PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

Summary

Transporte de iões celular muitas vezes pode ser avaliado pelo monitoramento pH intracelular (pH_eu). Geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação do pH intracelular em células intactas. Este protocolo detalha a quantificação do pH intracelular através de celular ex vivo ao vivo-imagens de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster com pHerry, um pseudo-ratiometric geneticamente codificado indicador de pH.

Abstract

Transporte de íons epitelial é vital para a homeostase do íon sistêmica, bem como a manutenção dos gradientes eletroquímicos celulares essenciais. PH intracelular (pH_eu) é influenciado por muitos transportadores de íons e assim monitoramento de pH, é uma ferramenta útil para avaliar a atividade de transporte. Moderna geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação de pH em células intactas na escala celular e subcellular. Este protocolo descreve em tempo real quantificação do pH celular_eu regulamento em túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster através de ex vivo ao vivo-imagem latente de pHerry, um pseudo-ratiometric GEpHI com pK_um adequado para controlar as alterações do pH no citosol. Extraído de mosca adulta MTs são compostos de seções morfologicamente e funcionalmente distintas de epitélios de célula única camada e podem servir como um modelo acessível e geneticamente tractable para investigação de transporte epitelial. GEpHIs oferecem diversas vantagens sobre os convencionais sensíveis ao pH de corantes fluorescentes e eletrodos íon-seletivos. GEpHIs pode rotular populações de células distintas, desde elementos promotor apropriados estão disponíveis. Esse rótulo é particularmente útil em ex vivo, in vivoe em situ preparações, que são inerentemente heterogêneas. GEpHIs também permitem quantificação de pH_i em tecidos intactos ao longo do tempo, sem necessidade de exteriorização de tratamento ou tecido de tintura repetidas. A principal desvantagem de GEpHIs atual é a tendência de agregar no citosol inclusões em resposta ao dano tecidual e sobre-expressão de construir. Estas deficiências, suas soluções e as vantagens inerentes de GEpHIs são demonstradas neste protocolo através de avaliação do transporte de protões (H⁺) basolateral nas células principais e estreladas funcionalmente distintas de mosca extraída MTs. As técnicas e a análise descrita são facilmente adaptáveis a uma grande variedade de preparações de vertebrados e invertebradas, e a sofisticação do ensaio pode ser dimensionada de ensino labs para intrincados determinação do fluxo de iões através de transportadores específicos.

Introduction

O objetivo do presente protocolo é descrever a quantificação do pH intracelular (pH_i) usando um geneticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) e demonstrar como esse método pode ser usado para avaliar o transporte de H⁺ basolateral em um inseto modelo d (. melanogaster) estrutura renal, túbulos de Malpighi (MT). MTs servem como órgãos excretores da mosca da fruta e são funcionalmente semelhantes aos mamíferos néfron em vários aspectos chave¹. MTs são arranjados como 2 pares de túbulos (anteriores e posteriores) no tórax e abdômen de uma mosca. O tubo de única célula epitelial de cada MT é composto por metabolicamente ativas células principais com distintas apicais (luminal) e polaridade basolateral (hemocoel), bem como células estreladas intercaladas. MTs anteriores são compostas de 3 morfologicamente, funcionalmente, e mentalmente distintos segmentos, nomeadamente a inicial dilatadas segmento, segmento de transição e secretora segmento principal, que se junta ao ureter². Na escala celular transporte trans-epitelial íons no lúmen é realizado por uma membrana plasmática apical V-ATPase³ e um cambista do alcaloide-metal/H⁺ , bem como um basolateral at⁺–⁺K-ATPase⁴, aperfeiçoamento activo-retificador K⁺ canais⁵, at⁺-conduzido Cl⁻/HCO₃⁻ cambista (NDAE1)⁶e Na⁺-K⁺-2 Cl⁻ cotransporter (NKCC; Ncc69)⁷, enquanto células estreladas mediam Cl^– e transporte de água^8,9. Este sistema fisiológico complexo mas acessível oferece excelentes oportunidades para a investigação de mecanismos de transporte de íon endógena quando combinado com diversos fatores genéticos e comportamentais conjuntos de ferramentas de Drosophila.

A justificativa para este protocolo foi descrever um sistema geneticamente maleável para estudar o transporte de íons epitelial com potencial para a integração do celular para o comportamento e exportação de ferramentas para outros sistemas de modelo. Expressão de pHerry¹⁰, uma GEpHI derivada de uma fusão de verdes sensíveis ao pH super eclíptica pHluorin^11,12 (SEpH) e vermelho mCherry diferenciação de pH¹³, em MTs permite a quantificação de transporte H⁺ , em células únicas MT através da alta K⁺/nigericin calibração técnica¹⁴. Como muitos transportadores de iões mover equivalentes de H⁺ , quantificação de pH intracelular serve como uma representação funcional do movimento de iões através de uma variedade de transportadores. O modelo de sistema de Drosophila MT também oferece ferramentas poderosas de genéticas em tecido-específica do transgene¹⁵ e RNA interferência (RNAi)¹⁶ expressão, que pode ser combinado com o celular imagens e ensaios todo-órgão^{17 , 18 , 19} da função do túbulo para criar um conjunto de ferramentas robusto com integração vertical das moléculas de comportamento. Isto contrasta com muitos outros protocolos para avaliação biologia epitelial, como historicamente, tais medidas têm confiado na intrincada e assustadora micro-dissecção, sofisticado eletrodos íon-seletivos^20,21, e sensíveis ao pH caro tinge²² com requisitos de carga restritiva e pobre especificidade celular em tecidos heterogêneos. GEpHIs têm sido utilizados para medir o pH_eu em uma variedade de tipos de célula²³extensivamente. Primeiros trabalhos exploraram a pH-sensibilidade inerente de proteína fluorescente verde (GFP) para monitorar o pH_eu em culturas de células epiteliais²⁴ mas nas duas últimas décadas viram GEpHIs usado em neurônios²⁵, glia²⁶, fungos²⁷ , e células de plantas²⁸. A combinação do potencial de segmentação celular de construções genéticas através da expressão de GAL4/UAS sistema¹⁵ e a acessibilidade fisiológica de MT a drosófila isto fazer uma preparação ideal para investigações de pH_eu regulamento e transporte de íon epitelial.

pH_eu regulamento tem sido estudado há décadas e é vital para a vida. A preparação de MT oferece um modelo robusto de ensinar fisiologia do Regulamento pH_eu mas também realizar sofisticadas investigações de pH_i Regulamento ex vivo e in vivo. Este protocolo descreve a quantificação do movimento H⁺ através da membrana basolateral das células epiteliais da drosófila MT usando o NH₄Cl ácido de pulso técnica²¹a carregar, mas como o indicador de pH é geneticamente codificado, esses métodos e o seu enquadramento teórico podem ser aplicados a qualquer preparação passível de transgênese e geração de imagens ao vivo.

Protocol

Todas as etapas neste protocolo estar em conformidade com as diretrizes de uso de animais da clínica Mayo (Rochester, MN). 1. criação de voar Aumento voa e conjunto cruza de acordo com o padrão de criação29.Nota: A expressão fluorescente repórter pelo sistema GAL4/UAS é proporcional à temperatura e, portanto, a criação da temperatura pode ser ajustada para alterar o nível de expressão. Enquanto os níveis de alta expressão muitas vezes levam…

Representative Results

Tecidos saudáveis e identificação adequada de MTs anteriores são vitais para o sucesso do presente protocolo. Durante a dissecção, deve ter cuidado para não diretamente toque os MTs e identificador único-los pelo ureter como segurando os MTs diretamente conduzirá à quebra (Figura 4A– B). Quando MTs são varridos plana para o slide, túbulos devem ser tocados o mínimo possível e movimento em excesso evitado como…

Discussion

O sucesso da quantificação de pH em Drosophila MTs depende inteiramente da saúde de MTs extraídos e a qualidade da montagem e dissecação (Figura A – C). Assim, o tratamento cuidadoso do tecido como descrito é imperativo. Slides recém revestidos em PLL substancialmente ajuda MT montagem como eles tendem a ser muito mais adesivo do que os slides que anteriormente foram expostos a solução. Cuidado montagem também ajudarão na identificaç?…

Materials

Poly-L-Lysine Solution	Sigma-Aldrich	P4832	Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt	Sigma-Aldrich	N7143	CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm	Sigma-Aldrich	GBL622105	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands	Harbor Freight Tools	60501	Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors	Bioscience Tools	PS-8S	Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator	Warner Instruments	64-0221	Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium	Fisher Scientific	21720024	Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps	Fine Science Tools	11252-20	Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish	Corning Life Sciences	Fisher Scientific 08-757-100A	Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides	Corning Life Sciences	2949-75X25	Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm	Warner Instruments	64-0796	Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch	Fisher Scientific	14-171-129	Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease	Sigma-Aldrich	Z273554	Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp	Fisher Scientific	05-869	Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter	delphiglass.com	9198	Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen	Sigma-Aldrich	Z377821	Available from multiple vendors.
Sealing Film	Sigma-Aldrich	P7668	Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube	BD Falcon	352096	Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube	BD Falcon	352070	Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	H3375	Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate	Sigma-Aldrich	69892	Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid	Sigma-Aldrich	T5130	Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective	Zeiss	000000-1063-139	Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope	Zeiss	Discovery.V8	Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster	Available from Romero Lab		First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera	Zeiss	Axiocam 506 mono	Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic	Chroma	CZ909	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic	Chroma	CZ915	Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope	Zeiss	Axio Observer Z.1	Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software	Microcal	Origin 6.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software	National Institutes of Health	ImageJ 1.50i	Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software	Zeiss	Zen 1.1.2.0	Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade	Electron Microscopy Sciences	71960	Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder	Fisher Scientific	16-04	Available from multiple vendors.
Bunsen Burner	Fisher Scientific	50-110-1231	Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs	Genesee Scientific	32-109BF	Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket	Fisher Scientific	07-210-129	Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004	Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips	MidSci	AV200	Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette	Gilson Incorporated	PIPETMAN P200	Available from multiple vendors.