה.

GEpHIs לשאת מספר מגבלות כללי בהשוואה לכימות של pHאני עם צבעי פלורסנט. שימור צבע יכול לשמש כמחוון של קרום התא של תקינות בריאות39, אך אין assay מקביל זמין לשימוש GEpHIs. ככזה, בריאות הכנה חייב להיות במעקב באמצעים עצמאיים, אם נזק לתאים לנבא תוצאות לבלבל. GEpHIs העלול לאפשר הדמיה של הפרעה מינימלית ויוו ההכנות אך רקמת מטבעו מגביל את המניפולציות ניסיוני, יכול להפוך את נקודת הכיול אפשרי. הגבלה ספציפית אחרת הגלום באמצעות pHerry של אחרים מציינים pH cytosolic fluorophore כפולה (כגון ClopHensor40) נובעת הנטייה של fluorophores שני לשנות שלהם פלורסצנטיות ללא תלות אחד בשני וגם pHאני . RFP צבירת חפצים הביטוי המשמעותי ביותר של מגבלה זו, אבל גם יכול להיות בסכנה כימות מאת photobleaching של fluorophores אחת או את שתיהן. לפיכך, הדמיה בפרוטוקולי הרבה להיות מותאם כדי למזער את photobleaching, אשר יכול להוביל הרבה פעמים חשיפה וקצבי רכישה < 0.2 פעמים חשיפה ארוכה הרץ. ייכשל לדווח rapid pHאני משמרות. קרינה פלואורסצנטית ע מציגה מתאם ליניארי ל pHאני מ- pH 6.8-7.8 רוב ההכנות, אך מידת הדיוק של מדידות כאלה תלויה הדיוק של שיטת קיי+ nigericin/גבוהה. Nigericin משמש ionophore /H K++ וכן ראוי כיול על equilibrating חוץ-תאית [K+] עם תאיים [K+]. הערכות של תאיים [K+] אינם זמינים או השגה בקלות לכל מערכות ניסיוני. הדיוק של ה-pHאני כימות יהיה כמו הערכות של תאיים [K+], רק למרות המחירים של השינוי היחסי ב pHאני יהיה עקבי. שגבה תאיים [H+] מגבלה זו והקשר לוגריתמי ההופכי של pHאני , תמיד עדיף לדווח נתונים כמו שיעורי השינוי ב pHאני, של שיעור ההבלטה חומצה (JH +, איור 6C), או חומצה השטף (איור 6D) ולא מוחלט שינויים ב- pHאני. ניתוח של הנתונים כפי השטף חומצה יתרון נוסף לתיקון הבדלים על פני השטח הם יחס נפח בין סוגי תאים.

בטח יהיה מוערך מספר אזהרות כאשר הנתונים תרגום סימולטני במבוגר לטוס הכנה MT שמתואר פרוטוקול זה. ההבחנה מורפולוגי של תיבות, המעבר, ואת מקטעי הראשי הוא כנראה פישוט של המגוון האמיתי של תחומים גנטי פונקציונלי נוכח MTs2. יתר על כן, בעוד פרוטוקול זה תוכנן כדי לזהות את תפקידה של מסועי חומצה basolateral זה אפשרי כי התחבורה הפסגה יכול להשפיע על pHi מידות כמו גם. איטום של ureters כאשר הרכבה של MTs (שלב 5.9) מבטיח פתרון חילופי בעיקר מתרחש על פני השטח basolateral אבל פארא-סלולר ולבלוב תנועת יונים עדיין עשויים להשפיע pHi כפי basolateral תחבורה בסופו של דבר משנה צד cytoplasmic של מעברי צבע יון לומן/cytosolic. הפרדה מוחלטת בין הפסגה פונקציה basolateral יכול להתבצע על ידי באופן עצמאי פרפוזיה את luminal ואת basolateral משטחים של MT אבל שיטות כאלה באופן משמעותי יותר מבחינה טכנית דורשים כפי שהם דורשים micropipette תעלות41 .

GEpHIs יתרונות רבים על פני שיטות קונבנציונליות של מדידת pH, ולהתאים את העוצמות האלה הם מוגבר כאשר בשילוב עם גמישות גנטי עלות נמוכה של הכנת דרוזופילה MT. כימות של pHאני מבחינה היסטורית יש לסמוך על צבעי פלורסנט כגון ((BCECF) 2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein22 או מסובך אלקטרופיזיולוגיות להערכת באמצעות אלקטרודות יון סלקטיבי20 ,21. כפי pHerry מקודד גנטית, זה יכול לבוא לידי ביטוי באוכלוסיות הסלולר ספציפיים על-ידי היזמים ספציפי (כפי שמוצג כאן תאים עיקריים, תאי stellate של MT, איור 6), והוא נוטה להשתמש בכל רקמות נתון transgenesis, תרביות תאים, או זיהום ויראלי בתיווך. צבעי מוגבלים על ידי עלות של ההכנות בודדים ופרוטוקולים היישום שעשוי להיות מסובך אשר מעבירים ללא ירידה לפרטים תאים ברקמות הטרוגנית. אלקטרודות יון סלקטיבי דורשים ציוד מיוחד עבור ייצור ומדידה, בזמן pHerry דורש widefield היחידים מיקרוסקופ פלורסנטי עם קונבנציונאלי GFP ו- RFP לסנן סטים. השימוש צבעי ואלקטרודות מחייבים פיזית כמו גם גישה אופטי הרקמה של הריבית בעוד GEpHIs ניתן לנטר ברקמות שחולצו טרי ושוב פעם ויוו. ההזדמנות עבור הדמיה חיה בהכנות שלם הוא עניין מיוחד כאשר הערכת והפיזיולוגיה pHאני תקנה כמו שום טכנולוגיה אחרים התאית מאפשרת כימות של pHאני בנוכחות אגירה אנדוגני מנגנונים.

דרוזופילה למבוגרים MT ההכנה מציג תכונות אטרקטיביות רבות עבור אלו המעוניינים בהעברה רגולציה ויון השתגעת לגמרי. דרוזופילה האחזקה זולה, כלים כגון מקודד גנטית ביוסנסור בונה והוספות ביטוי RNAi הינם זמינים בקלות מתוך מגוון מניות מרכזי (בלומינגטון דרוזופילה מניות במרכז באוניברסיטת אינדיאנה; וינה דרוזופילה מרכז המחקר). דרוזופילה MTs מורכבים שכבה אחת של תאי אפיתל מקוטב, הופכות אותה לאידיאלית לחקירה התחבורה יון transepithelial. תחבורה Basolateral יכול להיות בקלות לבדיקה (כפי שמוצג כאן) אבל אישיותי של הפסגה, basolateral יון תנועה אפשרי עם תעלות micropipette41. בנוסף, מבחני תפקוד האיבר כמו רמזי הפרשת assay17 את התצהיר של סידן luminal-אוקסלט18 הם מאופיין היטב ומאפשרים קורלציה של אפיתל פיסיולוגיה תאית למודלים של הפרשת נוזלים, nephrolithiasis, בהתאמה. ואילו תכונות אלה מספקות הזדמנויות עבור ניתוח חזקים, הזמינות בעלות נמוכה ורחבה של מיקרוסקופ פלורסנטי הופך המודל דרוזופילה MT לאידיאלי עבור הפגנות של פיזיולוגיה הסלולר ו כל-עוגב בהוראת מעבדות.

שליטתו של שיטות אלה מאפשר כימות של pHאני רגולציה על ידי basolateral H+ שטף של MTs דרוזופילה למבוגרים, נגישה עדיין חזקים מודל של יון transepithelial תחבורה. השימוש GEpHIs כגון pHerry ניתן להתאים בקלות כדי להעריך pH תקנהi בסוגי תא הגעה, תרבותי בתרבית של תאים, וההכנות ויוו . התפתחות חדשה GEpHIs סביר יעברו של סידן מקודד גנטית אינדיקטורים, עם הדור החדש פורש את הספקטרום והטיפול הנוכחי מגבלות כגון צבירת חפצים30,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49. GEpHIs כבר בשימוש נרחב לדווח מטריקס מיטוכונדריאלי pH50,51, subcellular אסטרטגיות מיקוד קיים כדי להתאים לשפה ביולוגיים כדי רשתית תוך-פלזמית52, גרעין 53, הסינפטיות12,43, ואת cytoplasmic54 המשטחים החיצוניים של קרום פלזמה הסלולר55 (לקבלת רשימה של ריאגנטים שפורסמו, ראה בטבלה 2 ). ככזה כלים זמינים הם יאפשר אינטגרציה אנכית של תקנת משנה השתגעת עם היבטים אחרים של פיסיולוגיה תאית, כגון Ca2 + טיפול והאיתות תאיים, ותפקוד כל האיבר במגוון של בעלי חוליות ההכנות הגעה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH DK092408, DK100227 אל MFR. AJR נתמכה על ידי T32-DK007013. המחברים רוצים להודות ד ר ג'וליאן ש א דאו כדי להפוך את CapaR-GAL4 c724-GAL4 מניות דרוזופילה . אנו מודים גם יעקב ב. אנדרסון לסיוע שמירה על ניסיוני צלבים לעוף.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O'Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

Tags

ביוכימיה גיליון 126 יון תחבורה החומציות תאיים epithelia Malpighian בקוריאנית דרוזופילה כתב פלורסנט pH גנטית מוצפנת אינדיקטור pH רגולציה הדמיה בשידור חי pHerry
PH כימות של תאיים אופטי <em>בדרוזופילה melanogaster </em>צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossano, A. J., Romero, M. F.… More

Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter