JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

الرقم الهيدروجيني "الكمي داخل الخلايا" الضوئية في Epithelia نبيب Malpighian melanogaster المورفولوجية مع الرقم الهيدروجيني "الفلورسنت وراثيا" ترميز مؤشر

Published: August 11, 2017
doi:
10.3791/55698
,
1Department of Physiology and Biomedical Engineering,Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

يمكن تقييم النقل أيون الخلوية غالباً عن طريق مراقبة درجة الحموضة داخل الخلايا (الأس الهيدروجينيأنا). وراثيا مرمز الأس الهيدروجيني-المؤشرات (جيفيس) توفر الكمي البصري لدرجة الحموضة داخل الخلايا في الخلايا سليمة. تفاصيل هذا البروتوكول التحديد الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلايا عن طريق الخلوي السابقين فيفو العيش-التصوير للأنابيب مالباييان من melanogaster المورفولوجية مع فري، زائفة-راتيوميتريك وراثيا ترميز مؤشر الرقم الهيدروجيني.

Abstract

النقل أيون الظهارية أمر حيوي للتوازن أيون النظامية، فضلا عن الحفاظ على التدرجات الكهروكيميائية الخلوية الأساسية. PH داخل الخلايا (درجة الحموضةأنا) يتأثر بالعديد من أيون الناقلين وهكذا رصد درجة الحموضةأنا أداة مفيدة لتقييم نشاط الناقل. الحديثة “وراثيا ترميز” الأس الهيدروجيني-(جيفيس) توفر المؤشرات الضوئية الكمي لدرجة الحموضةوأنا في خلايا سليمة في نطاق الخلايا وسوبسيلولار. يصف هذا البروتوكول الكمي في الوقت الحقيقي للأس الهيدروجيني الخلويةأنا تنظيم في الأنابيب Malpighian (MTs) من melanogaster المورفولوجية عن طريق السابقين فيفو العيش-تصوير فري، جيفي زائفة-راتيوميتريك مع فك مناسبة جداً لتعقب التغييرات الأس الهيدروجيني في سيتوسول. يطير الكبار المستخرجة MTs تتألف من فروع متميزة وظيفيا وشكليا من طبقة وحيدة الخلية ابيثيليا، ويمكن أن تكون بمثابة نموذجا موجوداً وتتبعها وراثيا للتحقيق في النقل الظهارية. جيفيس تقدم العديد من المزايا التقليدية الأصباغ الفلورية حساسة لدرجة الحموضة واقطاب الأيوني الانتقائي. يمكن تسمية جيفيس السكان خلية متميزة شريطة توافر عناصر المروج المناسبة. هذه العلامات مفيدة بشكل خاص في السابقين فيفو، في فيفو، و في الموقع الاستعدادات، التي أصلاً غير متجانسة. كما تسمح جيفيس الكمي pHi في أنسجة سليمة مع مرور الزمن دون الحاجة لتخريج المعاملة أو الأنسجة صبغ المتكررة. العيب الرئيسي من جيفيس الحالي هو الميل إلى تجميع في تضمينات سيتوسوليك استجابة لتلف الأنسجة وبناء التعبير المفرط. وأظهرت أوجه القصور هذه، وحلولها، ومزايا جيفيس المتأصلة في هذا البروتوكول من خلال تقييم للنقل بروتون (H+) باسولاتيرال في الخلايا الرئيسية وتلعبه متميزة وظيفيا ذبابة المستخرجة النظام التجاري المتعدد الأطراف. التقنيات وتحليل ووصف القابلة للتكييف وفقا لمجموعة متنوعة من الأعمال التحضيرية الفقاريات واللافقاريات، ويمكن تحجيمها تطور المقايسة من تدريس مختبرات لتحديد معقدة لايون الجريان عبر الناقلين محددة.

Introduction

والهدف من هذا البروتوكول هو وصف التقدير الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلايا (pHi) باستخدام ترميز وراثيا الأس الهيدروجيني-مؤشر (جيفي) وتبين كيف يمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم باسولاتيرال ح+ النقل في نموذج حشرة (د ميلانوجاستير) هيكل الكلوي، أنبوب مالباييان (طن متري). النظام التجاري المتعدد الأطراف بمثابة أجهزة مطرح ذبابة الفاكهة وتتشابه وظيفيا كليون الثدييات في عدة نواح رئيسية1. يتم ترتيب النظام التجاري المتعدد الأطراف كأزواج 2 من الأنابيب (الأمامي والخلفي) في الصدر والبطن من الطاير. يتألف أنبوب الظهارية خلية واحدة لكل طن متري النشط أيضي الخلايا الرئيسية مع متميزة قمي (لومينال) والأقطاب باسولاتيرال (هيموكول)، فضلا عن الخلايا النجمية المقحم. النظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية تتكون من 3 شكلياً، ووظيفيا، وشرائح متميزة تنمويا، لا سيما الأولى المتوسعة الجزء والجزء الانتقالي الافرازية الجزء الرئيسي، الذي ينضم إلى الحالب2. على المستوى الخلوي ويتم إنجاز النقل أيون عبر الظهارية في التجويف غشاء البلازما قمي الخامس-ATPase3 ومبادل قلوي-معادن/ح+ ، فضلا عن باسولاتيرال نا+-ك+-أتباسي4، القنوات إلى الداخل-مقوم ك+ 5غ+-مدفوعة Cl−/HCO− 3مبادل (NDAE1)6، و Na+-ك+-2 Cl− كوترانسبورتير (نككك؛ Ncc69)7، بينما الخلايا النجمية التوسط Cl– ، ونقل المياه8،9. ويوفر هذا النظام الفسيولوجية المعقدة لكن موجوداً فرصاً ممتازة لتحقيق آليات النقل أيون الذاتية عندما يقترن toolsets الجينية والسلوكية المتنوعة من المورفولوجية.

وكان الأساس المنطقي لهذا البروتوكول لوصف نظام طيع وراثيا لدراسة النقل أيون الظهارية مع إمكانات التكامل من الخلية إلى السلوك وتصدير أدوات لنظم نموذجية أخرى. التعبير عن فري10، جيفي المستمدة من مزيج من الأخضر حساسة لدرجة الحموضة دائرة البروج فائقة فلورين11،12 (SEpH) ومشري غير متحسسة للأس الهيدروجيني الأحمر13، في النظام التجاري المتعدد الأطراف يسمح التحديد الكمي للنقل ح+ في الخلايا طن متري واحد من خلال ارتفاع ك+/nigericin المعايرة تقنية14. كما نقل العديد من الناقلين أيون مكافئات ح+ ، التحديد الكمي لدرجة الحموضة داخل الخلاياوأنا بمثابة تمثيل وظيفية لحركة أيون عبر مجموعة متنوعة من الناقلين. كما يوفر النظام النموذجي المورفولوجية طن متري أدوات الوراثية قوية في التحوير الأنسجة على حدة15 والجيش الملكي النيبالي التدخل ([رني])16 التعبير، التي يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع التصوير بالهاتف الخلوي وفحوصات الجهاز الجامع17 , 18 , 19 وظيفة أنبوب لإنشاء مجموعة أدوات قوية مع التكامل الرأسي من الجزيئات للسلوك. وهذا يقف في المقابل للعديد من البروتوكولات الأخرى لتقييم البيولوجيا الظهارية، كما اعتمدت تاريخيا هذه القياسات على معقدة وشاقة والتشريح الدقيقة والمتطورة من أقطاب الأيوني الانتقائي20،21، والأصباغ غالية حساسة لدرجة الحموضة22 مع متطلبات تحميل التقييدية والفقيرة خصوصية الهاتف الخلوي في الأنسجة غير متجانسة. وقد استخدمت جيفيس لقياس درجة الحموضةوأنا في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا23على نطاق واسع. العمل في وقت مبكر في استغلال الملازمة للأس الهيدروجيني-الحساسية من الأخضر الفلورسنت البروتين (التجارة والنقل) لرصد درجة الحموضةأنا في الخلايا الظهارية مثقف24 ولكن خلال العقدين الماضيين شهدت جيفيس المستخدمة في الخلايا العصبية25،26من إطلاق، الفطريات27 ، والخلايا النباتية28. مزيج احتمال استهداف الخلوية الوراثية بنيات من خلال نظام التعبير GAL4/UAS15 وإمكانية الوصول إلى الفسيولوجية المورفولوجية طن متري جعل هذا إعداد مثالية للتحقيقات للأس الهيدروجينيأنا التنظيم والنقل أيون الظهارية.

تنظيم درجة الحموضةأنا درست على مدى عقود وأمر حيوي للحياة. ويوفر إعداد طن متري متطورة نموذج قوي تدريس علم وظائف الأعضاء تنظيم الأس الهيدروجينيأنا ولكن أيضا إجراء التحقيقات pHi التنظيم السابقين فيفو و في فيفو. هذا البروتوكول يصف التحديد الكمي لحركة ح+ عبر الغشاء باسولاتيرال للخلايا الظهارية من المورفولوجية استخدام NH4حمض نبض Cl تحميل تقنية21مليون طن، ولكن كمؤشر الرقم الهيدروجيني-وراثيا ترميز، هذه الأساليب وإطارها النظري يمكن تطبيقها على أي إعداد قابلة ترانسجينيسيس وتصوير العيش.

Protocol

كافة الخطوات في هذا البروتوكول الامتثال للمبادئ التوجيهية استخدام الحيوان “كلينيك” (روتشستر، مينيسوتا). 1-يطير تربية رفع الذباب وتقاطع مجموعة وفقا لمعيار تربية29.ملاحظة: التعبير مراسل الفلورسنت بنظام GAL4/UAS متناسبة مع درجة الحرارة وهكذا تربية درجة الحرار?…

Representative Results

الأنسجة السليمة والتحديد السليم للنظام التجاري المتعدد الأطراف الأمامية أمران حيويان لنجاح هذا البروتوكول. أثناء التشريح، ينبغي الحرص على اتصال غير مباشر النظام التجاري المتعدد الأطراف والمؤشر الوحيد لهم الحالب كالتي تجتاح النظام التجاري المتعدد الأطراف مباشرة سوف ي…

Discussion

نجاح التحديد الكمي لدرجة الحموضةوأنا في MTs المورفولوجية يعتمد كلياً على صحة المستخرجة من النظام التجاري المتعدد الأطراف ونوعية تركيب وتشريح (الشكل A – ج). وهكذا، المعالجة الدقيقة للأنسجة كوصف الحتمي. شرائح طازجة مغلفة في PLL إلى حد كبير المعونة MT تصاع…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

هذا العمل كان يدعمها DK092408 المعاهد الوطنية للصحة وأيد T32-DK007013 DK100227 على أجر MFR.. الكتاب نود أن نشكر الدكتور جوليان داو أ. ت. GAL4 كابار و c724-GAL4 الأرصدة المورفولوجية . ونشكر أيضا يعقوب باء أندرسون للمساعدة في الحفاظ على الصلبان الطيران التجريبي.

Materials

Poly-L-Lysine Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O’Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O’Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. . Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

Tags

Intracellular PHDrosophila MelanogasterMalpighian Tubule EpitheliaFluorescent Genetically-encoded PH IndicatorBasolateral Proton TransportEpithelial Proton MovementPH RegulationInsect EpithelialMammalian NephronEpithelial CellsIPBSSchneider’s MediumDissectionForceps

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image