Summary
Detta arbete presenterar en metod för att snabbt och exakt kvantifiera abdominal pigmentering av Drosophila melanogaster med hjälp av digital bildanalys . Denna metod effektiviserar förfarandena mellan fenotypförvärv och dataanalys och innefattar provmontering, bildförvärv, pixelvärdesutvinning och egenskapsmätning.
Abstract
Pigmentering är ett morfologiskt enkelt men mycket variabelt drag som ofta har adaptiv betydelse. Den har fungerat i stor utsträckning som en modell för att förstå utvecklingen och utvecklingen av morfologiska fenotyper. Abdominal pigmentering i Drosophila melanogaster har varit särskilt användbar, så att forskare kan identifiera de loci som ligger till grund för inter- och intraspecifika variationer i morfologi. Hittills har D. melanogaster bukpigmentering i stor utsträckning analyserats kvalitativt, genom scoring, snarare än kvantitativt, vilket begränsar formerna för statistisk analys som kan appliceras på pigmentationsdata. Detta arbete beskriver en ny metod som möjliggör kvantifiering av olika aspekter av abdominalpigmenteringsmönstret hos vuxen D. melanogaster . Protokollet innehåller provmontering, bildinspelning, datautvinning och analys. All programvara som används för makroer för bildinspelning och analysfunktionSkrivet för open-source bildanalys. Fördelen med detta tillvägagångssätt är möjligheten att exakt mäta pigmenteringsegenskaper med hjälp av en metod som är mycket reproducerbar över olika bildsystem. Medan tekniken har använts för att mäta variation i tergalpigmenteringsmönstren hos vuxen D. melanogaster är metoden flexibel och i stor utsträckning tillämplig på pigmenteringsmönster i otaliga olika organismer.
Introduction
Pigmentering visar enorm fenotypisk variation mellan arter, populationer och individer, och även inom individer under ontogeni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Även om det finns otaliga studier av pigmentering i ett stort antal djur har pigmentering kanske bäst studerats i Drosophila melanogaster , där molekylärgenetics fulla kraft har använts för att belysa de utvecklings- och fysiologiska mekanismer som reglerar pigmentering och hur dessa mekanismer utvecklas 1 , 6 . Mycket är känt om gener som reglerar den biokemiska syntesen av pigment i D. melanogaster 7 , 8 och de gener som styr den tidsmässiga och rumsliga diFördelning av denna biosyntes 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Vidare har genetisk kartläggning identifierat de genetiska loci som ligger bakom intra- och interspecifika skillnader i pigmentering i D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Förhållandena mellan pigmentering och pleiotropa egenskaper, såsom beteende 18 , 19 och immunitet 19 , 20 har också undersökts, liksom den adaptiva betydelsen av pigmenteringsmönstren 15 , 21 , 22 . Som sådan har pigmentering i D. melanogaster framkommit som en kraftfull men enkel mOdel för utveckling och utveckling av komplexa fenotyper.
Pigmentering i vuxen D. melanogaster kännetecknas av tydliga mönster av melanisering över kroppen, särskilt på vingarna och dorsalt thorax och buken. Det är pigmentering av varje kutikulär platta (tergit) på dorsaltabben, men det har fått mest forskningsinspektion. Det finns stor variation i denna pigmentering ( Figur 1A- F ), på grund av både genetiska 17 , 23 och miljömässiga 24 , 25 faktorer. Kutiklet i en buk-tergit består av främre och bakre utvecklingsfack ( Figur 1G ), som var och en kan vidareuppdelas beroende på pigmentering och ornamentation 26 . Det främre facket innehåller sex nagelbandTyperna (a1-a6) och det bakre facket innehåller tre (p1-p3) ( figur 1G ). Av dessa foldas pl, p2 och a1-kutiklet typiskt under tergiten i osträckta buken så att de är gömda. Den tillförlitliga synliga nageln kännetecknas av ett band av tung pigmentering, här kallad "pigmentband", bestående av nageltyper a4 (hårig med måttliga borstar) och a5 (håriga med stora borstar) med bandets bakre kant Mer intensivt pigmenterad än den främre kanten ( figur 1G ). Anterior till detta band är en region av lätt pigmenterad hårig kutikula, som har borst posteriorly (a3) men inte främre (a2). Variation i pigmentering mellan flugor observeras både i pigmentens intensitet och i pigmentbandets bredd. I allmänhet är variationen störst i de mest bakre segmenten (buksegment 5, 6 och 7) och är lägre i de mer främre segmenten (bukSegment 3 och 4) 24 . Vidare finns det en sexuell dimorfism vid D. melanogasterpigmentering , där män generellt har fullpigmenterad femte och sjätte buk-tergit ( Figur 4C ).
I de flesta studier av bukpigmentering i D. melanogaster har pigmentering behandlats som en kategorisk eller ordinär egenskap, mönstret mätt kvalitativt 27 , 28 , 29 eller halvkvantitativt i en skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Dessa metoder har oundvikligen en brist på precision, och eftersom de är beroende av den subjektiva bedömningen av pigmentering är det svårt att jämföra data mellan studier. Flera författare har kvantifierat de rumsliga dimensionerna för pigmentering 38 , 39 , intensiteten av pigmentering av en särskild kutikeltyp 23 , 25 , 39 , 40 eller pigmentens genomsnittliga intensitet över hela buk-tergiten som helhet 41 , 42 , 43 . Ändå mäter dessa kvantifieringsmetoder inte både intensiteten och den rumsliga fördelningen av bukpigmentering samtidigt och därmed fångar inte nyanser av hur pigmentering varierar över abdomenOminal tergit. Vidare fordrar flera av dessa kvantifieringsmetoder 38 , 41 , 42 , 43 dissektion och montering av bukpartikeln. Detta är både tidskrävande och förstör provet, vilket gör det otillgängligt för ytterligare morfologiska analyser. Eftersom förståelsen för utveckling och utveckling av bukpigmentering fördjupas, kommer mer sofistikerade verktyg att snabbt och exakt mäta både rumsfördelningen och pigmentens intensitet.
Det övergripande målet med denna metod är att utnyttja digital bildanalys för att erhålla ett replikerbart och mer exakt mått på bukpigmenteringen i D. melanogaster . Metoden omfattar tre steg. För det första är den vuxna flyget icke destruktivt monterad, och en digital bild av dorsal buken tas. För det andra använder användaren ett ImageJ-makroDefinierar en främre-posterior remsa av pixlar som sträcker sig från framsidan av a2-kutiklet till den bakre delen av a5-kutiklet (grön lådan, figur 1G ) på både det tredje och det fjärde buksegmentet. Det genomsnittliga pixelvärdet över bredden av denna remsa extraheras sedan längs sin längdaxel, vilket alstrar en profil som fångar rumsfördelningen och intensiteten av pigmenteringen när den ändras från den främre till den bakre delen av tergiten. För det tredje används ett R-skript för att beskriva pigmenteringsprofilen matematiskt med hjälp av en kubisk spline. R-skriptet använder sedan spline och dess första och andra derivat för att extrahera bredden på a2-a5-kutiklet, pigmentbandets bredd och pigmentens maximala och minsta nivåer. Metoden kvantifierar därför både de rumsliga egenskaperna och djupet av bukpigmenteringen.
Denna metod kvantifierar pigmenteringen av den tredje och fjärde buken tergiten,Som har varit i fokus för många tidigare studier 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , antingen exklusivt eller i kombination med mer bakre tergiter. Även om det är mindre variabelt än den femte och sjätte buk-tergiten, är den tredje och fjärde tergiten inte helt pigmenterad hos män, så detta protokoll kan tillämpas på både män och kvinnor. Trots detta kan protokollet användas för att mäta pigmentering i femte och sjätte buk-tergiten hos kvinnor. Vidare bör mindre modifieringar av de skript som används för att extrahera pigmenteringsprofilens egenskaper låta metoden användas för att kvantifiera variationen i pigmentering i en mängd andraorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Provmontering
OBS: Förvara döda flugor i 70% etanol i vatten före bildning.
- Häll 10 ml 1,25% agar löst i kokande vatten i en 60 mm x 15 mm petriskål och låt den sätta.
- Under ett dissekeringsmikroskop, använd ett par fintpunktappar för att skapa en ~ 20 mm grov, 2 mm bred, 1 mm djup spår i gelens yta. Med hjälp av fina pincett, lägg in den ventrala sidan av en vuxen flyga i spåret, med den dorsala sidan av flugan som skjuter ut ovanför gelén.
OBS: Lösningen av gelén möjliggör enkel omplacering utan att skada provet. Samma spår kan användas för flera exemplar, även om det blir smutsigt, uppbrutet och oanvändbart med tiden. Användaren kan sedan göra ett annat spår i samma gel. Varje platta kan användas för att bilda ~ 200 flugor. - Helt täcka provet i 70% etanol i vatten för att minska eventuella ljusreflektioner från vaxartiklarna och för att förhindra att vingen skadasManipulering av prov.
2. Microscope Setup
OBS! Bilderna är förvärvade med hjälp av en dissekeringsomfattning, överförd ljusbas, digitalkamera och gooseneck kall ljuskälla ansluten till en dator som kör bildövervakningsstyrningsprogram. Programvaruanvisningarna är specifika för Micro-Manager v1.4.20 44 , vilket är en open source-programvara som innehåller ImageJ 45 .
- Slå på mikroskopet, den digitala kameran, den dubbla gooseneckens kalla ljuskällan och datorn.
- Kör programvaran för bildinspelning för att öppna ett Micro-Manager-fönster och ett ImageJ-fönster. I ImageJ-fönstret klickar du på "Bild"> "Typ"> "8-bit" för att ställa in alla bilder som 8-bitars. Klicka på "live" i Micro-Manager-fönstret för att öppna ett "Snap / Live" -fönster som visar en förhandsvisning i realtid från kameran.
- Maximera storleken på "Snap / Live" -fönstret om necessary. Välj "Gråskala" i rullgardinsmenyn "Visningsläge" på fliken Kontrast i Micro-Manager-fönstret.
- Slå på den kalla ljuskällan till sin maximala intensitet och placera spetsarna på varje gängsäck till ca 120 mm från scenen, en till vänster och en till höger.
OBS! Användare kan också använda en ringformad belysning, även om det här kan generera en ring av reflekterat ljus runt flygunderlivet. - Ställ in mikroskopförstoringen manuellt till 60X så att synfältet fångar ett område som är ungefär 3 mm i diameter på scenen.
- Placera en mikrometer på 2 mm steg på scenen (byter bakgrund till vit om det behövs). När du tittar på live-förhandsvisningen fokuserar du på scenmikrometern och justerar exponeringen i Micro-Manager-fönstret genom att ange exponeringstiden i ms i rutan Exponering.
- För att spatialt kalibrera kameran, välj verktyget "rak linje" i tHan ImageJ fönster och rita en linje längden på scenen mikrometer. I BildJ-fönstret klickar du på "Analysera"> "Ange skala" för att öppna fönstret "Set Scale", ange längden på mikrometeren i μm i rutan "Känd distans" och ange "μm" i "Enhetens längd" låda.
- Se till att "Set Scale" -fönstret sedan visar skalan i "pixlar / μm". Notera skalan och klicka på "OK".
- I fönstret "Snap / Live" klickar du på "Stopp" och sedan "Snap" för att fånga en bild av scenmikrometern.
- Spara bilden som en 8-bitars gråskala TIFF för att säkerställa möjligheten att kalibrera bilderna igen, om nödvändigt. I ImageJ-fönstret klicka på "File"> "Save As"> "Tiff ..." Ange var filen ska sparas i filbläddraren, namnge filen och klicka på "Spara".
- Byt scenen till svart och placeraEn petriskål med en fluga monterad i agar (steg 1.1-1.2) på scenen.
- Titta igenom mikroskopet och placera flugan för att säkerställa att dorsal mittlinjen är rakt upp för att bäst kunna se pigmenteringsmönstret. Flytta några vingar och bilagor för att säkerställa att utsikten över buken är obegränsad. Om det pigmenterade nagelbandet (a2-a5) inte är synligt, klämma buken i sidled tills det är (även om flugens buk ligger i 70% etanol i vattensträckning, så att det inte är nödvändigt med det).
ANMÄRKNING: När du placerar flygningen kan användaren behöva använda en lägre förstoring (20X). Förstoringen måste returneras till 60X innan du fortsätter. - Manuell inriktning på flugens dorsala buk. Justera ljuskällans tips manuellt för att minimera skuggorna och reflektionerna på dorsal buken.
- När du tittar på live-förhandsgranskningen på datorskärmen och använder pixelvärdeshistogrammet på fliken Kontrast i Micro-Manager-fönstret,Justera exponeringen som beskrivs i steg 2.4 för att maximera intervallet av pixelvärden för förhandsgranskningsbilden.
- Ta bort flygel- och petriskålen och byt ut dem med en LED (spektralutgång 430-660 nm) ansluten till en spänningsmätare, centrerad i synfältet i samma position som flygningen. Använd LED- och spänningsmätaren som en ljusmätare 46 och registrera spänningen som genereras av ljuset som slår på LED-lampan (~ 125 mV).
OBS! LED- och spänningsmätaren används för att säkerställa att ljusnivåerna är konstanta över flera bildsessioner inom ett enda experiment. - För försökets varaktighet, ändra inte ljuskällans position eller intensitet ytterligare, förstoringen av mikroskopet eller kamerans exponering.
3. Provbildning
- Placera en petriskål med en fluga monterad i agar (steg 1.1-1.3) på det svarta mikroskopets stadium. Justera flygens läge så att den tredje och fjärdeH-buksegmenten är synliga och den dorsala mittlinjen är rakt upp, som beskrivs i steg 2.9. Se till att förstoringen är 60x innan du fortsätter.
- Manuellt fokusera mikroskopet så att den tredje och fjärde dorsala buken tergiten är i fokus. Använd bildinspelningsprogrammet för att skaffa en bild som en 8-bitars gråskala TIFF, som beskrivs i steg 2.6.
OBS! Bilden kan fångas i färg och konverteras därefter till gråskala för analys. - Spara bilden som "SESH000_sampleID.tiff", som beskrivs i steg 2.7.
OBS: Här är [SESH] konstant, [000] är sessionsnumret och det är variabelt men måste vara tre siffror långt och [sampleID] är vad användaren önskar, även om det inte får innehålla några ytterligare understrecks (_) tecken och Måste vara av konstant längd. [SampleID] bör innehålla detaljer om de faktorer som används vid analys av pigmentationsdata ( t.ex. temperatur eller linjär), separerad av ett distinkt icke-alfabetiskCal karaktär, till exempel en bindestreck (-). Detta gör att dessa faktorer enkelt kan analyseras ur [sampleID] med hjälp av standard statistisk programvara. - Ta bort Petriskålen från scenen och byt ut fluga med nästa prov. Upprepa steg 3.1-3.3 tills alla exemplar har avbildats, utan att ytterligare justera belysningsnivåerna, förstoringen eller exponeringen.
4. Imaging över flera sessioner
- Om bilder måste tas över flera sessioner, behåll ljusintensiteten, exponeringen och förstoringen över sessioner. I början av varje session kontrollerar kamerans rumsliga kalibrering (steg 2.4) och ljusintensiteten vid scenen (mätt med LED / spänningsmätare, steg 2.12).
- Fånga och spara en bild av scenmikrometern (steg 2.5-2.7) för att säkerställa möjligheten att kalibreras bilderna igen, om det behövs.
- Använd minst 15 kontrollprover och slumpmässigt återbilda dem i varje session till alloW för detektering och eliminering av sessionseffekter. Kontrollera att dubbla kontrollprover mellan sessioner har samma [sampleID] men olika [SESH000].
OBS! Kontrollproverna är flugor uppsamlade, lagrade och monterade identiskt till experimentella exemplar men återbildas över sessioner. Det exakta antalet kontrollprover kommer att bero på användarens experimentella inställning. Se diskussionen för ytterligare detaljer.
5. Bildanalys
OBS! Bildanalys utförs i ImageJ 45 och använder makrometoden "Mätning av Pigmentation.ijm", som tillhandahålls som en kompletterande fil.
- Placera alla bilder som ska analyseras i samma mapp.
- Starta ImageJ och kör makrometoden "Mätning av Pigmentation.ijm" genom att klicka på "Plugins"> "Macro"> "Kör" och välj "Mätning av Pigmentation.ijm" i webbläsaren och klicka på "öppen."
OBS! Alla efterföljande steg ligger inom makron. Varje steg är ett enskilt makrokommando. - Observera att dialogrutan "Åtgärdskrav" öppnas och anger "Välj mapp där bilder lagras". Klicka på "OK" och använd filbläddraren för att välja mappen som innehåller bilderna och klicka sedan på "välj".
- Observera att en dialogruta "Åtgärdskrävad" öppnas och anger "Välj mappen där du vill lagra dataen". Klicka på "OK" och använd filbläddraren för att välja önskad mapp för att spara pigmentprofilerna. Klicka på "välj".
- Observera att en dialogruta öppnas och frågar "Hur många tecken i ditt exempel-ID?" I datainmatningsrutan anger du antalet tecken i [SampleID], som anges i steg 3.3 och klickar på "OK".
- Observera att en dialogruta öppnas och frågar "Hur stor är din avkastning?" I datainmatningsrutan anger du pixelbredden på den främreBakre remsa längs vilken pigmenteringsprofilen skall läsas (grön rektangel, figur 1G , figur 2A och 2A '). Klicka på "OK;" Standardvärdet är 20 pixlar.
OBS: Pigmenteringsprofilen läses över en remsa av nagelband, snarare än en linje, för att minska buller på grund av hår och borst. Bredden på denna remsa kommer att bero på bildens upplösning, men den ska vara ~ 1/20 av bredden på buken, i pixlar. - Observera att makrot öppnar bilden av den första flygningen och en dialogruta frågar om du vill mäta den aktuella flygningen (klicka på "Ja") för att gå vidare till nästa flygning (klicka "Nej") eller för att avsluta Makro (klicka på "Avbryt").
- Observera att en dialogruta öppnas, med angivande "Definiera mittlinjen av dorsal buken, från ANTERIOR till POSTERIOR." Rätlinjeverktyget är redan valt. Rita en linje från främre till bakreFör att definiera mittlinjen av dorsal buken. Klicka på "OK;" Se figur 2A och 2A ', gul linje.
OBS! Det här används för att omorientera bilden så att den dorsala mittlinjen ligger horisontellt över skärmen, med främre till vänster, vilket gör de följande stegen enklare. - Observera att en dialogruta öppnas, med angivande "Definiera Tergite 4 POSTERIOR-kanten strax bakom pigmentbandet." Rätlinjeverktyget är redan valt. Rita en linje från den bakre midterkanten till den högra sidokanten så att mittpunkten av linjen (markerad med en vit fyrkant) sitter precis bakom den bakre delen av pigmentbandet (nagelbandet a5). Klicka på "OK;". Se figur 2A och 2A ', magenta linje.
OBS! R- skriptet identifierar automatiskt pigmentbandets bakre kant från pigmenteringsprofilen. - Observera att en dialogrutaLådan öppnas och anger "Definiera Tergite 4: s bakre kant 4 vid den främre kanten av den pigmenterade nageln (a2)." Rätlinjeverktyget är redan valt. Rita en linje från den främre midterkanten till den högra sidokanten så att mittpunkten av linjen (markerad med en vit fyrkant) sitter vid den främre kanten av den pigmenterade kutikletet (nagelbladet a2). Klicka på "OK;". Se figur 2A och 2A ' , cyanlinje.
OBS! R- skriptet kommer att definiera denna punkt som den främre kanten av tergitens pigmenterade nagelband. På bilden kommer makroen att visa intresseområdet (ROI) längs vilket pigmenteringsprofilen läses (grön rektangel, Figur 2A och 2A ', förstorad i Figur 2B och 2B '). Makroet öppnar också ett andra fönster som visar pigmenteringsprofilen för avkastningen ( Figur E 2C och 2C '), där x-axeln är läget, uttryckt som antalet pixlar från profilens bakre kant, och y-axeln är det genomsnittliga pixelvärdet vid varje position. - Se diagrammen för pigmenteringsprofilen som öppnas av makroet. Om det behövs klickar du på "Live" i profilfönstret för att justera placeringen av avkastningen så att den inte innehåller några strukturer ( t.ex. borst) som skulle påverka pigmenteringsprofilen. När profilen är tillfredsställande klickar du på "OK".
- Upprepa steg 5.8-5.11 för Tergite 3.
OBS! Makroen exporterar sedan pigmenteringsprofilerna som två CSV-filer, var och en heter "SESH000_samplename_TX_profile.csv", där [SESH000_samplename] är bildnamnet och [TX] är antingen T3 eller T4 för respektive tredje och fjärde tergiter. - Observera att makrot öppnar nästa bild. Upprepa steg 5.7-5.13 tills alla bilder har analyserats.
OBS: All dataanalys utförs i R 47 och använder den skript som tillhandahålls av "Analysis of Pigmentation.R". Nedan anger "L ..." vilken linje av skriptet som ska köras för varje del av analysen. Se kompletterande information för ytterligare information om hur analysen genomförs.
- Redigera R- skriptet för att ställa in arbetsboken (L6) och definiera filepathen till mappen som innehåller the.csv-profilerna (L11).
- Kör L13-15 för att generera en lista över pigmenteringsprofilerna som är lagrade i profilmappen.
- Ladda och kör funktionen "läsare" och "addPrimaryKey" (L17-41) för att läsa profilerna i en enda dataram.
- Redigera manuset vid L43 för att ange rumslig kalibrering av bilderna i μm / pixlar, som bestäms i steg 2.5.
- Ladda och kör "adjusTments "-funktionen (L46-58) för att omvandla profilpositionen (x-axeln, Figur 2C och 2C ') från pixlar-från-bakre kant-av-ROI till μm-från-främre kant-av-ROI och Profilvärde (y-axeln, Figur 2C och 2C ') från pixelvärdet (0 = svart, 255 = vit) till pigmenteringsvärdet (0 = inget pigment, 255 = maximalt pigment).
- Ladda och kör funktionen "spline.der.er" (L60-71) för att generera pigmentationsprofilens kubiska spline och dess första och andra derivat ( Figur 2D -2F och 2D '- 2F ').
- Ladda och kör funktionen "koord" och "assmbly.coord" (L74-163), först för att extrahera positionen av pigmentbandets bakre (T3) och främre (T2) kanter ( Figur 2D och 2D ';) Och den bakre kanten av a2-kutiklet (T1, Figur 2D och 2D ') och sedan extrahera de maximala ( Pmax ) och minsta (Pmin) pigmenteringsvärdena, taget vid T3 respektive T1.
OBS! Den främre kanten av a2-kutiklet har redan definierats i steg 5.9. - Valfritt: Ladda och kör funktionen "chek" (L165-175) för att kontrollera om funktionen "koord" korrekt identifierar positionerna T 1-3 för en slumpmässigt vald pigmenteringsprofil.
- Ladda och kör index och mätfunktioner (L178-193) för att generera en datatabell med rubrikerna "Session", "Sample", "Tergite", "id" (en sammanfogning av Prov och Tergite), "P max " "P min ", "W- band " (bredden av pigmentbandet, = T3-T2) och "W- tergit " (bredden av den pigmenterade cUtiklar a2-a5, = T3).
- Ladda och kör korrigeringsfunktionen (L196-234) för att generera en datatabell som korrigerar Pmax och Pmin för eventuella olägenheter som uppstår på grund av sessioneffekter. Använd den genomsnittliga ökningen (eller minskningen) i P max eller P min från kontrollproverna som återimages över tillfälligt intilliggande sessioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollet användes för att undersöka effekten av uppfödningstemperatur på bukpigmentering. Tidigare studier har visat att en ökning av utvecklingstemperaturen resulterar i en minskning av spridningen av bukpigmentering hos flera arter av Drosophila , inklusive D. melanogaster 30 , 32 . Specifikt, i buk-tergiterna 3 och 4, minskar pigmentens omfattning (bredden av pigmentbandet) från 17 ° C till 25 ° C och förblir densamma från 25 ° C till 28 ° C 24 , 36 . Dessa studier har skrivit graden av pigmentering på en 1-10 skala (0: nej pigmentband, tergit helt gul; 5: pigmentband upptar 50% tergit; 10: tergit fullständigt mörkt). För att fastställa huruvida den kvantitativa metoden kunde fånga denna fenotypiska plasticitet mättes pigmenteringen i thE tredje och fjärde buk-tergiterna av en isogen linje av blankt vildtypsflugor, uppfödda från ägg till vuxna vid 17 ° C (sju flugor), 25 ° C (nio flugor) och 28 ° C (nio flugor). För att bestämma effektiviteten av korrigeringsförfarandet vid avlägsnande av störningsfaktorer som infördes genom sessionseffekter, avbildades pigmenteringen av samma flugor och uppmättes en, två, fyra och åtta dagar senare. Belysningsförhållanden och exponering mellan sessioner ändrades ändå ändamålsenligt för att säkerställa att det fanns sessionseffekter för att korrigeringsproceduren skulle avlägsnas. Bilderna har publicerats på Dryads digitala arkiv.
Den första frågan var om det fanns systematiska skillnader i pigmenteringsåtgärder över sessionerna. Detta undersöktes med hjälp av lme4- paketet i R 48 för att passa blandade modellerna M ijk = S i + A j +Ε ijk och M ij = A j + ε ij till både P max och P min , där M är pigmentmåttet, S är sessionen (slumpmässig effekt), A är buktergiten som mäts (slumpmässig effekt) och e är Återstående fel (abonnemang är nivåer inom variabler). Ett test för likelihood-förhållandet användes för att testa om insamlingen av session som en slumpmässig faktor avsevärt förbättrade passformen; Det gjorde ( tabell 1 ). Som förväntat visade undersökningen av varianskomponenterna (genererad genom REML 48 ) att variation på grund av sessionseffekter svarade för 67% och 70% av den totala variansen i Pmax respektive Pmin ( Tabell 1 ).
Femton slumpmässigt utvalda kontrolltergiter (antingen tredje eller fjärde, från flugor reaRöd vid 17 ° C, 25 ° C eller 28 ° C) valdes och förändringar i deras genomsnittliga Pmax och Pmin användes för att korrigera pigmenteringsåtgärderna för de återstående tergiterna över sessioner. Upprepa analysen av de korrigerade pigmenteringsåtgärderna eliminerade sessionseffekterna ( tabell 1 ) och reducerade procentandelen av den totala variationen på grund av sessionseffekter till noll. Återstående fel är en uppskattning, ett mätfel efter att sessionseffekterna har tagits bort och var 22% och 27% för Pmax respektive Pmin ( Tabell 1 )
Därefter användes de korrigerade data för att bestämma huruvida temperaturens effekt på olika aspekter av pigmentering och storlek kunde detekteras. Den blandade modellen M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm var monterad på data, där T D är tergiten (tredje eller fjärde), och X är den individuella flygningen (slumpmässig faktor). Eftersom förhållandet mellan pigmentering och temperatur inte är linjär 24 , 36 behandlades T som en kategorisk faktor. Maximala och minsta nivåer av pigmentering ( Pmax och Pmin) och bredden av pigmentbandet och av tergiten ( W- band och W- tergit ) testades. Effekten av temperatur på den relativa bredden av pigmentbandet ( R- band = W- band / W- tergit ) testades också. Uppgifterna visade att pigmentbandets absoluta (W- band ) och relativa ( R- band ) bredd minskade från 17 ° C till 25 ° C (Tukey post-hoc test, P <0,05 för alla) och förändrades inte signifikant från 25 ° C till 28 ° C (Tukey post-hoc test,
Effekten av temperatur på tergitets bredd var mer komplex. I D. melanogaster sjunker kropps- och organstorlek olinjärt med temperatur 49 . Tidigare studier tyder på att bredden på den femte buktergiten minskar med 10% från 16,5 ° C till 25 ° C och ytterligare 4% från 25 ° C till 29 ° C 50 . Medan det fanns en signifikant minskning i bredden avDen fjärde buk-tergiten från 17 ° C till 25 ° C ökade både den tredje och den fjärde buk-tergiten i bredd från 25 ° C till 28 ° C ( Tabell 2 , Figur 3D ). Eftersom bredden av buk-tergiterna väsentligen definieras av användaren (steg 5,9-5,10 i protokollet) är skillnaden mellan nuvarande och tidigare studier osannolikt att bero på hur R- skriptet extraherar W- tergit från pigmenteringsprofilen. Snarare kan det spegla skillnader i hur magsegmentet mäts, i flugens genotyper och i de exakta aspekterna av buk-tergiterna som mäts.
Nästa fråga ställde upp var huruvida metoden kunde generera data som var jämförbar med data som samlats in med hjälp av befintliga bedömningar av pigmentering. Dessa metoder kräver normalt att observatören subjektivt tilldelar varje flygning till en av en finIte antal fenotypiska klasser baserat på pigmentationsgraden 15 , 30 , 32 , 33 , 34 och är därför beroende av observatörens förmåga att bedöma bredden av pigmentbandet. För att testa hur väl denna objektivmetod jämför sig med subjektiva metoder, blev fem observatörer ombedd att rangordna 45 bilder av kvinnliga abdomäner baserat på bredden av pigmentbandet i den fjärde buk-tergiten. Den genomsnittliga rankningen över observatörer jämfördes med rankningen baserat på W- band , mätt med denna metod. Det var en stark korrelation mellan subjektiva och objektiva rankningar ( Tilläggs Figur 1 , i kompletterande Information.pdf), Spearmen = 0,7342, P <0,0001).
En annan fråga ställde uppVar hur denna metod för att extrahera W- band från pigmenteringsspline jämfört med mätning av pigmentbandets bredd för hand (visuell metod) med hjälp av det linjära mätverktyget i ImageJ . Återigen hittades en stark korrelation mellan data som samlats in med hjälp av de två metoderna ( tilläggs figur 2 , i kompletterande information.pdf, OLS, r2 = 0,49 , P <0,0001). Även om beräkningsmetoden metodiskt mätt pigmentbandet som smalare än i "visuellt" -metoden var regressionskoefficienten inte signifikant annorlunda än 1 ( P> 0,05).
Den slutliga frågan var huruvida denna metod skulle kunna användas för att mäta abdominal pigmentering i andra sammanhang. Metoden kunde extrahera Pmax, Pmin , W- band och W- tergit för fIfth och sjätte buk-tergiter hos kvinnor och tredje och fjärde buk-tergiter hos män ( figur 4 ). Vidare kan metoden användas för att kvantifiera ökningen av Pmax och Pmin i flugormutant för ebbenhållning ( e 1 ), vilket visar en ökning av cutikulär pigmentering över kroppen och en specifik ökning av pigmentering av cuticleet framför pigmentet Band 28 ( figur 4 ).
Figur 1: Abdominal pigmentering i D. melanogaster . ( A - F ) Variation i bukpigmentering hos kvinnor av två genotyper som föddes vid tre temperaturer (17 ° C, 25 ° C och 28 ° C). A3 och A4 är den tredje och fjärde buken tergi Tes respektive ( G ) Dorsal buk tergit innehåller ett främre och bakre fack, endast delar av dem är tillförlitligt synliga i osträckta buken. Facken är vidare indelade i olika köttstycketyper: a1: opigmenterade, inga hår; A2: lätt pigmenterade och hår A3: lätt pigmenterad, hår och måttlig borst A4: mörkt pigmenterat, hår och måttlig borst A5: mörkt pigmenterat, hår och stor borste; A6: icke-pigmenterade och hår P3: icke-pigmenterade och hår P2: opigmenterade och inga hår; Och p1: opigmenterad och tessellerad. Pigmentbandet består av cuticles a4 och a5. Endast pigmenterade naglar (a2-a5, grön låda) används i analysen. Skalstänger = 200 μm in (AF). Kontrasten på alla bilder har justerats för att markera pigmenteringsmönstret, och bilderna är illustrativa. Ojusterade bilder som används för att generera representativa resultat deponeras på Dryad Digital repository..com / filer / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bild- och dataanalys för kvantifiering av bukpigmentering. ( A - F ) och ( A - F ) är för olika exemplar och visar hur analysen handlar om bilder av olika kvalitet. ( A ) Användaren definierar först bukets mittlinje (gul linje), tergitets främre kant (cyanlinje) och en linje något bakom pigmentbandets bakre kant (magenta linje). ImageJ-makroet drar sedan en rad från mittpunkten av de främre och bakre linjerna (vit streckad linje), vilken den breddar för att bilda en ROI (svart låda), förstorad i ( B ). ( C ) ImageJ-makroen exSpårar det genomsnittliga pixelvärdet längs ROI: s främre och bakre axel. Observera att i detta skede läses profilen från bakre till framsida. ( D - E ) R- makroen omvandlar de genomsnittliga pixelvärdena till ett pigmenteringsvärde, reverserar pigmenteringsprofilens riktning, passar den med en kubisk spline ( S (x) ) ( D ) och beräknar den första ( S (x ) ) ( E ) och andra ( S (x) ) derivat av splinjen ( F ). Skriptet identifierar sedan: T 3 , positionen för maximal pigmentering, där S (x) övergångar från <0 till> 0, förflyttning framåt från den bakre delen av spline; T 2 , den position där nedgången i pigmentering är störst och S (x) är maximal; Och Ti , den position där tergitpigmenteringen är minst och S (x) övergångar från> 0 till <0, förflyttning av främre fRom T 2 ,. Den främre delen av den tillförlitliga synliga tergiten (främre delen av cuticle a2) definieras av användaren. (AF) I de fall där det första derivatet inte kan användas för att hitta T 1 , typiskt eftersom S (x) inte korsar 0 anteriorly till pigmentbandet, definierar skriptet T 1 som den position där S (x) övergångar från> 0 till <0 vid förflyttning framåt från T2 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Effekten av temperatur på olika aspekter av bukpigmentering hos kvinnlig D. melanogaster . ( A ) Pigmentbandets bredd ( W- band , FIgur 1). ( B ) Pigmentband som andel av tergit ( R- band ). ( C ) Maximal ( P max , övre linjer) och minsta ( P min , lägre linjer) pigmentering. ( D ) Tergitbredd ( W- tergit ). Punkterna är minst kvadratiska medel från linjära blandade effektmodeller (tabell 2). Felstängerna representerar standardfelet och kan vara dolda av markörerna. Den svarta linjen är tredje buk tergit. Den grå linjen är den fjärde buken tergiten. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Skillnader i pigmentering mellan tredje och fjärde buk-tergiterna. Detta visas i ( A ebony 1 kvinnor, ( B ) vildtypliga kvinnor, ( C ) vildtyp-män och den femte och sjätte buktergiten hos vildtypliga kvinnor. ( D ) Maximal pigmentering, P max . ( E) Minimal pigmentering, P min . ( F ) Bredd av pigmentbandet, W- band . ( G ) Relativ bredd av pigmentbandet, R- bandet . Barer med olika bokstäver är signifikant olika (Tukey HSD post-hoc test, P <0,05). N = 6 för alla utom ebenholts 1 , där N = 4. Skalstänger = 200 μm i ( A - C ). Felfälten representerar standardfelet. Kontrasten på alla bilder har justerats för att markera pigmenteringsmönstret, och bilderna är illustrativa. Vänligen cliCk här för att se en större version av denna figur.
| Modelljämförelse | Variantkomponenter (% av totalt) | ||||||
| Pigmentation Egenskaper | Modell | df | Log-sannolikhet | X |  (%) |  (%) |  (%) |
| P max Okorrigerad | M ij = A i + e ij | 3 | -678,28 | 1,94 (14%) | 11,86 (86%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -457,95 | 440,66 *** | 4,08 (26%) | 10,71 (67%) | 1,14 (7%) | |
| P min okorrigerad | M ij = A i + e ij | 3 | -875,03 | 6,05 (9%) | 59,39 (91%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -664,58 | 420,91 *** | 16,67 (22%) | 53,08 (70%) | 6,31 (8%) | |
| P max korrigerad | M ij = A i + e ij | 3 | -445,05 | <Td> 4,08 (78%) | 1,15 (22%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -444,88 | 0,3378 | 4,08 (78%) | 0,01 (<1%) | 1,14 (22%) | |
| P min rättad | M ij = A i + e ij | 3 | -649,9 | 16,67 (73%) | 6,24 (27%) | ||
| M ijk = S i + A j + ε ijk | 4 | -649,9 | 0 | 16,67 (73%) | 0 | 6,31 (27%) | |
Tabell 1: Linjära blandade effektmodeller av effekten av tergit och session. Linjära blandade effektmodeller av effekten av tergit och session på aBdominalpigmentering ( Pmax och Pmin) på 50 tergiter uppmättes över fem sessioner, med varianskomponenter uppskattade via REML. Modeller var linjära blandade effektmodeller. M : Pigmenteringsåtgärd; A : Individuell tergit uppmätt S : Session; Ε : Återstående fel. Betydande X² visas med fetstil. * P <0,05. ** p <0,01. *** p <0,001.
| Drag | Temperatur | Tergite | Temperatur X Tergite | |
| P max | F -ratio | 8,14 | 55,59 | 6,6 |
| P | 0,002 | <0,001 | ||
| P min | F -ratio | 4,41 | 66,11 | 6,36 |
| P | 0,026 | <0,001 | 0,002 | |
| W band | F -ratio | 113,93 | 0,01 | 0,64 |
| P | <0,001 | 0,931 | 0,531 | |
| W tergit | F -ratio | 1,79 | 0,92 | 5,11 |
| P | 0,191 | 0,338 | 0,007 | |
| R- band | F -ratio 27,66 | 0,08 | 1,46 | |
| P | <0,001 | 0,782 | 0,23 |
Tabell 2: Effekt av temperatur och tergitidentitet. Effekten av temperatur och tergitidentitet På olika aspekter av bukpigmentering i 50 tergiter uppmättes över fem sessioner. Modeller var linjära blandade effektmodeller, med individuell flygning inkluderad som en slumpmässig faktor. P max : Maximal pigmentering (korrigerad); P min : Minsta pigmentering (korrigerad); W band : Bredd av pigmentband; W tergit : Tergitens bredd; R- band : Relativ bredd av pigmentband. Betydande fasta faktorer visas med fetstil ( P < 0,05).
| Snappa upp | W band | Temperatur | Tergite | |||
| 17C | 25˚C | Tredje | ||||
| P max | β | 234,35 | 0,069 | 0,063 | -1,178 | -0,588 |
| F | 29,93 | 5,97 | 54,82 | |||
| P | <0,001 | 0,008 | <0,001 | |||
| P min | β | 223,96 | -0,137 | 3,931 | -3,024 | -1,54 |
| F | 19,33 | span = "2"> 9,66 | 62,02 | |||
| P | <0,001 | 0,001 | <0,001 | |||
Tabell 3: Effekt av pigmentbandets bredd, temperatur och tergitidentitet på pigmenteringsnivå. Effekten av pigmentbandets bredd, temperatur och tergitidentitet på pigmenteringsnivå i 50 tergiter uppmättes över fem sessioner. Modeller var linjära blandade effektmodeller, med individuell flygning inkluderad som en slumpmässig faktor. P max : Maximal pigmentering (korrigerad); P min : Minsta pigmentering (korrigerad); W band : Bredd av pigmentband; R- band : Relativ bredd av pigmentband.
Kompletterande fil 1. Supplementaly Information.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2. Analys av Pigmentation.R-skript. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 3. Mätning av Pigmentation.ijm Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Simulation R Script. Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod möjliggör det exakta, snabba och repeterbara förvärvet av pigmenteringsdata i en kvantitativ form som är lämplig för flera nedströmsanalyser. Metoden har använts för att erhålla data om effekten av temperatur på abdominal pigmentering i en isogen linje av flugor. Metoden kan emellertid användas i fram-genetikstudier för att identifiera gener som ligger till grund för pigmentationsskillnader mellan individer, populationer eller arter eller omvandlingsgenetiska studier för att utforska effekterna av specifika gener på pigmenteringsmönster. Fastän, som diskuterats ovan, det har funnits otaliga studier som har undersökt utvecklingen och utvecklingen av D. melanogasterpigmentering, är precisionen med vilken denna metodik fångar pigmenteringsdata i kvantitativ form möjliggör mer kraftfulla statistiska metoder. Detta tillåter i sin tur att forskare använder färre prover vid analys av pigmenteringsmönster, eller låter dem belysa mer subtilaAspekter av pigmentering. Vidare kräver denna metod inte dissektion av fluga, så att provet därefter kan användas för ytterligare analyser, såsom morfologiska mätningar eller genotypning. Faktiskt kan metoden potentiellt användas på bedövade flugor, vilka sedan kan selektivt uppfödas baserat på deras pigmenteringsegenskaper.
Ett potentiellt problem med mätning av pigmentering genom bildanalys är att pigmenteringsvärdena kan återspegla exponeringen och ljusförhållandena under vilka en bild togs, snarare än pigmenteringsnivån själv. Vid användning av fasta belysningsnivåer bidrar ljuspositioner, förstoring och exponering till att lindra dessa problem. Det är troligt att det fortfarande är nödvändigt att ta flera repeterande kontrollbilder i varje session för att helt kontrollera sessionseffekter. Denna metod innefattar att ombilda femton kontrollprover varje session och använda mellansessionen förändringar i P maX och p min för att detektera och eliminera sessioneffekter. Det exakta antalet kontrollprover som ska återbildas beror emellertid på bildhårdvaran och mjukvaran som används, aspekten av pigmentering av intresse för användaren och hur varierande det är mellan behandlingar och hur många bilder som tas i varje session. Genomförande av ett preliminärt experiment där samma exemplar återbildas över fem sessioner gör det möjligt för användaren att beräkna variansen på grund av sessionseffekter, variansen på grund av providentitet och restvarianten (vilket är en uppskattning av mätfel efter korrigering För sessionseffekter) ( Tabell 1 ). Dessa värden kan sedan användas för att uppskatta hur många kontrollbilder som behöver tas i varje session för att detektera och kontrollera sessionseffekter. Ett enkelt R- skript har skrivits och använder data från ett sådant preliminärt experiment för att simulera pigmenteringsåtgärder över sessioner. Den kan användasFör att kontrollera att antalet kontrollbilder per session är tillräckliga för att ta bort sessionseffekterna. Detta skript tillhandahålls som en kompletterande fil.
Om användarna är oroade över att det finns olägenheter i sessionerna, kan de också omarbeta samma prov flera gånger under hela sessionen, som beskrivs i John et al., 2016 41 . I detta fall måste [sampleID] för det enda kontrollprovet ändras varje gång det återbildas inom en session ( t.ex. kontroll1, kontroll2, kontroll3, etc. ); Annars kommer bildhanteringsprogrammet att ersätta den tidigare bilden med den nya bilden med samma namn. Korrigeringsfunktionen baserar sin korrigering på dubbla bilder med samma [sampleID] mellan temporärt intilliggande sessioner och korrigeras, om samma exemplar återbildas flera gånger inom och mellan sessioner eller om samma uppsättning kontrollprover bildas mellan sessioner. Oavsett hur thE-kontrollbilder tas, sessioner ska behandlas som block och där det är möjligt bör användarna använda en randomiserad blockdesign så att eventuella sessionseffekter som kvarstår efter korrigering kan kontrolleras statistiskt för. Om detta misslyckas ska proverna slumpmässigt tilldelas sessioner, så att sessionseffekter inte är förknippade med experimentella faktorer.
Protokollet bygger på genereringen av en pigmenteringsprofil som representerar förändringen i pigmentering över varje tergit. Ett problem med att generera den här profilen är de mörka håren som täcker bukhålan, som alltid bisfekteras av någon anterior-posterior linje som passerar tergiten. Protokollet minskar bruset som genereras av dessa hår genom att ta pigmenteringsprofilen i genomsnitt över ett band av nagelband. Ändå kan användarna ställa in avkastningens bredd till 1 pixel i steg 5.6 om de vill skapa profiler som är baserade på en tunn snittrik. Dessutom kan användarna analysera tHan samma bild flera gånger, ändra sidopositionen för pigmenteringsprofilen för att fånga förändringar i bredden av pigmentbandet inom ett segment. I det här fallet måste användarna emellertid kopiera samma bild flera gånger och ge varje kopia ett unikt namn innan de utför steg 5.1, eftersom makro ImageJ kommer att skriva över profiler med samma namn.
En andra viktig faktor vid bildning av pigmenteringsprofilen är utjämningsparametern för den kubiska spline som definieras inom spline.der.er-funktionen (L63) i analysen av pigmentering R- skript. Den lämpliga utjämningsparametern beror på bildbildningsinställningen och upplösningen. Att överskrida en profil kan resultera i förlust av egenskaperna hos splinesprofilen som används för att beräkna koordinaterna för T 1 , T 2 och T 3 ( Figur 2D och 2D '). Omvänt ökar under-utjämning avLjud av profilen och följaktligen noggrannheten hos koordinatuttagningarna. Chek-funktionen ger en grafisk sammanfattning av spline och dess derivat och kan användas som en visuell signal för att välja en lämplig utjämningsparameter.
Metoden som beskrivs här fokuserar på att fånga data på pigmenteringen av den tredje och fjärde buk-tergiten hos kvinnlig och manlig D. melanogaster . De representativa resultaten indikerar emellertid att det också kan användas för att mäta pigmenteringen av kvinnans femte och sjätte buksegment. Vidare kan metoden detektera skillnader i fenotyp orsakad av mutanter av gener som påverkar pigmentering. ImageJ-makro- och R- skripten kan lätt modifieras för att mäta pigmentering i buken av olika D. melanogasterarter , eller till och med pigmentering av andra kroppsdelar i andra taxa, förutsatt att pigmenteringsmönstret är stereotypt. Slutligen metodikenKan också anpassas för att mäta aspekter av pigmenteringsfärg genom att ta bilder i RGB och analysera varje kanal separat.
I allmänhet är denna metod en del av det framväxande området för fenomik 51 , 52 . Målet med fenomik är att generera och analysera stora multidimensionella fenotypiska dataset för att bättre förstå de genetiska och miljömässiga interaktionerna som påverkar fenotypen, inklusive sjukdom, och hur dessa interaktioner utvecklas för att generera biologisk mångfald. För att fenomen ska kunna uppfylla sin potential måste metoder för att erhålla fenotypiska data vara enkla och lätt anpassade till olika fenotyper, såväl som fritt tillgängliga. Genom att använda öppen källkodsprogramvara för att analysera bilder som tagits med standardutrustning, bidrar denna metodik till att uppnå detta mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete finansierades av National Science Foundation beviljar IOS-1256565 och IOS-1557638 till AWS. Vi tackar Patricia Wittkopp och tre anonyma granskare för deras hjälpsamma kommentarer till en tidigare version av detta dokument.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
References
- Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
- Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
- Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
- Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
- Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
- Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
- Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
- True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
- Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
- Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
- Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
- Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
- Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
- Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
- Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
- Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
- Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
- Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
- Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
- Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
- Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
- Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
- Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
- Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
- Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
- Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
- Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
- True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
- David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
- Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
- Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
- Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
- Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
- Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
- Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
- Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
- Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
- Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
- Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
- John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
- Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
- Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
- Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
- U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
- Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
- R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
- Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
- French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
- Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
- Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).
