JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Optische kwantificering van intracellulaire pH in Drosophila melanogaster Malpighian zaadvormende epithelen met een pH van fluorescerende genetisch-gecodeerde Indicator

Published: August 11, 2017
doi:
10.3791/55698
,
1Department of Physiology and Biomedical Engineering,Mayo Clinic College of Medicine, 2Department of Nephrology and Hypertension,Mayo Clinic College of Medicine

Summary

Cellulaire ion vervoer kan vaak worden geëvalueerd door het toezicht van de intracellulaire pH (pHik). Genetisch een Encoded pH-indicatoren (GEpHIs) optische kwantificering van intracellulaire pH in onbeschadigde cellen. Dit protocol gegevens de kwantificering van de intracellulaire pH via cellulaire ex vivo wonen-imaging van Malpighian tubuli van Drosophila melanogaster met pHerry, een pseudo-ratiometric genetisch gecodeerd pH-indicator.

Abstract

Epitheliale ion vervoer is essentieel voor systemische ion homeostase evenals onderhoud van essentiële cellulaire elektrochemische verlopen. Intracellulaire pH (pHik) wordt beïnvloed door vele ion vervoerders en dus controle pHik is een nuttig instrument voor de beoordeling van de activiteit van de vervoerder. Moderne genetisch gecodeerd pH-indicatoren (GEpHIs) een optische kwantificering pHik in onbeschadigde cellen op een cellulaire en subcellular schaal. Dit protocol beschrijft real-time kwantificering van cellulaire pHik regulering in Malpighian tubuli (MTs) van Drosophila melanogaster via ex vivo wonen-imaging van pHerry, een pseudo-ratiometric-GEpHI met een pKeen geschikt voor pH wijzigingen bijhouden in het cytosol. Uitgepakte volwassen vliegen MTs zijn samengesteld uit morfologisch en functioneel verschillende secties van eencellige laag epitheel, en kunnen dienen als een model voor toegankelijk en genetisch hanteerbare voor onderzoek van epitheliale vervoer. GEpHIs bieden verschillende voordelen ten opzichte conventionele pH-gevoelige fluorescente kleurstoffen en ion-Ionselectieve electroden. GEpHIs kan verschillende cel populaties label mits passende promotor elementen beschikbaar zijn. Deze etikettering is vooral handig in ex vivo, in vivoen in situ preparaten, die intrinsiek heterogeen. GEpHIs ook de kwantificering van pHi in intact weefsels na verloop van tijd zonder de behoefte aan herhaalde kleurstof behandeling of weefsel externalization toestaan. Het primaire nadeel van de huidige GEpHIs is de neiging om aggregaat in cytosolische inclusies in reactie op weefselbeschadiging en overmatige expressie op te bouwen. Deze tekortkomingen, hun oplossingen, en de inherente voordelen van GEpHIs zijn in dit protocol door evaluatie van de basolaterale proton (H+) vervoer in functioneel verschillende hoofd- en Notti cellen van uitgepakte vlieg MTs gedemonstreerd. De technieken en analyse beschreven zijn gemakkelijk aanpasbaar aan een breed scala aan gewervelde en ongewervelde preparaten, en de verfijning van de bepaling van het onderwijs labs voor ingewikkelde bepaling van ion flux via specifieke vervoerders kan worden geschaald.

Introduction

Het doel van dit protocol is kwantificering van intracellulaire pH (pHi) met behulp van een genetisch-gecodeerde pH-Indicator (GEpHI) beschrijven en demonstreren hoe deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen basolaterale H+ vervoer in een model insect (overleden melanogaster) renale structuur, de Malpighian zaadvormende (MT). MTs dienen als de uitscheidingsmechanisme organen van de fruitvlieg en functioneel vergelijkbaar zijn met de zoogdieren nefronen in enkele belangrijke opzichten1. MTs zijn gerangschikt als 2 paar tubuli (anterior en posterior) in de borstkas en de buik van de vlieg. De eencellige epitheliale buis voor elke MT is samengesteld uit metabolisch actief belangrijkste cellen met verschillende apicale (luminal) en basolaterale (hemocoel) polariteit evenals tussenliggende Notti cellen. Anterior MTs zijn samengesteld uit 3 morfologisch, functioneel, en ontwikkelingsachterstand afzonderlijke segmenten, met name de aanvankelijke uitgezet segment, overgangs segment en secretoire belangrijkste segment, die naar de urineleider2. Op de cellulaire schaal trans-epitheliale ion vervoer in het lumen wordt bereikt door een apicaal plasmamembraan V-ATPase-3 , evenals een alkali-metalen/H+ -wisselaar en een basolaterale nb+-K+-ATPase4, actieve veredeling-gelijkrichter K+ kanalen5, nb+-gedreven Cl−/HCO3− exchanger (NDAE1)6en nb+-K+-2 Cl− cotransporter (NKCC; Ncc69)7, terwijl Notti cellen Cl– bemiddelen en water transport8,9. Dit complexe maar toegankelijk fysiologische systeem biedt uitstekende mogelijkheden voor onderzoek van endogene ion vervoer mechanismen in combinatie met de diverse genetische en gedragsmatige toolsets van Drosophila.

De reden voor dit protocol was in het beschrijven van een genetisch smeedbaar systeem voor het bestuderen van epitheliale ion vervoer met potentieel voor de integratie van cel tot gedrag en uitvoer van hulpprogramma’s voor andere modelsystemen. Uitdrukking van pHerry10, een GEpHI die zijn afgeleid uit een fusie van groene pH-gevoelige super ecliptica pHluorin11,12 (SEpH) en rode pH-ongevoelig mCherry13, in MTs toelaat kwantificering in vervoermiddelen H+ afzonderlijke MT cellen tot en met de hoge K+/nigericin kalibratie techniek14. Zoals vele ion transporters H+ -equivalenten verplaatsen, dient kwantificering van intracellulaire pHik als een functionele weergave van ion verkeer via diverse transporteurs. Het systeem van Drosophila MT model biedt ook krachtige genetische hulpmiddelen in weefsel-specifieke transgenic15 en RNA interferentie (RNAi)16 expressie, die kan worden gecombineerd met cellulaire beeldvorming en geheel-orgel testen17 , 18 , 19 van zaadvormende functie voor het maken van een robuuste toolset met verticale integratie van moleculen tot gedrag. Dit staat in contrast met veel andere protocollen voor de beoordeling van epitheliale biologie, zoals historisch dergelijke metingen hebben vertrouwd op ingewikkeld en ontmoedigend micro-dissectie, verfijnde ion-Ionselectieve electroden20,21, en dure pH-gevoelige kleurstoffen22 met beperkende laden eisen en arme cellulaire specificiteit in heterogene weefsels. GEpHIs werden gebruikt voor het meten van pHik in een verscheidenheid van cel typen23uitgebreid. Vroege werk benut de inherente pH-gevoeligheid van groen Fluorescent proteïne (GFP) volgen pHik in gekweekte epitheliale cellen24 maar de afgelopen twee decennia heb gezien GEpHIs gebruikt in neuronen25, glia26, schimmels27 , en28van de cellen van de plant. De combinatie van het potentieel voor cellulaire targeting van genetische constructies door middel van de GAL4/UAS expressie systeem15 en de fysiologische toegankelijkheid van de Drosophila MT maken dit een ideale voorbereiding voor onderzoek van de pHik verordening en epitheliale ion vervoer.

pHik verordening decennialang is onderzocht en is essentieel voor leven. De MT-voorbereiding biedt een robuust model om te leren van de Fysiologie van pHik verordening maar ook uitvoeren geavanceerde onderzoeken bij pHi verordening ex vivo en in vivo. Dit protocol beschrijft kwantificering van H+ verkeer over het basolaterale membraan van de epitheliale cellen van de Drosophila MT met behulp van de NH-4Cl pulse zuur laden techniek21, maar als pH-indicator is genetisch gecodeerd, kunnen deze methoden en hun theoretisch kader worden toegepast op elk preparaat vatbaar voor Transgenese en live-imaging.

Protocol

Alle stappen in dit protocol voldoen aan de richtsnoeren voor het gebruik van de dieren van de Mayo Clinic (Rochester, MN). 1. vliegen veehouderij Raise vliegt en set kruist volgens standaard veehouderij29.Opmerking: TL verslaggever expressie door het systeem GAL4/UAS is evenredig met de temperatuur en dus fokken temperatuur kan worden aangepast om te veranderen van expressie niveau. Terwijl hoge expressie niveaus vaak tot een betere signaal-/ ruisverhoudi…

Representative Results

Gezonde weefsels en correcte identificatie van anterior MTs zijn essentieel voor het succes van dit protocol. Tijdens de dissectie, moet worden gewaakt om niet direct touch de MTs en enige greep zal hen door de ureter als aangrijpend de MTs rechtstreeks leiden tot breuk (figuur 4Avan- B). Bij MTs zijn geveegd plat op de dia, de tubuli moeten zo weinig mogelijk worden aangeraakt en overtollige beweging vermeden als dit zal sc…

Discussion

Het succes van kwantificering van pHik in Drosophila MTs hangt volledig af van de gezondheid van uitgepakte MTs en de kwaliteit van de montage en dissectie (Figuur A – C). De zorgvuldige behandeling van weefsel als is beschreven dus noodzakelijk. Dia’s vers gecoat in PLL aanzienlijk steun MT montage als ze de neiging om veel meer lijm dan dia’s die eerder zijn blootgesteld aan oplossing. Zorgvuldige montage zal ook helpen bij de identificatie van de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gesteund door de NIH DK092408 en DK100227 naar MFR. AJR werd gesteund door T32-DK007013. De auteurs bedank Dr. Julian A.T. Dow voor de CapaR-GAL4 en c724-GAL4 Drosophila voorraden. Wij danken ook Jacob B. Anderson voor bijstand behoud van experimentele vliegen kruisen.

Materials

Poly-L-Lysine Solution Sigma-Aldrich P4832 Store at 4 °C, can be reused.
Nigericin Sodium Salt Sigma-Aldrich N7143 CAUTION: Handle with gloves. Store as aliquots of 20 mM stock solution in DMSO at 4 °C.
Adhesive Perfusion Chamber Covers, adhesive size 1 mm, chamber diameter × thickness 9 mm × 0.9 mm, ports diameter 1.5 mm Sigma-Aldrich GBL622105 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Ellsworth Adhesives 184 SIL ELAST KIT 0.5KG Available from multiple vendors.
Helping Hands Soldering Stands Harbor Freight Tools 60501 Available from multiple vendors.
Open Gravity-fed Perfusion System with Valve Controller, 8 to 1 Manifold and Reserviors Bioscience Tools PS-8S Any comparable perfusion system can be used.
Flow Regulator Warner Instruments 64-0221 Can be substituted as needed to match perfusion system.
Schneider's Medium Fisher Scientific 21720024 Store at 4 °C in sterile aliquots.
#5 Inox Steel Forceps Fine Science Tools 11252-20 Can be substituted based on experimenter comfort.
35 mm x 10 mm polystyrene Petri dish Corning Life Sciences Fisher Scientific 08-757-100A Exact brand and size are unimportant.
75 x 25 mm Microscope Slides Corning Life Sciences 2949-75X25 Exact brand and size can vary as long as perfusion wells are compatible.
Filimented Borosilicate Capillary Glass, ID 1.5 mm, OD 0.86 mm, thickness 0.32 mm Warner Instruments 64-0796 Filiment not necessary, glass can be substituted to match perfusion tubing and perfusion wells.
Tygon Tubing, ID 1/16 inch, OD 1/8 inch, thickness 1/32 inch Fisher Scientific 14-171-129 Available from multiple vendors, can be substituted to match perfusion system.
Vacuum Silicone Grease Sigma-Aldrich Z273554 Available from multiple vendors.
Plastic Flow Control Clamp Fisher Scientific 05-869 Available from multiple vendors, sterility not required
Glass rods, 5 mm diameter delphiglass.com 9198 Exact size is personal preference, multiple vendors available
PAP Hydrophobic Pen Sigma-Aldrich Z377821 Available from multiple vendors.
Sealing Film Sigma-Aldrich P7668 Available from multiple vendors.
15 mL Falcon tube BD Falcon 352096 Available from multiple vendors.
50 mL Falcon tube BD Falcon 352070 Available from multiple vendors.
HEPES; 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid Sigma-Aldrich H3375 Available from multiple vendors.
MES; 4-Morpholineethanesulfonic acid monohydrate Sigma-Aldrich 69892 Available from multiple vendors.
TAPS; N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid Sigma-Aldrich T5130 Available from multiple vendors.
10x/0.45 Air Objective Zeiss 000000-1063-139 Comparable objectives can be substituted. 40x objectives can be used for single cell imaging.
Dissecting Stereoscope Zeiss Discovery.V8 Any dissecting stereoscope can be used.
UAS-pHerry transgenic Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 10
capaR-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 32
c724-GAL4 driver line Drosophila melagnogaster Available from Romero Lab First published: Citation 2
Monochromatic High Sensitivity Digital Camera Zeiss Axiocam 506 mono Exact brand and model can vary, can be replaced with any monochromatic high-sensitivity camera suited to live cellular imaging.
GFP/FITC filter set, 470/40 nm ex., 515 nm longpass em., 500 nm dichroic Chroma CZ909 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
RFP/TRITC filter set, 546/10 nm ex., 590 nm longpass em., 565 nm dichroic Chroma CZ915 Any GFP/FITC filer set can be substituted.
Inverted Epifluoescent Microscope Zeiss Axio Observer Z.1 Any comparable microscope with motorized filter switching can be used. Upright microscopes can be used with open perfusion baths and water-immersion objectives.
Statistical Analysis Software Microcal Origin 6.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Image Analysis Software National Institutes of Health ImageJ 1.50i Any software with comparable functionality can be substituted
Image Acquisition Software Zeiss Zen 1.1.2.0 Any software with comparable functionality can be substituted
Single-edged Carbon Steel Razor Blade Electron Microscopy Sciences 71960 Available from multiple vendors.
Microscopy Slide Folder Fisher Scientific 16-04 Available from multiple vendors.
Bunsen Burner Fisher Scientific 50-110-1231 Available from multiple vendors.
Polystrene Drosophila Rearing Vials with Flugs Genesee Scientific 32-109BF Comparable items can be substituted.
2.5 L Laboratory Ice Bucket Fisher Scientific 07-210-129 Available from multiple vendors.
NMDG; N-Methyl-D-glucamine Sigma-Aldrich M2004 Available from multiple vendors.
200 uL barrier pipette tips MidSci AV200 Available from multiple vendors.
200 uL variable volume pipette Gilson Incorporated PIPETMAN P200 Available from multiple vendors.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dow, J. A. T., Romero, M. F. Drosophila provides rapid modeling of renal development, function, and disease. Am J Physiol Renal Physiol. 299 (6), F1237-F1244 (2010).
  2. Sozen, M. A., Armstrong, J. D., Yang, M., Kaiser, K., Dow, J. A. Functional domains are specified to single-cell resolution in a Drosophila epithelium. P Natl Acad Sci USA. 94 (10), 5207-5212 (1997).
  3. Davies, S. A., et al. Analysis and inactivation of vha55, the gene encoding the vacuolar ATPase B-subunit in Drosophila melanogaster reveals a larval lethal phenotype. J Biol Chem. 271 (48), 30677-30684 (1996).
  4. Torrie, L. S., et al. Resolution of the insect ouabain paradox. P Natl Acad Sci USA. 101 (37), 13689-13693 (2004).
  5. Evans, J. M., Allan, A. K., Davies, S. A., Dow, J. A. Sulphonylurea sensitivity and enriched expression implicate inward rectifier K+ channels in Drosophila melanogaster renal function. J Exp Biol. 208 (Pt 19), 3771-3783 (2005).
  6. Sciortino, C. M., Shrode, L. D., Fletcher, B. R., Harte, P. J., Romero, M. F. Localization of endogenous and recombinant Na(+)-driven anion exchanger protein NDAE1 from Drosophila melanogaster. Am J Physiol Cell Physiol. 281 (2), C449-C463 (2001).
  7. Ianowski, J. P., O’Donnell, M. J. Basolateral ion transport mechanisms during fluid secretion by Drosophila Malpighian tubules: Na+ recycling, Na+:K+:2Cl- cotransport and Cl- conductance. J Exp Biol. 207 (Pt 15), 2599-2609 (2004).
  8. O’Donnell, M. J., et al. Hormonally controlled chloride movement across Drosophila tubules is via ion channels in stellate cells. Am J Physiol. 274 (4 Pt 2), R1039-R1049 (1998).
  9. Cabrero, P., et al. Chloride channels in stellate cells are essential for uniquely high secretion rates in neuropeptide-stimulated Drosophila diuresis. P Natl Acad Sci USA. 111 (39), 14301-14306 (2014).
  10. Rossano, A. J., Kato, A., Minard, K. I., Romero, M. F., Macleod, G. T. Na+ /H+ -exchange via the Drosophila vesicular glutamate transporter (DVGLUT) mediates activity-induced acid efflux from presynaptic terminals. J Physiol. 595 (3), 805-824 (2017).
  11. Sankaranarayanan, S., De Angelis, D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The use of pHluorins for optical measurements of presynaptic activity. Biophys J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  12. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  13. Shaner, N. C., et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
  14. Thomas, J. A., Buchsbaum, R. N., Zimniak, A., Racker, E. Intracellular pH measurements in Ehrlich ascites tumor cells utilizing spectroscopic probes generated in situ. Biochemistry. 18 (11), 2210-2218 (1979).
  15. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  16. Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151 (2007).
  17. Dow, J. A., et al. The malpighian tubules of Drosophila melanogaster: a novel phenotype for studies of fluid secretion and its control. J Exp Biol. 197, 421-428 (1994).
  18. Hirata, T., et al. In vivo Drosophilia genetic model for calcium oxalate nephrolithiasis. Am J Physiol Renal Physiol. 303 (11), F1555-F1562 (2012).
  19. Schellinger, J. N., Rodan, A. R. Use of the Ramsay Assay to Measure Fluid Secretion and Ion Flux Rates in the Drosophila melanogaster Malpighian Tubule. J Vis Exp. (105), (2015).
  20. Caldwell, P. C. An investigation of the intracellular pH of crab muscle fibres by means of micro-glass and micro-tungsten electrodes. J Physiol. 126 (1), 169-180 (1954).
  21. Boron, W. F., De Weer, P. Intracellular pH transients in squid giant axons caused by CO2, NH3, and metabolic inhibitors. J Gen Physiol. 67 (1), 91-112 (1976).
  22. Rink, T. J., Tsien, R. Y., Pozzan, T. Cytoplasmic pH and free Mg2+ in lymphocytes. J Cell Biol. 95 (1), 189-196 (1982).
  23. Bizzarri, R., Serresi, M., Luin, S., Beltram, F. Green fluorescent protein based pH indicators for in vivo use: a review. Anal Bioanal Chem. 393 (4), 1107-1122 (2009).
  24. Kneen, M., Farinas, J., Li, Y., Verkman, A. S. Green fluorescent protein as a noninvasive intracellular pH indicator. Biophys J. 74 (3), 1591-1599 (1998).
  25. Raimondo, J. V., Irkle, A., Wefelmeyer, W., Newey, S. E., Akerman, C. J. Genetically encoded proton sensors reveal activity-dependent pH changes in neurons. Front Mol Neurosci. 5, 68 (2012).
  26. Raimondo, J. V., et al. Tight Coupling of Astrocyte pH Dynamics to Epileptiform Activity Revealed by Genetically Encoded pH Sensors. J Neurosci. 36 (26), 7002-7013 (2016).
  27. Bagar, T., Altenbach, K., Read, N. D., Bencina, M. Live-Cell imaging and measurement of intracellular pH in filamentous fungi using a genetically encoded ratiometric probe. Eukaryot Cell. 8 (5), 703-712 (2009).
  28. Gjetting, K. S., Ytting, C. K., Schulz, A., Fuglsang, A. T. Live imaging of intra- and extracellular pH in plants using pHusion, a novel genetically encoded biosensor. J Exp Bot. 63 (8), 3207-3218 (2012).
  29. Greenspan, R. J. . Fly pushing: the theory and practice of Drosophila genetics. , (2004).
  30. Raimondo, J. V., et al. A genetically-encoded chloride and pH sensor for dissociating ion dynamics in the nervous system. Front Cell Neurosci. 7, 202 (2013).
  31. Koivusalo, M., et al. Amiloride inhibits macropinocytosis by lowering submembranous pH and preventing Rac1 and Cdc42 signaling. J Cell Biol. 188 (4), 547-563 (2010).
  32. Terhzaz, S., et al. Mechanism and function of Drosophila capa GPCR: a desiccation stress-responsive receptor with functional homology to human neuromedinU receptor. PloS one. 7 (1), e29897 (2012).
  33. Boyarsky, G., Ganz, M. B., Sterzel, R. B., Boron, W. F. pH regulation in single glomerular mesangial cells. I. Acid extrusion in absence and presence of HCO3. Am J Physiol. 255 (6 Pt 1), C844-C856 (1988).
  34. Chesler, M. The regulation and modulation of pH in the nervous system. Prog Neurobiol. 34 (5), 401-427 (1990).
  35. Rossano, A. J., Chouhan, A. K., Macleod, G. T. Genetically encoded pH-indicators reveal activity-dependent cytosolic acidification of Drosophila motor nerve termini in vivo. J Physiol. 591 (7), 1691-1706 (2013).
  36. Roos, A., Boron, W. F. Intracellular pH. Physiol Rev. 61 (2), 296-434 (1981).
  37. Vaughan-Jones, R. D., Wu, M. L. pH dependence of intrinsic H+ buffering power in the sheep cardiac Purkinje fibre. J Physiol. 425, 429-448 (1990).
  38. Buckler, K. J., Vaughan-Jones, R. D., Peers, C., Nye, P. C. Intracellular pH and its regulation in isolated type I carotid body cells of the neonatal rat. J Physiol. 436, 107-129 (1991).
  39. Bevensee, M. O., Schwiening, C. J., Boron, W. F. Use of BCECF and propidium iodide to assess membrane integrity of acutely isolated CA1 neurons from rat hippocampus. J Neurosci Methods. 58 (1-2), 61-75 (1995).
  40. Arosio, D., et al. Simultaneous intracellular chloride and pH measurements using a GFP-based sensor. Nat Methods. 7 (7), 516-518 (2010).
  41. Wu, Y., Baum, M., Huang, C. L., Rodan, A. R. Two inwardly rectifying potassium channels, Irk1 and Irk2, play redundant roles in Drosophila renal tubule function. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 309 (7), R747-R756 (2015).
  42. Schulte, A., Lorenzen, I., Bottcher, M., Plieth, C. A novel fluorescent pH probe for expression in plants. Plant Methods. 2, 7 (2006).
  43. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  44. Johnson, D. E., et al. Red fluorescent protein pH biosensor to detect concentrative nucleoside transport. J Biol Chem. 284 (31), 20499-20511 (2009).
  45. Mahon, M. J. pHluorin2: an enhanced, ratiometric, pH-sensitive green florescent protein. Adv Biosci Biotechnol. 2 (3), 132-137 (2011).
  46. Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
  47. Tantama, M., Hung, Y. P., Yellen, G. Imaging intracellular pH in live cells with a genetically encoded red fluorescent protein sensor. J Am Chem Soc. 133 (26), 10034-10037 (2011).
  48. Matlashov, M. E., et al. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. Biochimica et biophysica acta. 1850 (11), 2318-2328 (2015).
  49. Kogure, T., et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy. Nat biotechnol. 24 (5), 577-581 (2006).
  50. Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G., Tsien, R. Y. Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. P Natl Acad Sci USA. 95 (12), 6803-6808 (1998).
  51. Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
  52. Stornaiuolo, M., et al. KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex. Mol Biol Cell. 14 (3), 889-902 (2003).
  53. Makkerh, J. P., Dingwall, C., Laskey, R. A. Comparative mutagenesis of nuclear localization signals reveals the importance of neutral and acidic amino acids. Curr Biol. 6 (8), 1025-1027 (1996).
  54. Zacharias, D. A., Violin, J. D., Newton, A. C., Tsien, R. Y. Partitioning of lipid-modified monomeric GFPs into membrane microdomains of live cells. Science. 296 (5569), 913-916 (2002).
  55. McGuire, R. M., Silberg, J. J., Pereira, F. A., Raphael, R. M. Selective cell-surface labeling of the molecular motor protein prestin. Biochem Biophys Res Comm. 410 (1), 134-139 (2011).

Tags

Intracellular PHDrosophila MelanogasterMalpighian Tubule EpitheliaFluorescent Genetically-encoded PH IndicatorBasolateral Proton TransportEpithelial Proton MovementPH RegulationInsect EpithelialMammalian NephronEpithelial CellsIPBSSchneider’s MediumDissectionForceps

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Rossano, A. J., Romero, M. F. Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator. J. Vis. Exp. (126), e55698, doi:10.3791/55698 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image