Menneskeinducerte pluripotente stamceller (hiPSCs) anses som et kraftig verktøy for stoff- og kjemisk screening og for utvikling av nye in vitro- modeller for toksisitetstesting, inkludert nevrotoksisitet. Her beskrives en detaljert protokoll for differensiering av hiPSCs i nevroner og glia.
Humane pluripotente stamceller kan differensiere til forskjellige celletyper som kan brukes på humane-baserte in vitro toksisitetsanalyser. En stor fordel er at omprogrammeringen av somatiske celler for å produsere humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) unngår de etiske og lovgivningsmessige problemene knyttet til bruken av humane embryonale stamceller (hESCs). HiPSCs kan utvides og effektivt differensieres til forskjellige typer nevrale og glialceller, som tjener som testsystemer for toksisitetstesting, og spesielt for vurdering av forskjellige veier involvert i nevrotoksisitet. Dette arbeidet beskriver en protokoll for differensiering av hiPSCs i blandede kulturer av nevron- og glialceller. Signalveiene som er regulert og / eller aktivert ved neuronal differensiering er definert. Denne informasjonen er kritisk for anvendelsen av cellemodellen til det nye toksisitetsprøveparadigmet, der kjemikalier vurderes ut fra deres evne til å peRturb biologiske veier. Som et bevis på konseptet ble rotenon, en inhibitor av mitokondriell respiratorisk kompleks I, brukt til å vurdere aktiveringen av Nrf2 signalveien, en nøkkelregulator av antioksidant-respons-elementet (ARE) -driven cellulær forsvarsmekanisme mot oksidativ stress .
Den amerikanske forskningsrådets rapport 1 forestilte et nytt toksisitetsprøveparadigm hvor reguleringstoksisitetstesting skulle forskyves fra en tilnærming som baserer seg på fenotypiske endringer observert hos dyr til en tilnærming som fokuserer på mekanistiske in vitro- analyser ved bruk av humane celler. Pluripotente stamceller (PSC) derivater kan representere alternativer til kreftcellemodeller, da de oppnådde celler kan ligner de fysiologiske tilstandene av humane vev og gi mer relevante verktøy for å studere kjemisk fremkalte bivirkninger. De to hovedtyper av PSC-kulturer som er mest lovende for toksisitetstesting er humane embryonale stamceller (hESCs) og humant induserte pluripotente stamceller (hiPSCs), som for tiden er mye brukt innen grunnforskning og regenerativ medisin 2 , 3 . Denne kompetansen kan nå utnyttes for utvikling av en ny klasse toxicoloGiske in vitro tester med sikte på å identifisere de forstyrrede fysiologiske banene som er involvert i utviklingen av bivirkninger in vivo . Testmetoder for reguleringssikkerhetsvurderinger basert på hESCs vil imidlertid ikke sannsynligvis bli akseptert av alle EU-landene og landene over hele verden på grunn av mulige etiske bekymringer og ulike nasjonale lovgivningspolitikker som regulerer bruken av embryoavledede celler.
HiPSCs deler egenskaper som ligner hESCs 4 , 5 og har stort potensial for in vitro- metoder, både for å identifisere terapeutiske mål, samt for sikkerhetsvurderinger. I tillegg reduserer hiPSC-teknologien begrensningene i et begrenset donorbasseng og de etiske problemene knyttet til embryo-avledede celler. En stor utfordring for hiPSC er demonstrasjonen om at disse cellene reproduserbart kan danne et betydelig utvalg av toksikologisk relevante cellederivater,Med egenskaper og responser som er typiske for humane vev. Forhåndsdefinerte nivåer av de valgte markørene brukes vanligvis til å karakterisere cellepopulasjoner etter differensieringsprosessen og å gi innsikt i stabiliteten av differensieringsprosessen.
Tidligere arbeider evaluerte egnethet av hiPSCs for å generere blandede kulturer av nevron- og glialceller og for å vurdere effekten av rotenon, en inhibitor av mitokondriell respiratorisk kompleks I, ved aktivering av Nrf2-banen, en nøkkelregulator for antioksidant-forsvarsmekanismer i Mange celletyper 6 , 7 .
Dette arbeidet beskriver en protokoll som brukes for differensiering av hiPSCs i blandede nevron- og glialkulturer, og gir detaljer om signalveiene (gen- og proteinnivå) som aktiveres ved neuronal / glialdifferensiering. I tillegg viser arbeidet representative resultater som viser hvordan detteHiPSC-avledet nevron- og glialcellemodell kan brukes til å vurdere Nrf2-signalaktivisering indusert ved akutt (24-h) behandling med rotenon, som muliggjør vurdering av oksidativ stressinduksjon.
IMR90 fibroblaster ble omprogrammert til hiPSCs ved I-Stem (Frankrike) ved viral transduksjon av 2 transkripsjonsfaktorer (okt4 og sox2) ved anvendelse av pMIG vektorer 6 . Analoge HiPSC-modeller kan også brukes. Protokollene beskrevet nedenfor oppsummerer alle stadier av differensiering av hiPSCs i neurale stamceller (NSC) og videre inn i blandede kulturer av postmittotiske nevroner og glialceller (trinn 1 og 2, se også EURL ECVAM DBALM-nettsiden for en detaljert beskrivelse av Protokollen) 8 .
En tilleggsprotokoll for isolering, utvidelse, kryopreservering og videre differensiering av NSC i blandede nevroner og glialceller er beskrevet i trinn 3 og 4 (se også EURL ECVAM DBALM viBsite for en detaljert beskrivelse av denne protokollen) 9 . Trinn 5 beskriver analysene som kan gjøres for å vurdere cellens fenotypiske identitet under de flere stadier av engasjement og differensiering.
Dette arbeidet beskriver en robust og relativt rask protokoll for differensiering av IMR90-hiPSCs i postmittotiske nevroner og glialceller. Tidligere publiserte neuronal differensieringsprotokoller basert på hESCs og hiPSCs gir vanligvis høye prosentvis av nevrale forløpere 25 , 26 og et signifikant antall neuronale målceller 27 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 . Analogt er differensieringsprotokollen beskrevet her egnet for å generere heterogene kulturer av GABAergic, glutamatergiske og dopaminerge neuronale celler, sammen med glia og en diskret andel av nestin + -celler. Tilstedeværelsen av glutamatergiske (~ 35-42%) og GABAergic (~ 15-20%) nevrale celler antyder atDenne kulturen har forløp, kortikale egenskaper, og tilstedeværelsen av et diskret antall dopaminerge nevroner (~ 13-20%) kan også indikere midbrainspesifikitet. Videre kan permanentheten til en beskjeden andel av nestin + -celler være egnet for undersøkelsen av nevrogenese og de mulige effektene av kjemikalier på NSC, som hovedsakelig er begrenset til både hippocampus og subventrikulær sone (SVZ) av forebrain 34 . Ytterligere immuncytokjemiske og genuttrykksanalyser vil bidra til å bedre definere den regionale spesifisiteten av de differensierte cellederivatene.
De to mest kritiske trinnene i differensieringsprotokollen beskrevet i dette dokumentet er: (i) kutting av hiPSC-kolonier i homogene fragmenter (som er kritisk for generering av EB med homogene størrelser) og (ii) kutting av neuroektodermale strukturer (rosetter ) For NSC-differensiering, som krever betydelig manuell ferdighetOg presisjon for å unngå å samle mesodermale og endodermale celler som kan redusere proporsjonene av nevroner og glialceller oppnådd ved differensiering.
Det er avgjørende å karakterisere fenotypene til cellene under ekspansjon (som utifferentierte kolonier eller NSC) og under alle differensieringstrinn. Spesielt bør gen- og proteinuttrykksprofiler av nevron / glialcelle-derivatene vise oppregulering og aktivering av nevronrelaterte signalveier, mens uttrykket av pluripotensmarkører bør reduseres.
Genereringen av EB og neuroektodermale derivater (rosettes) kan være manuelt utfordrende og utsatt for variabilitet. Av denne grunn utviklet vi en protokoll for utvidelse av rosett-avledede NSC og deres videre differensiering i nevron / glialceller.
Mulige begrensninger av denne differensieringsprotokollen er hovedsakelig (i) den relativt lave prosentandelen av dIfferentiated glialderivater og (ii) mangelen på modne neuronale nettverksfunksjoner (som vist ved mangel på sprekker). Videre kan spesifikke subpopulasjoner av astrocytter fungere som primære progenitorer eller NSCs 35 . Mens nestin / GFAP dobbelt positive celler ikke ble observert i denne differensierte cellekulturen (data ikke vist), er det hypoteset at GFAP + -cellene i disse blandede kulturer er astrocytiske stamceller og astrocytter. Det er plausibelt at ved å forlenge tiden for differensiering, kan antallet astrocytter øke, og deres morfologi kan bli mer moden, som allerede angitt av tidligere verk fra Zhangs gruppe 36 , 37 .
I det nye toksisitetsprøveparadigmet er kunnskap om kjemisk induserte forstyrrelser av biologiske veier av største betydning når man vurderer kjemisk motgang. Derfor bør in vitro testsystemer kunneRelaterer bivirkninger til forstyrrelser av signalveier, i henhold til begrepet bivirkningsvei (AOP). Som et bevis på konseptet kan rotenon brukes til å vurdere aktiveringen av Nrf2-banen, som er involvert i det cellulære forsvaret mot oksidativ eller elektrofil stress 38 , og oksidativt stress er en viktig og vanlig nøkkelhendelse i ulike AOPer som er relevante for Utviklings- og voksen nevrotoksisitet 39 .
Rotenon bør fremkalle aktiveringen av Nrf2-banen, som kan demonstreres ved Nrf2-proteinkjernetranslokasjon og økt ekspression av Nrf2-mål-enzymer, inkludert NQO1 og SRXN1. Det har blitt funnet at rotenon induserer en doseavhengig økning av GFAP-proteinnivåer, som indikerer astrocytaktivering 40 , 41 . Rotenon reduserer også antall dopaminerge (TH + ) celler, som er i samsvar med previOus in vitro og in vivo studier som viser rotenonavhengig dopaminerge celledød, siden denne typen neuron er spesielt følsom for oksidativt stress 21 , 22 , 23 .
Som konklusjon er denne hiPSC-avledede nevron- og glialcellekulturmodellen et verdifullt verktøy for å vurdere de nevrotoksiske virkninger av kjemikalier som fremkaller oksidativt stress som resulterer i Nrf2-pathway-aktivering. Siden denne differensieringsprotokollen tillater generering av blandede kulturer av nevronceller (GABAergic, dopaminergic og glutamatergic neurons) og astrocytter, kan det vise seg egnet til å studere kronestrekningen mellom nevroner og glia i fysiologiske og patologiske forhold, som for eksempel i neurodegenerative sykdommer ( F.eks. Parkinsons sykdom). Videre kan tilstedeværelsen av en betydelig andel NSCs bidra til å vurdere de mulige effektene av kjemikalier på neurale progEnitors, som er kjent for å være hovedmål for kjemisk induserte mutasjoner eller virusinfeksjoner 42 .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gjerne takke Dr. Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Frankrike), for å gi IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari og Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Italia); Dr. Simone Haupt (Universitetet i Bonn, Tyskland); Dr. Tiziana Santini (italiensk institutt for teknologi, Roma), for å gi råd om immunfluorescensfarging evaluering; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo, og Dr. Luca Persano (Universitetet i Padua, Italia), for deres bidrag til RPPA-analysen og antistoffvalidering. Finansiering: dette arbeidet ble støttet av EU-finansiert prosjekt "SCR & Tox" (Grant Agreement nr. 266753).
Complete hiPSC medium: | |||
mTeSR1 Basal Medium | Stem Cell Technologies | 05851 | (Step 1.2.6). Complete mTeSR1 is stable when stored at 2 – 8°C for up to 2 weeks. 5X Supplements can be dispensed into working aliquots and stored at -20°C. Use frozen aliquots within 3 months. |
mTeSR1 5X Supplements | Stem Cell Technologies | 05852 | |
Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | 1:100 (Step 1.1). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 ul aliquots and store them in -80°C. For coating, dilute 200ul aliquot in 20 ml of DMEM/F12 medium. |
CryoStem Freezing Medium | Stemgent | 01-0013-50 | Freeze ~ 100 fragments/250 ul/vial (Step 1.2.1) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
hiPSC EB medium: | |||
Knockout DMEM | Thermo-Fisher | 10829-018 | (Step 2.1.7) |
Knockout Serum Replacement (KOSR) | Thermo-Fisher | 10828-028 | 20% final concentration (Step 2.1.7) |
Non-Essential Amino Acids | Thermo-Fisher | 11140-035 | (Step 2.1.7) |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 2.1.7) |
L-Glutamine 200 mM Solution | Thermo-Fisher | 25030-081 | 2 mM final concentration (Step 2.1.7) |
β-Mercaptoethanol | Thermo-Fisher | 31350-010 | 50 µM final concentration (Step 2.1.7) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Complete neuroepithelial induction medium (NRI): | |||
DMEM/F12 | Thermo-Fisher | 3133-038 | (Step 2.3.1) |
Non-Essential Amino Acids | Thermo-Fisher | 11140-035 | (Step 2.3.1) |
N2 Supplement | Thermo-Fisher | 17502-048 | (Step 2.3.1) |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 2.3.1) |
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg | Sigma-Aldrich | H3149-100KU | 2 µg/ml final concentration (Step 2.3.1) |
bFGF | Thermo-Fisher | 13256-029 | 20 ng/ml final concentration added before use (Step 2.3.1) |
Matrigel Basement Membrane Matrix | Corning | 354234 | 1:100 (Step 2.2). Thaw Matrigel on ice, prepare 200 ul aliquots and store them in -80°C. For coating, dilute 200 ul aliquot in 20 ml of cold DMEM/F12 medium. |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | 1:100 (Step 2.2). Dilute in PBS 1X. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Complete Neuronal Differentiation medium (ND): | |||
Neurobasal Medium | Thermo-Fisher | 21103049 | (Step 2.4.11) |
B-27 Supplements (50x) | Thermo-Fisher | 17504044 | (Step 2.4.11) |
N2 Supplement | Thermo-Fisher | 17502-048 | (Step 2.4.11) |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 2.4.11) |
GDNF | Thermo-Fisher | PHC7045 | 1 ng/ml final concentration. Added before use. (Step 2.4.11) |
BDNF | Thermo-Fisher | PHC7074 | 2.5 ng/ml final concentration. Added before use. (Step 2.4.11) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neural induction medium (NI): | |||
DMEM/F12 | Thermo-Fisher | 3133-038 | (Step 3.3) |
Non-Essential Amino Acids | Thermo-Fisher | 11140-035 | (Step 3.3) |
N2 Supplement | Thermo-Fisher | 17502-048 | (Step 3.3) |
Penicillin/Streptomycin | Thermo-Fisher | 15140-122 | 50 U/mL final concentration (Step 3.3) |
Heparin Grade I-A, ≥180 USP units/mg | Sigma-Aldrich | H3149-100KU | 2 µg/ml final concentration (Step 3.3) |
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo-Fisher | 12587010 | (Step 3.3) |
L-Glutamine 200 mM Solution | Thermo-Fisher | 25030-081 | 2 mM final concentration (Step 3.3) |
bFGF | Thermo-Fisher | 13256-029 | 10 ng/ml final concentration. Added before use (Step 3.3) |
EGF | Thermo-Fisher | PHG6045 | 10 ng/ml final concentration. Added before use (Step 3.3) |
BDNF | Thermo-Fisher | PHC7074 | 2.5 ng/ml final concentration. Added before use (Step 3.3) |
Defined Trypsin Inhibitor (DTI) | Thermo-Fisher | R007-100 | Pre-warm at 37°C. Add an equal amount of DTI to Trypsin-EDTA (Step 3.10) |
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Thermo-Fisher | 15400054 | 1:10. Dilute Trypsin-EDTA in PBS 1x (without calcium and magnesium), pre-warm the solution at 37°C (Step 3.8) |
CryoStor cell cryopreservation medium | Sigma-Aldrich | C2874-100ML | (Step 4.2) |
Trypan Blue (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | multiple manufacturers/suppliers |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
TaqMan Probesets and reagents for gene expression analysis: | |||
RNAqueous-Micro kit | Thermo-Fisher | AM1931 | (Step 5.1.6) |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits | Thermo-Fisher | 4368814 | |
TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo-Fisher | 4369016 | |
GFAP | Thermo-Fisher | Hs00909233_m1 | |
MAP2 | Thermo-Fisher | Hs00258900_m1 | |
NQO1 | Thermo-Fisher | Hs02512143_s1 | |
SRXN1 | Thermo-Fisher | Hs00607800_m1 | |
HMOX1 | Thermo-Fisher | Hs01110250_m1 | |
GSR | Thermo-Fisher | Hs00167317_m1 | |
PAX6 | Thermo-Fisher | Hs01088112_m1 | |
NES | Thermo-Fisher | Hs00707120_s1 | |
GRIA1 | Thermo-Fisher | Hs00181348_m1 | |
GAP43 | Thermo-Fisher | Hs00967138_m1 | |
GABRA3 | Thermo-Fisher | Hs00968132_m1 | |
GABRA1 | Thermo-Fisher | Hs00168058_m1 | |
NR4A2 | Thermo-Fisher | Hs00428691_m1 | |
TH | Thermo-Fisher | Hs00165941_m1 | |
GAPDH | Thermo-Fisher | Hs02758991_g1 | |
ACTB | Thermo-Fisher | Hs99999903_m1 | |
MAPT | Thermo-Fisher | Hs00902194_m1 | |
SYP | Thermo-Fisher | Hs00300531_m1 | |
NANOG | Thermo-Fisher | Hs04260366_g1 | |
POU5F1 (OCT4) | Thermo-Fisher | Hs04195369_s1 | |
SOX1 | Thermo-Fisher | Hs01057642_s1 | |
AFP | Thermo-Fisher | Hs00173490_m1 | |
KRT18 | Thermo-Fisher | Hs01941416_g1 | |
NPPA | Thermo-Fisher | Hs00383230_g1 | |
T | Thermo-Fisher | Hs00610080_m1 | |
NCAM1 | Thermo-Fisher | Hs00941821_m1 | |
NR4A1 | Thermo-Fisher | Hs00374226_m1 | |
PHOX2A | Thermo-Fisher | Hs00605931_mH | |
PHOX2B | Thermo-Fisher | Hs00243679_m1 | |
NARG2 | Thermo-Fisher | Hs00973298_g1 | |
SLC18A3 | Thermo-Fisher | Hs00268179_s1 | |
SLC5A7 | Thermo-Fisher | Hs00222367_m1 | |
ISL1 | Thermo-Fisher | Hs00158126_m1 | |
LHX3 | Thermo-Fisher | Hs01033412_m1 | |
TaqMan Human Protein Kinase Array | Thermo-Fisher | 4418721 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies and reagents for immunostaining: | |||
B-III-tubulin (Tuj1) | Covance | MMS-435P | 1:500 (Step 5.2.5). Other antibodies may also be used. |
MAP2 | Sigma Aldrich | M4403 | 1:500 |
NF200 | Sigma Aldrich | N4142 | 1:1000 |
GFAP | Acris Antibodies GmbH | AP02002SU-N | 1:500 |
Nestin | Sigma-Aldrich | N5413 | 1:200 |
synaptophysin (SYN) | Abcam | AB14692 | 1:200 |
Tau | Thermo-Fisher | MA5-12808 | 1:100 |
Nrf2 | Abcam | AB62352 | 1:200 |
Keap1 | Abcam | AB66620 | 1:200 |
sulfiredoxin1 (SRXN1) | Abcam | AB92298 | 1:200 |
NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) | Abcam | AB2346 | 1:200 |
OCT4 | Millipore | MAB4401 | 1:100 |
SSEA3 | Millipore | MAB4303 | 1:100 |
Tra1-60 | Millipore | MAB4360 | 1:250 |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | 1:200 |
Gamma-aminobutyric acid (GABA) | Sigma-Aldrich | A0310 | 1:100 |
Vesicular glutamate transporter 1 (VGlut1) | Abcam | AB72311 | 1:500 |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148-500G | 4% (4% formaldehyde can also be used) |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo-Fisher | 14190144 | |
Triton-X-100 Solution | Sigma-Aldrich | 93443-100ML | 0.1% |
BSA 35% | Sigma-Aldrich | A7979-50ML | 3.5% |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 594 conjugate | Thermo-Fisher | SA5-10040 | 1:500. (Step 5.2.7) Other fluorochrome-conjugated secondary antibodies may also be used. In this case, appropriate dilutions should be tested by the enduser. |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate | Thermo-Fisher | SA5-10166 | 1:500 |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross Adsorbed Secondary Antibody, DyLight 488 conjugate | Thermo-Fisher | SA5-10086 | 1:500 |
DAPI Solution (1 mg/ml) | Thermo-Fisher | 62248 | 1:1000 (Step 5.2.7) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies for Reverse Phase Protein Array (RPPA): | |||
4E-BP1 (S65) | Abcam | AB81297 | 1:250 (Note after step 5.2.8) |
Akt (T308) | Cell Signaling | 9275 | 1:100 |
Akt (S473) | Cell Signaling | 9271 | 1:100 |
AMPKalpha (T172) | Cell Signaling | 2531 | 1:100 |
AMPKbeta1 (S108) | Cell Signaling | 4181 | 1:100 |
ATF-2 (T71) | Cell Signaling | 9221 | 1:100 |
c-Jun (S63) | Cell Signaling | 9261 | 1:200 |
c-Jun (S73) | Cell Signaling | 9164 | 1:200 |
c-Kit (Y719) | Cell Signaling | 3391 | 1:250 |
CREB (S133) | Cell Signaling | 9191 | 1:100 |
EGFR (Y1068) | Cell Signaling | 2234 | 1:50 |
ErbB2/HER2 (Y1248) | Cell Signaling | 2247 | 1:100 |
ERK 1/2, p44/42 (T202/Y204) | Cell Signaling | 9101 | 1:2000 |
GSK-3alpha (S21) | Cell Signaling | 9337 | 1:50 |
Jak1 (Y1022/1023) | Cell Signaling | 3331 | 1:100 |
Lck (Y505) | Cell Signaling | 2751 | 1:500 |
LKB1 (S428) | Cell Signaling | 3051 | 1:100 |
mTOR (S2448) | Cell Signaling | 5536 | 1:100 |
NFkB p65 (S536) | Cell Signaling | 3031 | 1:50 |
p70 S6 Kinase (T389) | Cell Signaling | 9205 | 1:200 |
PDK1 (S241) | Cell Signaling | 3061 | 1:100 |
PKA C (T197) | Cell Signaling | 4781 | 1:250 |
PRAS40 (T246) | BioSource | 44-1100 | 1:2000 |
PTEN (S380) | Cell Signaling | 9551 | 1:500 |
Smad1 (S463/465), Smad5 (S463/465), Smad8 (S426/428) | Cell Signaling | 9511 | 1:500 |
Src (Y527) | Cell Signaling | 2105 | 1:500 |
Src Family (Y416) | Cell Signaling | 2101 | 1:200 |
Stat1 (Y701) | Cell Signaling | 9171 | 1:200 |
Stat3 (S727) | Cell Signaling | 9134 | 1:200 |
Zap-70 (Y319) | Enogene | E011159 | 1:100 |
βCatenin (S33/37/T41) | Cell Signaling | 9561 | 1:250 |
CREB | Upstate Biotechnologies | 06-863 | 1:100 |
Fos B | Cell Signaling | 2251 | 1:200 |
GRB2 | Cell Signaling | 3972 | 1:2000 |
HSP70 | Stressgen | SPA-810 | 1:100 |
c-Jun | Cell Signaling | 9165 | 1:100 |
Kip1/p27 | BD | 610241 | 1:100 |
Lck | Cell Signaling | 2984 | 1:250 |
Mcl-1 | Cell Signaling | 4572 | 1:80 |
Musashi | Cell Signaling | 2154 | 1:100 |
NOTCH1 | Cell Signaling | 3439 | 1:100 |
PTEN | Cell Signaling | 9552 | 1:500 |
SGK1 | Abnova | PAB4590 | 1:250 |
Zap-70 | Cell Signaling | 2705 | 1:250 |
β-Catenin | Abcam | AB32572 | 1:1000 |
Dll4 | Abcam | AB7280 | 1:500 |
Shh | Abcam | AB53281 | 1:250 |
HIF-1α | BD | 610958 | 1:50 |
NUMB PAN-ISO | Upstate Biotechnologies | 07-207 | 1:400 |
NUMB-L | Chemicon | AB15145 | 1:750 |
Cyclin B | BD | 610220 | 1:75 |
c-Myc | Calbiochem | OP-10 | 1:100 |
BCIP/NBT Kit | Thermo-Fisher | 002209 | (Note after step 5.2.8). Kit used to measure alkaline phosphatase activity, similar kits can be used. |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Antibodies for Flow Cytometry: | |||
SSEA1 Antibody, Pacific Blue conjugate | Thermo-Fisher | MHCD1528 | 1:100 (Note after step 5.2.8) |
SSEA4 Antibody (MC813-70), Alexa Fluor 647 | Thermo-Fisher | SSEA421 | 1:100 |
Name | Company | Catalog number | Comments |
Specific instruments, tools and softwares: | |||
Countess Automated Cell Counter | Thermo-Fisher | C10227 | Neubauer chamber or other suitable glass hemocytometer can be used. |
MEA1060-Inv-BC | Multichannel Systems | MEA1060-Inv-BC | (Step 5.3) |
MEA1060-BC control software | Multichannel Systems | MEA1060-BC | (Step 5.3) |
NeuroExplorer | Multichannel Systems | NeuroExplorer (NE) | (Step 5.3) For post-processing of MEA data |
Multielectrode arrays (MEA) | Multichannel Systems | 60MEA100/10iR-Ti-gr | (Step 5.3) Single-well MEA chip |
ArrayScan XTI High Content Platform | Thermo-Fisher | ASN00002P | (Step 5.2.8) Mean fluorescence can be quantified by using specific ArrayScan algorithms (e.g., Cytotoxicity V.4 and NucTrans V.4 bioapplications). It is recommended to take minimum 20 pictures/well, and have 7-8 internal replicates per condition |
7900HT Fast Real-Time PCR System | Thermo-Fisher | 4351405 | (Step 5.1.6) |
BD ULTRA-FINE Needle Insulin Syringe (with 30G needle) | BD | 328280 | (Steps 1.3.1, 2.1.2, and 2.4.1) |
StemPro EZPassage Disposable Stem Cell Passaging Tool | ThermoFisher | 23181010 | This colony cutting tool can be used as an alternative to the use of 30G needle 1 mL syringes (Step 1.3.1) |
Ultra-Low attachment Petri dish (60 mm) | Corning | 10010582 | (Step 2.1.8) Also other brands can be used. |
Mr. Frosty Freezing container | Sigma-Aldrich | C1562-1EA |