Summary

PH intracelular de quantificação de óptica em Drosophila melanogaster túbulo de Malpighi epitélios com um indicador de pH fluorescente geneticamente codificado

Published: August 11, 2017
doi:

Summary

Transporte de iões celular muitas vezes pode ser avaliado pelo monitoramento pH intracelular (pHeu). Geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação do pH intracelular em células intactas. Este protocolo detalha a quantificação do pH intracelular através de celular ex vivo ao vivo-imagens de túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster com pHerry, um pseudo-ratiometric geneticamente codificado indicador de pH.

Abstract

Transporte de íons epitelial é vital para a homeostase do íon sistêmica, bem como a manutenção dos gradientes eletroquímicos celulares essenciais. PH intracelular (pHeu) é influenciado por muitos transportadores de íons e assim monitoramento de pH, é uma ferramenta útil para avaliar a atividade de transporte. Moderna geneticamente codificado-indicadores de pH (GEpHIs) fornecem óptica quantificação de pH em células intactas na escala celular e subcellular. Este protocolo descreve em tempo real quantificação do pH celulareu regulamento em túbulos de Malpighi (MTs) de Drosophila melanogaster através de ex vivo ao vivo-imagem latente de pHerry, um pseudo-ratiometric GEpHI com pKum adequado para controlar as alterações do pH no citosol. Extraído de mosca adulta MTs são compostos de seções morfologicamente e funcionalmente distintas de epitélios de célula única camada e podem servir como um modelo acessível e geneticamente tractable para investigação de transporte epitelial. GEpHIs oferecem diversas vantagens sobre os convencionais sensíveis ao pH de corantes fluorescentes e eletrodos íon-seletivos. GEpHIs pode rotular populações de células distintas, desde elementos promotor apropriados estão disponíveis. Esse rótulo é particularmente útil em ex vivo, in vivoe em situ preparações, que são inerentemente heterogêneas. GEpHIs também permitem quantificação de pHi em tecidos intactos ao longo do tempo, sem necessidade de exteriorização de tratamento ou tecido de tintura repetidas. A principal desvantagem de GEpHIs atual é a tendência de agregar no citosol inclusões em resposta ao dano tecidual e sobre-expressão de construir. Estas deficiências, suas soluções e as vantagens inerentes de GEpHIs são demonstradas neste protocolo através de avaliação do transporte de protões (H+) basolateral nas células principais e estreladas funcionalmente distintas de mosca extraída MTs. As técnicas e a análise descrita são facilmente adaptáveis a uma grande variedade de preparações de vertebrados e invertebradas, e a sofisticação do ensaio pode ser dimensionada de ensino labs para intrincados determinação do fluxo de iões através de transportadores específicos.

Introduction

O objetivo do presente protocolo é descrever a quantificação do pH intracelular (pHi) usando um geneticamente codificado-indicador de pH (GEpHI) e demonstrar como esse método pode ser usado para avaliar o transporte de H+ basolateral em um inseto modelo d (. melanogaster) estrutura renal, túbulos de Malpighi (MT). MTs servem como órgãos excretores da mosca da fruta e são funcionalmente semelhantes aos mamíferos néfron em vários aspectos chave1. MTs são arranjados como 2 pares de túbulos (anteriores e posteriores) no tórax e abdômen de uma mosca. O tubo de única célula epitelial de cada MT é composto por metabolicamente ativas células principais com distintas apicais (luminal) e polaridade basolateral (hemocoel), bem como células estreladas intercaladas. MTs anteriores são compostas de 3 morfologicamente, funcionalmente, e mentalmente distintos segmentos, nomeadamente a inicial dilatadas segmento, segmento de transição e secretora segmento principal, que se junta ao ureter2. Na escala celular transporte trans-epitelial íons no lúmen é realizado por uma membrana plasmática apical V-ATPase3 e um cambista do alcaloide-metal/H+ , bem como um basolateral at++K-ATPase4, aperfeiçoamento activo-retificador K+ canais5, at+-conduzido Cl/HCO3 cambista (NDAE1)6e Na+-K+-2 Cl cotransporter (NKCC; Ncc69)7, enquanto células estreladas mediam Cl e transporte de água8,9. Este sistema fisiológico complexo mas acessível oferece excelentes oportunidades para a investigação de mecanismos de transporte de íon endógena quando combinado com diversos fatores genéticos e comportamentais conjuntos de ferramentas de Drosophila.

A justificativa para este protocolo foi descrever um sistema geneticamente maleável para estudar o transporte de íons epitelial com potencial para a integração do celular para o comportamento e exportação de ferramentas para outros sistemas de modelo. Expressão de pHerry10, uma GEpHI derivada de uma fusão de verdes sensíveis ao pH super eclíptica pHluorin11,12 (SEpH) e vermelho mCherry diferenciação de pH13, em MTs permite a quantificação de transporte H+ , em células únicas MT através da alta K+/nigericin calibração técnica14. Como muitos transportadores de iões mover equivalentes de H+ , quantificação de pH intracelular serve como uma representação funcional do movimento de iões através de uma variedade de transportadores. O modelo de sistema de Drosophila MT também oferece ferramentas poderosas de genéticas em tecido-específica do transgene15 e RNA interferência (RNAi)16 expressão, que pode ser combinado com o celular imagens e ensaios todo-órgão17 , 18 , 19 da função do túbulo para criar um conjunto de ferramentas robusto com integração vertical das moléculas de comportamento. Isto contrasta com muitos outros protocolos para avaliação biologia epitelial, como historicamente, tais medidas têm confiado na intrincada e assustadora micro-dissecção, sofisticado eletrodos íon-seletivos20,21, e sensíveis ao pH caro tinge22 com requisitos de carga restritiva e pobre especificidade celular em tecidos heterogêneos. GEpHIs têm sido utilizados para medir o pHeu em uma variedade de tipos de célula23extensivamente. Primeiros trabalhos exploraram a pH-sensibilidade inerente de proteína fluorescente verde (GFP) para monitorar o pHeu em culturas de células epiteliais24 mas nas duas últimas décadas viram GEpHIs usado em neurônios25, glia26, fungos27 , e células de plantas28. A combinação do potencial de segmentação celular de construções genéticas através da expressão de GAL4/UAS sistema15 e a acessibilidade fisiológica de MT a drosófila isto fazer uma preparação ideal para investigações de pHeu regulamento e transporte de íon epitelial.

pHeu regulamento tem sido estudado há décadas e é vital para a vida. A preparação de MT oferece um modelo robusto de ensinar fisiologia do Regulamento pHeu mas também realizar sofisticadas investigações de pHi Regulamento ex vivo e in vivo. Este protocolo descreve a quantificação do movimento H+ através da membrana basolateral das células epiteliais da drosófila MT usando o NH4Cl ácido de pulso técnica21a carregar, mas como o indicador de pH é geneticamente codificado, esses métodos e o seu enquadramento teórico podem ser aplicados a qualquer preparação passível de transgênese e geração de imagens ao vivo.

Protocol

Todas as etapas neste protocolo estar em conformidade com as diretrizes de uso de animais da clínica Mayo (Rochester, MN). 1. criação de voar Aumento voa e conjunto cruza de acordo com o padrão de criação29.Nota: A expressão fluorescente repórter pelo sistema GAL4/UAS é proporcional à temperatura e, portanto, a criação da temperatura pode ser ajustada para alterar o nível de expressão. Enquanto os níveis de alta expressão muitas vezes levam…

Representative Results

Tecidos saudáveis e identificação adequada de MTs anteriores são vitais para o sucesso do presente protocolo. Durante a dissecção, deve ter cuidado para não diretamente toque os MTs e identificador único-los pelo ureter como segurando os MTs diretamente conduzirá à quebra (Figura 4A– B). Quando MTs são varridos plana para o slide, túbulos devem ser tocados o mínimo possível e movimento em excesso evitado como…

Discussion

O sucesso da quantificação de pH em Drosophila MTs depende inteiramente da saúde de MTs extraídos e a qualidade da montagem e dissecação (Figura A C). Assim, o tratamento cuidadoso do tecido como descrito é imperativo. Slides recém revestidos em PLL substancialmente ajuda MT montagem como eles tendem a ser muito mais adesivo do que os slides que anteriormente foram expostos a solução. Cuidado montagem também ajudarão na identificaç?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado pelo NIH DK092408 e DK100227 de Mfr. AJR foi apoiado por T32-DK007013. Os autores desejam agradecer Dr. Julian A.T. Dow de CapaR-GAL4 e c724-GAL4 estoques de Drosophila . Agradecemos também o Jacob B. Anderson para obter assistência manutenção cruzamentos experimentais de voar.

Materials

Poly-L-Lysine Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

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Cite This Article
Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).

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