Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Optisk kvantificering af intracellulære pH i Drosophila melanogaster Malpighian tubulus epitheler med en fluorescerende genetisk kodet pH indikator

Published: August 11, 2017 doi: 10.3791/55698
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension, Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Cellulære ion transport kan ofte vurderes ved at overvåge intracellulære pH (pH,jeg). Genetisk giver kodet pH-indikatorer (GEpHIs) optisk kvantificering af intracellulære pH i intakt celler. Denne protokol detaljer kvantificering af intracellulære pH via cellular ex vivo live-billeddannelse af Malpighian tubuli af Drosophila melanogaster med pHerry, en pseudo-ratiometric kodet genetisk pH-indikator.

Abstract

Epitelial ion transport er afgørende for systemisk ion homøostase samt vedligeholdelse af væsentlige cellulære elektrokemiske gradienter. Regulering af intracellulært pH (pHjeg) er påvirket af mange ion transportvirksomheder og dermed overvågning pH,jeg er et nyttigt redskab til vurdering af transporter aktivitet. Moderne genetisk kodet pH-indikatorer (GEpHIs) giver optisk kvantificering af pHjeg i intakt celler på cellulært og subcellulært niveau. Denne protokol beskriver real-time kvantificering af cellulære pHjeg regulering i Malpighian tubuli (MTs) af Drosophila melanogaster gennem ex vivo live-billedbehandling af pHerry, en pseudo-ratiometric GEpHI med en pKet velegnet til at spore pH-ændringer i cytosol. Udtrukne voksen flue MTs er sammensat af morfologisk og funktionelt adskilte sektioner af encellede lag epitheler, og kan tjene som en tilgængelig og genetisk tractable model for efterforskning af epithelial transport. GEpHIs tilbyder flere fordele i forhold til konventionelle pH-følsom fluorescerende farvestoffer og ion-selektiv elektroder. GEpHIs kan mærke forskellige cellepopulationer, forudsat at passende promotor elementer er tilgængelige. Denne mærkning er især nyttig i ex vivo i vivoog i situ præparater, som er i sagens natur heterogene. GEpHIs også tillade kvantificering af pHi i intakt væv over tid uden behov for gentagne farvestof behandling eller væv udlægning. Den primære ulempe ved nuværende GEpHIs er tendensen til at aggregere i cytosole optagelser i reaktion på vævsskade og konstruere overdrevne udtryk. Disse mangler, deres løsninger og de iboende fordele af GEpHIs er vist i denne protokol gennem vurdering af basolateral proton (H+) transport i funktionelt adskilte principal og Stjernehus celler af uddraget flyve MTs. De teknikker og beskrevne referenceanalysemetode er let at tilpasse til en bred vifte af hvirveldyr og hvirvelløse præparater, og raffinement af analysen kan skaleres fra undervisning labs indviklede fastsættelse af ion flux via specifikke transportvirksomheder.

Introduction

Målet med denne protokol er at beskrive kvantificering af intracellulære pH (pHi) ved hjælp af en genetisk kodet pH-indikator (GEpHI) og vise, hvordan denne metode kan anvendes til at vurdere basolateral H+ transport i en model insekt (D. melanogaster) renale struktur, Malpighian tubulus (MT). MTs tjene som ekskretionsorganerne af frugtflue og svarer funktionelt til de pattedyr nephron i flere vigtige henseender1. MTs arrangeres som 2 par af tubuli (anterior og posterior) i thorax og abdomen af fluen. Encellede epitelial røret af hver MT er sammensat af metabolisk aktive principal celler med særskilte apikale (luminale) og basolateral (hemocoel) polaritet som indtrængere Stjernehus celler. Forreste MTs består af 3 morfologisk, funktionelt, og udviklingshæmmede adskilte segmenter, navnlig oprindelige forstørrede segment, overgangsbestemmelser segment, og sekretoriske største segment, der slutter sig til ureter2. På det cellulære skala trans-epitelial ion transport i lumen opnås ved en apikale plasmamembran V-ATPase3 samt en alkali-metal/H+ varmeveksler og en basolateral Na+-K+-ATPase4, indad-ensretter K+ kanaler5, Na+-drevet Cl−/HCO3− exchanger (NDAE1)6, og Na+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, mens Stjernehus celler mægle Cl- og vand transportere8,9. Denne komplekse men tilgængelige fysiologisk system giver fremragende muligheder for undersøgelse af endogene ion transportmekanismer når det kombineres med de forskellige genetiske og adfærdsmæssige toolsets i Drosophila.

Begrundelsen for denne protokol var at beskrive en genetisk plastisk system for at studere epitelial ion transport med potentiale for integration fra celle til adfærd og eksport af værktøjer til andre modelsystemer. Udtryk for pHerry10, en GEpHI, der er afledt af en fusion af grønne pH-følsom super-ekliptika pHluorin11,12 (SEpH) og rød pH-ufølsom mCherry13, i MTs tillader kvantificering af H+ transport i enkelt MT celler gennem høj K+/nigericin kalibrering teknik14. Som mange ion transportvirksomheder flytte H+ ækvivalenter, tjener kvantificering af intracellulære pH,jeg som en funktionel repræsentation af ion bevægelse via en lang række transportvirksomheder. Drosophila MT modelsystem tilbyder også stærke genetiske værktøjer i væv-specifikke transgen15 og RNA interferens (RNAi)16 udtryk, som kan kombineres med cellulære imaging og hele-orgel assays17 , 18 , 19 i tubulus funktion til at skabe en robust værktøjskasse med vertikal integration fra molekyler til adfærd. Dette står i kontrast til mange andre protokoller for at vurdere epithelial biology, som historisk set sådanne målinger har stolet på indviklede og skræmmende mikro-dissektion, sofistikeret ion-selektiv elektroder20,21, og dyre pH-følsom farvestoffer22 med restriktive lastning krav og fattige cellulære specificitet i heterogen væv. GEpHIs har været brugt flittigt måle pHjeg i en lang række celle typer23. Tidlige arbejde udnyttes den iboende pH-følsomhed af grøn fluorescerende proteiner (NGL) at overvåge pHjeg i kulturperler epitelceller24 men de seneste to årtier har set GEpHIs anvendt i neuroner25, glia26, svampe27 , og anlægget celler28. Kombinationen af potentialet for cellulære målretning af genetiske konstruktioner gennem GAL4/UAS udtryk system15 og fysiologisk tilgængeligheden af Drosophila MT gøre dette til en ideel forberedelse til undersøgelser af pHjeg forordning og epitelial ion transport.

pHjeg forordning er blevet undersøgt i årtier og er afgørende for liv. MT forberedelse tilbyder en robust model at undervise fysiologi af pHjeg forordning men også udføre sofistikerede undersøgelser af pHi forordning ex vivo og in vivo. Denne protokol beskriver kvantificering af H+ bevægelighed på tværs af basolateral membranen af epitelceller af Drosophila MT ved hjælp af NH4Cl puls syre loading teknik21, men som pH-indikator er genetisk kodet, kan disse metoder og deres teoretiske ramme anvendes på enhver tilberedning medgørlige til transgenese og live imaging.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle trin i denne protokol i overensstemmelse med Mayo Clinic (Rochester, MN) retningslinjerne for brug af dyr.

1. flyve dyrehold

  1. Raise flyver og sæt krydser ifølge standard dyrehold29.
    Bemærk: Fluorescerende reporter udtryk af GAL4/UAS system er proportional med temperatur og dermed opdræt temperaturen kan justeres for at ændre udtryk niveau. Mens høje udtryk niveauer ofte føre til et bedre signal-støj-forholdet er denne betingelse også forbundet med øget cytosole og organellar aggregater, når ved hjælp af normal god landbrugspraksis til rødt fluorescerende proteiner (RFP) fusion konstruktioner såsom pHerry10, 30,31. Hvis sammenlægning er uundgåelig, kvantificering er stadig muligt ved at udføre punkt kalibreringer i hvert eksperiment og normalisering af data, således at forholdet fluorescens af 1.0 svarer til pHjeg 7.0 (Se trin 7.4 notat om kalibrering nedenfor).
  2. Sæt krydser homozygot capaR-GAL432 mænd til homozygot UAS-pHerry10 jomfruelige hunner og homozygote c724-GAL42 hanner til homozygot UAS-pHerry jomfruelige hunner at tillade imaging af pHjeg i principal celler og Stjernehus celler af MT, henholdsvis. Læg 6 UAS-pHerry hunner med 3 GAL4 hanner i frisk hætteglas med mad og orlov til at parre ved 28 ° C.
    Bemærk: Larver skal være tydeligt inden for 4 d og voksne vil begynde at velsmagende omkring dag 10.
  3. Indsamle kvindelige fluer på eclosion og der er afsat til alder for 10 d ved 28 ° C.
    Bemærk: Timingen af eksperimenter kan justeres for at svare til nogen restriktive adfærdsmæssige assays (såsom Ramsay sekretion assay17,19), der vil være korreleret til intracellulære live pH imaging. Mandlige fluer kan bruges men tubuli fra hunner er ofte større og mere robust.

2. forberedelse af Poly-L-lysin dias.

  1. Tegne en 40 x 20 mm kant med en hydrofobe PAP pen omkring toppen af standard 75 x 25 mm dias og der er afsat til tørre i 15 min. ved RT. Brug store coverslips hvis diasene ikke er kompatible med imaging optik.
  2. 2 ml af stock 0,01% Poly-L-lysin (PLL) løsning på hvert dias og der er afsat til 1 h på RT.
  3. Fjern overskydende PLL med en pipette. Gemme løsningen i en 50 mL konisk hætteglas til fremtidig brug. Opbevares ved 4 ° C.
  4. Opsug enhver resterende løsning med en vakuum linje. Køre vakuum linje over den hele dias overflade til at sikre, at ingen løsning på diasene.
  5. Sæt dias afsat til 1 ekstra h på RT før brug. Gemme diasene tør på RT for op til 1 måned i en standard dias bog.

3. forberedelse af dissekere parabol og glas stænger

  1. Tilsættes 0,5 mL af elastomer hærder til 4,5 mL elastomer base i en 35 x 10 mm polystyren petriskål på RT for at producere en dybde på 5 mm. Mix med en engangs pipette spids. Tillad elastomer at helbrede O/N på RT.
    Bemærk: Elastomer skal være klar og fri af bobler. Clearing af bobler kan lettes ved at holde elastomer plader i et tomrum krukke til 10-15 min efter at hælde.
  2. Holde en 5 mm diameter glasstang mellem hænder og Smelt centrum af stangen over en tændt bunsenbrænder samtidig trække enderne fra hinanden. Som glasset trække smelter mere hurtigt til at producere en tynd (0,1 mm) og koniske aksel (figur 1).
    Bemærk: En 45 ° vinkel på skaftet er ofte nyttige i håndtering af tubuli. Dette kan opnås ved at sænke en hånd som skanken trækkes (Se figur 1).
  3. Bryde den tynde skaft i midten med den stumpe side af en single-kantet kulstofstål barberblad. Inspicere den tynde ende af stangen under en dissekere muligheder for at sikre, at pausen er ren.

Figure 1
Figur 1: Opdigte glas stænger til håndtering af Malpighian tubuli.
A - E. Processen med varme og trække en glasstav for at producere en tilspidsning og vinkel egnet til håndtering af MTs. pile betegne retning og omfanget af kraft skal anvendes. F. fotografi af en passende fabrikerede glas værktøj. Skalalinjen = 10 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

4. forberedelse af løsninger og Perfusion System

Bemærk: Perfusion systemer adskiller sig af fabrikanten. Denne protokol er baseret omkring en tyngdekraft fodret 8-kanals åben reservoir med en input flow sats regulator og en vakuum-drevet udstrømning, men metoden for montering MTs som beskrevet her kan tilpasses til at arbejde med enhver perfusion system.

  1. Forberede følgende løsninger:
    1. Alikvot Schneiders medium (40 mL i 50 mL konisk hætteglas) og opbevares ved 4 ° C.
    2. Forberede løsninger (dvs. insekt Phosphate-Buffered saltvand (iPBS) og iPBS med NH4Cl) på RT efter behov i henhold til tabel 1). Varm løsninger til RT før brug på dagen af forsøget.
      Bemærk: iPBS og iPBS med 40 mM NH4Cl kan tilberedes i store mængder (1 L eller mere) og opbevares ved 4 ° C.
    3. Forberede 8 kalibreringsopløsningerne i 500 mL diskenheder på pH = 5.0, 6.0, 6.5, 7.0, 7.3, 7.6, 8.0 og 9.0, som anført i tabel 1 og opbevares ved 4 ° C. Justere pH af hver opløsning ved titrering med N-methyl-D-glucamine (NMDG) og HCl.
    4. På dagen for eksperimenter, varm 5 mL alikvoter af kalibreringsopløsningerne til RT og tilføje stock nigericin løsning (20 mM i dimethylsulfoxid (DMSO)) til at producere en slutkoncentration på 10 µM.
      Forsigtig: Håndtag nigericin med handsker. Behandl alt udstyr, der kommer i kontakt med nigericin som engangs. Nigericin forbliver på glas og plast og vil gå på kompromis biologiske præparater hvis udstyr er genbrugt.
  2. Perfusion system:
    1. Prime perfusion system ved at udfylde alle reservoirer med ddH2O (figur 2). Åbne kanaler en ad gangen for at tillade alle linjer proksimalt for flow sats regulator til at fylde.
      Bemærk: Det kan være nødvendigt at rydde luften i linjerne ved at åbne den blokerede kanal og bruger en stemplet til at drive flow fra reservoiret.
    2. Åbne 2 kanaler og tillade ddH2O til afløb. Når reservoirerne er næsten tomme, skal du udfylde de første reservoir med iPBS og den anden reservoir med NH4Cl-pulserende iPBS. Indstille strømningshastighed til maksimal med flow sats regulator og tillade hver løsning til at flyde til 1 min til at fylde de distale linjer og derefter stoppe strømmen (figur 2).
    3. Position 2 sæt lodning "hjælpende hænder" klemmer på stadiet imaging mikroskop. Placer en klemme på hver side af imaging-platformen.
    4. Forsigtigt opvarmes de distale 0,5 inches af et stykke af kapillar glas (indvendig diameter 1,5 mm, ydre diameter 0,86 mm, længde 100 mm) over en bunsenbrænder. Oprette en 45 ° bøjning af tillader den distale ende til at bøje af tyngdekraften og fjerne glasset fra flammen, når den ønskede vinkel er opnået. Gentag denne proces med et andet stykke af kapillar glas.
    5. Indsæt bøjet glas kapillærer i i-flow linje og vakuum-tilsluttet udstrømning linje, henholdsvis og montere dem i "hjælpende hænder" til at justere dem med den billeddiagnostiske fase af mikroskop (figur 3).

Figure 2
Figur 2: Perfusion System og Imaging konfiguration.
Nødvendige for den fysiologiske vurdering af MT basolateral transport funktion gennem samtidige komponenter live fluorescens billedbehandling og hurtig løsning exchange. Gasledninger vist er valgfri og tillade udvidelse af forsøg til vurdering af HCO3- transport. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Flow skematisk af Perfusion apparater til NH4Cl puls eksperimenter.
Pile skildrer strømningsbane og ventil skiftes point. Løsning flytter fra reservoir til modellen af tyngdekraften flow og trækkes fra modellen kammer affald kolben af vakuum sug. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

5. dissektion af voksen Drosophila forreste Malpighian tubuli.

  1. Samle dissektion parabol og trak glasstav fra afsnit 3, en PLL-belagt slide fra afsnit 2, en selvklæbende perfusion-godt skillevæg, vakuum fedt, en 4 x 2" strimler af forsegling film, 2 par af #5 fine pincet og 40 mL alikvoter af iskold Schneiders medium og RT iPBS.
  2. Sprede vakuum fedt på den forsegling tape, og tryk på den klæbende perfusion-godt skillevæg på båndet til pels nederst med fedt. Skrælle den klæbende perfusion-godt divider og placere det fedt-side-down på toppen af en PLL belagt slide. Fjerne perfusion-godt adskilleren for at forlade individuelle modellen wells spores i hydrofobe fedt.
  3. Sted 200 µL af RT iPBS i fedt-omringet godt på PLL belagt slide og flytte diaset under Stereoskopet.
  4. Sted UAS-pHerry/capaR-GAL4 fluer i en tom flyve hætteglasset og bedøver dem i isbad i 10 min.
    Bemærk: Denne metode af anæstesi, i modsætning til CO2, sikrer, at fluerne ikke dehydrerer.
  5. Hæld iskold Schneiders medium i dissekere fadet og bruge fine pincet til at overføre en enkelt bedøvede kvindelige flue i fadet under et dissekere Stereoskopet.
  6. Holde fluen af thorax med et sæt af tang og bruge den anden til forsigtigt greb bageste af maven. Træk åbne bageste af flyve med pincet kort sagt bevidst bevægelser. Når stortarmen er synlige, greb den distale ende og gratis gut og MTs fra de underliggende tracheoles ved at trække stortarmen fra kroppen gennem gentagne, korte slæbebåde.
    Bemærk: De forreste og bagerste MTs bliver synlig hvor de mødes krydset af midgut, og stortarmen gennem ureter. Det første par MTs at være gratis vil sandsynligvis være den posteriore tubuli, så de omkranser stortarmen. Disse kan være ignoreret (figur 4A).
  7. Knivspids off de forreste MTs på ureter med fine pincet når anden sæt af MTs er fri for maven. Dette vil adskille de forreste MTs fra tarmen og lukke ureter.
  8. Afhente de gratis forreste MTs med trak glasstaven ved at skubbe stang under ureter, sådan at tubuli falder til begge sider. Løft MTs lige op ud af løsningen.
  9. Drej glasstaven, MTs og ureter overholdes på undersiden af stangen og sænke ureter lige ned i diaset. Anbringer ureter og forsegle MTs distale ender ved at trykke på ureter ned på glas dias (figur 4B). Ikke manipulere MTs mere end nødvendigt. MTs bør flydende op i opløsningen med ureter forankret til diaset.
  10. Bruge den fine ende af glasstaven forsigtigt feje hver tubulus på tværs af slide overflade. Brace stang mod diaset for at undgå knusning i tubulus og skub stangen over toppen af tubulus, flytte distale til proksimalt, vedhæfte den fulde længde af hver tubulus til overfladen af PLL-belagt slide (figur 4 c).
  11. Sted på selvklæbende perfusion-godt opdeleren tilbage på diaset til at danne en lille væskefyldte godt over de monterede tubuli.
  12. Placer modellen på stadiet mikroskop. Placer tilstrømningen og udstrømning kapillærer over fjorden og outlet åbning af perfusion godt, henholdsvis.
    Bemærk: Godt divider kan venstre, hvis en åben perfusion kammer ønskes. I dette tilfælde kan tilstrømning og udstrømning kapillærerne justeres modsatte sider af en billeddannelse godt.

6. validering af Imaging protokol og tubulus sundhed

Bemærk: Denne protokol er udført på en inverteret wide-felt epifluorescerende mikroskop med normal god landbrugspraksis (SEpH) og RFP (mCherry) filter sæt (470/40 nm excitation (ex), 515 nm longpass emission (em), 500 nm dichroic og 546/10 nm ex, 590 nm longpass em, 565 nm dichroic), en 10 X / 0,45 luft mål, en monokromatisk kamera til live-billedoptagelse og billedbehandlingsprogrammer. Protokollen kan tilpasses enhver opretstående eller omvendt mikroskop med automatiseret filter Skift mellem normal god landbrugspraksis og RFP optik og image erhvervelse software, selv om optimal eksponering gange, lysintensitet og udsmidningen parametre vil variere. I alle analyser, fluorescens-intensiteten, bør analyseres som betyder pixel intensitet i regionen af interesse (ROI), efter baggrund subtraktion i hver kanal, ved hjælp af en ROI med indeholder ingen fluorescens støder op til signal ROI.

  1. Tænde mikroskopet, lyskilde og billedbehandling system.
  2. Åbne tilknyttede billedbehandlingsprogrammer.
  3. Se igennem okularet og manuelt justere fokus, indtil lumen af MT er klart synlig under gennemlysning.
  4. Klik på fanen "Tilegnelse" i billed analyse software og vælg "2 x 2" i pull-down-menuen "Binning" i afsnittet "Erhvervelse Mode".
  5. Indsæt en 5% neutral density filter i lysbanen at reducere belysning lys og minimere photobleaching.
  6. Klik på normal god landbrugspraksis (SEpH) kanal i menuen "Kanaler", så klik på "Live" til at overholde de fluorescerende signal via kameraet.
  7. Juster skydekontrollen "Tid" for at indstille eksponeringstiden sådan at de lyseste pixelværdier i intensitet histogrammet er ca. 40% af den maksimale værdi, så klik på "Stop" for at stoppe belysningen.
  8. Gentag trin 6.6-6.7 i RFP (mCherry) kanal og bekræfte tilstedeværelsen af de forstørrede første segment af den forreste MT og fraværet af cytosole mCherry aggregater (vejledende vævsskader eller overekspression) (figur 4D).
    Bemærk: Den forstørrede segment skal være klart, da det er den mest proksimale segment af tubulus og diameteren af den indre lumen af dette segment er ~ 20 µm større end i de tilstødende overgangsbestemmelser segment. 2 x 2 pixel binning er ofte tilstrækkelig, men kan forhøjes til yderligere for at reducere den nødvendige belysning intensitet. Typiske eksponeringstider er mellem 150 & 800 ms/kanal. Bruge som lille lys som muligt for at minimere photobleaching. Minimering af photobleaching er afgørende for brugen af dobbelt-fluorophore indikatorer såsom pHerry som de to fluorophores kan blege uafhængigt, dermed afkræfte enhver forholdet kalibrering.
  9. Aktiver en time-lapse imaging protokol ved at klikke på afkrydsningsfeltet "Tidsserier".
  10. Justere "varigheden" i rullemenuen i afsnittet "Tidsserier" til 10 min og "Interval" skyderen til 0 for at angive den samlede fange tid med en maksimal billede erhvervelse sats. Samlede anskaffelsessum rate på 0,2 Hz er ofte tilstrækkelig.
  11. Kontrollere RFP (mCherry) boksene i afsnittet "Kanaler" og normal god landbrugspraksis (SEpH).
  12. Åbn iPBS linjen af perfusion system ved at aktivere den relevante ventil controller og starte imaging-protokollen ved at klikke på "Start eksperiment." Efter 1 min, skifte til NH4Cl puls løsning for 20 s ved at åbne den relevante ventil og lukke iPBS linjen, derefter vende tilbage til iPBS ved at lukke NH4Cl linje og genåbning iPBS ventil. Tillad fuld billedbehandling protokollen at fuldføre før du stopper perfusion system.
    Bemærk: Time-lapse analyse skal afsløre en stabil mCherry signal og en SEpH signal, som øger i overværelse af NH4Cl, slukker efter udvaskning og gradvis bedres.
  13. Udføre en 2-punkts kalibrering.
    1. Fjern den godt skillevæg ved at skrælle det væk fra det underliggende dias og fjern perfusion kapillærer og klemmer fra imaging godt.
    2. Gælde imaging godt med 200 µL pipette 200 µL kalibrering iPBS (pH 7,4, 10 µM nigericin). Fjerne løsningen fra imaging godt med en pipette, og erstatte med en anden 200 µL af kalibreringsopløsningen. Gentag denne proces 4 gange for at sikre komplet løsning udveksling.
    3. Inkuber forberedelse i kalibreringsopløsningen i 30 min før billeddannelse. Gentag imaging protokollen ved hjælp af de samme parametre bestemmes i trin 6.6-6.11, med ændringen af kun 1 min af image capture.
      Bemærk: Perfusion system og kapillærer er ikke nødvendige i dette trin og skal ikke være tilknyttet imaging godt at undgå at udsætte kapillærer til nigericin.
    4. Tilføje 200 µL kalibrering iPBS (pH 9,0, 10 µM nigericin) til billedbehandling godt med 200 µL pipette. Fjerne løsningen fra imaging godt med en pipette, og erstatte med en anden 200 µL af kalibreringsopløsningen. Gentag denne proces 4 gange for at sikre komplet løsning udveksling.
    5. Inkuber forberedelse i den anden kalibreringsopløsningen for 10 min før billeddannelse. Gentag imaging protokollen som i trin 6.13.3.
    6. Anmeld fanget billed stakken i billed analyse software til at bekræfte, at ingen pixel i enten kanal er mættet ved at klikke på "Betyder ROI" og rulle selv billedstak med "Rammen" skyderen under iagttagelse, der ingen værdier rapporteret i intensitet histogram nå den maksimale påviselige værdi. Hvis nogen rammer indeholder pixel, nå den maksimale påviselige intensitet, reducere eksponering tid eller belysning intensitet og gentage afsnit 6.
      Bemærk: Når der oprettet ikke ændrer tænkelig parametre mellem eksperimenter eller kalibrering, medmindre punkt kalibreringer skal bruges i hvert præparat (Se trin 8.3).
  14. Analysere billedstak for at afbilde fluorescerende intensitet og fluorescens ratio (SEpH/mCherry) som funktion af tiden.
    1. Klik på "Betyder ROI" og vælg værktøjet Kombinationstegning. Hold venstre-klik til at spore en ~ 50 µm længde af MT. Højreklik for at færdiggøre tegning ROI, derefter gentage i et område, der støder op til MT til at definere en baggrund ROI (figur 5A).
    2. Klik på "Gennemsnitlig intensitet" under "Målinger." Oprette en tabel med intensitetsværdier ved at klikke på "Export > datatabel > Opret."
    3. Klik på ikonet konfiguration tandhjul og fravælge alle parametre, bortset fra "Tid" og "Betyde intensitet." Skal du højreklikke på fanen for den nyoprettede datatabel, Vælg "Gem som" og eksportere dataene som en .csv-fil.
      Bemærk: Lignende målinger kan også gøres ved hjælp af fri software som ImageJ.
    4. Åbn et regneark tabel og importere datatabellen ved at vælge fanen "Data" efterfulgt af "Fra tekst".
    5. Bruge funktioner i regnearket til at fratrække SEpH baggrund intensitet fra SEpH Signal intensitet på hvert tidspunkt. Gentag denne proces for mCherry signal.
    6. Plot hver kanal intensitet som en funktion af tid ved at markere de kolonner, der indeholder den tid og baggrundskorrigeret intensitet data og derefter klikke på "Indsæt > Scatter (diagrammer) > punktdiagram med lige linjer" (figur 5B).
    7. Bruge regnearksfunktionerne til at beregne SEpH/mCherry fluorescens ratio på hvert tidspunkt.
    8. Plot fluorescens ratio som en funktion af tid ved at markere de kolonner, der indeholder tid og forholdet mellem data og derefter klikke på "Indsæt > Scatter (diagrammer) > punktdiagram med lige linjer" (figur 5 c).

7. fuld kalibrering af pHerry i Malpighian tubuli Ex Vivo.

  1. Dissekere og montere et nyt sæt af anterior MTs, som beskrevet i afsnit 5.
  2. Udveksle iPBS for kalibrering iPBS (pH 7,4, 10 µM nigericin), som beskrevet i trin 6.13.2. Inkuber i 30 min.
  3. Find MTs og indsamle par SEpH/mCherry billeder som beskrevet i trin 6.1-6.11. Udskifte løsningen med en anden bestand af kalibrering iPBS som beskrevet i trin 6.13.4, vent 10 min., og billedet igen. Gentag denne proces indtil SEpH/mCherry forholdet har været afbildet i alle løsninger. Opnå pH 9,0 billeder sidst som modellen sjældent genindvinder fra høj pH-værdi.
  4. Plot fluorescens forholdet mellem SEpH til mCherry fra kalibreringer i otte prøver som en funktion af pålagte pH,jeg som beskrevet i trin 6.14.9. Passe kalibreringsdata med en Boltzmann kurve til at opnå fuld kalibreringsfunktionen ifølge ligning 1 (fig. 5 d). Hvis data er inkonsekvent, plot kalibrering sæt fra hvert prøvemateriale normaliseret sådan, at et fluorescens forholdet mellem 1,0 svarer til pHi 7.0 og re analyser (figur 5E).
    Bemærk: Hvis den sidste proces er nødvendige individuelle eksperimenter skal deres egen indre punkt kalibreringer33 (Se kvantificering fremgangsmåden nedenfor (trin 8.3)).
  5. Ligning 1
    Equation 1
    Hvor R = SEpH/mCherry ratio og en1,2, xoog dx er kurven montering parametre repræsenterer minimum fluorescens ratio, maksimale fluorescens ratio, pKet, og bredden af funktionen henholdsvis. xo = tilsyneladende PedersenKen af pHerry, som kan variere mellem 7.1 og 7.4 celletype og nøjagtig kalibrering betingelser.

8. kvantificering af Basolateral syre ekstrudering fra Ex Vivo Malpighian tubulus epitheler.

  1. Image pHerry-udtrykker Stjernehus celler og pHerry-udtrykker principal celler samtidigt.
    1. Dissekere forreste MTs fra et UAS-pHerry/capaR-GAL4 flyve, som beskrevet i afsnit 5, men ikke overføre MTs fra den dissekere Schneider medium til imaging godt.
    2. Dissekere forreste MTs fra et UAS-pHerry/c724-GAL4 fly i den samme dissekere fad ved hjælp af den procedure, der er beskrevet i afsnit 5.
    3. Overføre MTs 2 sæt ind i den samme imaging godt som beskrevet i trin 5.8-5.11.
      Bemærk: Når svungne arme af MTs til diaset, placere MTs UAS-pHerry/c724-GAL4 og UAS-pHerry/capaR-GAL4 tubuli nær hinanden så pHerry udtryk for hovedstol og Stjernehus celler kan visualiseres i det samme felt ( Figur 6A).
  2. Anvende NH4Cl prepulse som beskrevet i trin 6.12.
    Bemærk: Hvis konsekvent kalibrering (figur 4B) ikke kunne opnås, udføre et punkts kalibrering ved at pHi til 7,0 ved udgangen af hvert eksperiment med kalibrering iPBS (pH 7,0, 10 µM nigericin, 30 min inkubation) efter selvklæbende perfusion-godt divider og perfusion udstyr er blevet fjernet.
  3. Kalibrere spor fra Stjernehus og vigtigste celler af forskellige MT segmenter (ved hjælp af den absolutte eller normaliseret ratio som passende) med ligning 2 og analysere opvågningsfasen efter NH4Cl tilbagetrækning ved at anvende eksponentiel henfald funktioner ved hjælp af statistisk analyse software og at bemærke tænderne konstant (τ) (fig. 6B).
    Ligning 2
    Equation 2
    Hvor R = SEpH/mCherry ratio og en1,2, xoog dx er kurven montering parametre bestemmes af kalibrering i trin 7.4 (ligning 1).
    1. Beregne syre ekstrudering sats (JH +Se ligning 3) som en funktion af pHjeg at tage højde for variationer i hvile pH,jeg og syre lastning mellem præparater34. Bruge de eksponentielle funktioner afledt taktfast 8.3 til at beregne differentialkvotienten af pHjeg for tiden i hvert tidsinterval.
      Ligning 3
      Equation 3
    2. Beregne den iboende stødpudeevne (βjeg; Ligning 4) i cytosol på pHjeg fra starten af hvert interval i trin 8.3.1 baseret på tidligere litteratur (Se ligning 4).
      Bemærk: I Drosophila, den mest grundige karakterisering af β,jeg kommer fra larve motoriske nerve terminaler35 og disse data kan antages for at holde til MT celler i mangel af andre tilgængelige data.
      Ligning 4
      Equation 4
    3. Beregn produktet af βT (fra trin 8.3.2)og dpHjeg/dt (fra trin 8.3.1) for at bestemme JørgensenH + (ligning 3).
      Bemærk: I nominelt bikarbonat-fri løsninger som beskrevet i denne protokol, bikarbonat-afledte stødpudeevne (βb) antages for at være ~ 0 mM. Samlede stødpudeevne (βT) er summen af β,jeg ogβb, og dermed βjeg = βT i mangel af HCO3-/CO236.
    4. Plot JørgensenH + som en funktion af pHjeg i begyndelsen af hvert tidsinterval, som beskrevet i trin 6.14.9.
    5. Anvende eksponentiel henfald funktioner til del af alle datasæt, som overlapper pHjeg ved hjælp af statistisk analyse software. Sammenlign priser på ændring af de deraf følgende funktioner til at sammenligne syre ekstrudering priser mellem celler og MT segmenter (figur 6 c).
      Bemærk: Funktionen mest hensigtsmæssigt anvendes til kurven montering kan ikke altid være en enkelt eksponentiel. Andre funktioner kan erstattes, hvis de forbedrer godhed af fit.
    6. Beregne syre flux (Se ligning 5) som en funktion af pHjeg at tage højde for variationer i Cellestørrelse og form.
      Ligning 5
      Equation 5
      Bemærk: Celle dimensioner kan enten måles direkte i billeder eller tilnærmet. Principal celler kan være repræsenteret som halvdele af et hult rør med følgende dimensioner: indvendige diameter 24 µm; ydre diameter 48 µm; højde 50 µm. overgangsperiodens Stjernehus celler er variabel, men kan være nogenlunde repræsenteret som cylindre med højder på 50 µm og diameter på 10 µm. Se sidste afsnit af Repræsentative resultater nedenfor.
    7. Anvende eksponentiel henfald funktioner til del af alle datasæt, som overlapper pHjeg ved hjælp af statistisk analyse software. Sammenlign priser på ændring af de deraf følgende funktioner til at sammenligne syre strømme mellem celler og MT segmenter (figur 6D).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Sunde væv og korrekt identifikation af anterior MTs er afgørende for succes i denne protokol. Under dissektion, pleje bør tages ikke direkte berøring til MTs og til kun at håndtere dem af ureter som gribende MTs direkte vil føre til brud (figur 4A- B). Når MTs er fejet fladt i diaset, tubuli skal røres så lidt som muligt og overskydende bevægelse undgås, da dette vil skade encellede epitel lag (fig. 4 c). Korrekt dissekeret vil forreste MTs vise jævn fordeling af både røde og grønne fluorescens gennem cytosol af epitelceller og morfologisk særskilte tubulus segmenter. Tubuli beskadiges af forkert perfusion eller mishandling vil vise sammenlægning af røde fluorescens med ingen parrede grønne aggregater og identificeret korrekt posterior MTs vil vise ensartet morfologi fra den proksimale blinde ende på den distale ureter (figur 4D) . 

Ordentlig funktion af pHerry skal bekræftes selv fysiologisk vurdering samt morfologi. Den mest hensigtsmæssig metode til bekræftelse af korrekt pH-sensing er at anvende en NH4Cl puls. Under disse betingelser den grønne SEpH signal bør rapportere forventede pH-ændringer (en stigning i pHjeg under puls som NH3 ind i cellen, en gradvis nedgang i pulsen som NH4+ ind gennem K+ transportvirksomheder og kanaler, og en hurtig forsuring og gradvis genopretning på NH4Cl tilbagetrækning21, mens den røde mCherry signal bør forblive konstant (figur 5A- B). Omfanget af ændringer i SEpH signal vil variere med protokollen og celle type, men mCherry signalet bør være stabil i alle tilfælde. Ændringer i mCherry signal under enkelte eksperimenter viser bevægelse artefakter eller progressive generation af sensor aggregater på grund af celleskader. Sidstnævnte vil forhindre kvantificering af pH,jeg og skal undgås. Efter at have afsluttet NH4Cl puls det er vigtigt at udføre en 2-punkts kalibrering (kalibrering iPBS, pH 7,4 og 9.0, 10 µM nigericin) til at bekræfte en hvilende pHjeg nær 7.4 og sikre, at de aktuelle imaging parametre ikke fører til mætning af Fluorescens påvisning når Fluorescens er maksimeret ved pH 9,0 (figur 5 c). Hvis hviler pH er betydeligt lavere end 7,4, bør protokollen gentages med sunde MTs; og hvis mætning sker ved pH 9,0, protokollen bør gentages med lavere lys intensitet eller eksponering tid. Når passende imaging parametre bestemmes, bør de ikke ændret mellem eksperimenter eller kalibreringer, hvis absolut fluorescens nøgletal skal bruges. Mens pseudo-ratiometric ved pHerry kan give en metode af bevægelse korrektion i præparater tilbøjelige til bevægelse eller ændringer i celle diameter, den absolutte kvantificering af pH,jeg kræver fuld systematisk sammenhæng i pHerry SEpH / mCherry forhold til pHjeg gennem nigericin/høj K+ teknik. Kalibrering af pHerry i sund præparater bør producere konsekvent kalibreringskurverne med en tilsyneladende PedersenKen af 7.1-7.4 afhængigt af celle type og kalibrering betingelser (fig. 5 d). For præparater i hvilke mCherry sammenlægning er uundgåelig, normalisering af forholdet mellem værdier sådan, at et fluorescens forholdet mellem 1,0 svarer til pH børjeg 7.0 udbyttet lignende resultater (figur 5E). Hvis der anvendes punkt kalibreringer og normaliserede kurver, imaging parametre kan være optimeret til hvert præparat. 

Kalibreret pHjeg spor kan bruges til at sammenligne pH regulerende mekanisme mellem celletyper. GAL4/UAS ekspressionssystem i Drosophila kan bruges til at udtrykke pHerry i principal celler og Stjernehus celler i den forreste MT (figur 6A). pHjeg forordning kan vurderes ved syre-loading celler med NH4Cl pulser og kvantificering af pHjeg dækningsgraden. Dette kan opnås ved at montere eksponentielle funktioner til opvågningsfasen i forskellige eksperimentelle betingelser til at udtrække tænderne konstant (τ) som celler med hurtigere H+ efflux vil vise en hurtigere genopretning (og dermed lavere værdier for τ). Baseret på denne analyse, synes Stjernehus celler af MT at have mere robust syre ekstrudering end principal celler (fig. 6B). Denne analyse vil holde så længe de hvilende pHjeg, omfanget af syre lastning og buffering kapacitet er ens mellem eksperimentelle grupper. Men når disse betingelser ikke er opfyldt, det er nødvendigt at tage højde for den observation, at iboende stødpudeevne cytosol (βi) af mange celler selv er pH-afhængige35,37,38 og dermed antallet af pHjeg ændring på forskellige pHjeg muligvis ikke direkte sammenlignelige. I sådanne tilfælde passer eksponentiel kurver til følgende syre ekstrudering fase en NH4Cl puls og tidligere beregnede skøn over iboende stødpudeevne (βjeg) kan bruges til at afbilde den syre ekstrudering sats (JH +) som en funktion af pH,jeg og bestemme kompenseret syre ekstrudering (ligninger 3 & 4). Når forskelle i syre lastning og hvile pH,jeg er tegnede sig for det er indlysende syre ekstrudering i principal celler af den midlertidige segment længere end Stjernehus celler (figur 6 c). Mens overbevisende, denne analyse ikke behandler der målt pH,jeg er en funktion af volumen, mens syre ekstrudering over plasmamembran er en funktion af membran areal. Dividere JørgensenH + af areal til volumen-forholdet på cellen i interesse vil give værdier i mol af syre-ækvivalenter pr. enhed areal pr. tidsenhed (ligning 5), således at korrektion for forskelle i Cellestørrelse og morfologi. Cirka to vigtigste celler omfatte omkredsen af MT i de midlertidige segmenter og dermed enkelt celler kan modelleres som halvdelen af et rør (indre diameter 24 µm, ydre diameter 48 µm, højde 50 µm). Stjernehus celler er mindre og har tendens til at blive bar-formede i den midlertidige segment af MT2. Nøjagtig kvantificering af overfladeareal og volumen er vanskeligt, men selv konservative tilnærmelser af overgangsordning Stjernehus celle form (cylinder med en højde på 50 µm og en diameter på 10 µm) angiver et areal til volumen-forholdet på mindst 2 x, for principal celler. Under hensyntagen hertil afslører at Stjernehus celle syre flux er betydeligt lavere end for overgangsperiodens vigtigste celler, og faktisk nærmer sig at indledende segment principal celler (figur 6D).

Figure 4
Figur 4: Dissektion af voksen Drosophila forreste Malpighian tubuli.
A. skematisk fremstilling af anterior MT fjernelse med 2 par af fine pincet i kølet Schneiders medium. "A. tubulus" = forreste MT. "S. tubulus" = posterior MT. B. Processen med hentning af og monterer udvundet MTs ved hjælp af tynde glas stænger. C. processen med at overholde den fulde længde af udvundet MTs til et dias til billedbehandling og fysiologisk vurdering. D. repræsentant widefield billeder af SEpH (470/510 nm ex / em) og mCherry (556/630 nm ex / em) komponenter af UAS-pHerry drevet af capaR-GAL4 skildrer sund forreste MTs, forreste MTs beskadiget af utilstrækkelig perfusion, og fejlidentificerede posterior MTs. Bemærk at sunde forreste MTs viser en klar forstørrede blinde første segment, en sammensnøret overgangsbestemmelser segment med relativt øget udtryk for UAS-pHerry når drevet af capaR-GAL4, og en distal main segment. Beskadiget MTs display mærkbar aggregater af mCherry fluorescens med ingen tilsvarende SEpH fluorescens. Posterior MTs er ensartet i diameter med ingen morfologisk adskilte segmenter. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Validering og kalibrering af pHerry i Malpighian tubuli.
A. repræsentant widefield billeder af SEpH (470/510 nm ex / em) og mCherry (556/630 nm ex / em) komponenter af UAS-pHerry drevet af capaR-GAL4 skildrer sund forreste MTs. "ROI" mærker signal region af interesse. "BG" mærker baggrund område af interesse, som blev efterfølgende trækkes fra signal ROI i samme kanal. Skalalinjen = 50 µm. B. Relative fluorescens ændringer i SEpH og mCherry signaler i pHerry som svar på en 20 s 40 mM NH4Cl puls. Bemærk, at mCherry signalet er stabil, mens SEpH signal viser en karakteristisk stigning i pulsen (vejledende af alkalization, dvs. øget pH,jeg) og en skarp nedgang efter udvaskning (vejledende af forsuring, dvs. faldt pHjeg). C. fluorescens forholdet mellem pHerry (SEpH/mCherry) beregnet ud fra data i B med yderligere data efter 30 min inkubation i kalibrering iPBS (10 µM nigericin, 130 mM K+, pH 7,4 og 9,0). D. kalibreringskurven fremstillet af absolutte pHerry ratio (SEpH / mCherry) som en funktion af pH,jeg under eksponering til kalibrering iPBS buffer til en af otte pH værdier. Grå cirkler er individuelle værdier form 8 præparater. Sorte firkanter og barer er mean ±SD. kurven er Boltzmann pasform. E. samme data som D normaliseret sådan at fluorescens ratio på pH 7,0 er 1,0. Kurven er ændret sigmoide curve fit (Se trin 7.4, ligning 1). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Kvantificering af syre ekstrudering i Malpighian tubuli epitheler.
A. Widefield billede af SEpH fluorescens (fra pHerry) principal celler i den forreste MT (venstre, drevet af capaR-GAL4 driver) og Stjernehus celler i den forreste MT (højre, drevet af c724-GAL4). Bemærk at Stjernehus celler er bar-formet i den første segment, variabel i den midlertidige segment, og vise forskellige cellulære fremskrivninger i det vigtigste markedssegment. Skalalinjen = 100 µm. B. Kalibreret pHjeg ændringer som reaktion på en 20 s 40 mM NH4Cl puls i regioner af interesse angivet i en (principal celler i overgangsperioden segment, principal celler i den første segment og Stjernehus celler af den midlertidige segment). Stiplede kurver betegne enkelt eksponentiel passer anvendt til syre opvågningsfasen efter NH4Cl tilbagetrækning som erklærede tænderne konstant (τ) værdier stammer. C. syre ekstrudering sats (JH +) afbildet som en funktion pHi afledt af eksponentialfunktionen passer ses i B. Se trin 8.3.1 for JH + beregning (ligning 3). Stiplede kurver er eksponentiel passer anvendes til hver data plot inden for overlappende pHjeg angivet ved den grå boks. D. syre flux afbildet som en funktion pHi afledt af eksponentialfunktionen passer ses i B og ligning 5. Stiplede kurver er eksponentiel passer anvendes til hver data plot inden for overlappende pHjeg angivet ved den grå boks. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

iPBS NH4Cl puls iPBS Kalibrering iPBS
NaCl 121,5 81,5 0
NH4Cl 0 40 0
KCl 20 20 130
Glukose 20 20 20
Buffer HEPES; 8.6 HEPES; 8.6 MES, HEPES eller VANDHANER; 8.6
NaHCO3 10.24 10.24 0
NaH2PO4 (1 H2O) 4.5 4.5 0
NMDG 0 0 30,5
pH 6.8 6.8 Varierer
Osmolaritet 350 ±5 350 ±5 350 ±5

Tabel 1: Eksperimenterende flyve løsninger.
iPBS solutions er forberedt ved stuetemperatur og pH ligger ved titrering med HCl og NaOH. Kalibreringsopløsningen titreres med HCl og NMDG. Buffer kalibreringsopløsning er varieret baseret på ønskede pH [2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (MES) for pH = 4,0-6,0; 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) for pH = 6.5-7.5; N-[tris (hydroxymethyl) methyl] -3-aminopropanesulfonic syre (VANDHANER) for pH = 8,0-9,0]. Alle værdier i mM, undtagen pH (unitless) og osmolalitet (mmol/kg). Stock nigericin i DMSO er føjet til kalibreringsopløsninger til en slutkoncentration på 10 µM lige før brug.

GEpHI Excitation (nm) Emission (nm) pKen Noter
Superecliptic pHluorin (SEpH)11 395, 488 530 7.2 Store lineære område, store fold (50 x) stigning i pH-følsom fluorescens på tværs af lineære område
PT Normal god landbrugspraksis42 390, 475 540 7.3 Godkendt til brug i plantecellerne
Superecliptic pHluorin - mCherry fusion31 488, 556 530, 620 7.2 Producerer uparret mCherry aggregater i nogle celler
ClopHensor40 488, 545 525, 590 6.8 pH og Cl- sensor. Opdateret ClopHensorN30 variant viser mindre sammenlægning i neuroner
pHerry10 488, 556 530, 620 7.2 Opdaterede SEpH-mCherry fusion med linker fra ClopHensor
mNectarine44 558 578 6.9 Korrektion for photobleaching er ofte nødvendigt
pHluorin245 395, 475 509 6.9 Variant af Ratiometric pHluorin12
Jytte47 440, 585 610 7.8 Opdaterede variant af lang-Stokes Skift mKeima49, kompatibel med FLIM NIR 2-foton imaging
pHuji43 566 598 7.7 Variant af mApple; lavere end forventede pH følsomhed i nogle celler
pHtomato46 550 580 7.8 Valideret for at spore vesikulære endocytose, fattige cytocolic pH følsomhed
pHoran443 547 561 7.5 Øget pH-følsom orange fluorescerende proteiner
SypHer-248 427, 504 525 8.1 Lysere variant af ratiometric SypHer51, oprindeligt til mitokondrie målinger

Tabel 2: Liste over udgivne cytosole GEpHIs
Excitation maxima, emission maxima og tilsyneladende PedersenKen værdierne er omtrentlige og kan variere afhængigt af ekspressionssystem, billedbehandling teknik og kalibreringsmetode. FLIM = fluorescens levetid imaging mikroskopi. NIR = nær infrarød.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantificering af pH,jeg succes i Drosophila MTs afhænger helt af sundhed udpakkede MTs og kvaliteten af montering og dissektion (Fig. A - C). Omhyggelig håndtering af væv som således beskrevet bydende nødvendigt. Dias frisk belagt med PLL væsentligt støtte MT montering som de har tendens til at være meget mere lim end dias der har tidligere været udsat til løsning. Omhyggelig montering vil også støtte i identifikationen af særskilte MT segmenter (Figur D). Sund MTs lette kalibrering af pHerry og funktionel vurdering ved at reducere mCherry sammenlægning og giver meget mere konsekvent kvantificering af syre ekstrudering, henholdsvis. I nogle tilfælde er undgår mCherry sammenlægning ikke muligt da de eksperimentelle betingelser kan i sagens natur skade MT epitheler eller producere betydelige overdrevne udtryk for den fluorescerende reporter. I disse tilfælde en pseudo-ratiometric kalibrering normaliseret fluorescens forholdet 1,0 svarer til pHjeg 7.0, og punkt kalibreringer vil tillade kvantificering (Figur E). Bør udvises forsigtighed ved udførelse af punkt kalibreringer for at undgå at udsætte de faste elementer i imaging og perfusion systemer til nigericin som ionophor vil holde sig til glas og plast. Endda pseudo-ratiometric kalibrering er ikke muligt for omstændigheder, hvor en eksperimentel manipulation inducerer cellulære skader under et eksperiment, dvs. denne skade vil forårsage en tilsyneladende progressive stigning i mCherry fluorescens hele forsøget. I sagerne senere SEpH fluorescens signal kan bruges med en normaliseret kalibreringskurven og punkt kalibreringer, med det forbehold, at imaging vil ikke længere rette for bevægelse artefakter og fokale skiftehold.

GEpHIs bærer flere almindelige begrænsninger i forhold til kvantificering af pH,jeg med fluorescerende farvestoffer. Dye fastholdelse kan bruges som en indikator for membran integritet og celle sundhed39, men ingen tilsvarende assay er tilgængelig til GEpHIs brug. Som sådan skal forberedelse Sundhed overvåges gennem uafhængige midler, hvis celleskader forventes for at forvirre resultater. GEpHIs tillade potentielt imaging fra minimalt forstyrret i vivo præparater men væv integritet i sagens natur begrænser eksperimentelle manipulationer og kan gøre punkt kalibreringer umuligt. En anden specifik begrænsning forbundet ved hjælp af pHerry og andre cytosole dual fluorophore pH indikatorer (f.eks. ClopHensor40) stammer fra de to fluorophores tendens til at ændre deres fluorescens uafhængigt af hinanden og pH . RFP sammenlægning artefakter er den mest betydningsfulde manifestation af denne begrænsning, men kvantificering kan også blive kompromitteret af photobleaching af et eller begge fluorophores. Således imaging protokoller meget justeres for at minimere photobleaching, som kan føre til lange eksponeringstider og erhvervelse satser < 0,2 Hz. lange eksponeringstider vil undlader at rapportere hurtige pH,jeg skifter. SEpH fluorescens viser lineær korrelation til pH,jeg fra pH 6,8-7.8 i de fleste præparater, men nøjagtigheden af sådanne målinger afhænger af nøjagtigheden af nigericin/høj K+ teknik. Nigericin fungerer som en K+h+ ionophor og korrekt kalibrering afhængig equilibrating ekstracellulære [K+] med intracellulære [K+]. Estimater af intracellulære [K+] er ikke tilgængelig eller let opnåelige for alle eksperimentelle systemer. Nøjagtighed af pHjeg kvantificering vil kun være så pålidelig som estimater af intracellulære [K+], selv om antallet af relative ændringer i pH,jeg vil være konsekvent. Givet denne begrænsning og den inverse logaritmisk forhold af pH,jeg til intracellulære [H+], det er altid at foretrække frem for rapportdata som satser for ændring i pH,jeg, syre ekstrudering sats (JH +, figur 6 c), eller syre flux (figur 6D) i stedet for absolutte ændringer i pH,jeg. Analyse af data som syre flux har den ekstra fordel at korrigere for forskelle i overfladen er til volumen-forholdet mellem celletyper.

Flere forbehold skal være værdsat, når tolkning data fra voksen flyve MT forberedelse beskrevet i denne protokol. Den morfologiske skelnen mellem oprindelige, overgangsbestemmelser, og vigtigste segmenter er sandsynligvis en forenkling af den sande mangfoldighed af funktionelle og genetiske domæner i MTs2. Mens denne protokol er udviklet til at registrere funktion af basolateral syre transportvirksomheder er det endvidere muligt at apikale transport kan påvirke pHi målinger så godt. Forsegling urinlederne når montering MTs (trin 5.9) sikrer at løsningen udveksling primært opstår på basolateral overflade men para-cellulære og apikale bevægelse af ioner kan stadig påvirke pHi som basolateral transport i sidste ende ændrer den cytoplasmatiske side af lumen/cytosole ion-gradienter. Absolut adskillelse af apikale basolateral funktion kan opnås ved selvstændigt perfusing den luminale og basolateral overflader af MT, men sådanne metoder betydeligt mere teknisk krævende, da de kræver mikropipette cannulation41 .

GEpHIs præsenterer mange fordele i forhold til konventionelle metoder til måling af pH, og disse styrker forstærkes, når kombineret med den genetiske formbarhed og lave omkostninger af Drosophila MT forberedelse. Kvantificering af pH,jeg har historisk påberåbes fluorescerende farvestoffer såsom (2',7'-Bis-(2-Carboxyethyl)-5-(and-6)-Carboxyfluorescein (BCECF)22 eller kompliceret elektrofysiologiske vurdering via ion-selektiv elektroder20 ,21. Som pHerry er genetisk kodet, det kan udtrykkes i specifikke cellulære populationer af bestemte initiativtagere (som vist her i principal celler og Stjernehus celler af MT, figur 6) og er indstillet til brug i alle væv under transgenese, Transfektion eller viral-medieret infektion. Farvestoffer er begrænset af omkostningerne ved individuelle præparater og potentielt kompliceret applikationsprotokoller, som formidler ingen celle specificitet i heterogen væv. Ion-selektiv elektroder kræver specialiseret udstyr til fremstilling og måling, mens pHerry kræver kun widefield epifluorescerende mikroskopi med konventionelle normal god landbrugspraksis og RFP filter sæt. Brugen af farvestoffer og elektroder nødvendiggøre fysiske samt optisk adgang til væv af interesse, mens GEpHIs kan overvåges i frisk udpakkede væv og over tid i vivo. Mulighed for live imaging i intakt præparater er af særlig interesse, når vurderingen af cellulær fysiologi af pHjeg forordning som ingen anden teknologi tillader kvantificering af pHjeg i overværelse af endogene buffering mekanismer.

Drosophila voksen MT forberedelse præsenterer mange attraktive funktioner for dem interesseret i cellulære pH forordning og ion transport. Drosophila dyrehold er billig og værktøjer som genetisk kodet biosensor konstruktioner og RNAi udtryk skær er let tilgængelige fra en række forskellige bestand Centre (Bloomington Drosophila Stock Center på Indiana University; Vienna Drosophila Research Center). Drosophila MTs er sammensat af et enkelt lag af polariseret epitelceller, hvilket gør dem ideelle til undersøgelse af transepithelial ion transport. Basolateral transport kan let analyseres (som vist her) men fuldstændig vurdering af apikale og basolateral ion bevægelse er muligt med mikropipette cannulation41. Derudover organfunktion undersøgelser såsom Ramsay sekretion assay17 og luminale calciumoxalat deposition18 er godt præget og giver mulighed for korrelation af epitel cellulær fysiologi til modeller af væske sekretion og nefrolitiasis, henholdsvis. Mens disse funktioner giver mulighed for robust analyse, gør low-cost og bred tilgængelighed epifluorescerende mikroskopi Drosophila MT model ideel til demonstrationer af cellulære og hele-orgel fysiologi i undervisningen laboratorier.

Beherskelsen af disse metoder tillader kvantificering af pHjeg forordning af basolateral H+ flux i voksen Drosophila MTs, en tilgængelig endnu robust model af transepithelial ion transport. Brug af GEpHIs kulturperler som pHerry kan tilpasses nemt at vurdere pHi forordning i andre hvirvelløse celletyper, pattedyrceller, og i vivo præparater. Udvikling af nye GEpHIs vil sandsynligvis følge af genetisk kodet calcium indikatorer, med nye generationer der spænder over det synlige spektrum og adressering nuværende begrænsninger såsom sammenlægning artefakter30,42, 43 , 44 , 45 , 46 , 47 , 48 , 49. GEpHIs har allerede blevet brugt flittigt til at rapportere mitokondriets matrix pH50,51, og subcellulært målretning strategier findes til at lokalisere biosensorer til endoplasmatiske reticulum52, nucleus 53, synaptiske vesikler12,43, og cytoplasmatisk54 og udvendige flader af cellulære plasmamembran55 (Se tabel 2 for en liste over udgivne reagenser). Som sådan værktøjer bliver tilgængelige vil de tillade vertikal integration af subcellulære pH-regulering med andre aspekter af cellulær fysiologi, såsom Ca2 + håndtering og intracellulær signalering, og hele organfunktion på tværs af en bred vifte af hvirveldyr og hvirvelløse præparater.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH DK092408 og DK100227 til MFR. AJR blev støttet af T32-DK007013. Forfatterne vil gerne takke Dr. Julian A.T. Dow for CapaR-GAL4 og c724-GAL4 Drosophila bestande. Vi takker også Jacob B. Anderson for assistance opretholde eksperimentelle flyve Kors.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly-L-Lysine (PLL) Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16", OD 1/8", thickness 1/32" Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10X/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40X objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 μL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O'Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O'Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

Tags

Biokemi sag 126 Ion transport intracellulære pH epitheler Malpighian tubuli Drosophila fluorescerende reporter genetisk kodet pH indikator pH-regulering live imaging pHerry
Optisk kvantificering af intracellulære pH i <em>Drosophila melanogaster </em>Malpighian tubulus epitheler med en fluorescerende genetisk kodet pH indikator
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rossano, A. J., Romero, M. F.… More

Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter