Summary
Introduciamo un nuovo sistema di camera ipossia per uso con organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema è semplice, robusto, conveniente e consente l'induzione e la suscettibilità di ipossia in vivo e fino a 48 ore. Presentiamo 2 metodi riproducibili per monitorare l'efficacia dell'ipossia.
Abstract
Qui introduciamo un nuovo sistema per l'induzione di ipossia, che abbiamo sviluppato per studiare gli effetti dell'ipossia negli organismi acquatici come embrioni di rana e zebrafish. Il nostro sistema comprende una camera con una semplice configurazione che è tuttavia robusta per indurre e mantenere una specifica concentrazione e temperatura di ossigeno in qualsiasi soluzione sperimentale di scelta. Il sistema presentato è molto efficace in termini di costi, ma altamente funzionale, permette l'induzione e il sostegno di ipossia per esperimenti diretti in vivo e per vari periodi di tempo fino a 48 ore.
Per monitorare e studiare gli effetti dell'ipossia, abbiamo impiegato due metodi: la misura dei livelli di fattore 1alpha (HIF-1α) inducibile all'ipossia in embrioni interi o nei tessuti specifici e la determinazione della proliferazione delle cellule staminali retiniche mediante 5-etinil-2'- Deoxyuridine (EdU) nel DNA. I livelli HIF-1α possono servire da indicatore di ipossia generale in tutto l'embrione o il tessutoDi scelta, qui retina embrionale. L'incorporazione di EdU nelle cellule proliferanti della retina embrionale è un'uscita specifica dell'induzione di ipossia. Così abbiamo dimostrato che i progenitori ematici retinici ipossici diminuiscono la proliferazione entro 1 ora di incubazione sotto il 5% di ossigeno di entrambi gli embrioni di rana e zebrafish.
Una volta acquisita, la nostra configurazione può essere impiegata per l'utilizzo con piccoli organismi del modello acquatico, per esperimenti diretti in vivo , in un determinato periodo di tempo e in concentrazione normale o ipossidica o iperossica o sotto qualsiasi altra miscela di gas.
Introduction
La ricerca di ipossia ha numerose applicazioni. Questi includono indagare la patogenesi e sviluppare trattamenti per le condizioni mediche caratterizzate da ipossia 1 e malattia acuta di alta altitudine 2 . Lo stress ipossico provoca importanti cambiamenti metabolici in tutti gli organismi che richiedono ossigeno. Lo stress ipossico influenza anche la crescita fetale e lo sviluppo e la patogenesi di diverse malattie umane, inclusa la restrizione intrauterina della crescita 3 . Lo stress ipossico non può solo portare a ridurre il peso alla nascita, la mortalità fetale e neonatale, ma può anche provocare molte complicazioni nella vita adulta, come la malattia cardiovascolare, il diabete di tipo 2, l'obesità e l'ipertensione 4 . Lo stress ipossico è spesso osservato durante lo sviluppo del tumore solido, quando il tessuto tumorale supera la sua offerta di sangue. È quindi fondamentale poter studiare gli effetti dell'ipossia in vivo e direttamente durante l'embr Lo sviluppo yonic.
Tra i metodi più noti che sono stati utilizzati per studiare gli effetti dell'ipossia durante lo sviluppo è l'impiego di cloruro di cobalto nel mezzo di crescita o l'incubazione dell'organismo in una camera ipossica. La cloruro di cobalto induce artificialmente una reazione ipossidica alla normale concentrazione di ossigeno, a causa del suo ruolo nella stabilizzazione di alfa (HIF-1α) di fattore-1 indotta da ipossia, impedendo il degrado proteosomico 5 , 6 , 7 . Tuttavia, essendo un metodo conveniente 8 , l'uso di cloruro di cobalto e altri simili mimetici di ipossia chimica possono avere effetti deleteri non specifici sulle cellule e sui tessuti, ad esempio l' apoptosi 9 . Di conseguenza, le camere ipossiche sono un metodo migliore per l'induzione di "ipossia naturale" negli organismi viventi attraverso il corso di uno sviluppo normale.
Ntent "> Ci siamo concentrati sullo sviluppo di un sistema per l'induzione di ipossia negli embrioni animali acquatici, sia le rane che gli zebrafish che sono diventati degli organismi modello vertebrati informativi per studi di numerosi processi biologici, nonché modelli per varie malattie umane. Sviluppare ulteriormente, eliminando la complicazione della compensazione materna Inoltre, un rapido sviluppo dello sviluppo consente di manipolare i fattori ambientali e di osservare i cambiamenti fenotipici nella formazione degli organi in tempo reale. Inoltre, molti componenti dei principali percorsi di trasduzione del segnale sono altamente conservati Questi organismi di modello sono stati caratterizzati in dettaglio da un ampio volume di letteratura. Il principale vantaggio nell'uso delle rane e degli embrioni di zebrafish per studiare gli effetti dell'ipossia sullo sviluppo del vertebrato è che tutti i processi possono essere monitorati direttamente, in quanto l'ossigeno penetra rapidamente negli embrioni. Così, in rane e zebrafish, come in contrasto con altri organismi di modello comeEmbrioni di topi, l'influenza di una specifica concentrazione di ossigeno può essere studiata nel tessuto di interesse, senza prendere in considerazione la presenza o la mancanza di vascolarizzazione funzionale.La maggior parte delle configurazioni commercialmente disponibili per l'incubazione ipossica presenta lo svantaggio di essere comparabilmente grandi e avendo così elevati costi di funzionamento. Oltre al loro elevato costo iniziale e al consumo di gas, l'equilibratura e la manutenzione di camere comuni di ipossia richiedono l'assunzione di un'atmosfera ipossica costante contro il gradiente del gas che si verifica naturalmente in queste camere a causa della loro dimensione e / o respiratorio dell'organismo. Ciò richiede l'impiego di ventilatori a gas e di un sistema di raffreddamento, che aumenta la quantità di apparecchiature necessarie aggiuntive, ostacola la destrezza del ricercatore e in generale diminuisce la semplicità della procedura sperimentale. Al contrario, l'installazione che presentiamo qui è comparabilmente robusta ma molto conveniente, piccola, facile da stabilire e permette fL'equilibratura del gas, l'atmosfera ipossica stabile e lo scambio semplice di materiali e soluzioni all'interno della camera. Il nostro sistema può essere utilizzato per l'utilizzo con qualsiasi organismo di interesse acquatico.
Abbiamo costruito una camera ipossica che è convenientemente piccola e quindi può essere collocata all'interno di un incubatore di laboratorio comune, che consente facilmente le procedure sperimentali a qualsiasi temperatura specifica. Fornire un comodo controllo della temperatura e la concentrazione di ossigeno nel mezzo, il vantaggio del nostro sistema contro gli incubatori di ipossia commercialmente disponibili risiede nella sua ridotta dimensione e nell'efficienza dei costi. Quindi, la nostra configurazione può essere creata usando le forniture di laboratorio disponibili per la maggior parte dei laboratori di ricerca e non richiedono materiali costosi. Inoltre, la nostra configurazione non genera calore, a differenza degli incubatori di ipossia commercialmente disponibili e consente l'utilizzo a temperature inferiori alla temperatura ambiente in un incubatore. La laSt è particolarmente importante per il lavoro con organismi sangue freddi come rane e pesci dove i tassi di sviluppo e metabolismo sono fortemente dipendenti dalla temperatura.
Essendo molto conveniente e facilmente costruito, la nostra camera di incubazione del gas è tuttavia molto versatile nella determinazione di diverse condizioni ipossiche o iperossiche, oltre a consentire una gestione rapida e facile di diversi supporti e soluzioni per un vasto numero di condizioni sperimentali. Inoltre, impiegando una piastra a 24 pozzetti invece di piatti comunemente usati o serbatoi di laboratorio 10 , 11 , 12 , il nostro sistema consente di osservare e sperimentare contemporaneamente diverse condizioni mutanti.
Per controllare la corretta induzione dell'ipossia, abbiamo monitorato i livelli della proteina HIF-1α mediante la rilevazione Western blot. Inoltre, il numero di cellule proliferanti prima e dopo l'incubazioneN nella camera ipossica può essere utilizzato per determinare se l'ipossia è stata indotta nel tessuto. Questo metodo si basa sui nostri risultati pubblicati in precedenza 13 , mostrando che la proliferazione nella nicchia delle cellule staminali del retino embrionale diminuisce dopo l'induzione dell'ipossia. Così abbiamo monitorato il livello della proliferazione delle cellule staminali retiniche aggiungendo l'5-etinil-2'-deoxyuridine (EdU) al mezzo embrionale e misurando la sua incorporazione nel DNA delle cellule appena proliferanti.
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Protocol
Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Cambridge.
1. Manutenzione degli animali
- Embrioni di rana
NOTA: Gli embrioni possono essere sollevati e mantenuti secondo l'impianto di animale e di laboratorio. Qui viene descritto un esempio della manutenzione animale.- Preparare la soluzione soluzione modificata di Barth (MBS): 0,88 mM NaCl, 10 μM KCl, 24 μM NaHCO 3 , 100 μM HEPES, 8,2 μM MgSO 4 , 3,3 μM Ca (NO 3 ) 2 e 4.1 μM CaCl2, pH 7,6 .
- Ottenere embrioni di Xenopus laevis dalla fecondazione in vitro .
- Indurre l'ovulazione nelle rane africane africane adulte ( Xenopus laevis) mediante iniezione con gonadotropina sierica di mare incinta una settimana (60 UI) e 12 h (500 UI) prima della posa dell'uovo.
- Raccogliere oociti e fertilizzarli in vitro con testicoli maschi omogeneizzati.
- RaiSe embrioni in 0,1x MBS a 16 - 18 ° C. Stabilire gli embrioni secondo la tabella Normale di Xenopus laevis 14 . Prestate attenzione nella scelta di embrioni interi e vivi per l'esperimento.
- Zebrafish embrioni
NOTA: Gli embrioni possono essere sollevati e mantenuti secondo l'impianto di animale e di laboratorio. Qui viene descritto un esempio della manutenzione animale.- Preparare il medium embrionale: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2, 0,33 mM MgSO 4 e 0,00001% blu metilene.
- Mantenere e generare il ceppo WT AB Danio rerio a 26,5 ° C.
- Raccogliere gli embrioni alla mattina della fecondazione, sollevare fino a 4 giorni dalla fecondazione (dpf) a 28 ° C in mezzo ad embrione preparato come sopra descritto, selezionare e mettere come descritto in precedenza 15 .
2. Induzione dell'ipossia in vivo
- Utilizzare un serbatoio acquatico riproduttore ( Figura 1A ) che normalmente è utilizzato nella struttura dei pesci per la costruzione di camere ipossiche. Questo serbatoio dovrebbe montare una piastra da 24 pozzetti.
- Preparare una piastra a 24 pozzetti in mesh, come illustrato nella figura 1 . Rimuovere il fondo in plastica della piastra a 24 pozzetti ( figura 1B ), ad es ., Utilizzando una macchina di fresatura a tale scopo.
- Riempire lo spazio tra la plastica dei pozzetti e le pareti della lastra con resina epossidica. Fissare il filtro in nylon ( Figura 1C ) con un diametro della maglia di 0,1-0,2 mm sulla plastica rivestita in resina e lasciare che la piastra sia completamente asciutta.
- Una volta asciutta, trapano tre o quattro gallerie ( Figura 1D ) di lunghezza 10 mm e diametro 5 mm nelle pareti di piastre rivestite in resina e in rete. Collegare barre di plastica o teflon( Figura 1E ) di diametro appropriato e lunghezza 30 mm alle gallerie e posizionare la piastra nel serbatoio di scelta.
- Posizionare la piastra a 24 pozzetti in fondo alla rete nel serbatoio acquatico di scelta. Utilizzando tubi in silicone ( Figura 1F ), collegare un serbatoio a gas ( Figura 1G ) con la miscela O 2 / N 2 desiderata o un'altra miscela di gas scelta a una valvola di distribuzione ( Figura 1H ) utilizzando un appropriato regolatore del gas (I) (BOC 200 bar). Qui si utilizzano serbatoi a gas contenenti una miscela di ossigeno al 5% e 95% N 2 negli esperimenti di ipossia qui presentati.
- Regolare la portata dell'ossigeno nel mezzo della camera a 0,0017-0,0019 metri cubi al secondo. In questa portata di gas, non si deve vedere alcun disturbo del mezzo nei pozzetti della piastra.
- A tale scopo utilizzare il regolatore a gas a due stadi ad alta purezza. Impostare il regolatore per ridurre la pressione interna di th(1000 - 2500 PSI) ad una pressione di consegna di 10 PSI durante l'esperimento. Pertanto, in conformità alle specifiche di questo regolatore di gas, è stata raggiunta una portata pari a 0,00189 metri cubi al secondo durante l'esperimento.
- Collegare il tubo in silicone e la valvola di distribuzione a un diffusore a disco in ceramica ( figura 1J ) all'interno del serbatoio acquatico. Chiudere il serbatoio acquatico e sigillare con cura il coperchio, rivestendolo con grasso in silicone ( Figura 1K ) (confronta con la Figura 1 ). Se è necessaria una particolare temperatura non-ambiente, posizionare la camera ipossica in un incubatore di laboratorio di temperatura desiderata.
- A seconda del tipo di embrioni utilizzati nell'esperimento, riempire il serbatoio della camera ipossica con l'apposito mezzo embrionale e iniziare a diffondere la miscela di gas attraverso il diffusore a disco in ceramica. Equilibrare per 10-15 min.
- Dopo l'equilibratura con la thE la miscela di ossigeno desiderata, misurare la concentrazione di ossigeno nell'acqua usando una sonda ossimetrica o ossigeno. A questo scopo, utilizzare un ossimetro con l'ossigeno disciolto e il sensore di temperatura in fibra ottica.
- Selezionare con cura gli embrioni per l'esperimento, utilizzare embrioni interi e vivi per l'incubazione dell'ipossia. Qui, noi embrioni di rana dello stadio 38 o zebrafish embrioni 4 dpf negli esperimenti presentati qui.
- Posizionare i piatti di embrione nell'incubatrice ( Figura 1K ) contenente la camera di incubazione del gas e lasciarli equilibrare alla temperatura dell'incubatore.
- Trasferire con cura gli embrioni nei pozzetti della piastra a 24 pozzetti ( fig. 1B ) della camera di incubazione del gas, utilizzando una pipetta di plastica. Utilizzare sempre una pipetta di plastica per il trasferimento di embrioni durante tutto il protocollo.
NOTA: ogni pozzetto di questa piastra può contenere in suA 5 embrioni di rana dello stadio 38 o fino a 7 embrioni di zebrafish di 4 dpf. Etichettare con attenzione i pozzetti se usi genotipi diversi. - Mantenere la camera di incubazione del gas sotto un'infusione costante con la miscela di gas di scelta per 5 ore o per un tempo più lungo che si adatta all'esperimento. Utilizzare una miscela di 5% O 2 e 95% N 2 qui.
- Trasferire con cura gli embrioni dalla camera di incubazione del gas nel mezzo normossico corrispondente al tipo di embrione e procedere immediatamente con i passaggi 3 o 4.
- Se è necessario un ulteriore trattamento normossico, trasferire con cura gli embrioni nel mezzo normoxico corrispondente al tipo di embrione.
3. Controllo dell'insufficienza di ipossia attraverso monitoraggio dei livelli HIF-1α
- preparativi
- Preparare la soluzione 0,4 mg / mL di MS222 in 0,1 x MBS.
- Preparare il tampone di omogeneizzazione: Acquistare il buffer di analisi della radioimmunoprecipitazione (RIPA bUffer) per l'omogeneizzazione del tessuto e integrare la quantità di tampone necessaria per l'esperimento con l'inibitore della proteasi ad una concentrazione finale di 1: 100 v / v.
- Preparare soluzioni per Western blot.
- Preparare il tampone di carico del gel di Laemmli 4x: 425 mM Tris pH 8,0, 40% v / v Glicerolo, 8% v / v SDS, 4% v / v beta-mercaptoetanolo, 0,5% w / v Bromofenolo blu, 10 ml volume totale ddH2 O.
- Preparare il tampone di esercizio 5x: 15 g di base Trizma, 72 g di Glicina, 5 g di SDS, 1 L di volume totale ddH 2 O.
- Preparare il tampone di trasferimento: 2,66 g di base Trizma, 14,4 g di glicina, 200 ml di metanolo al 100%, volume totale di 1 L ddH 2 O.
- Preparare 10 volte TBST: 5 mL di 1 M Tris pH 8,0, 30 mL di 5M NaCl, 2,5 mL Tween 20, 1 L volume totale H 2 O.
- Preparare la soluzione di blocco: 4% in peso di latte scremato in polvere in 1x TBST.
- Raccolta di tessuti
- Anestetizzare gli embrioni bagnando in soluzione 0,4 mg / mL MS22216 , 17 e trasferirli in un tubo di reazione di plastica riempito con tampone di omogeneizzazione usando una pipetta di plastica. Usare 20 μL di tampone per embrione. Si noti che almeno 5 embrioni di rana dello stadio 38 o 7 embrioni zebrafish di 4 dpf sono necessari per determinare una significativa modifica dei livelli di proteine HIF1α.
- Omogeneizzare il tessuto utilizzando un appropriato omogeneizzatore di tessuti o un sonicatore. Rimuovere i detriti per centrifugazione (15 min; 13.000 xg; 4 ° C).
- In alternativa, dissectare le retine dagli embrioni rana anestetizzati 17 e omogeneizzare come sopra. Utilizzare 20 μl di tampone di omogeneizzazione per 10 retine.
- Portare il surnatante usando una pipetta denaturandola a 85 ° C per 5 min e completare il tampone di carico del gel di Laemmli fino a una concentrazione finale di 1x v / v ( ad esempio aggiungere 5 μl di tampone Laemmli 4x a 15 μl di homogenato). Usa questo supernatante per la WesO bloccare i campioni a -20 ° C.
- Western Blot
- Caricare i campioni preparati come descritto nella fase 3.2 su un gel prefabbricato del 12% in un sistema di elettroforesi usando un tampone di rotazione di 1x v / v. Utilizzare una scala proteica per determinare la dimensione delle proteine. Trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa (membrana da 0,45 μm) nel tampone di trasferimento per 1 ora imballata su ghiaccio a 4 ° C, secondo il protocollo del produttore.
- Bloccare siti di associazione non specifici che incubicano la membrana nel buffer di blocco per 60 min. Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in 1x TBST.
- Incubare la membrana in soluzione di anticorpi anti-HIF-1α coniglio e anti-α-tubulina del mouse, diluiti rispettivamente 1: 100 v / v e 1: 5000 v / v nella soluzione di blocco, per 2,5 h alla RT. Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in 1x TBST.
- Per il rilevamento, incubare negli anticorpi coniugati HRP con anti-coniglio e capra anti-topo diluiti 1: 1000 v / v nella soluzione di blocco per 1 h.Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in 1x TBST e visualizzare la colorazione HRP usando un kit commerciale e una macchina sviluppatrice di scelta.
- Quantificare la quantità di proteina HIF1α usando la quantificazione digitale.
4. Monitoraggio della proliferazione cellulare in ipossia
- preparativi
- Preparare una soluzione di 5 mM EdU nel mezzo di embrione di scelta. La soluzione può essere utilizzata immediatamente o in aliquota e conservata a -20 ° C per un massimo di 6 mesi.
- Preparare la salina fosfata-bufferizzata (PBS) o acquistare PBS da risorse commerciali. Autoclave per 10 minuti a 115 ° C.
- Preparare soluzioni per la rilevazione dell'incoronazione di EdU.
- Preparare la soluzione di fissazione: 4% v / v del 16% Soluzione di formaldeide in PBS.
- Preparare la soluzione di saccarosio: 30% in peso di saccarosio in PBS.
- Preparare PBST: 0,1% v / v Triton X-100 in PBS.
- Preparare la soluzione di blocco: 10% v / v Serum di capra inattivato termicamente (HIGS) in PBST.
- Preparare la soluzione DAPI: 1: 1000 v / v 4 ', 6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) in PBST.
- Incubazione di embrioni in ipossia per l'incorporazione di EdU
- Riempire la camera di incubazione del gas con 400-500 ml di soluzione di 5 mM EdU integrata con 1% v / v DMSO. Pre-equilibrare la soluzione con la stessa miscela di gas utilizzata nell'esperimento per 15 minuti prima dell'esperimento. Si noti che il volume della soluzione di incubazione può essere minimizzato mediante l'aggiunta di aste più corte ( figura 1E ) alla piastra inferiore della rete.
- Collegare il tubo del gas al cilindro di gas contenente una miscela di gas di 5% O 2 e 95% N 2 . Incubare la soluzione per 15 minuti.
- Trasferire gli embrioni nella camera ipossica, distribuendole uniformemente tra i pozzetti e incubare per 2 ore. Ogni pozzetto può ospitare fino a 5 embrioni di rana dello stadio 38 o fino a 7 embrioni zebrafish 4 dpf.
- Analizzare l'embrioneS per l'incorporazione di EdU.
- Corso di tempo dell'incubazione embrionale in ipossia e incorporazione di EdU
- Riempire la camera di incubazione del gas con 500 ml di mezzo di embrione di scelta. Collegare la tubazione del gas al cilindro del gas contenente una miscela di gas del 5% O 2 e 95% N 2 e bilanciare il mezzo con la miscela di gas per 15 minuti.
- Trasferire gli embrioni nella camera ipossica, distribuendole uniformemente tra i pozzetti e incubare per il periodo di tempo desiderato fino a 48 h. Negli ultimi 1 h, sostituire il mezzo embrionale con 5 mM EdU soluzione integrata con 1% v / v DMSO.
- Trasferisci gli embrioni al piatto normoxico e analizza per l'incorporazione di EdU.
- Rilevamento ed analisi di incorporazione di EdU
- Anestetizzare gli embrioni bagnando in soluzione 0,4 mg / mL MS222.
- Trasferire gli embrioni in un appropriato flaconcino di vetro e fissarlo incubando in soluzione di Fissaggio per 2 haT RT o O / N a 4 ° C. Seguire con 3 x 10 minuti di lavaggio in PBS. Trasferire con cura gli embrioni alla soluzione di saccarosio per la criocorrosione dei tessuti. Incubare per 4 ore o fino a che gli embrioni non si affondano sul fondo della fiala di vetro.
- Incorporare gli embrioni nel mezzo incorporante (composto ottimale della temperatura di taglio). Bloccare i blocchi con embrioni immediatamente o conservare fino a 14 giorni a -80 ° C.
- Cryosection i blocchi contenenti embrioni usando un cryostat. Raccogli le sezioni di 12 μm (embrioni di zebrafish) o 16 μm (embrioni di rana) sulle vetrini del microscopio e lasciar asciugare. Crioconduttori di processo immediatamente o conservare a -20 ° C per un massimo di 3 mesi.
- Rileva l'incorporazione di EdU mediante la colorazione immunofluorescenti usando un kit di chimica commerciale. Preparare la quantità di EdU Reaction Mix necessaria per il numero di criose nell'esperimento, come descritto dal produttore.
- Per 500 μL di EdU Reaction Mix, utilizzare 430 μl di 1X EdU buffer di reazione, 20 μl di CuSO 4 , 1,2 μL di Alexa Fluor azide, 50 μl di additivo 1 X EdU tampone.
- Lavare le criose una volta con PBS per rimuovere il mezzo di incorporazione e 3 x 5 min con PBST per permeabilizzare il tessuto. Incubare le criose nella soluzione di blocco per 30 min.
- Incubare le criose con la EdU Reaction Mix per 1 h e seguire 3 volte 10 minuti di lavaggio in PBST. Conservare le criose con soluzione DAPI per 15 minuti, seguite da 3 x 10 min di lavaggio in PBST. Montare le diapositive con criose colorate in un supporto di montaggio, coprire con coperchio e lasciare asciugare prima di analizzare sotto un microscopio fluorescente o conservare a 4 ° C per un periodo di 1 anno.
- Analizzare le criose con la colorazione anti-EdU sotto un microscopio di scansione confocale invertito e determinare il numero di cellule EdU-positive utilizzando la quantificazione digitale.
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Representative Results
L'impiego del sistema ipossidico a camera che presentiamo consente di studiare gli effetti dell'ipossia individualmente e in vivo in tutti gli animali vivi. L'ipossia può essere indotta mettendo interi rana o zebrafish nella camera ipossica ( Figura 1 ) e intraprendere diverse combinazioni di condizioni. Un'immagine della nostra configurazione camera a gas completata è mostrata in Figura 2 . Abbiamo monitorato la concentrazione di ossigeno nel mezzo di incubazione usando un sensore di ossigeno a fibre ottiche (2.1.9) a diversi punti temporali durante l'esperimento. Questi dati indicano che abbiamo indotto un'ipossia stabile (6-6,5% ossigeno disciolto) durante i nostri esperimenti ( Tabella 1 ).
Innanzitutto, abbiamo valutato livelli onnipresenti e retinici di HIF-1α in normossia e in ipossia come indotte nella nostra camera ipossica. HIF-1αÈ una proteina che si stabilizza a basse concentrazioni di ossigeno. Abbiamo misurato i livelli di HIF-1α in lisati di embrioni di rana, mantenuti sotto normale concentrazione di ossigeno o sottoposti a ipossia del 5% e nei lisati delle loro retine isolate. Come mostrato nella figura 3 , HIF-1α è stabilizzata sotto ipossia in entrambi gli embrioni interi e nelle retine. La stabilizzazione della HIF-1α è ottenuta in diversi pozzetti della piastra di incubazione a fondo maglia ( figura S1 ).
Come abbiamo già dimostrato, l'ipossia influisce sulla proliferazione dei progenitori delle cellule staminali retiniche nella zona marginale delle cellule (CMZ) della retina 13 . Pertanto, il monitoraggio della proliferazione nel CMZ mediante l'incorporazione di EdU è un buon indicatore per una buona induzione dell'ipossia. Abbiamo incubato gli embrioni in una camera ipossica mantenuta al 5% di ossigeno e abbiamo valutato la proliferazione retinica come descritto nel punto 4.2. Come si aspettaLe retine di controllo normossico hanno mostrato una colorazione intensiva di EdU nel CMZ, dove i progenitori proliferanti risiedono sia in rana ( figure 4B e 4D ) che in embrioni di zebrafish ( figure 5A e 5C ). Dopo la deprivazione dell'ossigeno nella camera ipossica, è stata osservata una forte diminuzione della proliferazione dei progenitori CMZ in entrambe le rane ( figure 4C-4D ) e gli embrioni di zebrafish (figure 5B, 5C). Per determinare la portata dell'effetto, abbiamo eseguito un tempo, incubando gli embrioni in camera ipossica per periodi più lunghi fino a 24 h, monitorando la proliferazione per incorporazione di EdU come descritto nella fase 4.3. Potremmo dimostrare che la diminuzione della proliferazione progenitrice retinica era acuta e maggiore entro 2 ore e persisteva per molte ore ( Figura 4D ), mentre gli embrioni si svilupparono normalmente secondo la loro fase di sviluppo. Questo risultato suggerisce che il nostro sistema può indurre in modo efficiente l'ipossia in un target tiDi interesse, su brevi tempi di incubazione e sostenere queste condizioni per periodi più lunghi, sostenendo normalmente lo sviluppo degli embrioni.
Figura 1: Rappresentazione schematica della configurazione della camera sperimentale del gas. ( A ) serbatoio acquatico di allevamento (22) x 10,5 (larghezza) x 10,5 cm (altezza)) ( B ) fondo a maglia inferiore a 24 pozzetti (12,8 x 8,6 x1,7 x 1,5 cm diametro del pozzo) Filtro con un diametro della maglia di tunnel di 0,1-0,2 mm ( D ) di 10 (lunghezza) x 5 mm (diametro) ( E ) Teflon o canne di PVC di diametro appropriato e tubo di silicone ( G ) di lunghezza 30 mm ( F ) La valvola di distribuzione della valvola distributore ( I ) della miscela ossigeno / CO 2 desiderata ( I ) ( J ) cerCoperchio del serbatoio del diffusore del disco amico ( K ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: un'immagine dell'impostazione della camera sperimentale del gas. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Tabella 1: Misurazione della concentrazione di ossigeno nei diversi tempi di incubazione nella camera del gas. Clicca qui per vedere una versione più grande di questo f IGURA.
Figura 3: Livelli HIF-1α aumentano sull'ipotesi di ipossia negli embrioni Xenopus e nelle loro retine. Western blot di lisati proteici provenienti da interi embrioni ( A ) o da retini embrionali isolati ( B ) mantenuti in normali concentrazioni di ossigeno o in ipossia. Le macchie sono state saggiate per la subunità HIF-1α e l'α-tubulina. Almeno 5 embrioni o 22 retine sono stati presi per ogni condizione ( n = 5) ( C, D ) Quantificazione della macchia Western eseguita in ( A, B ) rispettivamente. I livelli proteici di HIF-1α sono stati normalizzati ai livelli proteici di α-tubulina. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard tra gli esperimenti. * P -valore <0,05, *** p -valore <0,001; N = 5.D / 55710 / 55710fig3large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: L'ipossia diminuisce la proliferazione dei progenitori nella nicchia delle cellule staminali retiniche degli embrioni di rana. ( A ) Rappresentazione schematica di una sezione trasversale attraverso una retina Xenopus a 38 stadi, indicando la posizione della zona marginaria cilica (CMZ) ( B , C ) L'incorporazione di EdU misurata dopo un impulso di 2 h di EdU nelle retine colorate DAPI da 38 stadio Embrioni di rana mantenuti sotto normoxia ( B ) o nella camera ipossica ( C ). Magenta = macchia DAPI; Grigio = macchia EdU. Barre di scala = 50 μm ( D ) Quantificazione dell'esperimento eseguito in B e C. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard. ***
Figura 5: L'ipossia diminuisce la proliferazione dei progenitori nella nicchia delle cellule staminali retiniche di 4 dpf Zebrafish Embryos. L'incorporazione di EdU misurata dopo un impulso di 2 h di EDU nelle retine macchiate da DAPI da 4 dpf vecchi embrioni di zebrafish WTeEr normoxia ( A ) o nella camera ipossica ( B ). Magenta: macchia DAPI; Grigio: macchia EdU. Barre di scala = 50 μm ( C ) Quantificazione dell'esperimento eseguito in B e C. Le barre di errore rappresentano deviazioni standard. *** p -valore <0,001; N = 7. Per ogni condizione sono state quantificate 10-15 retine. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplementare Figura 1: Livelli HIF-1α aumentano all'India Hypoxia coerentemente in diversi pozzetti della piastra e tra diversi esperimenti. Western blot di lisati proteici da tutti gli embrioni Xenopus mantenuti in normali concentrazioni di ossigeno oIn due diversi pozzetti della camera ipossidica sotto induzione di ipossia per 2 ore nell'esperimento 1 ( A ) o nell'esperimento 2 ( B ). Le macchie sono state saggiate per la subunità HIF-1α e l'α-tubulina. Sono stati presi 5 embrioni di rana dello stadio 38 per ogni condizione. Gli esperimenti 1 e 2 sono replicati biologici indipendenti ( C, D ) Quantificazione delle macchie Western eseguite in ( A, B ), rispettivamente. I livelli proteici di HIF-1α sono stati normalizzati ai livelli proteici di α-tubulina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Qui abbiamo presentato un nuovo metodo semplice ma robusto per indurre l'ipossia che è regolato per l'uso con embrioni di rana e zebrafish, ma può anche essere adatto ad altri organismi acquatici. Il principale vantaggio di questo metodo consiste nella semplicità e nell'efficienza dei costi. Tuttavia, i risultati ottenuti con questo metodo sono molto robusti. Abbiamo dimostrato che l'ipossia può essere efficacemente indotta nella camera sia in embrioni interi che in tessuti specifici - qui, retinas. Per determinare l'efficacia dell'induzione dell'ipossia, abbiamo monitorato i livelli di proteina HIF-1α in interi embrioni e lisati retinici. Secondo i nostri risultati, l'induzione dell'ipossia può essere considerata come un successo se un aumento dei livelli di HIF-1α può essere osservato per 1 h nella camera ipossidica rispetto al controllo normossico e normalizzato ai livelli globali di proteine, ad esempio utilizzando i livelli di α-tubulina Come controllo. Abbiamo confermato l'attività dell'ipossia nel tessuto monitorando il prolifero delle cellule staminaliIn retinas per incorporazione di EdU e potrebbe dimostrare, in accordo con i nostri risultati pubblicati in precedenza 13 , che l'ipossia indotta usando il setup presentato qui porta ad una diminuzione della proliferazione delle cellule staminali retiniche sia negli embrioni di rana e zebrafish.
Uno dei passaggi critici di questo protocollo è quello di garantire che la camera ipossidica sia correttamente sigillata. Viene realizzato utilizzando una guarnizione appropriata sul coperchio del serbatoio, che era il grasso siliconico nel nostro caso. Inoltre, il posizionamento all'interno di un incubatore contribuirà a evitare la perdita di ossigeno atmosferico nella camera, fornendo una barriera aggiuntiva. Una misurazione della concentrazione di ossigeno con una sonda o un elettrodo appropriato garantisce anche che i livelli ipossici di ossigeno siano mantenuti stabili e senza fluttuazioni. Inoltre, occorre prestare attenzione a evitare l'apertura della camera per lunghi periodi, mentre scambiare soluzioni o campioni tra sperimentazioni.
Dato equilibrio veloceTempi di ibration di 10-15 minuti per l'istituzione di ipossia, solo una piccola quantità di miscela di gas e una bassa portata di gas sono necessari per sostenere il sistema anche per periodi più lunghi di quanto descritto nei risultati rappresentativi (24 h). Le soluzioni utilizzate nell'esperimento devono essere pre-equilibrate per ottenere l'ipossia per 15 minuti prima dell'incubazione nella camera (come descritto al punto 4.2.1). Abbiamo usato la camera ipossica nel periodo di 48 ore di ipossia costante senza errori come si vede dalle nostre misure di concentrazione di ossigeno ( Tabella 1 ). Va notato che la corretta diffusione del gas deve essere controllata durante i periodi più lunghi di incubazione. Infine, occorre prestare attenzione a mettere gli embrioni nei pozzetti (punto 2.2.1.) Per evitare la mescolanza di embrioni da animali mutanti / condizioni sperimentali. Questo è abbastanza semplice da ottenere dato le pareti relativamente alte dei singoli pozzetti della piastra.
Nonostante sia un semplice ma efficaceE un sistema robusto per l'induzione di ipossia, l'uso della camera qui descritta ha un inconveniente per esperimenti che richiedono l'uso di soluzioni e mezzi di incubazione costosi. Il volume minimo di supporti nel serbatoio della camera non dovrebbe scendere sotto i 400 ml. Tuttavia, è possibile effettuare regolazioni per i volumi più bassi: siamo riusciti a regolare la lunghezza delle aste ( figura 1E ) fissata alla piastra (2.1.4 e 4.2.1) in modo da richiedere solo 50 ml di media / soluzione . Sebbene non sia ideale per tempi di incubazione più lunghi, questa configurazione può essere inserita nello stesso tubo di gas e può essere opportunamente sigillata per garantire un'ipossia sufficiente fino a 8 h.
Assorbiti insieme, la nostra configurazione della camera a gas può essere impiegata per l'utilizzo con qualsiasi organismo modello acquatico e viene separata da altri sistemi simili commercialmente disponibili per la sua semplicità, redditività e robustezza. Una volta masterizzato, può essere utilizzato per esperimenti in vivo diretto, in qualsiasi periodo di tempo e in qualsiasi desiderioD atmosfera a gas, compresi ipossia, iperossia o altre miscele di gas.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal sostegno da Wellcome Trust SIA Award 100329 / Z / 12 / Z a WAH e dalla borsa DFG KH 376 / 1-1 assegnata a HK
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | NaCl/0.1x MBS, Embryo medium, 10x TBST |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | KCl/0.1x MBS, Embryo mediu, |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | NaHCO3/0.1x MBS |
| HEPES | Sigma | H3375 | 0.1x MBS |
| Magnesium sulfate | Sigma | M7506 | MgSO4/0.1x MBS, Embryo medium |
| Calcium nitrate | Sigma | 202967 | Ca(NO3)2/0.1x MBS |
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | CaCl2/0.1x MBS, Embryo medium |
| Methylene blue | Sigma | M9140 | Embryo medium |
| Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG) | Sigma | CG10 | Frog fertilization |
| Zebrafish breeding tank | Carolina | 161937 | Gas chamber construction |
| 24-well plate | Thermo Scientific | 142475 | Nunclon Delta Surface, for gas chamber construction |
| Epoxy resin | RS Components UK | Kit 199-1468 | |
| Gas distributor valve | WPI Luer Valves | Kit 14011 | Aquatic tank attachment (Schema 1, H) |
| High precision gas valve | BOC | 200 bar HiQ C106X/2B | Gas tank attachment (Schema 1, I) |
| 5% oxygen and 95% N2 gas tank | BOC | 226686-L | Hypoxic gas mixture |
| ceramic disc diffuser | CO2 Art | Glass CO2 Nano Aquarium Diffuser, DG005DG005 | Schema 1, J |
| silicone grease | Scientific Laboratory Supplies | VAC1100 | Schema 1, K |
| oxymeter | Oxford Optronix | Oxylite, CP/022/001 | Hypoxic chamber setup |
| fibre-optic dissolved oxygen sensor | Oxford Optronix | HL_BF/OT/E | Hypoxic chamber setup |
| plastic pasteur pipette | Sterilin | STS3855604D | For embryo transfer |
| MS222 | Sigma Aldrich | E10521-50G | Embryo anesthetic |
| RIPA buffer | Sigma | R0278-50ML | Tissue homogenization |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 | Tissue homogenization |
| Tris | Sigma | 77-86-1 | 4x Laemmli loading buffer, 10x TBST |
| Glycerol | Sigma | G5516 | 4x Laemmli loading buffer |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma | L3771 | 4x Laemmli loading buffer, 5x Running buffer |
| beta-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | 4x Laemmli loading buffer |
| Bromophenol Blue | Sigma-Aldrich | B0126 | 4x Laemmli loading buffer |
| Trizma base | Sigma | 77-86-1 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Glycine | Sigma | G8898 | 5x Running buffer, Transfer buffer |
| Methanol | Sigma | 34860 | Transfer buffer |
| Tween 20 | Sigma | P2287-500ML | 10x TBST |
| skim milk powder | Sigma | 70166 | Blocking Solution |
| Eppendorf microcentrifuge tube | Sigma | T9661 | |
| tissue homogenizer | Pellet Pestle Motor Kontes | Z359971 | Tissue homogenization |
| pellet pestles | Sigma | Z359947-100EA | Tissue homogenization |
| precast 12% gel | Biorad | Mini-ProteinTGX, 456-1043 | Western Blot |
| protein ladder | Amersham | Full-Range Rainbow ladder, RPN800E | Western Blot |
| nitrocellulose membrane (0.45 µm) | Biorad | 162-0115 | Western Blot |
| anti-HIF-1α antibody | Abcam | ab2185 | Western Blot |
| anti-α-tubulin antibody | Sigma | T6074 | Western Blot |
| goat anti-rabbit antibody | Abcam | ab6789 | Western Blot |
| goat anti-mouse antibody | Abcam | ab97080 | Western Blot |
| Pierce ECL 2 reagent | Thermo Scientific | 80196 | Western Blot |
| ECL films Hyperfilm | GE Healthcare Amersham | 28906837 | Western Blot |
| 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine | santa cruz | CAS 61135-33-9 | EdU, EdU incorporation |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | Oxoid | BR0014G | 1x |
| Formaldehyde | Thermo Scientific | 28908 | Fixation solution |
| Sucrose | Fluka | S/8600/60 | Solution solution |
| Triton X-100 | Sigma | T9284-500ML | PBST |
| Heat-inactivated Goat Serum (HiGS) | Sigma | G6767-100ml | Blocking solution (EdU incorporation) |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | DAPI, EdU incorporation |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation |
| glass vial | VWR | 98178853 | EdU incorporation analysis |
| Tissue-Plus optimal cutting temperature compound | Scigen | 4563 | Embedding medium, EdU incorporation analysis |
| cryostat Jung Fridgocut 2800E | Leica | CM3035S | EdU incorporation analysis |
| microscope slides Super-Frost plus Menzel glass | Thermo Scientific | J1800AMNZ | EdU incorporation analysis |
| EdU Click-iT chemistry kit | Molecular Probes | C10338 | EdU incorporation analysis |
| FluorSave | Calbiochem | D00170200 | Mounting medium, EdU incorporation analysis |
| coverslips | VWR | ECN631-1575 | EdU incorporation analysis |
| fluorescent microscope | Nikon | Eclipse 80i | EdU incorporation analysis |
| confocal scanning microscope | Olympus | Fluoview FV1000 | EdU incorporation analysis |
| Volocity software | PerkinElmer | Volocity 6.3 | EdU incorporation analysis |
References
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