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Medicine

Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als Published: June 8, 2017 doi: 10.3791/55704
Automatic Translation
1,2,3, 1,4, 1,2,4
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Harvard Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology

Summary

Das Ziel dieses Protokolls ist es, die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten zu demonstrieren. Die Technik kann als In-vitro- Screening-Tool in der Hörforschung genutzt werden.

Abstract

Während es in den vergangenen Jahrzehnten bemerkenswerte Fortschritte in der Hörforschung gegeben hat, gibt es noch keine Heilung für den sensorineuralen Hörverlust (SNHL), eine Bedingung, die typischerweise eine Beschädigung oder einen Verlust der empfindlichen mechanosensorischen Strukturen des Innenohrs beinhaltet. Ausgefeilte In-vitro- und Ex-vivo- Assays haben sich in den letzten Jahren entwickelt, was es ermöglicht, eine zunehmende Anzahl von potentiell therapeutischen Verbindungen zu screenen und gleichzeitig die Ressourcen zu minimieren und die Bemühungen um die Entwicklung von Kuren für SNHL zu beschleunigen. Obwohl homogene Kulturen bestimmter Zelltypen weiterhin eine wichtige Rolle in der aktuellen Forschung spielen, verlassen sich viele Wissenschaftler nun auf komplexere organotypische Kulturen von murinen inneren Ohren, die auch als Cochlea-Explantate bekannt sind. Die Erhaltung organisierter Zellstrukturen im Innenohr erleichtert die in situ- Bewertung verschiedener Komponenten der Cochlea-Infrastruktur, einschließlich innerer und äußerer Haarzellen, Spiralganglion-Neuronen, NeurItes und unterstützende Zellen. Hier präsentieren wir die Vorbereitung, Kultur, Behandlung und Immunfärbung von neonatalen murinen Cochlea-Explantaten. Die sorgfältige Vorbereitung dieser Explantate erleichtert die Identifizierung von Mechanismen, die zu SNHL beitragen und ein wertvolles Instrument für die Hörforschungsgemeinschaft darstellen.

Introduction

Sensorineural Hörverlust (SNHL) spiegelt Schäden am Innenohr oder aufsteigender Gehörgang. Während Hörverlust das häufigste sensorische Defizit bei Menschen 1 ist , existieren heilende Therapien noch nicht 2 . Obgleich Cochlear- oder auditorische Hirnstammimplantate ein gewisses Maß an Hörvermögen für Patienten mit schwerer bis tiefgehender SNHL wiederherstellen können, ist das Hören, das von diesen Geräten zur Verfügung gestellt wird, immer noch sehr verschieden von dem "natürlichen" Gehör, vor allem bei Versuchen, die Sprache im Lärm zu verstehen oder Musik zu hören.

Während die Haarzelldegeneration seit langem als die primäre Konsequenz traumatischer auditorischer Ereignisse ( z. B. Exposition gegenüber lautem Rauschen) angesehen wird, gibt es wachsende Hinweise darauf, dass die Synapsen, die Informationen von Haarzellen zum Hörnerv übermitteln, mindestens ebenso anfällig für akustisches Trauma 3 sind , 4 , 5 > , 6 Da menschliche audiometrische Schwellenwerte, der aktuelle Goldstandard für die Auswertung der Hörfunktion, keine spezifische Zellschädigung im Innenohr vorhersagen, sind so bald wie möglich raffinierte Werkzeuge erforderlich, um die zelluläre Degeneration so schnell wie möglich zu erkennen und eine adäquate Behandlung einzuleiten 7 .

Vielversprechende pharmazeutische Behandlungen für Hörverlust werden oft in homogenen Zellkulturen in vitro getestet, aber solche Systeme präzisieren die Cochlea-Mikroumgebung nicht genau. Cochlear-Zellen sind bekannt, um trophische Faktoren zu sezern, die andere Zelltypen innerhalb der Cochlea 8 , 9 beeinflussen, ein entscheidendes in vivo- Verfahren, das verloren geht, wenn das Organ von Corti 10 , 11 oder Spiral-Ganglion-Neuronen (SGNs) 12 isoliert oder kultiviert wird Molekulare Marker werden analysiertEf "> 13. In vivo- Studien, die für die Validierung von In-vitro- Daten notwendig sind, um neue, personalisierte Behandlungen für Hörverlust bei der Verfolgung von" Präzisionsmedizin "zu schaffen, erfordern erhebliche Ressourcen und Zeit. Dies ist besonders wichtig bei der Betrachtung Wie viel Aufwand für die Vervollkommnung und Durchführung von Mittelohr- oder Rundfenster-Membran-Injektionen mit Hörtests und die anschließende Zerlegung von Cochlear-Vollmontagen erforderlich ist. Das effiziente Screening von vielversprechenden Verbindungen in organotypischen Ex-vivo- Kulturen, die als Cochlea-Explantate bekannt sind, bietet eine wirtschaftliche und zuverlässige Alternative 14 , 15 , 16 , 17 .

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, mit dem bearbeitete Cochlea-Explantate erzeugt, gepflegt und ausgewertet werden können. Spezielle Anwendungen für dieses Modell werden unterstrichen, einschließlich seiner Verwendung in der ScreeningVon potentiell therapeutischen Verbindungen und der vergleichenden Bewertung von Virusvektoren für die Gentherapie. Ein Ex-vivo- Explantat-Ansatz ermöglicht es Forschern, die Effekte einer gegebenen Behandlung auf verschiedene Zellpopulationen in situ zu visualisieren, die Identifizierung von zelltypspezifischen Mechanismen und die anschließende Verfeinerung von zielgerichteten Therapeutika zu erleichtern.

Insgesamt bietet diese Technik ein Modell, um die Cochlea ex vivo zu studieren, während sie ein vitales Übersprechen zwischen den sehr unterschiedlichen Zelltypen, die in der Cochlea koexistieren, bewahrt werden.

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Protocol

Das Studienprotokoll wurde vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) von Massachusetts Eye und Ear genehmigt. Die Experimente wurden nach dem Ethikkodex der World Medical Association durchgeführt.

1. Vorbereitung der Dissektion

  1. Vorbereitung der chirurgischen Tabelle
    1. Verwenden Sie 70% Ethanol, um den chirurgischen Tisch zu desinfizieren.
    2. Lege zwei unversöhnliche Vorbereitungspads neben dem Mikroskop auf.
    3. Bereiten Sie das Instrumentenfach vor, einschließlich der hitze-sterilisierten Bedienschere, eines Skalpellgriffes, eines Mikromessers und einer Pinzette (jeweils zwei # 4 & # 55). Legen Sie die Instrumententafel und eine 50 mm breitblättrige Petrischale auf eine nicht sterile Unterlage.
    4. Erhalten Sie eine sterile # 15 Skalpell Klinge; Ein abdichtbarer Plastikbeutel oder -behälter (zur Entsorgung der Schlachtkörper im Einklang mit den institutionellen Richtlinien); Eis in einem Eimer; Und kalte, sterile Hank's Balanced Salt Solution (HBSS). Lege diese Gegenstände auf dieAndere nonsterile Pad
    5. Übertragen Sie die HBSS in ein 50 ml Plastiklaborrohr und legen Sie es auf Eis.
  2. Vorbereitung der Kultur
    1. Bereiten Sie alle Materialien in einer laminaren Strömungshaube vor. Für jede vier Exemplare, setzen vier autoklavierte 10 mm runde Glasabdeckungen in die vier Einlagen der 35 mm 4-well Petrischale.
    2. Für jede 4 Exemplare wird ein Gesamtvolumen von 300 μl, bestehend aus folgendem in einem Mikrozentrifugenröhrchen, vermischt: 10 μl Gewebeklebstoff, 285 μl NaHCO 3 und 5 μl NaOH.
    3. 40 μl der resultierenden Lösung auf jeden Deckzettel geben und dort mindestens 20 min bei RT ablassen; Diese Lösung kann für mehrere Stunden auf dem Deckglas belassen werden, kann aber nicht O / N bleiben.
    4. Legen Sie eine oder zwei 35 mm 4-well Petrischale in einer 10 cm Petrischale, um zwei Barrieren gegen Verschmutzung zu schaffen.
    5. Bereiten Sie Kulturmedium mit 98% Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem (Mikro-) Zentrifugenröhrchen). Die Lösung vor 25 ° C auf 25 ° C erwärmen.

2. Murine Cochlear Explant Dissection

  1. Enthauptung der neonatalen Maus
    1. Erhalten Sie eine 60-mm-Plastik-Petrischale und sprühen Sie 70% Ethanol in den Deckel, so dass die Oberfläche nass ist.
    2. Gießen Sie kaltes HBSS aus dem Kunststoff-Laborrohr in den unteren Teil des 60-mm-Plastiks und die 50 mm klare Wand aus Glas-Petrischale. Lagern Sie das Plastiklaborrohr und beide Petrischalen auf Eis, um das Gewebe kalt zu halten, wann immer es nicht zerlegt wird.
    3. Lege eine P3 - P5 - gealterte neonatale Maus auf Eis in einen Cutoff - Finger eines Latexhandschuhs und warte, bis die Hypothermie den Verlust des Bewusstseins (ca. 1-3 min) induziert.
    4. Entkuppeln Sie die Maus schnell mit einer Arbeitsschere und entsorgen Sie den Körper in der versiegelbaren Plastiktüte. Setzen Sie den abgetrennten Neugeborenenkopf in die70% Ethanol im Deckel der 60 mm Plastik-Petrischale.
  2. Makroskopische Dissektion des Schläfenbeins
    1. Entfernen Sie die Haut des Schädels, indem Sie einen oberflächlichen Schnitt vom vorderen bis zum hinteren Ende (direkt über die Sagittalnaht) mit dem Skalpellblatt machen.
    2. Schneiden Sie beide äußeren Gehörgänge mit dem Skalpellblatt und falten Sie die Haut nach vorne, um den ganzen Schädel auszusetzen.
      HINWEIS: Obwohl für dieses Schritt kein Dissektionsmikroskop benötigt wird, kann es für eine verbesserte Visualisierung verwendet werden.
    3. Öffnen Sie den Schädel entlang der Sagittal Naht mit dem # 15 Skalpell Klinge. Achten Sie darauf, den Schädel zu schneiden, indem Sie die Klinge vorsichtig von vorne nach hinten nach oben bewegen und die Kompression der Cochleae vermeiden.
      HINWEIS: Der Schädel sollte in diesem Alter nicht verknöchert werden und sollte leicht schneiden.
    4. Entfernen und verwerfen Sie die Schnauze, indem Sie einen vertikalen Schnitt direkt hinter den Umlaufbahnen mit dem # 15 Skalpell machenKlinge.
      HINWEIS: Der hintere Teil des Schädels sollte noch das Gehirn und die Cochleae enthalten.
    5. Entsorgen Sie das Vorderhirn, Kleinhirn und Hirnstamm durch stumpfe Dissektion mit # 4 Pinzette.
  3. Mikroskopische Extraktion der Cochleae
    1. Stellen Sie das Mikroskop (6,5fache Vergrößerung) und die Lichtquelle ein, indem Sie die Pinzette unter den Geltungsbereich stellen und die Beleuchtung und den Fokus optimieren.
    2. Legen Sie die beiden Hälften des Schädels in die 60 mm Plastik-Petrischale, die mit kaltem HBSS gefüllt ist.
    3. Vollständig die Cochlea / e ausstellen, die als angrenzend an die umgebende Stapedialarterie (eine gewundene Arterie innerhalb des Schläfenbeins) identifizierbar ist, und das Orgel aus dem Schläfenbein mit Hilfe der # 4 Pinzette unverblümt trennen.
    4. Übertragen Sie die Cochlea in die 50 mm, klarwandige, Petrischale mit Glasboden und legen Sie die Schale unter das Mikroskop.
    5. Legen Sie die 60 mm Plastik Petrischale mit der anderen Hälfte des Schädels auf Eis. Entfernen Sie die Cochlea aus dem Vestibularsystem und zerlegen Sie sorgfältig die Cochlear-Otic-Kapsel (typisch knorpelig in diesem Alter) mit # 4 Pinzette. Verwenden Sie # 55 Pinzette für alle weiteren Schritte.
  4. Endschritte der Gewebeverarbeitung
    1. Weiter mit der Verarbeitung des Innenohrgewebes durch sorgfältiges Trennen des Spiralbandes an das Orgel von Corti aus dem Rest der Cochlea und dem Modiolus mit dem Mikromesser oder zwei Pinzetten.
      1. In den dunkleren, lichtdurchlässigen Bereich an der Felsspalte zwischen dem Spiralband und dem Haarzellenbereich schneiden und mit dem darauffolgenden Entfernen des Spiralbandes fortfahren, indem man ihn am grundsätzlichsten anfängt und ihn bei gleichzeitiger Verschiebung sanft abwickelt.
    2. Positionieren Sie die Probe, um eine längliche, sagittale Ansicht der Cochlea zu erhalten und die Cochlea in zwei bis drei Abschnitte unter Verwendung des Mikromessers zu schneiden, wobei diese Abschnitte als die apikale (mittlere) und b klassifiziert werdenAsal dreht sich Entfernen Sie das Gewebe überlegen und unterhalb der tatsächlichen Schicht von Haarzellen und Neuriten, um ein Cochlea-Explantatstück zu erreichen, das horizontal auf der Petrischale liegen kann.
      HINWEIS: Eine angemessene Größe für eine stabile Haftung an der Kulturschale ist etwa die Hälfte einer Cochlear-Umdrehung.
    3. Entfernen Sie die Tectorialmembran, eine sehr dünne lichtdurchlässige Schicht, die dem Organ des Corti unmittelbar überlegen ist, indem Sie sie sanft mit einer Pinzette abschälen.
    4. Entfernen Sie die Membran von Reissner, die den SGNs überlegen ist, indem Sie sie mit einer Pinzette auf beiden Seiten berühren und sie abschälen.
      HINWEIS: Entfernen Sie alle seitlich angeordneten beschädigten Haarzellen, indem Sie sie mit dem Mikromesser abschneiden.

3. Übertragen von Exemplaren auf die Kulturplatten

  1. Entfernen Sie die 45 μl Gewebeklebstofflösung aus den vier Deckgläschen. Waschen Sie jeden Deckel mit 50 μl sterilem H 2 O. Aspirieren Sie das Wasser.
  2. Hebe die 1-ml-Pipette auf. Die Pipettenspitze mit ca. 120 μl DMEM benetzen, um zu verhindern, dass die Probe an der Innenseite der Spitze anhaftet.
  3. Übertragen Sie die Proben einzeln mit der 1-ml-Pipette. Pipettieren Sie maximal 70 μl aus der HBSS-gefüllten, kleinen, klarwandigen, mit Petritornen versehenen Petrischale und legen Sie die Probe zusammen mit der Flüssigkeit auf eine der 4 Inlays (vorbereitet mit Deckgläschen) in die 4-Well-Petrischale .
  4. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop (50fache Vergrößerung), dass sich die Probe in der richtigen Ausrichtung befindet. Stellen Sie sicher, dass der Bereich der Haarzellen, von dem die Tectorialmembran entfernt wurde, nach oben zeigt. Sicherstellen, dass die Basilarmembran zusammen mit dem beschnittenen, basalen Teil des Modiolus nach unten weist und an dem Deckglas haftet.
    1. Wenn die Probe bei der Inspektion umgedreht wird, legen Sie die HBSS ab, die in der Pipettenspitze in die Einlage verbleibt, und positionieren Sie das Stück, bis es richtig ausgerichtet ist.
      NEINTE: Dies verhindert, dass Haarzellen in Kulturmedium ohne strukturelle Unterstützung aus dem Deckglas schweben, was zu Degeneration führen könnte.
  5. Setzen Sie überschüssiges HBSS mit der 1-ml-Pipette ein. Warten auf 15 s.
  6. 25 μl des vorbereiteten warmen Kulturmediums (98% DMEM, 1% N-2 und 1% Ampicillin) direkt auf die Probe pipettieren. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht mit der Pipette zu berühren. Ersetzen Sie die inneren und äußeren Petrischalenabdeckungen und inkubieren Sie O / N bei 37 ° C.
  7. Setzen Sie alle Lagerlösungen an ihre richtigen Stellen zurück, entsorgen Sie Schlachtkörper und Restmüll, dekontaminieren Sie den chirurgischen Tisch nach institutionellen Richtlinien ( z. B. mit Ethanol oder Hypochlorit), reinigen und autoklavieren Sie die Instrumente und entsorgen Sie die Scharfe im entsprechenden Behälter .

4. Hinzufügen von endgültigen Kulturmedien und Substanzen von Interesse

ANMERKUNG: Cochlea-Explantate sind für 10-16 Stunden später bereit.

  1. Vorbereitung einer MischungVon 97% DMEM, 1% fötalem Rinderserum (FBS), 1% N-2 und 1% Ampicillin (65 μl pro Vertiefung in einem Mikrozentrifugenröhrchen, Erwärmen der Lösung auf 25 ° C vor Gebrauch).
  2. Fügen Sie andere Substanzen für die Lösungen für die jeweiligen Behandlungsgruppen hinzu. Wenn fluoreszierende Substanzen zugegeben werden ( zB grün fluoreszierende Proteine ​​(GFP) -exprimierende Viren, wurde in einer neueren Publikation eine Konzentration von 10 10 GC Adeno-assoziierten Viren (AAVs) für 48 h in 50 μl) verwendet Licht.
  3. Übertragen Sie die Cochlea-Explantat-haltigen Petrischalen aus dem Inkubator und legen Sie sie unter die laminare Strömungshaube.
  4. Aspirieren Sie das alte Kulturmedium (ohne FBS) mit der Pipette aus den Inlays.
  5. Fügen Sie 60 μl pro Vertiefung des vorbereiteten Warmkultur- (Behandlungs-) Mediums (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% Ampicillin und die interessierenden Stoffe) hinzu.
  6. Legen Sie die Petrischale wieder in den Inkubator (37 ° C).
  7. Ansicht rEgal unter dem Mikroskop, um Anzeichen einer Kontamination, zelluläre Migration oder Ablösung des Cochlea-Explantats zu identifizieren und Färbung nach maximal 7 Tagen durchzuführen.

5. Immunfluoreszenz - Tag 1

  1. Vorbereitung der Blockierungslösung (94% Phosphat-gepufferte Saline (PBS), 5% normales Ziegen- oder Pferdeserum (NGS / NHS, abhängig von den sekundären Antikörpern) und 1% nichtionisches Tensid (siehe Tabelle der Materialien )) und Bestand Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid mit den jeweiligen Antikörpern).
    ANMERKUNG: Antikörper umfassen Kaninchen anti-Myo7A bei einer Konzentration von 1: 400+ (Myosin 7A, für innere und äußere Haarzellen) und Maus anti-TuJ1 1: 200+ (β-Tubulin, für SGNs) ODER Maus (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (C-terminales Bindungsprotein, für Presynapse), Maus (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (postsynaptische Dichte, für postsynapse) und Hühner anti-NF-H 1: 1000+ (Neurofilament, Für SGNs und Nervenfasern). "+" MeaNs "oder höher".
  2. Das Kulturmedium mit einer Pipette ausspülen. Achten Sie darauf, das Exemplar nicht zu berühren.
  3. Unter der Laminar-Flow-Kapuze spülen Sie die Cochlea-Explantate zweimal mit sterilem PBS aus und legen die Exemplare für 5 min nach jeder Wäsche auf einen Shaker.
  4. Fixieren Sie das Gewebe in 4% Paraformaldehyd (PFA - VORSICHT) für 20 min auf dem Shaker (unter der Kapuze). Aspirieren Sie die PFA.
  5. Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x.
  6. Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine präparierte Sperrlösung (94% PBS, 5% NHS und 1% nichtionisches Tensid) für 30 min auf Shaker.
  7. Legen Sie die Cochlea-Explantate in eine vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit den jeweiligen primären Antikörpern (Vortex vor Gebrauch) O / N auf einem Zähler bei RT.
    HINWEIS: Wickeln Sie die Petrischalen mit feuchten Papiertüchern ein, die in Plastikfolie eingeschlossen sind (oder Aluminiumfolie, wenn das hinzugefügte SolutIon enthält fluoreszierende Materialien wie GFP-exprimierende Viren), um das Geschirr feucht zu halten und die Verdampfung der Antikörperlösung O / N zu verhindern.

6. Immunfluoreszenz - Tag 2

  1. Bereiten Sie den 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) -Färbung (300 nM) vor und verwenden Sie die Stamm-Antikörper-Lösung, um die richtigen sekundären Antikörper-Mischungen zu erhalten, die komplementär zu den primären Antikörpern in Schritt 5.1 sind. (IgG1) 488 1: 200+ und Ziegen-Anti-Maus 568 1: 200+ ODER Ziegen-Anti-Maus (IgG1) 568 1: 1000+, Ziegen-Anti-Maus (IgG2a) 488 1: Und Ziegen-Anti-Huhn 647 1: 200+ ODER Phalloidin 568 1: 200+ (für innere und äußere Haarzellen)).
  2. Ansaugen der primären Antikörperlösung.
  3. Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x.
  4. Legen Sie die Cochlea-Explantate in die vorbereitete Antikörper-Lösung (98,6% PBS, 1% NHS und 0,4% nichtionisches Tensid) mit der ResPektive sekundäre Antikörper (Vortex vor Gebrauch) für 1,5 h auf einem Theke und vor Licht schützen.
  5. Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung und spülen Sie die Cochlea-Explantate mit einem DAPI-Fleck aus (Platzieren auf einem Shaker für 1 Minute und dann aspirieren).
  6. Tragen Sie 60 μl PBS auf die Cochlea-Explantate und legen Sie die Petrischale auf einen Shaker für 5 min. Aspirieren Sie die PBS. Wiederholen Sie 3x.
  7. Verwenden Sie Pinzetten, um Deckgläser mit Proben aus der 4-Well-Platte zu entfernen, tauchen Sie sie in einen mit destilliertem H 2 O gefüllten Empfänger und trocknen Sie die Deckgläser, indem Sie sie vertikal mit Papiertüchern in Berührung bringen.
  8. Legen Sie einen Tropfen Antifade-Montagemedium auf den Objektträger und umdrehen Sie die Deckgläser, um das nach unten gerichtete Gewebe in das Medium einzutauchen.
  9. Dichtung des Deckglases mit klarem Nagellack, der den Rand umgibt (ohne die Probe unter dem Glas zu zerkleinern). Lassen Sie die Rutschen flach in einem überdachten Bereich weg von Licht für 15 - 20 min bis trocken und thSie in eine Schachtel legen oder unter dem konfokalen Mikroskop untersuchen.
    HINWEIS: Die Fluoreszenzfärbung wird am besten durch die Aufbewahrung der Objektträger bei 4 oder -20 ° C erhalten.

7. Konfokale Bildgebung

  1. Erhalten Sie einen Überblick und gezoomte Bilder für die Orgel der Region Corti, einschließlich Neuriten und SGNs.
    HINWEIS: Standardeinstellungen für den Imaging-Prozess: Format von 1.024 x 1.024 Pixeln, Geschwindigkeit von 400 Hz, Frame-Durchschnitt von 3, 20% Gesamt-Laserintensität und meist 20X und 63X Objektiv mit Öleintritt (potentiell kombiniert mit 2fachem Digitalzoom). Die Kanaleinstellungen für das DAPI-, Myo7A- und TuJ1-Färbeprotokoll sind oben skizziert: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% Fluoresceinisothiocyanat (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% Tetramethylrhomadinisothiocyanat (TRITC), "Smart Gain" 562.4V, "Smart Offset" 0,0%.
  2. Fügen Sie die Bilder in einem Z-Stack mit demSoftware, um eine z-Achsenprojektion zu erhalten.

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Representative Results

Während viele Protokolle auf Orgel von Corti explants konzentrieren, versucht diese Technik, die Anatomie der gesamten Cochlear-Umdrehung zu bewahren, einschließlich der SGNs. Dies gibt den Forschern die Möglichkeit, die Auswirkungen einer gegebenen Behandlung auf Neuriten und Somata von SGNs zusätzlich zu dem Organ von Corti zu analysieren. Die Durchführung einer Sektion, die einen Teil des Modiolus bewahrt, wie hier beschrieben, ist technisch anspruchsvoller, als das Organ von Corti allein zu erforschen. Allerdings ist die Neuriten- und SGN-Region wichtig, da in dieser Region nach der Anwendung vestibulärer Schwannom-Sekrete (Abbildung 1 ) und extrazellulären Vesikeln in zwei jüngsten Publikationen mit der gleichen Methodik 19 , 20 signifikante pathologische Effekte beobachtet wurden. Solche Veränderungen konnten nicht durch die Verwendung von isolierten Orgel von Corti-Explantaten aufgedeckt werden.

ThE-Quantifizierung von beschädigten oder GFP-exprimierenden Zellen für innere und äußere Haarzellen, unterstützende Zellen und SGNs können durch manuelle Zählung oder mit einem automatisierten Prozess durchgeführt werden, wie der, der in das ImageJ-Plugin NeuronJ eingebaut ist. Repräsentative Bereiche für diese Zählungen können nach der Bestätigung ihrer Korrelation mit den Gesamtzahlen festgelegt werden. 3D-Rekonstruktionen sind besonders nützlich, um Überlagerungseffekte in den z-Achsenprojektionen von SGNs auszuschließen. Faserorganisation, Anzahl der SGNs pro gegebener Fläche und SGN-Soma-Bereich können ausgewertet werden. Die Färbung und Zählung von Synapsen, Haarzellen und Neuriten ist in Abbildung 2 dargestellt; Kann das gleiche Protokoll auch für Cochlear-Volllager verwendet werden und hat sich als zuverlässiges Modell für diese Zwecke erwiesen 17 , 21 , 22 . Andere Forscher haben elegante alternative Methoden etabliert, die auch in experimentelle Paradigmen 23 < integriert werden können/ Sup> , 24 .

Die maximale Kulturlänge ist in der Regel durch den Beginn der zellulären Migration begrenzt und hängt von der Konzentration von FBS im Kulturmedium ab. Als der Anteil der FBS von fünf Prozent auf drei Prozent oder ein Prozent reduziert wurde, wurde der Zeitraum für die Aufrechterhaltung eines anatomisch intakten Cochlea-Explantats auf etwa eine Woche verlängert (Abbildung 3 ).

Fig. 4 zeigt GFP-positive Cochlea-Explantationszellen nach der Transduktion mit dem synthetischen Adeno-assoziierten Virusvektor Anc80 für 48 h 25 . In dieser Ansicht können innere Haarzellen, äußere Haarzellen und unterstützende Zellen quantifiziert werden, während eine 3D-Rekonstruktion dazu beitragen kann, GFP-positive Zellen im SGN-Bereich zu quantifizieren. Verschiedene virale Serotypen können im Hinblick auf ihre Transduktionseffizienz in bestimmten ce verglichen werdenLl Typen mit der skizzierten Methodik 18 .

Abbildung 1
Abbildung 1: Repräsentative konfokale Mikroskopie Bilder von Cochlea-Explantaten aus den apikalen und basalen Regionen nach Inkubation mit Sekreten von großen Aurikularnerven oder vestibulären Schwannomen für 48 h . ( A ) Übersicht Bild eines Explantats Das Rechteck markiert den Bereich in Nahaufnahmen. Maßstab = 200 μm. ( B - E ) Vergrößerte Ansichten von Haarzellen und Neuriten. Maßstab = 50 μm. Grün = Myosin 7A (Myo7A), Flecken Haarzellen; Rot = Klasse III Beta-Tubulin (Tuj1), Flecken neuronale Strukturen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2: Konfokale Mikroskopie Bild der Cochlear Explant Hair Cell Region. ( A ) Intakte Synapsen können durch Markierung von präsynaptischen (C-terminalen Bindungsprotein, roten) und postsynaptischen (postsynaptischen Dichte-95, grünen) Proteinen zusammen mit der Färbung von neuronalen Strukturen (Neurofilament, Blau) beurteilt werden. OHC, äußere Haarzellen; IHC, innere Haarzellen. Maßstab = 10 μm. ( B ) Fokus auf die innere Haarzellenregion mit der Anzahl der inneren Haarzellen (rote Pfeilspitzen) und Neuriten (blaue Pfeilspitzen). Aufgrund der Verzweigung der neuronalen Strukturen ist es wichtig, den Abstand von den inneren Haarzellen beim Zählen zu standardisieren (hervorgehoben mit dem weißen Rahmen, der direkt mit den Synapsen verbunden ist). Maßstab = 5 μm. ( C ) Nahaufnahmen von separaten Synapsen (2 vor- und postsynaptische Paare mit weißen Pfeilspitzen markiert). Maßstab = 1 & # 181; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: Repräsentative konfokale Mikroskopie Bilder von apikalen und basalen Cochlea-Explantaten nach 7 d in Kultur mit entweder 3% oder 1% FBS. ( A und B ) In 3% FBS inkubierte Zellen beginnen zwischen 4 und 5 Tagen zu migrieren (hellgraue Pfeile für Haarzellen, rote Pfeile für Neuriten), ( C und D ) Explantate in 1% FBS halten die organisatorische Integrität bis zum Tag 7. Hellgrau: Myosin 7A (Myo7A), Flecken alle Haarzellen; Rot: Klasse III Beta-Tubulin (Tuj1), Flecken neuronale Strukturen. OHC, äußere Haarzellen; IHC, innere Haarzellen. Maßstab = 100 μm, angewendet auf alle Platten.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Konfokale Mikroskopie Bild einer Cochlea-Explantation nach Exposition gegenüber dem synthetischen Adeno-assoziierten Virus Vektor Anc80 für 48 h. Transduzierte Zellen exprimieren GFP (grün). Myosin 7A (Myo7A, blau) Flecken Äußere Haarzellen (OHC) und innere Haarzellen (IHC); Klasse-III-Beta-Tubulin (Tuj1, rot) verlässt neuronale Strukturen. Supp .: Bereich der Sox2-positiven Stützzellen; SGN, Spiralganglion Neuronen. Maßstab: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Die Forscher müssen die Dissektionstechnik perfektionieren, bevor sie Experimente mit Cochlea-Explantaten durchführen. Haarzellen werden häufig während der Sezierungen, die früh in der Lernkurve durchgeführt wurden, beschädigt, und ein besonders problematisches Moment für ihre Integrität ist die Entfernung der tectorialen Membran, die ständige Hände, richtige Werkzeuge und Erfahrung erfordert. Um Zeit und Ressourcen zu sparen, sollte eine visuelle Kontrolle unter dem Sektionsmikroskop durchgeführt werden und möglicherweise beschädigte Bereiche beachtet werden. Anstatt teure primäre und sekundäre Antikörper zu verwenden, sind billigere Reagenzien wie Phalloidin für Vorversuche besser geeignet. Leicht beschädigte Explantate können potentiell noch als Kontrollen in bestimmten Experimenten (Analyse von nicht betroffenen Abschnitten) oder für die Prüfung neuer Kombinationen von Antikörpern verwendet werden.

Die Übertragung der Exemplare ist auch besonders wichtig, denn man muss dafür sorgen, dass die StückeSind nicht umgedreht ("schwimmende" Haarzellen ohne die Führung des beschichteten Deckglases oft degeneriert). Eine zentrale Position auf dem Deckglas erleichtert alle weiteren Pipettierschritte.

Für Negativkontrollexperimente mit neuartigen Verbindungen (die offensichtlich im Kulturmedium löslich sein müssen) ist es wichtig, das entsprechende Vehikel auf die Explantate anzuwenden und sich nicht ausschließlich auf unbehandelte Explantate zu konzentrieren. Zum Beispiel, wenn ein kommerzielles Medikament Natriumcitrat zusätzlich zu dem aktiven Bestandteil enthält, dann sollte Natriumcitrat zu den negativen Kontroll-Cochlea-Explantaten hinzugefügt werden, da Natriumcitrat selbst eine Wirkung haben könnte.

Einschränkungen für die Verwendung von Cochlea-Explantaten beinhalten die Tatsache, dass diese organotypischen Kulturen typischerweise von jungen Welpen abgeleitet sind, die sich noch postnatalen Entwicklungsänderungen unterziehen und dass es einen fehlenden ionischen Gradienten über das Explantat gibt, was für normal istIn vivo hören Allerdings ist der Nutzen des Protokolls in einer kürzlich erschienenen Publikation zu AAVs 18 zwingend dargestellt. Während diese Gruppe von Vektoren auf etwa 4,7 kb Verpackungskapazität beschränkt ist, ist sie zu einer wichtigen Ressource für die Therapie mehrerer menschlicher Syndrome geworden. Mit dem Cochlea-Explantat-Modell zeigte die oben genannte Publikation, dass das Anc80-Virus die traditionellen AAV-Serotypen bei der Transduktion einer Vielzahl von Cochlearzellen, einschließlich Haarzellen und SGNs, übertraf. Diese In-vitro- Befunde wurden anschließend durch die Wahl der vielversprechendsten Kandidaten für die Injektion durch das runde Fenster in Maus-Welpen in vivo bestätigt. Das Ex-vivo- Modell bietet eine Möglichkeit, die Anatomie der Cochlea erfolgreich zu rekapitulieren und die Zeit und die Ressourcen zu reduzieren, die für die Durchführung von In-vivo- Arbeiten benötigt werden 27 .

Ein weiterer Vorteil der Ex vIvo-Modell ist sein Potenzial für die Anwendung auf die Untersuchung von spezifischen zellulären Mechanismen, die zu SNHL beitragen. Durch die Anwendung von Verbindungen, die in der Tumor-Mikroumgebung ( z. B. menschliche Tumorsekrete) zu einem Explantat gefunden werden, kann die Wirkung dieser Verbindungen auf die Cochlea direkt sichtbar gemacht und die Wirksamkeit oder Toxizität potentieller Arzneimitteltherapien beurteilt werden. Das ist wichtig, weil die menschliche Cochlea nicht biopsiert werden kann und die Zellen darin nicht in vivo sichtbar gemacht werden können . Zum Beispiel untersuchte eine aktuelle Publikation das ototoxische Potenzial von Proteinen, die aus vestibulären Schwannomen sezerniert wurden, die intrakranielle Tumore sind, die aus den Vestibularnerven entstehen und bei 95% der Patienten einen Hörverlust verursachen. Die Anwendung von menschlichen Tumorsekreten auf Cochlea-Explantate, verglichen mit Sekreten von kontrollierten gesunden menschlichen Nerven, bestätigte die toxischen Wirkungen dieser Sekrete auf die Cochlea 19 . Das gleiche Experiment wäre schwierig, in einem in vivo zu replizierenModell aufgrund der immunogenen Reaktion gegen menschliche Proteine, die in einer immunkompetenten Maus auftreten würde.

Zusammenfassend stellt dieses Manuskript eine Technik dar, die das gleichzeitige Studium von Cochlear-Haarzellen, Synapsen, Neuriten und Neuronen in einem Ex-vivo- Modell ermöglicht. Dieses Modell kann dazu beitragen, einen Einblick in die Wirkmechanismen von Molekülen zu erhalten, die neu in der Cochlea 28 sind , einschließlich Faktoren in den menschlichen Sekreten 19 , 20 , während sie möglicherweise das Screening von Kandidaten-therapeutischen Verbindungen 18 vor ihrer Untersuchung in vivo beschleunigen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt von der National Institute of Deafness und anderen Kommunikationsstörungen Zuschüsse R01DC015824 (KMS) und T32DC00038 (Unterstützung SD), die Abteilung für Verteidigung gewähren W81XWH-15-1-0472 (KMS), die Bertarelli Foundation (KMS), die Nancy Sayles Day Foundation (KMS) und das Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Wir danken Jessica E. Sagers, BA für aufschlussreiche Kommentare zum Manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ampicillin, Sodium Salt Invitrogen 11593-027
anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) BD Transduction Laboratories 612044
anti-Myo7A antibody, rabbit Proteus Biosciences 25-6790
anti-NF-H antibody, chicken EMD Millipore AB5539
anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) Antibodies Inc. 75-028
anti-TuJ1 antibody, mouse BioLegend 801202
Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg Corning 354241
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm Greiner Bio-One 664160
CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings Greiner Bio-One 627170
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm Greiner Bio-One 628160
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
Clear Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm Ted Pella Inc. 14027-20
Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm Ted Pella Inc. 260368
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
Distilled water, 500 mL Thermo Fisher Scientific 15230-162 
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
Dumont #4 Forceps Fine Science Tools 11241-30
Dumont #55 Forceps (Dumostar) Fine Science Tools 11295-51
Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% Sigma-Aldrich 459836-1L
Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028  Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
goat anti-chicken-647 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21469
goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-11004
goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21124
goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific A-21131
goat anti-rabbit-488 secondary antibody Thermo Fisher Scientific R37116
H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL EMD Millipore TMS-006-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL Thermo Fisher Scientific 14025-092
Instrument Tray with Lid Stainless Steel Mountainside Medical TechMed4255
Micro (dissecting) knife – angled 30° Fine Science Tools 10056-12
Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 VWR 16004-382
N-2 Supplement (100X), 5 mL Thermo Fisher Scientific 17502-048
NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL Thermo Fisher Scientific 25080-094
NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L Thermo Fisher Scientific SS266-1
Normal Horse Serum (NHS) Invitrogen 16050130
Operating scissors Roboz Surgical Instruments Co. RS-6806
Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023  Autoclave prior to use
Phalloidin, Alexa Fluor 568  Thermo Fisher Scientific A12380
Prep Pad, Non Sterile  Medline 05136CS
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Scalpel Handle - #4 Fine Science Tools 10004-13
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss  000000-1106-133
TCS SP5 confocal microscope Leica N/A
Triton-X (non-ionic surfactant) Integra T756.30.30
VectaShield antifade mounting medium for fluorescence Vector Laboratories, Inc. H-1000
Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick Zipline 0609132541599

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References

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Medizin Ausgabe 124 Murine Cochlea-Exploration Organotypische Kultur Innenohr äußere Haarzellen innere Haarzellen Spiralganglion-Neuronen auditorische Synaptopathie Adeno-assoziiertes Virus
Neonatal Murine Cochlear Explant Technik als<em&gt; In vitro</em&gt; Screening-Tool in der Hörforschung
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