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Genetics

Quantifier la pigmentation abdominale dans doi: 10.3791/55732 Published: June 1, 2017

Summary

Ce travail présente une méthode pour quantifier rapidement et précisément la pigmentation abdominale de Drosophila melanogaster en utilisant l'analyse d'image numérique . Cette méthode rationalise les procédures entre l'acquisition du phénotype et l'analyse des données et comprend le montage des échantillons, l'acquisition d'image, l'extraction de la valeur des pixels et la mesure des traits.

Abstract

La pigmentation est un trait morphologiquement simple mais très variable qui a souvent une signification adaptative. Il a largement servi de modèle pour la compréhension du développement et de l'évolution des phénotypes morphologiques. La pigmentation abdominale chez Drosophila melanogaster a été particulièrement utile, permettant aux chercheurs d'identifier les loci qui sous-tendent les variations inter-et intraspécifiques de la morphologie. Jusqu'à présent, cependant, la pigmentation abdominale de D. melanogaster a été largement analysée qualitativement, par marquage, plutôt que quantitativement, ce qui limite les formes d'analyse statistique qui peuvent être appliquées aux données de pigmentation. Ce travail décrit une nouvelle méthodologie qui permet de quantifier les différents aspects du modèle de pigmentation abdominale de D. melanogaster adulte. Le protocole comprend le montage d'échantillons, la capture d'image, l'extraction de données et l'analyse. Tous les logiciels utilisés pour la capture et l'analyse d'images sont des macrosÉcrit pour l'analyse d'image open source. L'avantage de cette approche est la capacité à mesurer précisément les traits de pigmentation en utilisant une méthodologie hautement reproductible sur différents systèmes d'imagerie. Bien que la technique ait été utilisée pour mesurer la variation des patrons de pigmentation tergale chez l'adulte D. melanogaster , la méthodologie est flexible et largement applicable aux modèles de pigmentation dans une multitude d'organismes différents.

Introduction

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La pigmentation montre une énorme variation phénotypique entre les espèces, les populations et les individus, et même chez les individus pendant l'ontogenèse 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Bien qu'il existe une myriade d'études de pigmentation dans une grande variété d'animaux, la pigmentation a peut-être été mieux étudiée chez Drosophila melanogaster , où la pleine puissance de la génétique moléculaire a été utilisée pour élucider les mécanismes de développement et physiologiques qui régulent la pigmentation et la manière dont ces mécanismes évoluent 1 , 6 . On connaît beaucoup les gènes qui régulent la synthèse biochimique des pigments dans D. melanogaster 7 , 8 et les gènes qui contrôlent le diDistribution de cette biosynthèse 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . En outre, le cartographie génétique a identifié les loci génétiques sous-jacents aux différences intra-et interspécifiques de pigmentation dans D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Les relations entre la pigmentation et les traits pleiotropes, tels que le comportement 18 , 19 et l'immunité 19 , 20 , ont également été explorées, tout comme la signification adaptative des motifs de pigmentation 15 , 21 , 22 . En tant que tel, la pigmentation chez D. melanogaster a émergé comme un puissant mais simple mOdel pour le développement et l'évolution des phénotypes complexes.

La pigmentation chez l'adulte D. melanogaster se caractérise par des formes distinctes de mélanisation à travers le corps, en particulier sur les ailes et le thorax et l'abdomen dorsal. C'est la pigmentation de chaque plaque cuticulaire (tergite) sur l'abdomen dorsal, qui a reçu l'attention la plus recherchée. Il existe une variation considérable de cette pigmentation ( figure 1A- F ), à la fois à la fois génétique 17 , 23 et à l'environnement 24 , 25 facteurs. La cuticule d'un tergite abdominal est constituée de compartiments de développement antérieurs et postérieurs ( Figure 1G ), chacun pouvant être subdivisé en fonction de la pigmentation et de l'ornementation 26 . Le compartiment antérieur comprend six cuticulesTypes (a1-a6), et le compartiment postérieur comprend trois (p1-p3) ( figure 1G ). Parmi ceux-ci, les cuticules p1, p2 et a1 sont généralement pliées sous le tergite dans des abdomens non étirés, de sorte qu'ils sont cachés. La cuticule visible de manière fiable est caractérisée par une bande de pigmentation lourde, appelée ici «bande de pigment», composée de types de cuticules a4 (poilus à poils modérés) et a5 (poilus à gros poils), avec le bord postérieur de la bande Plus intensément pigmenté que le bord antérieur ( Figure 1G ). Avant cette bande est une région de cuticule velue légèrement pigmentée, qui a des poils postérieurement (a3) ​​mais pas antérieurement (a2). La variation de la pigmentation entre les mouches est observée à la fois dans l'intensité de la pigmentation et dans la largeur de la bande de pigment. En général, la variation est plus élevée dans les segments les plus postérieurs (segments abdominaux 5, 6 et 7) et est plus faible dans les segments plus antérieurs (sécheresse abdominaleGentiment 3 et 4) 24 . En outre, il existe un dimorphisme sexuel dans la pigmentation de D. melanogaster , les mâles ayant généralement des cinquième et sixième tergites abdominaux entièrement pigmentés ( figure 4C ).

Dans la plupart des études de pigmentation abdominale chez D. melanogaster , la pigmentation a été traitée comme un trait catégorique ou ordinaire, le motif mesuré de manière qualitative 27 , 28 , 29 ou semi-quantitativement sur une échelle 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Ces méthodes souffrent inévitablement d'un manque de précision, et parce qu'elles dépendent de l'évaluation subjective de la pigmentation, il est difficile de comparer les données entre les études. Plusieurs auteurs ont quantifié les dimensions spatiales de la pigmentation 38 , 39 , l'intensité de la pigmentation d'un type cutané 23 , 25 , 39 , 40 ou l'intensité moyenne de la pigmentation à travers le tergite abdominal dans son ensemble 41 , 42 , 43 . Néanmoins, ces méthodes de quantification ne mesurent pas à la fois l'intensité et la répartition spatiale de la pigmentation abdominale simultanément et ne capturent donc pas les nuances de la variation de la pigmentation dans l'abdTergite terminale. En outre, plusieurs de ces méthodes de quantification 38 , 41 , 42 , 43 nécessitent la dissection et le montage de la cuticule abdominale. Cela prend du temps et détruit l'échantillon, ce qui rend indisponible pour des analyses morphologiques supplémentaires. À mesure que la compréhension du développement et de l'évolution de la pigmentation abdominale approfondit, des outils plus sophistiqués pour mesurer rapidement et précisément la répartition spatiale et l'intensité de la pigmentation seront nécessaires.

L'objectif global de cette méthode est d'utiliser l'analyse d'image numérique pour obtenir une mesure réplicable et plus précise de la pigmentation abdominale dans D. melanogaster . La méthodologie comprend trois étapes. Tout d'abord, la mouche adulte est montée de manière non destructive et une image numérique de l'abdomen dorsal est prise. Deuxièmement, en utilisant une macro ImageJ, l'utilisateurDéfinit une bande antérieure-postérieure de pixels qui s'étend de l'antérieur de la cuticule a2 à la postérieure de la cuticule a5 (boîte verte, figure 1G ) sur les troisième et quatrième segments abdominaux. La valeur moyenne des pixels sur la largeur de cette bande est ensuite extraite le long de son axe long, générant un profil qui capture la répartition spatiale et l'intensité de la pigmentation à mesure qu'elle change de l'antérieur à l'arrière du tergite. Troisièmement, un script R est utilisé pour décrire le profil de pigmentation mathématiquement à l'aide d'une cannelure cubique. Le script R utilise alors la spline et sa première et seconde dérivée pour extraire la largeur de la cuticule a2-a5, la largeur de la bande de pigment et les niveaux de pigmentation maximum et minimum. La méthode quantifie donc à la fois les caractéristiques spatiales et la profondeur de la pigmentation abdominale.

Cette méthodologie quantifie la pigmentation des troisième et quatrième tergites abdominales,Qui ont fait l'objet de nombreuses études précédentes 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , soit exclusivement, soit en combinaison avec d'autres tergites postérieures. Bien qu'il soit moins variable que les cinquième et sixième tergites abdominales, les troisième et quatrième tergites ne sont pas complètement pigmentés chez les mâles, donc ce protocole peut être appliqué chez les mâles et les femelles. Néanmoins, comme indiqué ici, le protocole peut être utilisé pour mesurer la pigmentation dans les cinquième et sixième tergites abdominales chez les femelles. En outre, des modifications mineures des scripts utilisés pour extraire les caractéristiques du profil de pigmentation devraient permettre d'utiliser la méthode pour quantifier la variation de pigmentation dans une grande variété d'autresorganismes.

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Protocol

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1. Montage de l'échantillon

REMARQUE: conserver les mouches mortes dans de l'éthanol à 70% dans l'eau avant l'imagerie.

  1. Verser 10 ml de goutte à 1,25% dissous dans de l'eau bouillante dans une boîte en Pétri de 60 mm x 15 mm et laisser la mettre en place.
  2. Sous un microscope à dissection, utilisez une paire de pinces fine pour créer une rainure profonde de ~ 20 mm d'épaisseur, 2 mm de largeur, 1 mm dans la surface du gel. À l'aide de pinces fines, incorporer le côté ventral d'une mouche adulte dans la rainure, le côté dorsal de la mouche dépassant le gel.
    REMARQUE: la folie du gel permet un repositionnement facile sans endommager l'échantillon. La même rainure peut être utilisée pour de multiples spécimens, bien qu'elle devienne sale, cassée et inutilisable avec le temps. L'utilisateur peut alors créer une autre rainure dans le même gel. Chaque plaque peut être utilisée pour imaginer ~ 200 mouches.
  3. Couvrir complètement l'échantillon dans de l'éthanol à 70% dans de l'eau pour réduire les réflexions lumineuses de la cuticule cireuse et prévenir les dégâts des ailes pendantManipulation d'échantillons.

2. Configuration du microscope

REMARQUE: les images sont acquises à l'aide d'une portée de dissection, d'une base de lumière transmise, d'un appareil photo numérique et d'une source de lumière froide à col de cygne attachée à un ordinateur utilisant un logiciel de contrôle d'acquisition d'image. Les instructions de logiciel sont spécifiques à Micro-Manager v1.4.20 44 , un logiciel open-source qui incorpore ImageJ 45 .

  1. Allumez le microscope, appareil photo numérique, source de lumière froide à double col de cygne et ordinateur.
  2. Exécutez le logiciel de capture d'image pour ouvrir une fenêtre Micro-Manager et une fenêtre ImageJ. Dans la fenêtre ImageJ, cliquez sur "Image"> "Type"> "8 bits" pour définir toutes les images en 8 bits. Cliquez sur "Live" dans la fenêtre Micro-Manager pour ouvrir une fenêtre "Snap / Live" montrant un aperçu en temps réel de la caméra.
    1. Maximisez la taille de la fenêtre "Snap / Live" si neCessionnaire. Sélectionnez «Niveaux de gris» dans le menu déroulant «Mode d'affichage» dans l'onglet «Contraste» de la fenêtre Micro-Manager.
  3. Allumez la source de lumière froide jusqu'à son intensité maximale et positionnez les pointes de chaque col de cygne à environ 120 mm de la scène, une à gauche et une à droite.
    REMARQUE: les utilisateurs peuvent également utiliser un illuminateur annulaire, bien que cela puisse générer un anneau de lumière réfléchie autour de l'abdomen de la mouche.
  4. Réglez manuellement le grossissement du microscope à 60X afin que le champ de vision capture une surface d'environ 3 mm de diamètre sur la scène.
  5. Placez un micromètre de 2 mm sur la scène (en changeant d'arrière-plan en blanc si nécessaire). Tout en regardant l'aperçu en direct, concentrez-vous sur le micromètre du stade et ajustez l'exposition dans la fenêtre Micro-Manager en entrant le temps d'exposition dans ms dans la zone "Exposition".
  6. Pour calibrer spatialement la caméra, sélectionnez l'outil "ligne droite" dans tIl ImageJ fenêtre et tracer une ligne de longueur de la scène micromètre. Dans la fenêtre ImageJ, cliquez sur "Analyser"> "Définir l'échelle" pour ouvrir la fenêtre "Set Scale", entrez la longueur du micromètre dans μm dans la zone "Distance connue" et entrez "μm" dans "Unité de longueur" boîte.
    1. Voyez que la fenêtre "Set Scale" affiche alors l'échelle dans "pixels / μm". Notez l'échelle et cliquez sur "OK".
  7. Dans la fenêtre "Snap / Live", cliquez sur "Stop", puis "Snap" pour capturer une image du micromètre de scène.
  8. Enregistrez l'image sous la forme d'un TIFF en niveaux de gris 8 bits pour assurer la possibilité d'étalonner spatialement les images si nécessaire. Dans la fenêtre ImageJ, cliquez sur "Fichier"> "Enregistrer sous"> "Tiff ..." Spécifiez où enregistrer le fichier dans le navigateur de fichiers, nommez le fichier et cliquez sur "Enregistrer".
  9. Passez la scène au noir et placez-laUne assiette de Petri tenant une mouche montée en gélose (étapes 1.1-1.2) sur la scène.
  10. Regardez à travers le microscope et positionnez la mouche pour vous assurer que la ligne médiane dorsale est droite vers le haut afin de mieux voir le motif de pigmentation. Déplacez les ailes et les appendices pour vous assurer que la vue de l'abdomen est dégagée. Si la cuticule pigmentée (a2-a5) n'est pas visible, serrer l'abdomen latéralement jusqu'à ce qu'elle soit (même si l'abdomen des mouches est stocké dans de l'éthanol à 70% dans l'eau, de sorte que cela n'est généralement pas nécessaire).
    REMARQUE: Lors du positionnement de la mouche, l'utilisateur peut avoir besoin d'un grossissement inférieur (20X). Le grossissement doit être retourné à 60X avant de continuer.
  11. Concentrez-vous manuellement sur l'abdomen dorsal de la mouche. Ajustez manuellement les pointes de la source lumineuse pour minimiser les ombres et la réflexion sur l'abdomen dorsal.
  12. En regardant l'aperçu en direct sur l'écran de l'ordinateur, et en utilisant l'histogramme des valeurs de pixels dans l'onglet "Contraste" de la fenêtre Micro-Manager,Ajustez l'exposition comme décrit à l'étape 2.4 pour maximiser la plage des valeurs de pixel de l'image d'aperçu.
  13. Retirez la mouche et la boîte de Petri et remplacez-les par une LED (sortie spectrale de 430-660 nm) connectée à un compteur de tension, centrée dans le champ de vision à la même position que la mouche. Utilisez la LED et le compteur de tension comme un compteur de lumière 46 et enregistrez la tension générée par la lumière qui frappe la LED (~ 125 mV).
    REMARQUE: la LED et le compteur de tension sont utilisés pour s'assurer que les niveaux de lumière sont constants sur plusieurs sessions d'imagerie au cours d'une seule expérience.
  14. Pendant la durée de l'expérience, ne modifiez pas davantage la position ou l'intensité de la source de lumière, le grossissement du microscope ou l'exposition de la caméra.

3. Imagerie par spécimen

  1. Placez une boîte à pétri tenant une mouche montée en gélose (étapes 1.1-1.3) sur le stade du microscope noir. Ajustez la position de la mouche afin que le troisième et le quatreH les segments abdominaux sont visibles et la ligne médiale dorsale est droite, comme décrit à l'étape 2.9. Assurez-vous que le grossissement soit à 60x avant de continuer.
  2. Concentrez-vous manuellement sur le microscope de telle sorte que les troisième et quatrième tergites abdominaux dorsaux soient concentrés. Utilisez le logiciel de capture d'image pour acquérir une image en tant que TIFF en niveaux de gris 8 bits, comme décrit à l'étape 2.6.
    REMARQUE: l'image peut être saisie en couleur et ensuite convertie en niveaux de gris pour analyse.
  3. Enregistrez l'image comme "SESH000_sampleID.tiff", comme décrit à l'étape 2.7.
    REMARQUE: ici, [SESH] est constant, [000] est le numéro de session et est variable, mais doit avoir trois chiffres et [sampleID] est ce que l'utilisateur souhaite, bien qu'il ne contienne aucun caractère de soulignement supplémentaire (_) et Doit être d'une longueur constante. [SampleID] devrait inclure des détails sur les facteurs utilisés dans l'analyse des données de pigmentation ( p. Ex., Température ou lignage), séparés par un caractère distinctif non alphabétiqueCal, comme un trait d'union (-). Cela permet de séparer facilement ces facteurs de [sampleID] à l'aide d'un logiciel statistique standard.
  4. Retirez la boîte de Petri de la scène et remplacez la mouche par le spécimen suivant. Répétez les étapes 3.1-3.3 jusqu'à ce que tous les spécimens aient été imagés, sans ajuster davantage les niveaux d'éclairage, le grossissement ou l'exposition.

4. Imagerie dans plusieurs sessions

  1. Si les images doivent être intégrées à plusieurs sessions, maintenez l'intensité de la lumière, l'exposition et l'agrandissement entre les sessions. Au début de chaque session, vérifiez l'étalonnage spatial de la caméra (étape 2.4) et l'intensité de la lumière au stade (mesuré par la LED / tension mètre, étape 2.12).
  2. Capturez et enregistrez une image du micromètre de scène (étapes 2.5-2.7) pour assurer la possibilité d'étalonner spatialement les images, si nécessaire.
  3. Utilisez au moins 15 spécimens de contrôle et re-imagez-les au hasard dans chaque session à alloW pour la détection et l'élimination des effets de session. Assurez-vous que les spécimens de contrôle en double entre les sessions ont le même [sampleID] mais différent [SESH000].
    REMARQUE: les échantillons de contrôle sont collectés, stockés et montés de manière identique à des spécimens expérimentaux, mais ils sont reproduits entre les sessions. Le nombre précis de spécimens de contrôle dépend de l'installation expérimentale de l'utilisateur. Voir la discussion pour plus de détails.

5. Analyse d'image

REMARQUE: l'analyse d'image est effectuée dans ImageJ 45 et utilise la macro "Measurement of Pigmentation.ijm", fournie sous forme de fichier supplémentaire.

  1. Placez toutes les images à analyser dans le même dossier.
  2. Démarrez ImageJ et exécutez la macro "Measurement of Pigmentation.ijm" en cliquant sur "Plugins"> "Macro"> "Exécuter", en sélectionnant "Mesurer Pigmentation.ijm" dans le navigateur de fichiers, puis en cliquant sur "ouvrir."
    REMARQUE: toutes les étapes suivantes sont dans la macro. Chaque étape est une commande de macro individuelle.
  3. Notez qu'une boîte de dialogue "Action requise" s'ouvre, en indiquant "Choisir le dossier où les images sont stockées". Cliquez sur "OK" et utilisez le navigateur de fichiers pour sélectionner le dossier contenant les images, puis cliquez sur "choisir".
  4. Notez qu'une boîte de dialogue "Action requise" sera ouverte, en indiquant "Choisissez le dossier dans lequel vous voulez stocker les données". Cliquez sur "OK" et utilisez le navigateur de fichiers pour sélectionner le dossier souhaité pour sauvegarder les profils de pigmentation. Cliquez sur "choisir".
  5. Notez qu'une boîte de dialogue s'ouvre, en demandant "Combien de caractères dans votre ID d'échantillon?" Dans la zone de saisie de données, entrez le nombre de caractères dans [SampleID], comme spécifié à l'étape 3.3, et cliquez sur "OK".
  6. Notez qu'une boîte de dialogue s'ouvre, en demandant "Quelle est la taille de votre ROI?" Dans la zone de saisie de données, entrez la largeur de pixels de l'espace antérieur-Bande postérieure sur laquelle le profil de pigmentation doit être lu (rectangle vert, figure 1G , figure 2A et 2A '). Cliquez sur "OK"; La valeur par défaut est de 20 pixels.
    REMARQUE: Le profil de pigmentation est lu à travers une bande de cuticule, plutôt qu'une ligne, pour réduire le bruit causé par les poils et les poils. La largeur de cette bande dépend de la résolution de l'image, mais elle doit être égale à ~ 1/20 de la largeur de l'abdomen, en pixels.
  7. Notez que la macro ouvrira l'image de la première mouche et une boîte de dialogue demandera s'il faut mesurer la mouche actuelle (cliquez sur "Oui"), pour passer à la prochaine volée (cliquez sur "Non") ou pour quitter le Macro (cliquez sur "Annuler").
  8. Notez qu'une boîte de dialogue s'ouvre, en indiquant "Définir la ligne médiane de l'abdomen dorsal, de ANTERIOR à POSTERIOR". L'outil "ligne droite" sera déjà sélectionné. Dessinez une ligne antérieure à postérieurePour définir la ligne médiane de l'abdomen dorsal. Cliquez sur "OK"; Voir les figures 2A et 2A ', ligne jaune.
    REMARQUE: ceci permet de réorienter l'image afin que la ligne médiane dorsale se trouve horizontalement sur l'écran, l'avant vers la gauche, ce qui rend les étapes suivantes plus faciles.
  9. Notez qu'une boîte de dialogue s'ouvre, en indiquant "Définir le bord POSTERIOR de Tergite 4 juste derrière la bande de pigments". L'outil "ligne droite" sera déjà sélectionné. Dessinez une ligne du bord de la ligne médiane postérieure au bord latéral droit, de sorte que le centre de la ligne (marqué par un carré blanc) se trouve juste en arrière sur le bord postérieur de la bande de pigment (cuticule a5). Cliquez sur "OK"; Voir les figures 2A et 2A ', ligne magenta.
    REMARQUE: Le script R détectera automatiquement le bord postérieur de la bande de pigment à partir du profil de pigmentation.
  10. Notez qu'un dialogueLa boîte s'ouvre, en indiquant "Définir le bord ANTERIOR de Tergite 4 au bord antérieur de la cuticule pigmentée (a2)". L'outil "ligne droite" sera déjà sélectionné. Dessinez une ligne du bord médian antérieur au bord latéral droit, de sorte que le centre de la ligne (marqué par un carré blanc) se trouve au bord antérieur de la cuticule pigmentée (cuticule a2). Cliquez sur "OK"; Voir la figure 2A et 2A ' , ligne cyan.
    NOTE: Le script R définira ce point comme le bord antérieur de la cuticule pigmentée du tergite. Sur l'image, la macro montrera la région d'intérêt (ROI) le long duquel le profil de pigmentation est lu (rectangle vert, figure 2A et 2A ', agrandi sur les figures 2B et 2B '). La macro ouvrira également une deuxième fenêtre montrant le profil de pigmentation du ROI ( Figur E 2C et 2C '), où l'axe des x est la position, exprimée en nombre de pixels à partir du bord postérieur du profil, et l'axe des y est la valeur moyenne de pixel à chaque position.
  11. Voir les tracés du profil de pigmentation qui sera ouvert par la macro. Si nécessaire, cliquez sur "Live" dans la fenêtre de profil pour ajuster la position du ROI afin qu'il n'inclue pas les structures ( p. Ex. Les poils) qui influenceraient le profil de pigmentation. Une fois que le profil est satisfaisant, cliquez sur "OK".
  12. Répétez les étapes 5.8-5.11 pour Tergite 3.
    REMARQUE: la macro exporte les profils de pigmentation en tant que deux fichiers CSV, chacun nommé "SESH000_samplename_TX_profile.csv", où [SESH000_samplename] est le nom de l'image et [TX] est T3 ou T4 pour le troisième et le quatrième tergit, respectivement.
  13. Notez que la macro ouvre l'image suivante. Répétez les étapes 5.7-5.13 jusqu'à ce que toutes les images aient été analysées.
Jove_title "> 6. Prétraitement de données, analyse et correction de session

REMARQUE: toute analyse de données est effectuée dans R 47 et utilise le script "Analyse de Pigmentation.R" fourni. Ci-dessous, "L ..." indique la (les) ligne (s) du script à exécuter pour chaque partie de l'analyse. Consultez l' information supplémentaire pour plus de détails sur la façon dont l'analyse est menée.

  1. Modifiez le script R pour définir le répertoire de travail (L6) et définissez le chemin du fichier dans le dossier contenant les profils .csv (L11).
  2. Exécutez L13-15 pour générer une liste des profils de pigmentation stockés dans le dossier de profil.
  3. Chargez et exécutez les fonctions "lecteur" et "addPrimaryKey" (L17-41) pour lire les profils dans une seule base de données.
  4. Modifiez le script à L43 pour spécifier l'étalonnage spatial des images en μm / pixels, comme indiqué à l'étape 2.5.
  5. Chargez et exécutez le "réglage"Tments "(L46-58) pour convertir la position du profil (axe des x, figure 2C et 2C ') des pixels-de-postérieur-bord-de-ROI à μm-de-antérieur-bord-de-ROI et le Valeur de profil (axe y, figure 2C et 2C ') de la valeur de pixel (0 = noir, 255 = blanc) à la valeur de pigmentation (0 = aucun pigment, 255 = pigment maximum).
  6. Chargez et exécutez la fonction "spline.der.er" (L60-71) pour générer la spline cubique des profils de pigmentation et ses dérivées premières et secondes ( Figure 2D -2F et 2D '- 2F ').
  7. Chargez et exécutez les fonctions "coord" et "assmbly.coord" (L74-163), d'abord pour extraire la position des bords postérieur (T 3 ) et antérieur (T 2 ) de la bande de pigment ( Figure 2D et 2D ';) Et le bord postérieur de la cuticule a2 (T 1 , Figure 2D et 2D '), puis pour extraire les valeurs de pigmentation maximale (P max ) et minimale (P min ), prises respectivement à T 3 et T 1 .
    NOTE: Le bord antérieur de la cuticule a2 a déjà été défini à l'étape 5.9.
  8. Facultatif: chargez et exécutez la fonction "chek" (L165-175) pour vérifier si la fonction "coord" identifie correctement les positions T 1-3 pour un profil de pigmentation sélectionné de manière aléatoire.
  9. Chargez et exécutez les fonctions d'index et de métriques (L178-193) pour générer une table de données avec les rubriques "Session", "Exemple", "Tergite", "id" (une concaténation d'Sample et Tergite), "P max " "P min ", " bande W" (largeur de la bande de pigment, = T3 - T 2 ) et "W tergite " (largeur du c pigmentéLes particules a2-a5, = T 3 ).
  10. Chargez et exécutez la fonction "correction" (L196-234) pour générer une table de données qui corrige P max et P min pour tous les facteurs nuisibles découlant des effets de la session. Utilisez l'augmentation moyenne (ou la diminution) dans P max ou P min à partir des spécimens de contrôle reproduits dans les sessions temporellement adjacentes.

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Representative Results

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Le protocole a été utilisé pour explorer l'effet de la température d'élevage sur la pigmentation abdominale. Des études antérieures ont montré qu'une augmentation de la température de développement entraîne une diminution de la propagation de la pigmentation abdominale dans plusieurs espèces de Drosophila , y compris D. melanogaster 30 , 32 . Plus précisément, dans les tergites abdominales 3 et 4, l'étendue de la pigmentation (largeur de la bande de pigment) diminue de 17 ° C à 25 ° C et reste la même de 25 ° C à 28 ° C 24 , 36 . Ces études ont marqué l'étendue de la pigmentation sur une échelle de 1 à 10 (0: aucune bande de pigment, tergite complètement jaune, 5: la bande de pigment occupe 50% du tergite, 10: le tergite complètement sombre). Pour déterminer si la méthodologie quantitative pouvait capter cette plasticité phénotypique, la pigmentation était mesuréeE troisième et quatrième tergites abdominales d'une ligne isogénique de mouches femelles ostensiblement sauvages, élevées d'un oeuf à un adulte à 17 ° C (sept mouches), 25 ° C (neuf mouches) et 28 ° C (neuf mouches). Pour déterminer l'efficacité de la procédure de correction pour éliminer les facteurs de nuisance introduits par les effets de la séance, la pigmentation des mêmes mouches a été ré-imagée et ré-mesurée un, deux, quatre et huit jours plus tard. Cependant, les conditions d'éclairage et l'exposition entre les sessions ont été délibérément changées pour s'assurer qu'il y avait des effets de session pour la procédure de correction à supprimer. Les images ont été publiées sur le dépôt numérique Dryad.

La première question posée était de savoir s'il existait des différences systématiques dans les mesures de pigmentation entre les sessions. Ceci a été examiné en utilisant le paquet lme4 dans R 48 pour s'adapter aux modèles mixtes M ijk = S i + A j +Ε ijk et M ij = A j + ε ij à P max et P min , où M est la mesure du pigment, S est la session (effet aléatoire), A est le tergite abdominal mesuré (effet aléatoire), et ε est L'erreur résiduelle (les indices sont des niveaux dans les variables). Un test de rapport log-vraisemblance a été utilisé pour tester si l'inclusion de la session en tant que facteur aléatoire a considérablement amélioré l'ajustement; Il l'a fait ( tableau 1 ). Comme prévu, l'examen des composants de variance (généré par REML 48 ) a indiqué que la variation due aux effets de la session représentait respectivement 67% et 70% de la variance totale en P max et P min ( tableau 1 ).

Quinze tergites de contrôle choisis au hasard (soit le troisième soit le quatrième, à partir des mouches reaRouge à 17 ° C, 25 ° C ou 28 ° C) ont été sélectionnés, et des changements dans leur P max moyen et P min ont été utilisés pour corriger les mesures de pigmentation des autres tergites entre les sessions. La répétition de l'analyse sur les mesures de pigmentation corrigées a éliminé les effets de la session ( Tableau 1 ) et a réduit le pourcentage de variance totale due aux effets de la session à zéro. L'erreur résiduelle est une estimation, une erreur de mesure après suppression des effets de la session et respectivement 22% et 27% pour P max et P min ( tableau 1 )

Ensuite, les données corrigées ont été utilisées pour déterminer si l'effet de la température sur différents aspects de la pigmentation et de la taille pourrait être détecté. Le modèle mixte M ijkm = T i * D j + X k + ε ijkm a été adapté aux données, où T D est le tergite (troisième ou quatrième), et X est la volée individuelle (facteur aléatoire). Parce que la relation entre la pigmentation et la température n'est pas linéaire 24 , 36 , T a été traitée comme un facteur catégorique. Les niveaux maximal et minimum de pigmentation ( P max et P min ) et la largeur de la bande de pigment et du tergite ( bande W et W tergite ) ont été testés. L'effet de la température sur la largeur relative de la bande de pigment ( bande R = bande W / W tergite ) a également été testé. Les données ont montré que la largeur absolue ( bande W ) et relative ( bande R ) de la bande de pigments a diminué de 17 ° C à 25 ° C (test Tukey post-hoc, P <0,05 pour tous) et n'a pas changé de manière significative de 25 ° C à 28 ° C (test Tukey post-hoc, tableau 2 , figure 3A et 3B ), ce qui correspond aux études précédentes 24 , 36 . Le même schéma a été observé pour le niveau maximal et minimum de pigmentation, P max et P min ( tableau 2 , figure 3C ). L'effet de la température sur le niveau de pigmentation n'a pas été décrit précédemment, mais il semble d'abord cohérent avec d'autres études qui montrent que le niveau minimum de pigmentation dans le quatrième tergit abdominal est corrélée positivement avec la largeur de la bande de pigments dans les populations de type sauvage 39 . Cependant, bien que les données de cette étude indiquent une relation positive entre P max et W , elles montrent une relation négative entre P min et W( Tableau 3 ). Cette différence entre les études actuelles et antérieures peut refléter des différences dans la façon dont les facteurs génétiques et environnementaux ont une incidence sur la corrélation entre le niveau et l'étendue de la pigmentation abdominale. Néanmoins, ces résultats représentatifs montrent que le protocole est capable non seulement d'identifier les modèles de pigmentation précédemment établis par des méthodologies qualitatives, mais aussi de révéler de nouvelles méthodes que les méthodologies qualitatives ne sont pas capables de détecter.

L'effet de la température sur la largeur du tergite était plus complexe. Dans D. melanogaster , la taille du corps et de l'organe diminue de manière non linéaire avec la température 49 . Des études antérieures suggèrent que la largeur du cinquième tergite abdominale diminue de 10% entre 16,5 ° C et 25 ° C et 4% de plus de 25 ° C à 29 ° C 50 . Bien qu'il y ait eu une diminution non significative de la largeur deLe quatrième tergit abdominal de 17 ° C à 25 ° C, les troisième et quatrième tergites abdominaux ont augmenté de 25 ° C à 28 ° C ( tableau 2 , figure 3D ). Étant donné que la largeur des tergites abdominales est essentiellement définie par l'utilisateur (étapes 5.9-5.10 dans le protocole), la disparité entre les études actuelles et antérieures est peu probable en raison de la façon dont le script R extrait W tergite du profil de pigmentation. Au contraire, cela peut refléter des différences dans la façon dont le segment abdominal est mesuré, dans les génotypes des mouches et dans les aspects précis des tergites abdominaux mesurés.

La prochaine question posée était de savoir si la méthodologie pourrait générer des données comparables aux données collectées en utilisant les évaluations existantes de la pigmentation. Ces méthodes demandent généralement à l'observateur d'affecter subjectivement chaque volée à l'une d'une ailetteNombre de classes phénotypiques basées sur l'étendue de la pigmentation 15 , 30 , 32 , 33 , 34 et dépendent donc de la capacité de l'observateur à évaluer la largeur de la bande de pigment. Pour tester à quel point cette méthode objective se compare à des méthodes subjectives, on a demandé à cinq observateurs de classer 45 images d'abdomen féminin en fonction de la largeur de la bande de pigments du quatrième tergit abdominal. Le classement moyen par rapport aux observateurs a été comparé au classement basé sur la bande W, mesurée à l'aide de cette méthodologie. Il y avait une forte corrélation entre les classements subjectif et objectif ( figure complémentaire 1 , dans Information complémentaire.pdf), Spearmen = 0.7342, P <0,0001).

Une autre question poséeÉtait de savoir comment cette méthode pour extraire la bande W de la spline de pigmentation par rapport à la mesure de la largeur de la bande de pigments à la main (méthode visuelle) en utilisant l'outil de mesure linéaire dans ImageJ . Encore une fois, une forte corrélation a été trouvée entre les données recueillies en utilisant les deux méthodologies ( Figure complémentaire 2 , dans Information complémentaire.pdf, OLS, r 2 = 0,49 , P <0,0001). Bien que la méthode de calcul ait constamment mesuré la bande de pigment comme étant plus étroite que dans la méthode "visuelle", le coefficient de régression n'était pas significativement différent de 1 ( P> 0,05).

La dernière question posée était de savoir si cette méthodologie pourrait être utilisée pour mesurer la pigmentation abdominale dans d'autres contextes. La méthodologie pourrait extraire le P max , P min , la bande W et W tergite pour la fSi et sixième tergites abdominales chez les femelles et troisième et quatrième tergites abdominales chez les mâles ( figure 4 ). En outre, la méthodologie pourrait être utilisée pour quantifier l'augmentation de P max et P min dans les mouches mutantes pour l' ébène ( e 1 ), qui montrent une augmentation de la pigmentation cuticulaire dans l'organisme et une augmentation spécifique de la pigmentation de la cuticule antérieure au pigment Bande 28 ( figure 4 ).

Figure 1
Figure 1: pigmentation abdominale chez D. melanogaster . ( A - F ) Variation de la pigmentation abdominale chez les femelles de deux génotypes élevés à trois températures (17 ° C, 25 ° C et 28 ° C). A3 et A4 sont les troisième et quatrième tergi abdominaux Tes, respectivement. ( G ) Le tergite abdominal dorsal comprend un compartiment antérieur et postérieur, dont certaines sont visible de façon fiable dans les abdomens non étirés. Les compartiments sont encore subdivisés en différents types de cuticules: a1: non pigmenté, pas de cheveux; A2: légèrement pigmenté et les cheveux; A3: légèrement pigmenté, poils et poils modérés; A4: pigment sombre, poils et poils modérés; A5: grossièrement pigmenté, poils et gros poils; A6: non pigmenté et cheveux; P3: non pigmenté et cheveux; P2: non pigmenté et pas de cheveux; Et p1: non pigmentés et tessellés. La bande de pigment est composée de cuticules a4 et a5. Seules les cuticules pigmentées (a2-a5, boîte verte) sont utilisées dans l'analyse. Barres d'échelle = 200 μm (AF). Le contraste de toutes les images a été ajusté pour mettre en évidence le motif de pigmentation, et les images sont illustratives. Les images non ajustées utilisées pour générer les résultats représentatifs sont déposées sur le stockage numérique Dryad..com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Analyse d'image et de données pour quantifier la pigmentation abdominale. ( A - F ) et ( A - F ) correspondent à différents spécimens et montrent comment l 'analyse porte sur des images de qualité différente. ( A ) L'utilisateur définit d'abord la ligne médiane de l'abdomen (ligne jaune), le bord antérieur du tergite (ligne cyan) et une ligne légèrement postérieure au bord postérieur de la bande de pigment (ligne magenta). La macro ImageJ tire ensuite une ligne du point médian des lignes antérieures et postérieures (ligne pointillée), qui s'élargit pour former un ROI (boîte noire), agrandi en ( B ). ( C ) ImageJ macro puis exTraite la valeur moyenne des pixels le long de l'axe antérieur-postérieur du ROI. Notez qu'à ce stade, le profil est lu de postérieur à antérieur. ( D - E ) La macro R convertit les valeurs moyennes des pixels en une valeur de pigmentation, renverse la direction du profil de pigmentation, correspond à une spline cubique ( S (x) ) ( D ) et calcule la première ( S (x ) ) ( E ) et seconde ( S (x) ) dérivée de la spline ( F ). Le script identifie alors: T 3 , la position de la pigmentation maximale, où S (x) transite de <0 à> 0, se déplaçant vers l'avant à partir de la partie postérieure de la cannelure; T 2 , le positionnement où le déclin de la pigmentation est le plus grand et S (x) est maximal; Et T 1 , la position où la pigmentation du tergite est à son minimum et S (x) transitions de> 0 à <0, en mouvement antérieur fRom T 2 ,. La partie antérieure du tergite visible de manière fiable (antérieure de la cuticule a2) est définie par l'utilisateur. (AF) Dans le cas où la première dérivée ne peut pas être utilisée pour trouver T 1 , généralement parce que S (x) ne se croise pas antérieurement à la bande de pigments, le script définira T 1 comme la position où S (x) transite de> 0 à <0 lors du déplacement antérieur de T 2 . Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

figure 3
Figure 3: L'effet de la température sur différents aspects de la pigmentation abdominale chez la femelle D. melanogaster . ( A ) Largeur de la bande de pigments ( bande W , FIgure 1). ( B ) Bande de pigment en proportion du tergite ( bande R ). ( C ) Maximum ( P max , lignes supérieures) et minimum ( P min , lignes inférieures) pigmentation. ( D ) Largeur du tergite ( W tergite ). Les points sont les moyens les moins carrés des modèles à effet mixte linéaire (tableau 2). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard et peuvent être obscurcies par les marqueurs. La ligne noire est le troisième tergite abdominal. La ligne grise est le quatrième tergit abdominal. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4: Différences de pigmentation entre les troisième et quatrième tergites abdominales. Ceci est montré dans ( A ébène 1 , ( B ) femelles de type sauvage, ( C ) mâles de type sauvage et cinquième et sixième tergites abdominales chez les femelles de type sauvage. ( D ) Pigmentation maximale, P max . ( E) Pigmentation minimale, P min . ( F ) Largeur de la bande de pigments, bande W. ( G ) Largeur relative de la bande de pigments, bande R. Les barres avec différentes lettres sont significativement différentes (Tukey HSD post-hoc test, P <0,05). N = 6 pour tous, sauf l'ébène 1 , où N = 4. Barres d'échelle = 200 μm ( A - C ). Les barres d'erreur représentent l'erreur standard. Le contraste de toutes les images a été ajusté pour mettre en évidence le motif de pigmentation, et les images sont illustratives. CliCk ici pour voir une version plus grande de cette figure.

<Td> 4,08 (78%)
Comparaison de modèles Variance Composants (% du total)
Traitement de pigmentation maquette Df Log-vraisemblance Équation (%) Équation (%) Équation (%)
P max Non corrigé M ij = A i + ε ij 3 -678.28 1,94 (14%) 11,86 (86%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -457.95 440,66 *** 4,08 (26%) 10,71 (67%) 1,14 (7%)
P min Non corrigé M ij = A i + ε ij 3 -875.03 6,05 (9%) 59,39 (91%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -664.58 420,91 *** 16,67 (22%) 53,08 (70%) 6,31 (8%)
P max Correction M ij = A i + ε ij 3 -445,05 1,15 (22%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -444,88 0.3378 4,08 (78%) 0,01 (<1%) 1,14 (22%)
P min corrigé M ij = A i + ε ij 3 -649.9 16,67 (73%) 6,24 (27%)
M ijk = S i + A j + ε ijk 4 -649.9 0 16,67 (73%) 0 6,31 (27%)

Tableau 1: Modèles à effet mixte linéaire de l'effet du tergite et de la session. Modèles à effet mixte linéaire de l'effet du tergite et de la session sur unPigmentation bdominal ( P max et P min ) de 50 tergites ré-mesurées au cours de cinq séances, avec des composants de variance estimés à travers REML. Les modèles étaient des modèles à effet mixte linéaire. M : mesure de pigmentation; A : Tergite individuel mesuré; S : Session; Ε : erreur résiduelle. Les X² significatifs sont indiqués en caractères gras. * P <0,05. ** p <0,01. *** p <0,001.

Trait Température Terger Température
X Tergite
P max F -ratio 8.14 55,59 6.6
P 0,002 <0,001
P min F -ratio 4.41 66,11 6.36
P 0,026 <0,001 0,002
Groupe W F -ratio 113,93 0,01 0,64
P <0,001 0.931 0,531
W tergite F -ratio 1,79 0,92 5.11
P 0.191 0,338 0,007
Bande R F -ratio 27,66 0,08 1,46
P <0,001 0,782 0,23

Tableau 2: Effet de la température et de l'identité du tergit. L'effet de la température et de l'identité du tergit Sur différents aspects de la pigmentation abdominale dans 50 tergites ré-mesurés au cours de cinq séances. Les modèles étaient des modèles à effet mixte linéaire, avec la volée individuelle incluse comme facteur aléatoire. P max : pigmentation maximale (corrigée); P min : pigmentation minimale (corrigée); Bande W : Largeur de la bande de pigments; W tergite : largeur du tergite; Bande R : Largeur relative de la bande de pigments. Les facteurs fixes importants sont indiqués en gras ( P < 0,05).

Intercepter Bande W Température Terger
17˚C 25˚C Troisième
P max Β 234,35 0,069 0,063 -1.178 -0.588
F 29,93 5.97 54,82
P <0,001 0,008 <0,001
P min Β 223,96 -0.137 3.931 -3,024 -1,54
F 19.33 Span = "2"> 9.66 62,02
P <0,001 0.001 <0,001

Tableau 3: Effet de la largeur de la bande de pigment, de la température et de l'identité du tergite au niveau de la pigmentation. Effet de la largeur de la bande de pigment, de la température et de l'identité du tergit sur le niveau de pigmentation dans 50 tergites ré-mesurés au cours de cinq séances. Les modèles étaient des modèles à effet mixte linéaire, avec la volée individuelle incluse comme facteur aléatoire. P max : pigmentation maximale (corrigée); P min : pigmentation minimale (corrigée); Bande W: Largeur de la bande de pigments; Bande R: Largeur relative de la bande de pigments.

Fichier supplémentaire 1. Complément d'information.Y_Information.pdf "target =" _ blank "> Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2. Analyse du script Pigmentation.R. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3. Mesure de Pigmentation.ijm Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

Simulation R Script. Cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

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Cette méthodologie permet l'acquisition précise, rapide et répétable de données de pigmentation sous une forme quantitative adaptée aux multiples analyses en aval. La méthode a été utilisée pour acquérir des données sur l'effet de la température sur la pigmentation abdominale dans une ligne isogénique de mouches. Cependant, la méthodologie pourrait être utilisée dans les études de génétique directe pour identifier les gènes qui sous-tendent les différences de pigmentation entre les individus, les populations ou les espèces, ou des études génétiques inverses pour explorer les effets de gènes spécifiques sur les modèles de pigmentation. Bien que, comme on l'a vu plus haut, il y a eu une myriade d'études qui ont exploré le développement et l'évolution de la pigmentation de D. melanogaster, la précision avec laquelle cette méthodologie capte les données de pigmentation sous une forme quantitative permet des approches statistiques plus puissantes. Cela permet aux chercheurs d'utiliser moins d'échantillons lors de l'analyse des modèles de pigmentation, ou leur permet d'élucider plus subtilAspects de la pigmentation. En outre, cette méthode ne nécessite pas la dissection de la mouche, ce qui permet à l'échantillon d'être utilisé ultérieurement pour des analyses supplémentaires, telles que les mesures morphologiques ou le génotypage. En effet, la méthodologie pourrait être utilisée sur des mouches anesthésiées, qui pourraient ensuite être élevées sélectivement en fonction de leurs caractéristiques de pigmentation.

Un problème potentiel avec la mesure de la pigmentation par l'analyse d'image est que les valeurs de pigmentation peuvent refléter les conditions d'exposition et d'éclairage sous lesquelles une image a été prise plutôt que le niveau de pigmentation elle-même. Tout en utilisant des niveaux d'éclairage fixes, les positions de lumière, le grossissement et l'exposition contribuent à atténuer ces problèmes, il est probable qu'il faudra encore prendre plusieurs images de contrôle de répétition dans chaque session pour contrôler complètement les effets de session. Cette méthode comprend la ré-imagerie de quinze spécimens de contrôle de chaque session et l'utilisation des modifications entre les sessions de P maX et P min pour détecter et éliminer les effets de session. Cependant, le nombre précis de spécimens de contrôle qui devraient être ré-imagés dépendra du matériel d'imagerie et du logiciel utilisés, de l'aspect de la pigmentation d'intérêt pour l'utilisateur et de la différence entre les traitements et le nombre d'images prises dans chaque session. La réalisation d'une expérience préliminaire dans laquelle les mêmes spécimens sont ré-imagés sur cinq sessions permettra à l'utilisateur de calculer la variance due aux effets de la session, la variance due à l'identité de l'échantillon et la variance résiduelle (qui est une estimation de l'erreur de mesure après correction Pour les effets de session) ( tableau 1 ). Ces valeurs peuvent alors être utilisées pour estimer le nombre d'images de contrôle qui doivent être prises dans chaque session pour détecter et contrôler les effets de la session. Un script R simple a été écrit et utilise les données d'une telle expérience préliminaire pour simuler des mesures de pigmentation à travers les sessions. Ça peut être utiliséPour vérifier que le nombre d'images de contrôle par session est suffisant pour supprimer les effets de la session. Ce script est fourni sous forme de fichier supplémentaire.

Si les utilisateurs s'inquiètent des facteurs nuisibles au sein des sessions, ils peuvent également réimporter le même échantillon plusieurs fois tout au long de la session, comme décrit dans John et al., 2016 41 . Dans ce cas, [sampleID] pour l'échantillon de contrôle unique doit être changé chaque fois qu'il est ré-imagé dans une session ( p. Ex. , Control1, control2, control3, etc. ); Sinon, le logiciel d'imagerie remplacera l'image précédente par la nouvelle image du même nom. La fonction de correction fonde sa correction sur les images en double avec le même [sampleID] entre les sessions temporellement adjacentes et corrige, si le même spécimen est reproduit à plusieurs reprises au sein et entre les sessions ou si le même ensemble de spécimens de contrôle est imagé entre les sessions. Indépendamment de la façon dontLes images de contrôle électronique sont prises, les sessions doivent être traitées comme des blocs et, dans la mesure du possible, les utilisateurs devraient utiliser une conception de bloc aléatoire afin que tous les effets de la session qui restent après la correction puissent être contrôlés statistiquement. À défaut, les spécimens doivent être assignés au hasard aux sessions afin que les effets de session ne soient pas confondus avec des facteurs expérimentaux.

Le protocole repose sur la génération d'un profil de pigmentation qui représente le changement de pigmentation sur chaque tergite. Un problème avec la génération de ce profil est les cheveux noirs qui couvrent la cuticule abdominale, qui sont invariablement divisées en deux par une ligne antérieure-postérieure qui traverse le tergit. Le protocole réduit le bruit généré par ces cheveux en prenant le profil de pigmentation en moyenne sur une bande de cuticule. Néanmoins, les utilisateurs peuvent définir la largeur du ROI à 1 pixel à l'étape 5.6 s'ils souhaitent générer des profils basés sur une fine ligne de cuticule. En outre, les utilisateurs peuvent analyser tLa même image à plusieurs reprises, changeant la position latérale du profil de pigmentation pour capturer des changements dans la largeur de la bande de pigment dans un segment. Dans ce cas, cependant, les utilisateurs devront copier la même image plusieurs fois et donner à chaque copie un nom unique avant de mener l'étape 5.1, car la macro ImageJ remplacera les profils du même nom.

Une deuxième considération importante lors de la génération du profil de pigmentation est le paramètre de lissage de la spline cubique, défini dans la fonction spline.der.er (L63) dans le script Analysis of Pigmentation R. Le paramètre de lissage approprié dépend de la configuration et de la résolution de l'imagerie. Le sur-lissage d'un profil peut entraîner une perte des caractéristiques du profil spline utilisé pour calculer les coordonnées de T 1 , T 2 et T 3 ( Figure 2D et 2D '). À l'inverse, le sous-lissage augmenteLe bruit du profil et par conséquent la précision des extractions de coordonnées. La fonction chek produit un résumé graphique de la spline et ses dérivées et peut être utilisé comme repère visuel pour choisir un paramètre de lissage approprié.

La méthodologie décrite ici se concentre sur la capture de données sur la pigmentation des troisième et quatrième tergites abdominales chez les femmes et les hommes D. melanogaster . Cependant, les résultats représentatifs indiquent qu'il peut également être utilisé pour mesurer la pigmentation des cinquième et sixième segments abdominaux des femelles. En outre, la méthodologie peut détecter les différences de phénotype causées par les mutants des gènes qui affectent la pigmentation. Les scripts ImageJ macro et R peuvent facilement être modifiés pour mesurer la pigmentation dans les abdomens de différentes espèces de D. melanogaster , ou même la pigmentation d'autres parties du corps dans d'autres taxons, à condition que le motif de pigmentation soit stéréotypé. Enfin, la méthodologiePourrait également être adapté pour mesurer les aspects de la couleur de pigmentation en capturant des images en RVB et en analysant chaque canal séparément.

En général, cette méthodologie fait partie du domaine émergent des phénomènes 51 , 52 . L'objectif des phénomènes est de générer et d'analyser de grands ensembles de données phénotypiques multidimensionnels afin de mieux comprendre les interactions génétiques et environnementales qui influencent le phénotype, y compris la maladie, et la manière dont ces interactions évoluent pour générer la diversité biologique. Pour que les phénomènes atteignent leur potentiel, cependant, les méthodologies d'acquisition de données phénotypiques doivent être simples et facilement adaptées à différents phénotypes, ainsi que disponibles gratuitement. En utilisant un logiciel open source pour analyser les images capturées à l'aide d'un équipement standard, cette méthodologie permet d'atteindre cet objectif.

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Disclosures

Les auteurs n'ont rien à dévoiler.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par la National Science Foundation octroie à AWS IOS-1256565 et IOS-1557638. Nous remercions Patricia Wittkopp et trois critiques anonymes pour leurs commentaires utiles sur une version antérieure de cet article.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

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References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20, (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282, (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200, (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25, (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18, (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124, (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124, (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126, (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408, (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134, (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100, (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59, (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168, (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11, (5), e1005163 (2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55, (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31, (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130, (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106, (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16, (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2, (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243, (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124, (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125, (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129, (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1, (5), e63 (2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3, (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3, (2), e30 (2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30, (2), 181 (1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67, (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19, (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54, (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92, (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163, (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326, (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6, (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106, (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326, (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1, (2), e10 (2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67, (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276, (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44, (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11, (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63, (6), 464-471 (2013).
Quantifier la pigmentation abdominale dans<em&gt; Drosophila melanogaster</em
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Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).More

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

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