Summary
एक विधि के लिए कीट कोशिकाओं को तैयार करने और उन्हें पुनः संयोजक mCD1d mCD1d tetramers पैदा proteinand के उत्पादन के उद्देश्य के लिए baculovirus साथ संक्रमित.
Abstract
CD1 प्रोटीन प्रतिजन पेश अणुओं की एक तिहाई वर्ग का गठन. वे कोशिका की सतह glycoproteins, लगभग 50 केडीए ग्लाइकोसिलेटेड भारी जंजीरों कि noncovalently beta2-microglobulin के साथ जुड़े रहे हैं के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. वे बजाय लिपिड पेप्टाइड्स बाँध. हालांकि उनकी संरचना MHC वर्ग मैं और वर्ग द्वितीय प्रतिजन अणुओं पेश CD1 प्रोटीन की समानता की पुष्टि, mCD1d नाली अपेक्षाकृत संकीर्ण, गहरी, और अत्यधिक hydrophobic है और यह दो बाध्यकारी जेब कई शास्त्रीय लिए वर्णित उथले जेब के बजाय MHC प्रतिजन - पेश अणुओं इनकोडिंग. उनके एमिनो एसिड दृश्यों के आधार पर, ऐसी hydrobphobic नाली लिपिड प्रतिजनों के बंधन के लिए एक आदर्श वातावरण प्रदान करता है.
प्राकृतिक हत्यारा टी कोशिकाओं (NKT) उनके TCR उपयोग करने के लिए बाध्य glycolipids या CD1d द्वारा प्रस्तुत की पहचान कर सकते हैं. टी कोशिकाओं लिपिड CD1 द्वारा प्रस्तुत प्रतिक्रियाशील autoimmune और संक्रामक रोगों के खिलाफ संरक्षण में और ट्यूमर अस्वीकृति में शामिल किया गया है. इस प्रकार, की पहचान करने के लिए, शुद्ध और CD1 प्रतिक्रियाशील NKT सेल की प्रतिक्रिया को ट्रैक करने की क्षमता काफी महत्व की है. CD1d साथ अल्फा Galactosyl ceramide (एक Galcer) के tetramers पीढ़ी NKT कोशिकाओं के जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि है. अन्य CD1 अणुओं से निर्माण tetramers भी उत्पन्न किया गया है और इन नए अभिकर्मकों लिपिड प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं के कार्यों का बहुत ज्ञान का विस्तार किया है लिपिड आधारित टीकों के जवाब की निगरानी में क्षमता का उपयोग के साथ और autoimmune रोगों और अन्य के निदान में, उपचार.
Protocol
मैं कक्ष पहले गला लें
TN5 कोशिकाओं के जमे हुए शीशी ले लो, और यह एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में गल. कीट एक्सप्रेस माध्यम से 5ml (Invitrogen, सूची संख्या - 10,486) 25cm 2 टीसी फ्लास्क में जोड़ें. ध्यान दें कि पाँच एक्सप्रेस Glutamine बिना आता है, 100X glutamine कलम strep या 1 लेफ्टिनेंट मीडिया अकेले Glutamine की 10ml जोड़ने की जरूरत है. इसे में TN5 कोशिकाओं जोड़ें और 30 मिनट के लिए एक 27 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सेते हैं. फिर, DMSO के साथ मध्यम धीरे aspirate फ्लास्क के नीचे से जुड़ी कोशिकाओं के बिना परेशान. ताजा माध्यम के 5ml जोड़ें.
द्वितीय. बढ़ रहा है और विस्तार कक्ष
कोशिकाओं को हर दिन मॉनिटर. जब फ्लास्क लगभग 70% मिला हुआ है, दोनों पक्षों पर फ्लास्क पीटने द्वारा निलंबन में कोशिकाओं को लाने के लिए और 175cm 2 फ्लास्क कीट व्यक्त मध्यम और सेल संस्कृति के 5ml के 21 मिलीलीटर जोड़कर कोशिकाओं हस्तांतरण . प्रत्येक T175 फ्लास्क अंतिम मात्रा के रूप में 25-30ml माध्यम के आसपास होना चाहिए. मिला हुआ फ्लास्क भाजित (लगभग 1 मिलियन / एमएल सान्द्र.) 1 / 4 या 1 / 5 के रूप में की जरूरत है. कोशिकाओं को ऊंचा हो जाना मत देना. मार्ग की संख्या की गणना करें कि आप कक्षों को विभाजित है. बढ़ने क्योंकि यह सेल lysis परिणामस्वरूप कोशिकाओं की उम्र बढ़ने का कारण हो सकता है नहीं बीतने संख्या 30 से अधिक है. जब आप 1 मिलियन / मिलीलीटर की एकाग्रता में वांछित मात्रा तक पहुँचते हैं, कोशिकाओं को संक्रमित.
मैं आम तौर पर 2 से 2.5 लीटर, जो आम तौर पर सत्तर 175cm 2 बोतल और लगभग मात्रा बढ़ने. 25 30ml / फ्लास्क, या पाँच 1 लीटर Erlenmeyer बोतल और लगभग. प्रत्येक फ्लास्क में 400ml 500 मिलीलीटर
नोट: आप या तो T-175 प्लग मुहर फ्लास्क या Corning Erlenmeyer फ्लास्क में कोशिकाओं को विकसित कर सकते हैं. Erlenmeyer बोतल में बढ़ कोशिकाओं तेज और आसान है.
III. अंत प्वाइंट कमजोर पड़ने विधि द्वारा वायरस Titering
- प्लेट फ्लैट नीचे 96 एक्सप्रेस पाँच SFM मध्यम 200ul में अच्छी तरह से थाली में 3000-5000 में अच्छी तरह से प्रति कोशिकाओं. कोशिकाओं को 27 डिग्री कम से कम 30 मिनट के लिए सी बसा.
- Baculovirus शेयर के धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाओ. एक 96 अच्छी तरह से यू नीचे की थाली की एक पंक्ति में 1 / 10 कमजोर पड़ने करते हैं, अच्छी तरह से प्रति 250ul का उपयोग करना चाहिए. Dilutions एक्सप्रेस पांच SFM माध्यम बना रहे हैं.
- एक multichannel विंदुक का प्रयोग, कोशिकाओं को अलग dilutions की एक निश्चित राशि (आमतौर पर 20 उल) हस्तांतरण.
- 27 ° 7 दिनों के लिए सी संस्कृति है. बढ़त पंक्तियों से वाष्पीकरण से बचने के लिए, parafilm के साथ थाली के किनारों लपेटो.
- 7 दिनों के बाद, थाली की जाँच करें और निर्धारित जो वायरस के कमजोर पड़ने एक 50% संक्रमण देता है - इस वायरस एकाग्रता में आधा कुओं संक्रमित हैं). फिर एक सूत्र का उपयोग टिटर, जो pfu / मिलीलीटर (pfu - पट्टिका के गठन इकाइयों) में व्यक्त किया है की गणना. सूत्र सबसे baculovirus मैनुअल में पाया जाता है.
चतुर्थ. कोशिकाओं से संक्रमण
वायरस की सटीक टिटर पता यह बहुत महत्वपूर्ण है. वायरस के लिए आवश्यक राशि जोड़ें. वायरल स्टॉक तैयार करने के लिए कोशिकाओं को संक्रमण की नहीं 1 से अधिक (1pfu पांच सेल 1High के लिए) उच्च MOI वायरल परिवर्तन के उत्पादन के लिए होता है की बहुलता (MOI) पर संक्रमित किया जाना चाहिए. प्रोटीन के उत्पादन के लिए, हमेशा की राशि MO1 5-10 है.
उदाहरण:
mCD1d baculovirus के टिटर = 1X108 pfu / एमएल
जोड़ें MOI = 1 (वायरस बढ़ाना) = 20X10 ^ 6 कोशिकाओं / फ्लास्क / 1x10 ^ 8 pfu / एमएल = उल फ्लास्क / 200
MOI = 5 से 10 (प्रोटीन के उत्पादन के लिए) = 20x10 लिए 2ml 1ml ^ 6 कोशिकाओं / फ्लास्क
संक्रमण के बाद 4 दिवस पर, संक्रमित कोशिकाओं पर देखो. वे अलग होना चाहिए, अस्थायी, सूजन और बनाने सॉस.
वी. पुनर्प्राप्त Supernatants
संक्रमित बोतल से मध्यम ले लो, और 250ml नीले टोपी फाल्कन स्पिनिंग बोतलें के लिए स्थानांतरण. वे और autoclaved जा सकता है reused. बोतलें समान रूप से भरें और 200rpm, 20 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर Sorvall जीएसए रोटर में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला लीजिए और आगे की शुद्धि के लिए आगे बढ़ना.
छठी. पुनः संयोजक mCD1d की शुद्धि
- डायलिसिस और 150mm सोडियम फास्फेट बफर में एकाग्रता (7.4 पीएच)
- नी NTA agarose क्रोमैटोग्राफी, 150mm सोडियम फास्फेट 200 मिमी Immidazole के साथ प्रोटीन mCD1d b2m + elute
- भागो Desalting 20mm Tris एचसीएल PH8 बफर का उपयोग Immidazole से छुटकारा पाने के स्तंभ
- MonoQ स्तंभ का उपयोग करने के लिए शेष contaminants को खत्म करने के आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी भागो.
- YM 30 concentrator (Millipore) का उपयोग 1mg/ml ध्यान
- बीरा के enzymatic biotynlation निर्माता प्रोटोकॉल (उत्सुकता) के अनुसार mCD1d
- मुक्त बायोटिन S200 स्तंभ (आकार अपवर्जन Chromatograpy) (पीबीएस) खारा, pH7.4 बफर फॉस्फेट का उपयोग से सफाया कर दिया है. Biotynlated प्रोटीन की 2 से 3 mgs के एक औसत सतह पर तैरनेवाला के 2 लीटर से प्राप्त किया जा सकता है
- एक Galcer CD1d tetramer का उत्पादन.
आदेश में एक Galcer साथ CD1d अणु लोड करने के लिए, घुलनशील biotynlated CD1d b2मीटर रात कमरे के तापमान पर एक Galcer की तीन गुना दाढ़ अतिरिक्त, पीबीएस में 0.5% बीच -20, O.9% सोडियम क्लोराइड में भंग के साथ incubated है. - संयुग्मित streptavidin और कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए incubating tetramers पीई के 4 गुना दाढ़ अधिक के साथ एक Galcer लोड CD1d monomers के मिश्रण से उत्पन्न कर रहे हैं. पर 48 स्टोर डिग्री सेल्सियस
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Discussion
इस प्रक्रिया में, यह दिखाया गया है कैसे आरंभ करने के लिए बढ़ती है, कीट कोशिकाओं को संक्रमित और कैसे इन कोशिकाओं का उपयोग baculovirus टिटर. इस प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण पहलुओं में कोशिकाओं के रखरखाव कर रहे हैं और baculovirus की सटीक टिटर पता. एक बार जब आप CD1 tetramers उत्पन्न किया है, वे glycolipid प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. Baculovirus सिस्टम भी व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं MHC वर्ग द्वितीय, तो इस कार्यविधि का एक बहुत व्यापक प्रयोज्यता है tetramers सहित पुनः संयोजक प्रोटीन, उत्पादन.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Express Five SFM | Serum Free Medium | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Insect Cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamine Pen strep | Antibiotics | Invitrogen | 10378-016 | |
| 25cm2 TC Flask | Plastic | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 175 cm2 TC Flask | Plug seal flask | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Erlenmeyer Flask | Cell Culture Flask | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| YM 30 Concenterator | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| FPLC equipment | GE Healthcare | |||
| BrA Enzyme and Buffer | Biotinylation Kit | Avidity | BIRA500 | |
| Ni-NTA Agarose Column | His Tag Protein Purification Column | GE Healthcare | ||
| Desalting column | To get Rod of Salt from Protein | GE Healthcare | ||
| MonoQ Column | Anion Exchange Chromatgraphy | GE Healthcare | ||
| S200 Column | Size Exclusion Chromatography | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glycolipid | |||
| PE- Streptavidin | For conjugating Protein | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
References
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells. Nature. 434, 520-525 (2005).
- Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules. J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).
- Porcelli, S. A. The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules. Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).
- Sidobre, S., Kronemberg, M. CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells. J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).
