Summary
O objetivo deste protocolo é demonstrar a preparação, cultura, tratamento e imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A técnica pode ser utilizada como ferramenta de seleção in vitro na pesquisa auditiva.
Abstract
Embora tenha havido avanços notáveis na pesquisa auditiva nas últimas décadas, ainda não há cura para a Perda auditiva sensorial (SNHL), uma condição que tipicamente envolve danos ou perda das delicadas estruturas mechanosensoriais da orelha interna. Ensaios sofisticados in vitro e ex vivo surgiram nos últimos anos, permitindo a triagem de um número crescente de compostos potencialmente terapêuticos, minimizando os recursos e acelerando os esforços para desenvolver curas para SNHL. Embora as culturas homogêneas de certos tipos de células continuem a desempenhar um papel importante na pesquisa atual, muitos cientistas agora contam com culturas organotípicas mais complexas de orelhas internas murinas, também conhecidas como explantes cocleares. A preservação de estruturas celulares organizadas dentro da orelha interna facilita a avaliação in situ de vários componentes da infra-estrutura coclear, incluindo células ciliadas internas e externas, neurônios ganglionares espirais, neurItes, e células de apoio. Aqui apresentamos a preparação, a cultura, o tratamento e a imunocoloração de explantes cocleares murinos neonatais. A preparação cuidadosa desses explantes facilita a identificação de mecanismos que contribuem para o SNHL e constitui uma ferramenta valiosa para a comunidade de pesquisa auditiva.
Introduction
Perda auditiva sensorial (SNHL) reflete dano ao ouvido interno ou via auditiva ascendente. Embora a perda de audição seja o déficit sensorial mais comum em humanos 1 , as terapias curativas ainda não existem 2 . Embora os implantes de tronco encefálicos cocleares ou auditivos possam restaurar algum grau de audição para pacientes com SNHL grave a profunda, a audiência fornecida por esses dispositivos ainda é muito diferente da audiência "natural", especialmente durante as tentativas de entender a fala em ruído ou para ouvir música.
Embora a degeneração de células ciliadas tenha sido considerada a principal conseqüência de eventos auditivos traumáticos ( por exemplo, exposição ao ruído alto), há evidências crescentes de que as sinapses que transportam informações de células ciliadas para o nervo auditivo são pelo menos tão vulneráveis a trauma acústico 3 , 4 , 5 > , 6 . Uma vez que os limiares audiométricos humanos, o padrão ouro atual para a avaliação da função auditiva, não prevêem danos celulares específicos na orelha interna, são necessárias ferramentas mais refinadas para detectar a degeneração celular o mais rápido possível e para iniciar um tratamento adequado 7 .
Os tratamentos farmacêuticos promissores para a perda auditiva são freqüentemente testados em culturas celulares homogêneas in vitro , mas esses sistemas não modelam com precisão o microambiente coclear. Sabe-se que as células cocleares secretam fatores tróficos que influenciam outros tipos de células dentro da cóclea 8 , 9 , um processo in vivo crucial que se perde quando o órgão de Corti 10 , 11 ou Neurônios de Ganglion Espiral (SGNs) 12 são cultivados isoladamente ou quando Marcadores moleculares são analisados13. No entanto, estudos in vivo que podem ser necessários para a validação de dados in vitro para estabelecer novos tratamentos personalizados para a perda de audição na busca de "medicina de precisão" requerem recursos e tempo significativos. Isto é especialmente relevante quando se considera Quanto esforço é necessário para aperfeiçoar e realizar injeções de membrana de orelha média ou arredondada com testes auditivos e a subsequente dissecção de montagens inteiras cocleares. O rastreio eficiente de compostos promissores em culturas orgotípicas ex vivo conhecidas como explantes cocleares fornece uma alternativa econômica e confiável 14 , 15 , 16 , 17 .
Este artigo detalha um protocolo para gerar, manter e avaliar explantes cocleares tratados. As aplicações específicas para este modelo são enfatizadas, incluindo seu uso na seleçãoDe compostos potencialmente terapêuticos e a avaliação comparativa de vetores virais para terapia genética. Uma abordagem de explante ex vivo permite aos pesquisadores visualizar os efeitos de um determinado tratamento em diferentes populações celulares in situ , facilitando a identificação de mecanismos específicos do tipo celular e o aprimoramento subseqüente de terapias específicas.
No geral, esta técnica fornece um modelo para estudar a cóclea ex vivo, ao mesmo tempo em que preserva a conversação vital entre os tipos de células muito diferentes que coexistem dentro da cóclea.
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Protocol
O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal (IACUC) do Massachusetts Eye and Ear. Os experimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial.
1. Preparando a dissecação
- Preparando a mesa cirúrgica
- Use etanol a 70% para desinfectar a mesa cirúrgica.
- Coloque duas pastilhas não preparadas ao lado do microscópio.
- Prepare a bandeja do instrumento, incluindo tesouras de operação esterilizadas por calor, uma alça de bisturí, uma microcarga e fórceps (duas em cada # 4 e # 55). Coloque a bandeja do instrumento e uma placa de Petri com fundo de parede de paredes claras de 50 mm sobre uma almofada não-estéril.
- Obter uma lâmina de bisturi # 15 estéril; Uma bolsa ou recipiente de plástico selável (para descartar as carcaças de acordo com as diretrizes institucionais); Gelo em um balde; E solução de sal equilibrada Hank, estéril e fria (HBSS). Coloque esses itens noOutra almofada não-esterilizada.
- Transfira o HBSS para um tubo de laboratório plástico de 50 mL e coloque-o sobre gelo.
- Preparando a cultura
- Prepare todos os materiais em uma capa de fluxo laminar. Para cada quatro espécimes, coloque quatro lâminas de cobertura de vidro redondas de 10 mm em autoclavagem nas quatro incrustações da placa de Petri de 35 mm de 4 poços.
- Para cada 4 espécimes, misture um volume total de 300 μL que consiste no seguinte em um tubo de microcentrífuga: 10 μL de adesivo de tecido, 285 μL de NaHCO 3 e 5 μL de NaOH.
- Coloque 45 μL da solução resultante em cada folha de cobertura e deixe-a lá durante pelo menos 20 minutos à TA; Esta solução pode ser deixada no lamínula durante várias horas, mas não pode ser deixada O / N.
- Coloque uma ou duas placas de petri de 4 mm de 4 mm no interior de uma placa de Petri de 10 cm para criar duas barreiras contra a contaminação.
- Preparar meio de cultura contendo 98% de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM), 1% de N-2 e 1% de ampicilina (65 μL por poço em um tubo de (micro) centrífuga). Aquecer a solução até 25 ° C antes da utilização.
2. Dissecção Extrica Cochlear Murina
- Decapitação do mouse neonatal
- Obtenha uma placa de petri de plástico de 60 mm e pulverize 70% de etanol na sua tampa de modo que a superfície esteja molhada.
- Despeje o HBSS frio do tubo de laboratório de plástico na parte inferior do plástico de 60 mm e a placa de Petri de fundo transparente com 50 mm de parede transparente. Armazene o tubo de laboratório de plástico e ambos os pratos de Petri no gelo para manter o tecido frio sempre que não estiver sendo dissecado.
- Coloque um rato neonatal P3-P5-envelhecido no gelo em um dedo de corte de uma luva de látex e aguarde até que a hipotermia induz perda de consciência (aproximadamente 1-3 min).
- Decapite o mouse rapidamente com tesoura em funcionamento e descarte o corpo na bolsa de plástico selável. Coloque a cabeça de recém-nascido em70% de etanol na tampa da placa PETRI de plástico de 60 mm.
- Dispersão macroscópica do osso temporal
- Remova a pele do crânio fazendo um corte superficial da parte anterior à posterior (diretamente na parte superior da sutura sagital) usando a lâmina do bisturi.
- Corte os dois canais auditivos externos com a lâmina do bisturi e dobre a pele anteriormente para expor todo o crânio.
NOTA: Embora não seja necessário nenhum microscópio de dissecação para esta etapa, ele pode ser usado para uma melhor visualização. - Abra o crânio ao longo da sutura sagital usando a lâmina # 15 do bisturi. Certifique-se de cortar o crânio movendo suavemente a lâmina para cima e para baixo de anterior para posterior para evitar a compressão das cócleas.
NOTA: O crânio não deve ser ossificado nesta idade e deve cortar facilmente. - Remova e descarte o focinho fazendo um corte vertical diretamente posterior às órbitas usando o bisturi # 15lâmina.
NOTA: A parte posterior do crânio ainda deve conter o cérebro e as cócleas. - Descarte o prosencéfalo, cerebelo e tronco cerebral através de dissecção sem corte com fórceps # 4.
- Extração microscópica das cócleas
- Ajuste o microscópio (ampliação 6.5X) e a fonte de luz colocando a pinça sob o escopo e otimizando a iluminação e o foco.
- Coloque as duas metades do crânio na placa de petri de plástico de 60 mm, preenchida com HBSS frio.
- Exponha completamente a cóclea / e, identificável como adjacente à artéria estapedial circundante (uma artéria tortuosa dentro do osso temporal) e separe sem rodeios o órgão do osso temporal usando fórceps # 4.
- Transfira a cóclea para a placa de Petri com fundo de vidro de 50 mm, de paredes claras e posicione o prato sob o microscópio.
- Coloque a placa de petri de plástico de 60 mm com a outra metade do crânio no gelo. Remova a cóclea do sistema vestibular e dissecar cuidadosamente a cápsula ocula coclear (tipicamente cartilaginosa a esta idade) com fórceps # 4. Use pinças # 55 para todas as etapas adicionais.
- Etapas finais do processamento de tecidos
- Continue com o processamento do tecido da orelha interna separando cuidadosamente o ligamento espiral aderente ao órgão de Corti do resto da cóclea e o modiolus usando a microcadeia ou duas fórceps.
- Corte na área mais escura e translúcida na fenda entre o ligamento espiral e a região das células ciliadas e proceda à remoção subseqüente do ligamento espiral, agarrando-o no aspecto mais basal e relaxando suavemente enquanto se move apicalmente.
- Posicione a amostra para obter uma visão longitudinal e sagital da cóclea e corte a cóclea em duas a três seções usando a microcâmara, classificando essas seções como apical, (meio) e bVoltas do Asal. Remova o tecido superior e inferior à camada real de células ciliadas e neurites, a fim de obter uma peça de explante coclear que pode ser colocada horizontalmente na placa de Petri.
NOTA: Um tamanho apropriado para a adesão estável ao prato de cultura é aproximadamente metade de uma volta coclear. - Remova a membrana tectorial, uma camada translúcida muito fina, imediatamente superior ao órgão de Corti, descascando suavemente com fórceps.
- Remova a membrana de Reissner, imediatamente superior às SGNs, tocando-a com fórceps em ambos os lados e descascando-a.
NOTA: Remova todas as áreas de células de cabelo danificadas localizadas lateralmente, cortando-as com a microcadeira.
- Continue com o processamento do tecido da orelha interna separando cuidadosamente o ligamento espiral aderente ao órgão de Corti do resto da cóclea e o modiolus usando a microcadeia ou duas fórceps.
3. Transferência de espécimes para as placas de cultura
- Remova os 45 μL de solução adesiva de tecido das quatro folhas de cobertura. Lavar cada deslizamento de cobertura com 50 μL de H2O estéril. Aspirar a água.
- Pegue a pipeta de 1 mL. Molhe a ponta da pipeta com aproximadamente 120 μL de DMEM para evitar que a amostra adira ao interior da ponta.
- Transfira os espécimes individualmente usando a pipeta de 1 mL. Pipetar um máximo de 70 μL da placa de Petri com fundo de vidro, pequeno, de paredes claras e com base em HBSS e colocar a amostra juntamente com o líquido em uma das 4 incrustações (preparadas com folhas de cobertura) na placa Petri de 4 poços .
- Verifique sob o microscópio (aumento de 50X) que a amostra está na orientação correta. Certifique-se de que a área das células ciliadas a partir da qual a membrana tectorial foi removida fica voltada para cima. Certifique-se de que a membrana basilar, juntamente com a parte basal reduzida do modiolus, esteja voltada para baixo e adere ao lamínula.
- Se o espécime for orientado de cabeça para baixo após a inspeção, deposite o HBSS que permanece na ponta da pipeta na embutição e reposicione a peça até que esteja corretamente orientada.
NÃOTE: isto impedirá que células ciliadas flutuem em meio de cultura sem suporte estrutural da lamínula, o que pode levar à degeneração.
- Se o espécime for orientado de cabeça para baixo após a inspeção, deposite o HBSS que permanece na ponta da pipeta na embutição e reposicione a peça até que esteja corretamente orientada.
- Aspirar excesso de HBSS usando a pipeta de 1 mL. Aguarde 15 s.
- Pipetar 60 μL do meio de cultura quente preparado (98% de DMEM, 1% de N-2 e 1% de ampicilina) diretamente sobre a amostra. Tenha cuidado para não tocar na amostra com a pipeta. Substitua as tampas interna e externa do prato de Petri e incube O / N a 37 ° C.
- Coloque todas as soluções de reserva em seus locais apropriados, descarte carcaças e resíduos residuais, descontaminar a mesa cirúrgica de acordo com diretrizes institucionais ( por exemplo, usando etanol ou hipoclorito), limpe e autoclave os instrumentos e descarte os objetos afiados no recipiente apropriado .
4. Adicionando meios culturais finais e substâncias de interesse
NOTA: Os explantes cocleares estarão prontos para uso 10-16 h depois.
- Prepare um mixtuRe 97% de DMEM, 1% de soro bovino fetal (FBS), 1% de N-2 e 1% de ampicilina (65 μL por poço em um tubo de microcentrífuga, aquecer a solução até 25 ° C antes da utilização).
- Adicione outras substâncias de interesse para as soluções para os respectivos grupos de tratamento. Se forem adicionadas substâncias fluorescentes ( p. Ex. Vírus da proteína fluorescente verde (GFP), em uma publicação recente, uma concentração de 10 10 GC de Vírus Adeno-Associados (AAVs) foi utilizada durante 48 h em 50 μL) 18 , proteja de luz.
- Transfira as placas de Petri contendo explantes cocleares da incubadora e coloque-as sob o capô de fluxo laminar.
- Aspirar o meio de cultura antigo (sem FBS) com a pipeta das inlays.
- Adicionar 60 μL por poço do meio de cultura quente (tratamento) preparado (97% de DMEM, 1% de FBS, 1% de N-2, 1% de ampicilina e as substâncias de interesse).
- Coloque a placa Petri de volta à incubadora (37 ° C).
- Ver rPor exemplo, no microscópio para identificar sinais de contaminação, migração celular ou desprendimento do explante coclear e realizar manchas após um máximo de 7 dias.
5. Imunofluorescência - Dia 1
- Preparar a solução de bloqueio (94% de solução salina tamponada com fosfato (PBS), 5% de soro normal de cabra ou cavalo (NGS / NHS, dependendo dos anticorpos secundários) e 1% de surfactante não iónico (ver Tabela de Materiais )) e estoque Solução de anticorpo (98,6% de PBS, 1% de NHS e 0,4% de surfactante não iónico com os respectivos anticorpos).
NOTA: Os anticorpos incluem o coelho anti-Myo7A a uma concentração de 1: 400+ (miosina 7A, para células ciliadas internas e externas) e anti-TuJ1 1: 200+ (β-tubulina, para SGNs) OU mouse (IgG1) anti -CtBP2 1: 200+ (proteína de ligação c-terminal, para presinapse), mouse (IgG2a) anti-PSD95 1: 50+ (densidade pós-sináptica, pós-sincronismo) e frango anti-NF-H 1: 1000+ (neurofilamento, Para SGNs e fibras nervosas). "+" MeaNs "ou superior". - Aspirar o meio de cultura usando uma pipeta. Tenha cuidado para não tocar na amostra.
- Sob o capô de fluxo laminar, enxágue os explantes cocleares duas vezes com PBS estéril, colocando os espécimes em um agitador durante 5 minutos após cada lavagem.
- Corrigir o tecido em paraformaldeído a 4% (PFA - CUIDADO) por 20 minutos no agitador (sob o capô). Aspirar o PFA.
- Aplique 60 μL de PBS nos explantes cocleares e coloque a placa de Petri em um agitador durante 5 min. Aspirar o PBS. Repita 3x.
- Coloque os explantes cocleares na solução de bloqueio preparada (94% de PBS, 5% de NHS e 1% de surfactante não iónico) durante 30 min no agitador.
- Coloque os explantes cocleares em uma solução de anticorpo de estoque preparada (98,6% de PBS, 1% de NHS e 0,4% de surfactante não iónico) com os respectivos anticorpos primários (vortex antes do uso) O / N em um contador na RT.
NOTA: Enrole as placas de Petri com toalhas de papel úmidas, incluídas em plástico (ou papel alumínio, se a solução adicionadaIon contém materiais fluorescentes, como vírus que expressam GFP) para manter a louça úmida e para evitar a evaporação da solução de anticorpo O / N.
6. Imunofluorescência - Dia 2
- Prepare a mancha de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) (300 nM) e use a solução de anticorpo de reserva para obter as misturas de anticorpos secundários corretas, complementares aos anticorpos primários no passo 5.1. (Por exemplo , cabra anti-coelho 488 1: 200+ e cabra anti-rato 568 1: 200+ OU cabra anti-rato (IgG1) 568 1: 1000+, cabra anti-rato (IgG2a) 488 1: 500+, E cabra anti-frango 647 1: 200+ OU Phalloidin 568 1: 200+ (para células ciliadas internas e externas)).
- Aspirar a solução primária de anticorpos.
- Aplique 60 μL de PBS nos explantes cocleares e coloque a placa de Petri em um agitador durante 5 min. Aspirar o PBS. Repita 3x.
- Colocar os explantes cocleares na solução preparada de anticorpo em estoque (98,6% de PBS, 1% de NHS e 0,4% de surfactante não iónico) com resAnticorpos secundários pectivos (vortex antes do uso) durante 1,5 h em um contador e protegem da luz.
- Aspirar a solução secundária de anticorpos e enxaguar os explantes cocleares com uma mancha DAPI (colocando em um agitador durante 1 min e depois aspirar).
- Aplique 60 μL de PBS nos explantes cocleares e coloque a placa de Petri em um agitador durante 5 min. Aspirar o PBS. Repita 3x.
- Use fórceps para remover lamínulas com espécimes da placa de 4 poços, mergulhe-os em um recipiente repleto de H 2 O destilado e retire os lamíninhos colocando-os verticalmente em contato com toalhas de papel.
- Coloque uma gota de meio de montagem antifade no slide do microscópio e inverta as lamelas para mergulhar o tecido voltado para baixo no meio.
- Selar a lamínula usando esmalte de asa transparente cobriu circunferencialmente a borda (sem esmagar a amostra sob o vidro). Deixe as lâminas deitado na área coberta longe da luz por 15 a 20 minutos até a secagem e a temperaturaColocá-los em uma caixa ou examinar sob o microscópio confocal.
NOTA: A coloração fluorescente é melhor conservada armazenando as lâminas a 4 ou -20 ° C.
7. Imagens confocais
- Obtenha uma visão geral e imagens ampliadas para o órgão da região de Corti, incluindo neurites e SGNs.
NOTA: Configurações padrão para o processo de imagem: Formato de 1.024 x 1.024 pixels, velocidade de 400 Hz, média de trama de 3, 20% de intensidade geral do laser e, geralmente, lente de 20X e 63X com imersão em óleo (potencialmente combinada com zoom digital 2X). As configurações de canal para o protocolo de coloração DAPI, Myo7A e TuJ1 são descritas acima: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766.8V, "Smart Offset" 0.0% - 488 15% isotiocianato de fluoresceína (FITC), "Smart Gain" 622.2V , "Smart Offset" 0,0% - 561 13% de isotiocianato de tetrametilrhomadina (TRITC), "Smart Gain" 562,4V, "Smart Offset" 0,0%. - Mesclar as imagens em uma pilha z usando oSoftware para obter uma projeção do eixo z.
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Representative Results
Enquanto muitos protocolos se concentram no órgão dos explantes de Corti, essa técnica tenta preservar a anatomia de toda a curva coclear, incluindo os SGNs. Isso dá aos pesquisadores a oportunidade de analisar os efeitos de um determinado tratamento sobre neurites e somata de SGNs, além do órgão de Corti. Realizar uma dissecção que preserva parte do modiolus, como descrito aqui, é mais tecnicamente desafiador do que explantar o órgão de Corti sozinho. No entanto, a área de neurite e SGN é importante, pois observaram-se efeitos patológicos significativos nesta região após a aplicação de secreções de schwannoma vestibular ( Figura 1 ) e vesículas extracelulares em duas publicações recentes usando a mesma metodologia 19 , 20 . Tais mudanças não poderiam ter sido reveladas usando órgão isolado de explantes de Corti.
ºA quantificação de células danificadas ou que expressam GFP para células ciliadas internas e externas, células de suporte e SGNs podem ser realizadas por contagem manual ou com um processo automatizado, como o incorporado ao plugin ImageJ NeuronJ. As áreas representativas para essas contagens podem ser estabelecidas após confirmar sua correlação com as contagens totais. As reconstruções em 3D são particularmente úteis para excluir efeitos de sobreposição nas projeções do eixo z de SGNs. A organização da fibra, o número de SGNs por área dada e a área SGN soma podem ser avaliadas. A coloração e contagem de sinapses, células ciliadas e neurites é representada na Figura 2 ; O mesmo protocolo também pode ser usado para montagens inteiras cocleares e mostrou ser um modelo confiável para esses propósitos 17 , 21 , 22 . Outros pesquisadores estabeleceram métodos alternativos elegantes que também podem ser incorporados em paradigmas experimentais 23 </ Sup> , 24 .
O comprimento máximo da cultura é geralmente limitado pelo início da migração celular e depende da concentração de FBS no meio de cultura. Quando a proporção de FBS foi reduzida de cinco por cento para três por cento ou um por cento, o período de tempo para manter um explante cochlear anatômico intacto foi estendido para aproximadamente uma semana ( Figura 3 ).
A Figura 4 demonstra células de explante cochlear positivas para GFP após transdução com o vetor de vírus adeno-associado sintético Anc80 durante 48 h 25 . As células internas do cabelo, as células do cabelo externo e as células de suporte podem ser quantificadas nesta visão, enquanto uma reconstrução 3D pode ajudar a quantificar as células GFP positivas na área SGN. Diferentes serotipos virais podem ser comparados em termos de eficiência de transdução em certasTipos usando a metodologia descrita 18 .
Figura 1: Microscopia Confocal Representativa de Explicantes Cochleares das Regiões Apical e Basais após Incubação com Secreções de Grandes Nervos Auriculares ou Schwannomas Vestibulares por 48 h . ( A ) Visão geral de um explante. O retângulo marca a área em imagens de close-up. Barra de escala = 200 μm. ( B - E ) Zoomed-in visões de células ciliadas e neurites. Barra de escala = 50 μm. Verde = Myosina 7A (Myo7A), mancha células ciliadas; Vermelho = classe III beta-tubulina (Tuj1), mancha estruturas neuronais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Imagem de Microscopia Confocal da Região de Células de Cabelo Explícitas Cochlear. ( A ) As sinapses intactas podem ser avaliadas rotulando proteínas pré-sinápticas (proteína de ligação C-terminal, vermelho) e pós-sináptica (densidade postsináptica-95, verde) juntamente com a coloração de estruturas neuronais (neurofilamento, azul). OHC, células ciliadas externas; IHC, células ciliadas internas. Barra de escala = 10 μm. ( B ) Concentre-se na região das células ciliadas internas com a contagem de células ciliadas internas (pontas de ponta vermelhas) e neurites (pontas de ponta azuis). Devido à ramificação das estruturas neuronais, é importante padronizar a distância das células ciliadas internas durante a contagem (destacada com a moldura branca, diretamente conectada às sinapses). Barra de escala = 5 μm. ( C ) Close-up de sinapses separadas (2 pares pré e pós-sinápticos marcados com setas de flecha brancas). Scale bar = 1 & # 181; m. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Microscopia Confocal Representativa Imagens de Explicantes Cochleais Apicais e Basais após 7 d em Cultura com FBS 3% ou 1%. ( A e B ) As células incubadas em 3% de FBS começam a migrar entre 4 e 5 dias (flechas cinza claro para células ciliadas, flechas vermelhas para neurites), ( C e D ). Os explantes em FBS 1% mantêm a integridade organizacional até o dia 7. Cinza claro: Myosina 7A (Myo7A), mancha todas as células ciliadas; Vermelho: classe III beta-tubulina (Tuj1), mancha as estruturas neuronais. OHC, células ciliadas externas; IHC, células ciliadas internas. Barra de escala = 100 μm, aplicada em todos os painéis.Iles / ftp_upload / 55704 / 55704fig3large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Microscopia Confocal Imagem de um Explicante Coclear Após Exposição ao Vector de Vírus Adeno-Associado Sintético Anc80 por 48 h. As células transduzidas expressam GFP (verde). Myosina 7A (Myo7A, azul) mancha células do cabelo externo (OHC) e células do cabelo interno (IHC); As estruturas neuronais das manchas de beta-tubulina classe III (Tuj1, vermelho). Suposição: área de células de suporte Sox2-positivas; SGN, neurônios ganglionares espirais. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os pesquisadores devem aperfeiçoar a técnica de dissecação antes de realizar experiências envolvendo explantes cocleares. As células do cabelo são comumente danificadas durante as dissecações realizadas no início da curva de aprendizado e um momento particularmente problemático para sua integridade é a remoção da membrana tectorial, que requer mãos firmes, ferramentas adequadas e experiência. Para economizar tempo e recursos, um controle visual deve ser realizado sob o microscópio de dissecação e áreas potencialmente danificadas devem ser observadas. Em vez de usar caras anticorpos primários e secundários, reagentes mais baratos, como a faloidina, são mais apropriados para experiências preliminares. Os explantes ligeiramente danificados podem ainda ser usados como controles em certas experiências (análise de seções que não foram afetadas) ou para o teste de novas combinações de anticorpos.
A transferência dos espécimes também é particularmente importante, porque é preciso garantir que as peçasNão estão orientados de cabeça para baixo (células de cabelo "flutuantes" sem a orientação do lamínula revestida, muitas vezes degeneradas). Uma posição central no lamínula facilita todas as etapas adicionais de pipetagem.
Para experiências de controle negativo envolvendo novos compostos (que obviamente devem ser solúveis no meio de cultura), é importante aplicar o veículo apropriado aos explantes e não se concentrar exclusivamente em explantes não tratados. Por exemplo, se um medicamento comercial inclui citrato de sódio, além do ingrediente ativo, então o citrato de sódio deve ser adicionado aos explantes cocleares de controle negativo porque o citrato de sódio pode ter um efeito.
As limitações ao uso de explantes cocleares incluem o fato de que essas culturas organotípicas são tipicamente derivadas de cachorros jovens que ainda estão sofrendo alterações de desenvolvimento pós-natal e que há uma falta de gradiente iónico em todo o explante, o que é essencial para o normalOuvindo in vivo . No entanto, a utilidade do protocolo é mostrada de forma convincente em uma publicação recente sobre AAVs 18 . Embora este grupo de vetores esteja limitado a cerca de 4,7 kb de capacidade de embalagem, tornou-se um recurso importante para a terapia de várias síndromes humanas 26 . Usando o modelo de explante coclear, a publicação acima mencionada demonstrou que o vírus Anc80 superou os serotipos de AAV tradicionais na transdução de uma variedade de células cocleares, incluindo células ciliadas e SGNs. Esses achados in vitro foram posteriormente confirmados pela escolha dos candidatos mais promissores para injeção através da janela redonda em filhotes de ratos in vivo . O modelo ex vivo fornece uma maneira de recapitular com sucesso a anatomia da cóclea, diminuindo o tempo e os recursos necessários para realizar trabalhos in vivo 27 .
Outra vantagem do ex vO modelo ivo é o seu potencial para aplicação no estudo de mecanismos celulares específicos que contribuem para o SNHL. Ao aplicar compostos encontrados no microambismo do tumor ( por exemplo, secreções de tumor humano) para um explante, o efeito desses compostos na cóclea pode ser visualizado diretamente e a eficácia ou toxicidade de potenciais terapias medicamentosas avaliadas. Isso é importante porque a cóclea humana não pode ser biopsiada, e as células nele não podem ser visualizadas in vivo . Por exemplo, uma publicação recente examinou o potencial ototóxico de proteínas segregadas de schwannomas vestibulares, que são tumores intracranianos que surgem dos nervos vestibulares e causam perda auditiva em 95% dos pacientes. A aplicação de secreções de tumor humano a explantes cocleares, em comparação com secreções de controle de nervos humanos saudáveis, confirmou os efeitos tóxicos dessas secreções na cóclea 19 . O mesmo experimento seria difícil de replicar em um in vivoModelo devido à resposta imunogênica contra proteínas humanas que surgiriam em um mouse imunocompetente.
Em resumo, este manuscrito apresenta uma técnica que permite o estudo simultâneo de células ciliadas cocleares, sinapses, neurites e neurônios em um modelo ex vivo . Este modelo pode ajudar a fornecer informações sobre os mecanismos de ação de moléculas novas para a cóclea 28 , incluindo fatores nas secreções humanas 19 , 20 , enquanto potencialmente aceleram a triagem de compostos terapêuticos candidatos 18 antes do teste in vivo .
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelos subsídios do Instituto Nacional de Surdez e Distúrbios da Comunicação R01DC015824 (KMS) e T32DC00038 (suporte de SD), o Departamento de Defesa concede W81XWH-15-1-0472 (KMS), a Fundação Bertarelli (KMS), o Nancy Sayles Day Foundation (KMS) e o Lauer Tinnitus Research Center (KMS). Agradecemos a Jessica E. Sagers, BA por comentários perspicazes sobre o manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ampicillin, Sodium Salt | Invitrogen | 11593-027 | |
| anti-CtBP2 antibody, mouse(IgG1) | BD Transduction Laboratories | 612044 | |
| anti-Myo7A antibody, rabbit | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| anti-NF-H antibody, chicken | EMD Millipore | AB5539 | |
| anti-PSD95 antibody, mouse(IgG2a) | Antibodies Inc. | 75-028 | |
| anti-TuJ1 antibody, mouse | BioLegend | 801202 | |
| Cell-Tak Cell and Tissue Adhesive, 5 mg | Corning | 354241 | |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 100 x 20 mm | Greiner Bio-One | 664160 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 35 x 10 mm, 4 inner rings | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 x 15 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| Clear Nail Polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | |
| Clear Wall Glass Bottom Dishes (Glass 40mm), PELCO®, Sleeve/20, 50 x 7 mm | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| Coverslips, Round, Glass, 10 mm diameter, Thickness #1, 0.13 - 0.16mm | Ted Pella Inc. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Distilled water, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #55 Forceps (Dumostar) | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Ethyl alcohol (EtOH), Pure, 200 proof, anhydrous, ≥99.5% | Sigma-Aldrich | 459836-1L | |
| Fetal Bovine Serum (FBS), qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| goat anti-chicken-647 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21469 | |
| goat anti-mouse(IgG)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11004 | |
| goat anti-mouse(IgG1)-568 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21124 | |
| goat anti-mouse(IgG2a)-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| goat anti-rabbit-488 secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2O, sterile, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 mL | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), calcium, magnesium, no phenol red, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| Instrument Tray with Lid Stainless Steel | Mountainside Medical | TechMed4255 | |
| Micro (dissecting) knife – angled 30° | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Microscope slides, VistaVision, color-coded, 75 x 25 mm (3 x 1"), 1 mm thick, white, pack of 72 | VWR | 16004-382 | |
| N-2 Supplement (100X), 5 mL | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3, Sodium Bicarbonate 7.5% solution, 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| NaOH, sodium hydroxide solution, 1 L | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| Normal Horse Serum (NHS) | Invitrogen | 16050130 | |
| Operating scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | |
| Paraformaldehyde (PFA), Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Phalloidin, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Prep Pad, Non Sterile | Medline | 05136CS | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Scalpel Handle - #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 confocal microscope | Leica | N/A | |
| Triton-X (non-ionic surfactant) | Integra | T756.30.30 | |
| VectaShield antifade mounting medium for fluorescence | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | |
| Zipper Bag, Reclosable, 4 x 6'' - 2 mm thick | Zipline | 0609132541599 |
References
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