Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kwantificering van buikpigmentatie in Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55732
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biology, Lake Forest College

Summary

Dit werk biedt een methode om de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van digitale beeldanalyse . Deze methode stroomlijnt de procedures tussen fenotype-acquisitie en data-analyse en omvat voorbeeldmontage, beeldverzameling, pixelwaarde-extractie en eigenschappen van eigenschappen.

Abstract

Pigmentatie is een morfologisch eenvoudig maar zeer variabel kenmerk dat vaak adaptieve betekenis heeft. Het heeft uitgebreid gediend als model om de ontwikkeling en evolutie van morfologische fenotypes te begrijpen. Abdominale pigmentatie in Drosophila melanogaster is bijzonder handig, zodat onderzoekers de loci kunnen identificeren die onderling en intraspecifieke variaties in morfologie liggen. Tot op heden is echter D. melanogaster buikpigmentatie grotendeels kwalitatief geanalyseerd, door middel van scoren, in plaats van kwantitatief, welke de vormen van statistische analyse beperken die op pigmentatiegegevens kan worden toegepast. Dit werk beschrijft een nieuwe methodologie die het mogelijk maakt om verschillende aspecten van het abdominale pigmentatiepatroon van volwassen D. melanogaster te kwantificeren . Het protocol bevat voorbeeldmontage, beeldopname, data-extractie en analyse. Alle software die wordt gebruikt voor macro-opnames en analysemogelijkhedenGeschreven voor open-source beeldanalyse. Het voordeel van deze aanpak is het vermogen om pigmentatiekenmerken nauwkeurig te meten met behulp van een methodologie die zeer reproducteerbaar is over verschillende beeldvormingssystemen. Hoewel de techniek is gebruikt om variatie in de tergal pigmentatiepatronen van volwassen D. melanogaster te meten , is de methodologie flexibel en breed toepasbaar op pigmentatiepatronen in veel verschillende organismen.

Introduction

Pigmentatie toont een enorme fenotypische variatie tussen soorten, populaties en individuen, en zelfs bij individuen tijdens ontogenie 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Hoewel er veel studies zijn over pigmentatie in een grote verscheidenheid aan dieren, is pigmentatie wellicht het beste bestudeerd in Drosophila melanogaster , waar de volledige kracht van de moleculaire genetica is gebruikt om de ontwikkelings- en fysiologische mechanismen die pigmentatie regelen en hoe deze mechanismen evolueren 1 toe te lichten , 6 . Er is veel bekend over de genen die de biochemische synthese van pigmenten regelen in D. melanogaster 7 , 8 en de genen die de temporale en ruimtelijke diVerdeling van deze biosynthese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Bovendien heeft genetische mapping de genetische loci onderliggende intra- en interspecifieke verschillen in pigmentatie in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 geïdentificeerd . De relaties tussen pigmentatie en pleiotropische eigenschappen, zoals gedrag 18 , 19 en immuniteit 19 , 20 , zijn ook onderzocht, evenals de adaptieve betekenis van pigmentatiepatronen 15 , 21 , 22 . Als zodanig is pigmentatie in D. melanogaster ontstaan ​​als een krachtige maar simpele mOdel voor de ontwikkeling en evolutie van complexe fenotypes.

Pigmentatie in volwassen D. melanogaster wordt gekenmerkt door verschillende melanisatiepatronen over het lichaam, met name op de vleugels en dorsale thorax en buik. Het is de pigmentatie van elke cutikulaire plaat (tergiet) op de dorsale buik, maar dat heeft de meeste onderzoeks aandacht gekregen. Er is aanzienlijke variatie in deze pigmentatie ( Figuur 1A -F ), door beide genetische 17 , 23 en milieu 24 , 25 factoren. De kutikula van een buiktergiet bestaat uit voorste en achterste ontwikkelingscompartimenten ( Figuur 1G ), die elk verder onderverdeeld kunnen worden, afhankelijk van pigmentatie en versiering 26 . Het voorste compartiment bevat zes kutikulaTypen (a1-a6), en het achterste compartiment omvat drie (p1-p3) ( figuur 1G ). Van deze worden de p1-, p2- en a1-kutikula typisch gevouwen onder de tergiet in onuitgespreide abdomenen, zodat ze verborgen zijn. De betrouwbare zichtbare kutikula wordt gekenmerkt door een band met zware pigmentatie, hierna aangeduid als een pigmentband, bestaande uit kutikeltypes a4 (harig met matige borstels) en a5 (harig met grote borstels), met de achterste rand van de band Meer intensief gepigmenteerd dan de voorste rand ( figuur 1G ). Voorkant van deze band is een gebied van licht gepigmenteerde harige kutikula, die achterste achterkant (a3) ​​maar niet anterior (a2) heeft. Variatie in pigmentatie tussen vliegen wordt waargenomen in zowel de intensiteit van pigmentatie als in de breedte van de pigmentband. In het algemeen is variatie het grootste in de meest achterste segmenten (abdominale segmenten 5, 6 en 7) en is lager in de meer anterior segmenten (buikzeeGents 3 en 4) 24 . Verder is er een seksuele dimorfie in D. melanogaster pigmentatie, waarbij mannen meestal volledig gepigmenteerde vijfde en zesde buiktergieten hebben ( Figuur 4C ).

In de meeste studies van buikpigmentatie in D. melanogaster is pigmentatie behandeld als een categorische of ordinale eigenschap, waarbij het patroon kwalitatief 27 , 28 , 29 of semi-kwantitatief wordt gemeten op een schaal 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Deze methoden hebben onvermijdelijk een gebrek aan precisie, en omdat ze vertrouwen op de subjectieve beoordeling van pigmentatie, is het moeilijk om de gegevens over studies te vergelijken. Verscheidene auteurs hebben de ruimtelijke dimensies van pigmentatie 38 , 39 gekwantificeerd, de intensiteit van pigmentatie van een bepaald kutikeltype 23 , 25 , 39 , 40 of de gemiddelde intensiteit van pigmentatie over de buiktergiet als geheel 41 , 42 , 43 . Desalniettemin meet deze kwantificatiewerkwijzen echter niet de intensiteit en de ruimtelijke verdeling van buikpigmentatie tegelijkertijd en derhalve niet de nuances van hoe pigmentatie varieert over de abdOminale tergiet Verder vereisen verscheidene van deze kwantificatiewerkwijzen 38 , 41 , 42 , 43 de dissectie en montage van de buikspieren. Dit is zowel tijdrovend en vernietigt het monster, waardoor het niet meer beschikbaar is voor aanvullende morfologische analyses. Aangezien het begrip van de ontwikkeling en evolutie van buikpigmentatie verdiept, zullen meer geavanceerde hulpmiddelen nodig zijn om snel en nauwkeurig zowel de ruimtelijke verdeling als de intensiteit van pigmentatie te meten.

Het algemene doel van deze methode is het gebruik van digitale beeldanalyse om een ​​replicabele en nauwkeuriger maatregel van de buikpigmentatie in D. melanogaster te verkrijgen . De methodologie omvat drie fasen. Ten eerste is de volwassen vlieg niet destructief gemonteerd en wordt een digitaal beeld van de dorsale buik genomen. Ten tweede, met behulp van een ImageJ macro, de gebruikerDefinieert een anterior-posterior strook pixels die zich uitstrekken van de voorkant van de a2-cuticle naar de achterkant van de a5-cuticle (groene doos, figuur 1G ) op zowel de derde als vierde buikspijkers. De gemiddelde pixelwaarde over de breedte van deze strip wordt vervolgens langs zijn lange as geëxtraheerd, waardoor een profiel wordt verkregen dat de ruimtelijke verdeling en intensiteit van pigmentatie vastlegt als het van de voorste naar de achterkant van de tergiet verandert. Ten derde wordt een R-script gebruikt om het pigmentatieprofiel wiskundig te beschrijven met behulp van een kubieke spline. Het R-script gebruikt dan de spline en zijn eerste en tweede afgeleide om de breedte van de a2-a5-kutikula, de breedte van de pigmentband en de maximale en minimumpigmenten van pigmentatie te extraheren. De methode kent dus zowel de ruimtelijke eigenschappen als de diepte van de buikpigmentatie.

Deze methodologie kwantificeert de pigmentatie van de derde en vierde abdominale tergieten,Die de focus zijn geweest van tal van eerdere studies 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , ofwel uitsluitend of in combinatie met meer posterior tergieten. Hoewel minder variabel dan de vijfde en zesde abdominale tergieten, zijn de derde en vierde tergieten niet helemaal gepigmenteerd bij mannen, dus dit protocol kan zowel bij mannen als vrouwen worden toegepast. Desalniettemin, zoals hier getoond, kan het protocol worden gebruikt om pigmentatie in de vijfde en zesde buiktergieten bij vrouwen te meten. Bovendien moeten kleine wijzigingen van de scripts die gebruikt worden om de eigenschappen van het pigmentatieprofiel te extraheren, de methode toestaan ​​om de variatie in pigmentatie in een grote verscheidenheid aan andere te kwantificerenorganismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Proefmontage

OPMERKING: Bewaar dood vliegen in 70% ethanol in water voor afbeelden.

  1. Giet 10 ml 1,25% agar opgelost in kokend water in een 60 mm x 15 mm Petri-schotel en laat het instellen.
  2. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een paar fijnpuntenpincen om een ​​~ 20 mm ong, 2 mm brede, 1 mm diepe groef in het oppervlak van de gel te maken. Gebruik fijne pincet, installeer de ventrale zijde van een volwassen vlieg in de groef, met de dorsale kant van de vlieg die boven de gel uitsteekt.
    OPMERKING: De loslating van de gel zorgt voor makkelijke herpositionering zonder het monster te beschadigen. De zelfde groef kan voor meerdere exemplaren gebruikt worden, hoewel het vies, ongebruikelijk en onbruikbaar zal worden met de tijd. De gebruiker kan dan een andere groef in dezelfde gel maken. Elke plaat kan worden gebruikt om af te beelden ~ 200 vliegen.
  3. Dek het monster volledig in 70% ethanol in water om alle lichtreflecties van het wasachtige kutikula te verminderen en om vleugelschade te vermijdenSpecimen manipulatie.

2. Microscoop Setup

OPMERKING: Beelden worden verworven met behulp van een dissecterende scope, overgebrachte lichtbasis, digitale camera en gooseneck-koude lichtbron die is aangesloten op een computer die de besturingssoftware voor het besturen van beelden verhaalt. Software-instructies zijn specifiek voor Micro-Manager v1.4.20 44 , dat is een open source software die ImageJ 45 bevat .

  1. Zet de microscoop, digitale camera, dubbele gooseneck koude lichtbron en computer aan.
  2. Voer de image capture software uit om een ​​Micro-Manager venster en een ImageJ venster te openen. Klik in het ImageJ venster op "Afbeelding"> "Type"> "8-Bit" om alle beelden als 8-bit te zetten. Klik in het venster Micro-Manager op 'live' om een ​​venster 'Snap / Live' te openen met een real-time preview van de camera.
    1. Maximaliseer de grootte van het venster "Snap / Live" als neecessary. Selecteer "Grijstinten" in het vervolgkeuzemenu "Beeldschermmodus" op het tabblad "Contrast" van het venster Micro-Manager.
  3. Zet de koude lichtbron op tot de maximale intensiteit en plaats de uiteinden van elke gooseneck tot ongeveer 120 mm van het podium, een aan de linkerkant en een aan de rechterkant.
    OPMERKING: Gebruikers kunnen ook een ringverlichting gebruiken, hoewel dit een ring van gereflecteerd licht kan genereren rond de vliegbuik.
  4. Stel de microscoopvergroting handmatig in op 60X zodat het zichtveld een gebied van ongeveer 3 mm in diameter op het podium vastlegt.
  5. Plaats een micrometer van 2 mm op het podium (indien nodig verandert de achtergrond naar wit). Terwijl u naar de live-voorvertoning kijkt, richt u op de podium-micrometer en past u de belichting in het Micro-Manager-venster aan door de belichtingstijd in ms in het vak 'Belichting' in te voeren.
  6. Om de camera ruimtelijk te kalibreren, selecteert u het gereedschap "rechte lijn" in tHij ImageJ venster en teken een lijn de lengte van de podium micrometer. Klik in het venster ImageJ op 'Analyse'> 'Schaal instellen' om het venster 'Schaal instellen' te openen, voer de lengte van de micrometer in μm in het vak 'Bekende afstand' in en voer 'μm' in de 'Lengte eenheid' doos.
    1. Zorg dat het venster 'Set Scale' dan de schaal toont in 'pixels / μm'. Noteer de schaal en klik op 'OK'.
  7. Klik in het venster 'Snap / Live' op 'Stop' en dan 'Snap' om een ​​beeld van de podiummicro-meter vast te leggen.
  8. Sla de afbeelding op als een 8-bits grijsschaal TIFF om ervoor te zorgen dat de beelden eventueel opnieuw kunnen worden gehercalibreerd. Klik in het ImageJ-venster op 'Bestand'> 'Opslaan als'> 'Tiff ...' Specificeer waar het bestand in de bestandsbrowser moet worden opgeslagen, geef het bestand een naam en klik op 'Opslaan'.
  9. Schakel het podium in zwart en plaatsEen Petri schotel met een vlieg gemonteerd in agar (stappen 1.1-1.2) op het podium.
  10. Kijk door de microscoop en plaats de vlieg om ervoor te zorgen dat de dorsale middenlijn rechtop om het pigmentatiepatroon het beste te bekijken. Verplaats alle vleugels en bijlagen om ervoor te zorgen dat het zicht op de buik onbelemmerd is. Als de gepigmenteerde cuticle (a2-a5) niet zichtbaar is, druk de buik lateraal totdat het is (hoewel de buik van de vliegen in 70% ethanol in waterreeks is opgeslagen, zodat dit gewoonlijk niet nodig is).
    OPMERKING: Bij het positioneren van de vlieg mag de gebruiker een lagere vergroting (20X) gebruiken. De vergroting moet teruggestuurd worden naar 60X voordat u verder gaat.
  11. Handmatig richten op de dorsale buik van de vlieg. Pas de tips van de lichtbron handmatig aan om de schaduwen en reflecties op de dorsale buik te minimaliseren.
  12. Terwijl u naar het live voorbeeld op het computerscherm kijkt, en met het pixelwaardehistogram op het tabblad 'Contrast' in het Micro-Manager-venster,Pas de belichting aan zoals beschreven in stap 2.4 om het bereik van de pixelwaarden van het voorbeeldbeeld te maximaliseren.
  13. Verwijder de vlieg- en Petri-schotel en vervang ze met een LED (spectrale uitgang van 430-660 nm) die is verbonden met een spanningsmeter, in de stand van de weergave in dezelfde positie als de vlieg. Gebruik de LED en spanningsmeter als een lichtmeter 46 en record de spanning die wordt gegenereerd door het licht dat op de LED raakt (~ 125 mV).
    OPMERKING: De LED- en spanningsmeter worden gebruikt om ervoor te zorgen dat het lichtniveau constant blijft in meerdere beeldsessies binnen een enkel experiment.
  14. Verplaats de positie of intensiteit van de lichtbron, de vergroting van de microscoop of de belichting van de camera niet langer gedurende de duur van het experiment.

3. Specimen Imaging

  1. Plaats een Petri schotel met een vlieg gemonteerd in agar (stappen 1.1-1.3) op de zwarte microscoop stage.Adjusteer de positie van de vlieg zodat de derde en viertDe buikspieren zijn zichtbaar en de dorsale middellijn is rechtop, zoals beschreven in stap 2.9. Zorg ervoor dat de vergroting 60x is voordat u verder gaat.
  2. Zet de microscoop handmatig op zodanig dat de derde en vierde dorsale buiktergieten in focus zijn. Gebruik de software voor het maken van beelden om een ​​afbeelding te verkrijgen als een 8-bits grijsschaal TIFF, zoals beschreven in stap 2.6.
    OPMERKING: Het beeld kan in kleur worden vastgelegd en vervolgens omgezet in grijstinten voor analyse.
  3. Sla de afbeelding op als "SESH000_sampleID.tiff", zoals beschreven in stap 2.7.
    OPMERKING: hier is [SESH] constant, [000] is het sessienummer en is variabel maar moet drie cijfers lang zijn en [sampleID] is wat de gebruiker wenst, hoewel het geen extra onderstreeptekens (_) moet bevatten en Moet van constante lengte zijn. [SampleID] moet gegevens bevatten over de factoren die worden gebruikt bij de analyse van de pigmentatiegegevens ( bijv. Temperatuur of afstamming), gescheiden door een onderscheidend niet-alfabetischCal karakter, zoals een streepje (-). Hiermee kunnen deze factoren gemakkelijk worden uitgebracht uit [sampleID] met behulp van standaard statistische software.
  4. Verwijder de Petri schotel uit het podium en vervang de vlieg met het volgende monster. Herhaal stap 3.1-3.3 totdat alle exemplaren zijn afgebeeld, zonder de verlichtingsniveaus, vergroting of blootstelling verder aan te passen.

4. Imaging over meerdere sessies

  1. Als afbeeldingen over meerdere sessies moeten worden overgenomen, behoudt u de lichtintensiteit, de belichting en de vergroting over de sessies. Controleer aan het begin van elke sessie de ruimtelijke kalibratie van de camera (stap 2.4) en de lichtintensiteit op het podium (gemeten door de LED / spanningsmeter, stap 2.12).
  2. Vang en bewaar een afbeelding van de podiummicro-meter (stappen 2.5-2.7) om ervoor te zorgen dat de beelden opnieuw kunnen worden geherruimteerd, indien nodig.
  3. Gebruik tenminste 15 controlespecifieken en willekeurig opnieuw in elke sessie om ze allo te herstellenW voor het opsporen en elimineren van sessie effecten. Zorg ervoor dat dubbele controle-exemplaren tussen sessies dezelfde [sampleID] maar verschillende [SESH000] hebben.
    OPMERKING: De controlespecies zijn vliegen verzameld, opgeslagen en gemonteerd identiek aan experimentele exemplaren, maar worden over de hele sessie opnieuw weergegeven. Het precieze aantal controle-exemplaren hangt af van de experimentele setup van de gebruiker. Zie de discussie voor verdere details.

5. Beeldanalyse

OPMERKING: Beeldanalyse wordt uitgevoerd in ImageJ 45 en gebruikt de macro 'Meting of Pigmentation.ijm', die als aanvullend bestand wordt geleverd.

  1. Plaats alle afbeeldingen die geanalyseerd moeten worden in dezelfde map.
  2. Start ImageJ en voer de macro 'Meting of Pigmentation.ijm' door op 'Plugins'> 'Macro'> ​​'Run' te klikken en selecteer 'Meting of Pigmentation.ijm' in de bestandsbrowser en klik op 'Open."
    OPMERKING: Alle volgende stappen zijn binnen de macro. Elke stap is een individueel macro commando.
  3. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster 'Action Required' wordt geopend, met vermelding 'Kies de map waar afbeeldingen worden opgeslagen'. Klik op "OK" en gebruik de bestandsbrowser om de map die de afbeeldingen bevat te selecteren en klik vervolgens op "kies".
  4. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster 'Action Required' wordt geopend waarin wordt aangegeven: 'Kies de map waar u de gegevens wilt opslaan'. Klik op "OK" en gebruik de bestandsbrowser om de gewenste map te selecteren voor het opslaan van de pigmentatieprofielen. Klik op 'kies'.
  5. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster wordt geopend met de vraag 'Hoeveel karakters in uw voorbeeld-id?' Voer in het gegevensinvoervak ​​het aantal karakters in [SampleID] in, zoals aangegeven in stap 3.3, en klik op "OK".
  6. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster wordt geopend met de vraag 'Hoe groot is uw ROI?' Voer in de gegevensinvoerbox de pixelbreedte van de voorste-Posterior strip waarlangs het pigmentatieprofiel moet worden gelezen (groene rechthoek, Figuur 1G , Figuur 2A en 2A '). Klik op "OK;" De standaardwaarde is 20 pixels.
    OPMERKING: Het pigmentatieprofiel wordt gelezen over een strookje cuticle, in plaats van een lijn, om geluid te verminderen door haar en borstels. De breedte van deze strip hangt af van de resolutie van het beeld, maar het zou moeten zijn ~ 1/20 van de breedte van de buik, in pixels.
  7. Merk op dat de macro het beeld van de eerste vlieg zal openen en in een dialoogvenster wordt gevraagd of de huidige vlieg moet worden gemeten (klik op "Ja"), om verder te gaan naar de volgende vlieg (klik op "Nee") of om de Macro (klik op "Annuleren").
  8. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster wordt geopend met de vermelding "De middenlijn van de dorsale buik definiëren, van ANTERIOR naar POSTERIOR." De "straight line" tool wordt al geselecteerd. Teken een lijn van voor naar achterkantOm de middellijn van de dorsale buik te definiëren. Klik op "OK;" Zie figuur 2A en 2A ', gele lijn.
    OPMERKING: dit wordt gebruikt om de afbeelding te heroriënteren zodat de dorsale middenlijn horizontaal over het scherm ligt, met de linker voorzijde, waardoor de volgende stappen makkelijker worden.
  9. Houd er rekening mee dat er een dialoogvenster wordt geopend met de vermelding "Definieer de POSTERIOR rand van Tergite 4 net achter de pigmentband." De "straight line" tool wordt al geselecteerd. Trek een lijn van de achterste middenlijnrand naar de rechterzijkant, zodat het midden van de lijn (gemarkeerd door een wit vierkant) net achteraf ligt aan de achterkant van de pigmentband (snijband a5). Klik op "OK;". Zie figuur 2A en 2A ', magenta lijn.
    OPMERKING: Het R- script detecteert automatisch de achterste rand van de pigmentband uit het pigmentatieprofiel.
  10. Merk op dat een dialoogVakje zal open staan ​​met vermelding "Definieer de ANTERIËRE rand van Tergite 4 aan de voorkant van de gepigmenteerde kutikula (a2)." De "straight line" tool wordt al geselecteerd. Trek een lijn van de voorste middenlijnrand naar de rechter-laterale rand, zodat het middelpunt van de lijn (gemarkeerd met een wit vierkant) aan de voorkant van de gepigmenteerde kutikula (cuticle a2) zit. Klik op "OK;". Zie figuur 2A en 2A ' , cyaanlijn.
    OPMERKING: Het R- script zal dit punt definiëren als de voorste rand van de gepigmenteerde kutikula van de tergiet. Op de afbeelding geeft de macro de regio van belang (ROI) weer waarna het pigmentatieprofiel wordt gelezen (groene rechthoek, Figuur 2A en 2A ', vergroot in Figuur 2B en 2B '). De macro zal ook een tweede venster openen met het pigmentatieprofiel voor de ROI ( Figuur E 2C en 2C '), waarbij de x-as de positie is, uitgedrukt als het aantal pixels van de achterste rand van het profiel en de y-as is de gemiddelde pixelwaarde in elke positie.
  11. Bekijk de percelen van het pigmentatieprofiel dat door de macro wordt geopend. Klik indien nodig op 'Live' in het profielvenster om de positie van de ROI aan te passen, zodat er geen structuren zijn (bijvoorbeeld borstels) die het pigmentatieprofiel zouden beïnvloeden. Zodra het profiel bevredigend is, klik op "OK".
  12. Herhaal stappen 5.8-5.11 voor Tergite 3.
    OPMERKING: De macro exporteert dan de pigmentatieprofielen als twee CSV-bestanden, elk met de naam "SESH000_samplename_TX_profile.csv," waar [SESH000_samplename] de afbeeldingnaam is en [TX] is respectievelijk T3 of T4 voor respectievelijk de derde en vierde tergieten.
  13. Merk op dat de macro de volgende afbeelding opent. Herhaal stappen 5.7-5.13 tot alle beelden zijn geanalyseerd.
Jove_title "> 6. Data Preprocessing, Analysis en Session Correction

OPMERKING: Alle data analyse wordt uitgevoerd in R 47 en gebruikt het script 'Analysis of Pigmentation.R'. Hieronder geeft "L ..." aan op welke regel (en) van het script voor elk deel van de analyse moet worden uitgevoerd. Zie de aanvullende informatie voor meer informatie over de wijze waarop de analyse wordt uitgevoerd.

  1. Bewerk het R- script om de werkmap (L6) in te stellen en het filepath te definiëren in de map die de.csv-profielen (L11) bevat.
  2. Voer L13-15 uit om een ​​lijst te maken van de pigmentatieprofielen die in de profielmap zijn opgeslagen.
  3. Load and run de functies "lezer" en "addPrimaryKey" (L17-41) om de profielen in een enkel gegevensframe te lezen.
  4. Bewerk het script bij L43 om de ruimtelijke kalibratie van de afbeeldingen in μm / pixels te specificeren, zoals bepaald in stap 2.5.
  5. Load and run de "adjusTments "-functie (L46-58) om de profielpositie (x-as, Figuur 2C en 2C ') van pixels-van-posterior-edge-of-ROI naar μm-van-voor-rand-of-ROI en de Profielwaarde (y-as, Figuur 2C en 2C ') van de pixelwaarde (0 = zwart, 255 = wit) naar de pigmentatiewaarde (0 = geen pigment, 255 = maximum pigment).
  6. Load and run de functie "spline.der.er" (L60-71) om de kubieke spline van de pigmentatieprofielen te genereren en de eerste en tweede derivaten ervan ( Figuur 2D -2F en 2D '- 2F ').
  7. Load en voer de functies "coördinaten" en "assmbly.coord" (L74-163) uit, om eerst de positie van de achterste (T3) en de voorste (T2) randen van de pigmentband te trekken ( Figuur 2D en 2D ';) En de achterste rand van de a2-kutikula (T1, Figuur 2D en 2D ') en vervolgens de maximale ( Pmax ) en minimale ( Pmin ) pigmentatiewaarden, respectievelijk bij respectievelijk T3 en T1.
    OPMERKING: De voorkant van de a2-cuticle is al in stap 5.9 gedefinieerd.
  8. Optioneel: Load and run de functie "chek" (L165-175) om te controleren of de functie "coördinatie" de posities T 1-3 goed herkent voor een willekeurig geselecteerd pigmentatieprofiel.
  9. Laad en voer de index- en statistische functies (L178-193) om een ​​gegevenstabel te genereren met de rubrieken 'Session', 'Sample', 'Tergite', 'id' (een concatenatie van Sample en Tergite), 'P max ' "P min ", "W band " (breedte van de pigmentband, = T3 - T2) en "W tergiet " (breedte van de gepigmenteerde cUtikels a2-a5, = T3).
  10. Load en voer de "correctie" functie (L196-234) in om een ​​data tabel te genereren die Pmax en P min registreert voor eventuele overlastfactoren die voortkomen uit sessie-effecten. Gebruik de gemiddelde toename (of daling) in P max of P min van de controle-monsters die opnieuw worden weergegeven over tijdelijk aangrenzende sessies.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het protocol werd gebruikt om het effect van de opslagtemperatuur op buikpigmentatie te onderzoeken. Uitgaande onderzoeken hebben aangetoond dat een toename van de ontwikkelingstemperatuur resulteert in een afname in de verspreiding van buikpigmentatie in verschillende soorten Drosophila , waaronder D. melanogaster 30 , 32 . Specifiek, in buiktergieten 3 en 4 neemt de mate van pigmentatie (breedte van de pigmentband) af van 17 ° C tot 25 ° C en blijft hetzelfde van 25 ° C tot 28 ° C 24 , 36 . Deze studies scoorden de mate van pigmentatie op een 1-10 schaal (0: geen pigmentband, tergiet volledig geel; 5: pigmentband beslaat 50% van de tergiet; 10: Tergiet volledig donker). Om vast te stellen of de kwantitatieve methodologie deze fenotypische plasticiteit kon vastleggen, werd de pigmentatie gemeten in thE derde en vierde buiktergieten van een isogene lijn van blijkbaar wildtype vrouwelijke vliegen, van ei tot volwassen bij 17 ° C (zeven vliegen), 25 ° C (negen vliegen) en 28 ° C (negen vliegen). Om de effectiviteit van de correctieprocedure te bepalen bij het verwijderen van overlastfactoren die door sessie-effecten werden geïntroduceerd, werd de pigmentatie van dezelfde vliegen opnieuw afgebeeld en opnieuw gemeten, twee, vier en acht dagen later gemeten. Verlichtingsvoorwaarden en blootstelling tussen sessies werden echter opzettelijk gewijzigd om ervoor te zorgen dat er sessie-effecten waren om de correctieprocedure te verwijderen. De afbeeldingen zijn op de Dryad digitale repository geplaatst.

De eerste vraag was of er systematische verschillen waren in pigmentatiemaatregelen over de sessies. Dit werd onderzocht met behulp van het lme4 pakket in R 48 om de gemengde modellen M ijk = S i + A j + te passenΕ ijk en M ij = A j + ε ij aan zowel P max als P min , waarbij M de pigmentmaat is, S de sessie is (willekeurig effect), A is de abdominale tergiet gemeten (willekeurig effect) en ε is De resterende fout (abonnees zijn niveaus binnen variabelen). Een log-waarschijnlijkheidsverhoudingstest werd gebruikt om te testen of de inclusie van de sessie als een willekeurige factor de fit aanzienlijk verbeterde; Het deed ( tabel 1 ). Zoals verwacht, gaf het onderzoek van de variatiecomponenten (gegenereerd via REML 48 ) aan dat variatie door sessie-effecten respectievelijk 67% en 70% van de totale variantie in respectievelijk Pmax en Pmin beliep ( Tabel 1 ).

Vijftien willekeurig geselecteerde controle tergieten (ofwel derde of vierde, van vliegen reaRood bij 17 ° C, 25 ° C of 28 ° C) werden geselecteerd en veranderingen in hun gemiddelde Pmax en P min werden gebruikt om de pigmentatiemaatregelen van de overblijvende tergieten over de hele sessies te corrigeren. Herhaling van de analyse op de gecorrigeerde pigmentatiemaatregelen elimineerde de sessie-effecten ( tabel 1 ) en verminderde het percentage van de totale variantie als gevolg van sessie-effecten op nul. De resterende fout is een schatting, een meetfout nadat de sessie-effecten zijn verwijderd en was respectievelijk 22% en 27% voor respectievelijk Pmax en Pmin ( Tabel 1 )

Vervolgens werden de gecorrigeerde gegevens gebruikt om te bepalen of het effect van temperatuur op verschillende aspecten van pigmentatie en grootte zou kunnen worden gedetecteerd. Het gemengde model M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm was gemonteerd op de data, waarbij T D is de tergiet (derde of vierde) en X is de individuele vlieg (willekeurige factor). Omdat de relatie tussen pigmentatie en temperatuur niet lineair is 24 , 36 , werd T als een categorische factor behandeld. De maximale en minimumniveaus van pigmentatie ( P max en P min ) en de breedte van de pigmentband en van de tergiet ( W- band en W- tergiet ) werden getest. Het effect van de temperatuur op de relatieve breedte van de pigmentband ( R band = W band / W tergiet ) werd ook getest. De gegevens toonden aan dat de absolute (W- band ) en de relatieve ( R- band ) breedte van de pigmentband van 17 ° C tot 25 ° C daalde (Tukey post-hoc test, P <0,05 voor alle) en veranderde niet significant van 25 ° C tot 28 ° C (Tukey post-hoc test, Tabel 2 , Figuur 3A en 3B ), die consistent is met vorige studies 24 , 36 . Hetzelfde patroon werd waargenomen voor het maximale en minimumniveau van pigmentatie, Pmax en P min ( Tabel 2 , Figuur 3C ). Het effect van temperatuur op het pigmentniveau is nog niet eerder beschreven, maar blijkt aanvankelijk consistent met andere studies die aantonen dat het minimumniveau van pigmentatie in de vierde buiktergiet positief is gecorreleerd met de breedte van de pigmentband in wildtypebevolkingen 39 . Hoewel de gegevens uit deze studie een positieve relatie tonen tussen P max en W- band , tonen ze een negatieve relatie tussen P min en W band( Tabel 3 ). Dit verschil tussen de huidige en eerdere studies kan weerspiegelen verschillen in hoe genetische en omgevingsfactoren invloed hebben op de correlatie tussen het niveau en de mate van abdominale pigmentatie. Desalniettemin blijkt uit deze representatieve resultaten dat het protocol niet alleen kan identificeren van pigmentatiepatronen die eerder zijn vastgesteld door kwalitatieve methodologieën, maar ook om nieuwe te onthullen die kwalitatieve methodologieën niet kunnen detecteren.

Het effect van temperatuur op de breedte van de tergiet was complexer. In D. melanogaster dalen lichaams- en orgaangrootte niet lineair met temperatuur 49 . Eerdere studies suggereren dat de breedte van de vijfde buiktergiet met 10% afneemt van 16,5 ° C tot 25 ° C en nog eens 4% van 25 ° C tot 29 ° C 50 . Hoewel er een niet-significante afname in de breedte vanDe vierde buiktergiet van 17 ° C tot 25 ° C, zowel de derde als vierde buiktergieten stegen in breedte van 25 ° C tot 28 ° C ( tabel 2 , figuur 3D ). Aangezien de breedte van de buiktergieten in hoofdzaak wordt gedefinieerd door de gebruiker (stappen 5.9-5.10 in het protocol), is het onwaarschijnlijk dat de verschillen tussen de huidige en de vorige studies het gevolg zijn van de manier waarop het R- script W tergiet uit het pigmentatieprofiel extrakt. Het kan eerder verschillen weerspiegelen in de wijze waarop het abdominale segment wordt gemeten, in de genotypen van de vliegen en in de precieze aspecten van de buiktergieten die worden gemeten.

De volgende vraag is of de methodologie gegevens kan vergelijken die zijn verzameld met behulp van bestaande beoordeling van pigmentatie. Deze methoden vragen de waarnemer meestal om elk vlieg naar een van een vinnen subjectief aan te wijzenHet aantal fenotypische klassen op basis van de mate van pigmentatie 15 , 30 , 32 , 33 , 34 en vertrouwt derhalve op het vermogen van de waarnemer om de breedte van de pigmentband te beoordelen. Om te testen hoe goed deze objectieve methode vergelijkt met subjectieve methoden, werden vijf waarnemers gevraagd om 45 beelden van vrouwelijke abdomenen te rangschikken op basis van de breedte van de pigmentband van de vierde abdominale tergiet. De gemiddelde ranking over waarnemers werd vergeleken met de ranking gebaseerd op W- band , zoals gemeten met behulp van deze methodologie. Er was een sterke correlatie tussen de subjectieve en objectieve rankings ( Aanvullend Figuur 1 , in Aanvullende Informatie.pdf), Spearmen's = 0.7342, P <0,0001).

Nog een vraag gesteldWas hoe deze methode om W- band uit de pigmenteringsspline te extraheren in vergelijking met het meten van de breedte van de pigmentband met de hand (visuele methode) met behulp van het lineaire meetinstrument in ImageJ . Opnieuw werd een sterke correlatie gevonden tussen data verzameld met behulp van de twee methodologieën ( aanvullend figuur 2 , in aanvullende informatie.pdf, OLS, r2 = 0,49 , P <0,0001). Hoewel de berekeningsmethode de pigmentband doorlopend gemeten heeft als kleiner dan in de "visuele" methode, was de regressiecoëfficiënt niet significant anders dan 1 ( P> 0,05).

De laatste vraag was of deze methode gebruikt zou kunnen worden om buikpigmentatie in andere contexten te meten. De methodologie kon de P max , P min , W band en W tergiet voor de f extraherenIfth en zesde abdominale tergieten bij vrouwen en de derde en vierde abdominale tergieten bij mannen ( figuur 4 ). Bovendien kan de methode worden gebruikt om de toename van Pmax en P min in vliegenmutant voor ebbehout ( e 1 ) te kwantificeren, die een toename in cutulair pigmentatie over het lichaam en een specifieke toename van pigmentatie van de cuticle voor het pigment vertoont Band 28 ( figuur 4 ).

Figuur 1
Figuur 1: Abdominale pigmentatie in D. melanogaster . ( A - F ) Variatie bij buikpigmentatie bij vrouwen van twee genotypen die bij drie temperaturen (17 ° C, 25 ° C en 28 ° C) worden opgewekt. A3 en A4 zijn de derde en vierde abdominale tergi Tes respectievelijk. ( G ) De dorsale buiktergiet omvat een anterior en posterior compartiment, waarvan slechts gedeelten betrouwbaar zichtbaar zijn in onuitgespreide buikspieren. De compartimenten worden verder onderverdeeld in verschillende soorten cuticle: a1: niet gepigmenteerd, geen haren; A2: licht gepigmenteerd en haar; A3: licht gepigmenteerde, haren en matige borstel; A4: donker gepigmenteerd, haren en matige borstel; A5: donker gepigmenteerd, haar en groot borstel; A6: niet-gepigmenteerd en haar; P3: niet-gepigmenteerd en haar; P2: niet-gepigmenteerde en geen haren; En p1: niet gepigmenteerd en tessellated. De pigmentband bestaat uit cuticles a4 en a5. Alleen in de analyse worden alleen gepigmenteerde kegels (a2-a5, groene doos) gebruikt. Schaalstaven = 200 μm in (AF). Het contrast van alle afbeeldingen is aangepast om het pigmentatiepatroon te markeren en de afbeeldingen zijn illustratief. Ongeoriënteerde afbeeldingen die gebruikt worden om de representatieve resultaten te genereren worden gedeponeerd op de Dryad digitale repository..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Beeld- en data-analyse voor het kwantificeren van buikpigmentatie. ( A - F ) en ( A - F ) zijn voor verschillende exemplaren en laten zien hoe de analyse betrekking heeft op beelden van verschillende kwaliteit. ( A ) De gebruiker definieert eerst de middellijn van de buik (gele lijn), de voorkant van de tergiet (cyaanlijn) en een lijn iets achter de achterkant van de pigmentband (magenta lijn). De ImageJ macro trekt vervolgens een lijn uit het middenpunt van de voorste en posterior lijnen (witte streeplijn), die het verbrengt om een ​​ROI (zwarte doos) te vormen, vergroot in ( B ). ( C ) De ImageJ macro dan exTrekt de gemiddelde pixelwaarde langs de voorste-achterste as van de ROI. Merk op dat in dit stadium het profiel van posterior naar voorzijde wordt gelezen. ( D - E ) De macro R converteert de gemiddelde pixelwaarden naar een pigmentatiewaarde, omgaat de richting van het pigmentatieprofiel, past het met een kubieke spline ( S (x) ) ( D ) en berekent de eerste ( S (x ) ) ( E ) en tweede ( S (x) ) derivaat van de spline ( F ). Het script identificeert dan: T 3 , de positie van de maximale pigmentatie, waar S (x) overgangen van <0 naar> 0 verplaatst naar de achterkant van de achterkant van de spline; T 2 , de positie waar de afname in pigmentatie het grootst is en S (x) maximaal is; En T 1 , de positie waar de tergietpigmentatie op zijn minimum is en S (x) overgangen van> 0 tot <0, verplaatsing van anterior fRom T 2 ,. De voorzijde van de betrouwbaar zichtbare tergiet (voorkant van kutikula a2) wordt bepaald door de gebruiker. (AF) In het geval dat het eerste afgeleide niet kan worden gebruikt om T 1 te vinden, meestal omdat S (x) 0 niet voorover naar de pigmentband komt, zal het script T 1 definiëren als de positie waarin S (x) overgangen van> 0 tot <0 bij het verplaatsen van de voorzijde van T2 . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Het effect van temperatuur op verschillende aspecten van buikpigmentatie in vrouwelijke D. melanogaster . ( A ) Breedte van de pigmentband ( W- band , FIguur 1). ( B ) Pigmentband als een deel van tergiet ( R- band ). ( C ) Maximum ( P max , bovenste lijnen) en minimale ( P min , onderste lijnen) pigmentatie. ( D ) Breedte van tergiet ( W tergiet ). De punten zijn minimaal vierkante middelen uit lineaire mixed-effect modellen (tabel 2). De foutbalkjes vertegenwoordigen de standaardfout en kunnen door de markers verduisterd worden. De zwarte lijn is derde buiktergiet. De grijze lijn is de vierde buiktergiet. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Verschillen in pigmentatie tussen de derde en vierde buiktergieten. Dit wordt getoond in ( A ebbehout 1 vrouwtjes, ( B ) wildtype vrouwtjes, ( C ) wildtype-mannetjes, en de vijfde en zesde buiktergieten in wildtype-vrouwtjes. ( D ) Maximale pigmentatie, P max . ( E) Minimale pigmentatie, P min . ( F ) Breedte van de pigmentband, W- band . ( G ) Relatieve breedte van de pigmentband, R- band . Bars met verschillende letters zijn significant verschillend (Tukey HSD post-hoc test, P <0,05). N = 6 voor alle behalve ebbehout 1 , waar N = 4. Schaalstaven = 200 μm in ( A - C ). De foutbalkjes vertegenwoordigen de standaardfout. Het contrast van alle afbeeldingen is aangepast om het pigmentatiepatroon te markeren en de afbeeldingen zijn illustratief. Gelieve cliCk hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

<Td> 4,08 (78%)
Model Vergelijking Variantiecomponenten (% van het totaal)
Pigmentatie Eigenschap Model df Log-waarschijnlijkheid X² Vergelijking (%) Vergelijking (%) Vergelijking (%)
P max niet gecorrigeerd M ij = A i + ε ij 3 -678,28 1,94 (14%) 11,86 (86%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -457,95 440,66 *** 4,08 (26%) 10,71 (67%) 1,14 (7%)
P min Ongecorrigeerd M ij = A i + ε ij 3 -875,03 6,05 (9%) 59,39 (91%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -664,58 420,91 *** 16,67 (22%) 53,08 (70%) 6,31 (8%)
P max gecorrigeerd M ij = A i + ε ij 3 -445,05 1,15 (22%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -444,88 0,3378 4,08 (78%) 0,01 (<1%) 1,14 (22%)
P min gerectificeerd M ij = A i + ε ij 3 -649,9 16,67 (73%) 6,24 (27%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -649,9 0 16,67 (73%) 0 6,31 (27%)

Tabel 1: Lineaire gemengde-effectmodellen van het effect van tergiet en sessie. Lineaire gemengde-effectmodellen van het effect van tergiet en sessie op aBdominale pigmentatie ( P max en P min ) van 50 tergieten opnieuw gemeten over vijf sessies, met variatiecomponenten geschat door REML. Modellen waren lineaire mixed-effect modellen. M : Pigmentatie maatregel; A : Individuele tergiet gemeten; S : Sessie; Ε : Resterende fout. Significante X² zijn vetgedrukt. * P <0,05. ** p <0,01. *** p <0.001.

trek Temperatuur tergiet Temperatuur
X Tergiet
P max F -ratio 8.14 55.59 6.6
P 0,002 <0,001
P min F -ratio 4.41 66.11 6.36
P 0,026 <0,001 0,002
W band F -ratio 113,93 0.01 0.64
P <0,001 0,931 0,531
W tergiet F -ratio 1.79 0.92 5.11
P 0,191 0.338 0,007
R band F -ratio 27.66 0.08 1.46
P <0,001 0,782 0.23

Tabel 2: Effect van temperatuur en tergietidentiteit. Het effect van temperatuur en tergietidentiteit Over verschillende aspecten van buikpigmentatie in 50 tergieten werden opnieuw gemeten over vijf sessies. Modellen waren lineaire gemengde-effect modellen, met individuele vlieg opgenomen als een willekeurige factor. P max : Maximale pigmentatie (gecorrigeerd); P min : Minimale pigmentatie (gecorrigeerd); W band : Breedte van pigmentband; W tergiet : Breedte van tergiet; R band : Relatieve breedte van pigmentband. Belangrijke vaste factoren zijn vetgedrukt ( P < 0,05).

Onderscheppen W band Temperatuur tergiet
17C 25 ° C Derde
P max β 234,35 0,069 0,063 -1,178 -0,588
F 29.93 5.97 54,82
P <0,001 0,008 <0,001
P min β 223,96 -0,137 3.931 -3,024 -1.54
F 19.33 uitstrekking = "2"> 9.66 62.02
P <0,001 0.001 <0,001

Tabel 3: Effect van pigmentbandbreedte, temperatuur en tergietidentiteit op het niveau van pigmentatie. Effect van pigmentbandbreedte, temperatuur en tergietidentiteit op het niveau van pigmentatie in 50 tergieten werd over vijf sessies gemeten. Modellen waren lineaire gemengde-effect modellen, met individuele vlieg opgenomen als een willekeurige factor. P max : Maximale pigmentatie (gecorrigeerd); P min : Minimale pigmentatie (gecorrigeerd); W band : Breedte van pigmentband; R band : Relatieve breedte van pigmentband.

Aanvullend bestand 1. Aanvullende informatie.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2. Analyse van Pigmentation.R script. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend Bestand 3. Meting van Pigmentation.ijm Klik hier om dit bestand te downloaden .

Simulatie R Script. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Deze methodologie zorgt voor de precieze, snelle en herhaalbare verwerving van pigmentatiegegevens in een kwantitatieve vorm die geschikt is voor meerdere downstream analyses. De methode is gebruikt om gegevens over het effect van temperatuur op buikpigmentatie in een isogene lijn vliegen te verwerven. De methodologie kan echter gebruikt worden in voorwaartse genetische studies om genen die onderliggende pigmentatieverschillen tussen individuen, populaties of soorten, of omgekeerde genetische studies zijn, te identificeren om de effecten van specifieke genen op pigmentatiepatronen te onderzoeken. Hoewel, zoals hierboven besproken, er sprake zijn van talloze studies die de ontwikkeling en evolutie van D. Melanogaster pigmentatie hebben onderzocht, is de precisie waarmee deze methode pigmentatiegegevens in een kwantitatieve vorm vastlegt, meer krachtige statistische benaderingen mogelijk. Dit zorgt ervoor dat onderzoekers minder samples kunnen gebruiken bij het analyseren van pigmentatiepatronen, of laten ze toe om subtieler te verklarenAspecten van pigmentatie. Bovendien vereist deze methode geen dissectie van de vlieg, waardoor het monster later gebruikt kan worden voor aanvullende analyses, zoals morfologische metingen of genotyperingen. Inderdaad kan de methode potentieel worden gebruikt bij verdovende vliegen, die vervolgens selectief kunnen worden gefokt op basis van hun pigmentatiekenmerken.

Een mogelijke kwestie bij het meten van pigmentatie via beeldanalyse is dat de pigmentatiewaarden de blootstelling en lichtomstandigheden waaronder een afbeelding is genomen, in plaats van het pigmenteringsniveau zelf kan weerspiegelen. Tijdens het gebruik van vaste verlichtingsniveaus helpen lichtposities, vergrotingen en belichtingen deze problemen op te lossen. Het is waarschijnlijk dat het nog steeds nodig is om meerdere herhalingscontrolebeelden in elke sessie te nemen om volledig te kunnen controleren voor sessie-effecten. Deze methode omvat vijftien besturingsmonsters elke keer opnieuw afbeelden en gebruik maken van de tussenzittingswijzigingen in P maX en p min om sessie effecten te detecteren en te elimineren. Het precieze aantal controle-exemplaren die opnieuw worden weergegeven, zullen echter afhangen van de gebruikte beeldhardeware en -software, het aspect van pigmentatie van belang voor de gebruiker en hoe variabel het is tussen behandelingen en hoeveel beelden er in elk zijn genomen sessie. Het uitvoeren van een voorlopig experiment waarbij dezelfde exemplaren opnieuw worden weergegeven over vijf sessies, zullen de gebruiker de variantie kunnen veroorzaken als gevolg van sessie-effecten, de variantie vanwege de identiteitsidentiteit en de resterende variantie (die een schatting is van meetfout na het corrigeren Voor sessie effecten) ( tabel 1 ). Deze waarden kunnen dan worden gebruikt om te schatten hoeveel controlebeelden in elke sessie moeten worden genomen om sessie-effecten op te sporen en te controleren. Een eenvoudig R- script is geschreven en gebruikt gegevens uit zo'n voorlopig experiment om pigmentatiemaatregelen over de sessies te simuleren. Het kan gebruikt wordenControleer of het aantal besturingsbeelden per sessie voldoende is om de sessie-effecten te verwijderen. Dit script wordt geleverd als aanvullend bestand.

Als gebruikers zich zorgen maken over overlastfactoren binnen sessies, kunnen ze hetzelfde monster meerdere keren door de sessie herhalen, zoals beschreven in John et al., 2016 41 . In dit geval moet [sampleID] voor het single control exemplaar worden gewijzigd elke keer als het opnieuw wordt weergegeven in een sessie (bijvoorbeeld control1, control2, control3, enz. ); Anders zal de beeldsoftware de vorige afbeelding vervangen door de nieuwe afbeelding van dezelfde naam. De correctiefunctie baseert zijn correctie op dubbele afbeeldingen met hetzelfde [sampleID] tussen tijdelijke aangrenzende sessies en zal corrigeren, of hetzelfde exemplaar meerdere keren binnen en tussen sessies opnieuw wordt afgebeeld of of er dezelfde verzameling controlemonsters tussen sessies wordt afgebeeld. Ongeacht hoe thE Beheersafbeeldingen worden genomen, sessies moeten als blokken worden behandeld en waar mogelijk dienen gebruikers een gerandomiseerd blokontwerp te gebruiken, zodat alle sessie-effecten die na correctie blijven kunnen statistisch gecontroleerd worden. Als dit niet lukt, moeten de voorbeelden willekeurig worden toegewezen aan sessies, zodat sessie-effecten niet in de war staan ​​met experimentele factoren.

Het protocol is gebaseerd op het genereren van een pigmentatieprofiel dat de verandering in pigmentatie over elke tergiet vertegenwoordigt. Een probleem bij het opwekken van dit profiel is de donkere haren die de buikspieren bedekken, die altijd door een voorste-posterior lijn die de tergiet oversteken, worden gesneden. Het protocol vermindert het geluid dat door deze haren wordt gegenereerd door het pigmentatieprofiel gemiddeld te verlagen over een band van kutikula. Niettemin kunnen gebruikers de breedte van de ROI instellen op 1 pixel in stap 5.6 als ze profielen willen genereren die zijn gebaseerd op een dunne snijsnede. Bovendien kunnen gebruikers t analyserenHij heeft dezelfde afbeelding meerdere keren, waardoor de zijdelingse positie van het pigmentatieprofiel verandert om veranderingen in de breedte van de pigmentband binnen een segment vast te leggen. In dit geval moeten gebruikers echter hetzelfde beeld meerdere keren kopiëren en elke kopie een unieke naam geven voordat u stap 5.1 uitvoert, aangezien de ImageJ macro profielen met dezelfde naam zal overschrijven.

Een tweede belangrijke overweging bij het genereren van het pigmentatieprofiel is de gladingsparameter van de kubieke spline, gedefinieerd binnen de spline.der.er functie (L63) in het script Analyse van Pigmentatie R. De juiste gladingsparameter hangt af van de beeldopstelling en de resolutie. Het overschrijden van een profiel kan leiden tot een verlies van de kenmerken van het spline profiel dat gebruikt wordt om de coördinaten van T1, T2 en T3 te berekenen ( Figuur 2D en 2D '). Omgekeerd verhoogt de ondervlotte deGeluid van het profiel en derhalve de nauwkeurigheid van de coördinaat-extracties. De chek functie produceert een grafische samenvatting van de spline en zijn derivaten en kan als visueel cue gebruikt worden om een ​​passende gladingsparameter te kiezen.

De hier beschreven methode richt zich op het vastleggen van gegevens over de pigmentatie van de derde en vierde buiktergieten in vrouwelijke en mannelijke D. melanogaster . De representatieve resultaten geven echter aan dat het ook kan worden gebruikt om de pigmentatie van de vijfde en zesde abdominale segmenten van vrouwen te meten. Bovendien kan de methodologie detecteren verschillen in fenotype veroorzaakt door mutanten van genen die pigmentatie beïnvloeden. De ImageJ macro- en R- scripts kunnen gemakkelijk worden aangepast om pigmentatie te meten in de buik van verschillende D. melanogaster soorten, of zelfs pigmentatie van andere lichaamsdelen in andere taxa, mits het pigmentatiepatroon stereotypisch is. Ten slotte, de methodologieKan ook aangepast worden om aspecten van pigmentatiekleur te meten door beelden in RGB vast te leggen en elk kanaal afzonderlijk te analyseren.

In het algemeen is deze methodologie onderdeel van het opkomende veld van fenomiek 51 , 52 . Het doel van de fenomiek is het genereren en analyseren van grote multidimensionale fenotypische datasets om de genetische en milieu-interacties die fenotype beïnvloeden, inclusief ziekte beter te begrijpen en hoe deze interacties evolueren om biologische diversiteit te genereren. Voor fenomenen om zijn potentieel te kunnen vervullen, moeten methoden voor het verkrijgen van fenotypische gegevens evenwel eenvoudig en gemakkelijk worden aangepast aan verschillende fenotypes, evenals vrij beschikbaar. Door gebruik te maken van open source software om beelden die zijn vastgelegd met behulp van standaard apparatuur te analyseren, helpt deze methodologie dit doel te bereiken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation, verleent IOS-1256565 en IOS-1557638 aan AWS. We bedanken Patricia Wittkopp en drie anonieme recensenten voor hun nuttige opmerkingen over een eerdere versie van dit artikel.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Tags

Genetica Pigmentation Drosophila fenotypische variatie microscopie digitale beeldanalyse fenomics
Kwantificering van buikpigmentatie in<em&gt; Drosophila melanogaster</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. … More

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter