Summary
この研究は、デジタル画像解析を用いてショウジョウバエの腹部色素沈着を迅速かつ正確に定量化する方法を提示する。この方法は、表現型の取得とデータ解析との間の手順を合理化し、標本のマウント、画像取得、画素値抽出、形質測定を含む。
Abstract
色素沈着は形態学的に単純であるが、しばしば適応性のある特徴を有する非常に可変性の形質である。それは、形態学的表現型の発達および進化を理解するためのモデルとして広範に役立ってきた。 Drosophila melanogasterの腹部色素沈着は特に有用であり、研究者は形態間および体内特異的変異の根底にある遺伝子座を同定することができます。しかしながら、 D.メラノガスターの腹部色素沈着は、色素沈着データに適用され得る統計学的分析の形態を制限する定量的ではなく、スコアリングによって定性的に大部分検定されてきた。この研究は、成人D. melanogasterの腹部色素沈着パターンの様々な局面の定量化を可能にする新しい方法論を記述している。このプロトコールは、標本のマウント、画像キャプチャ、データ抽出、および分析を含む。画像の取り込みと解析に使用されるすべてのソフトウェアは、マクロオープンソースの画像解析用に書かれています。このアプローチの利点は、異なるイメージングシステムにわたって再現性の高い方法論を使用して、色素沈着特性を正確に測定する能力である。この技術は、成虫のメラノガスターの褐色色素沈着パターンの変動を測定するために使用されてきたが、この方法論は柔軟性があり、無数の異なる生物における色素沈着パターンに広く適用可能である。
Introduction
色素沈着は、種、個体群、個体間、さらには個体群1,2,3,4,5,6において、個体間でさえ莫大な表現型の変化を示す 。多種多様な動物で色素沈着に関する研究が数多く行われていますが、色素沈着を調節する発達的および生理学的機序を解明するために分子遺伝学の完全な力が使用され、これらのメカニズムがどのように進化するかについて、Drosophila melanogaster 、 6 。 D.メラノガスター（melanogaster）7,8の生化学的合成を制御する遺伝子、および時間的および空間的なディーを制御する遺伝子については、多くのことが知られているこの生合成のストリエーション9,10,11,12,13。さらに、遺伝的マッピングは、 D.メラノガスター（ Melanogaster）14,15,16,17において色素沈着における細胞内および細胞間の相違の根底にある遺伝子座を同定した。行動18,19および免疫19,20などの色素沈着と多面発現形質との間の関係も、色素沈着パターン15,21,22の適応的意義を有するように探究されている。したがって、 D.メラノガスターの色素沈着は、強力でしかも単純なm複雑な表現型の発達と進化のためのodel。
成人の色素沈着D.メラノガスターは、特に翼と背側の胸部と腹部の体のメラニン化パターンが特徴です。しかし、最も研究の注目を集めているのは背側腹部の各クチクラ板（tergite）の色素沈着である。遺伝的な17,23および環境的な24,25の両方の要因のために、この色素沈着にはかなりの変動がある（ 図 1A〜F）。腹部硬質のクチクラは、前部および後部の発生区画（ 図1G ）で構成され、それぞれが色素沈着および装飾に基づいてさらに細分化することができる26 。前部区画は、6つのクチクラ（a1-a6）を含み、後区画は3つ（p1-p3）を含む（ 図1G ）。これらのうち、p1、p2、およびa1キューティクルは、典型的には、引き伸ばされていない腹部のターガイトの下に折りたたまれ、隠される。確実に目に見えるキューティクルは、キューティクルタイプa4（中程度の剛毛を有する毛状）およびa5（毛状の毛状）からなる「色素バンド」と呼ばれる重い色素沈着のバンドによって特徴付けられ、バンドの後端前縁よりも強く色素沈着した（ 図1G ）。このバンドの前部は、明るく着色した毛状のキューティクルの領域であり、後部に（a3）剛毛があり、前部にはa2ではない。ハエ間の色素沈着の変動は、色素沈着の強度および色素バンドの幅の両方で観察される。一般に、変動は、最も後部のセグメント（腹部セグメント5,6,7）において最も大きく、より前方のセグメント（腹部セグメント3および4項） 24 。さらに、 D. melanogasterの色素沈着に性的な二型性があり、男性は一般的に全身に5番目と6番目の腹部を着色しています（ 図4C ）。
D.メラノガスターの腹部色素沈着に関する大部分の研究では、色素沈着は、質的に27,28,29または半定量的に14,15,16,17,24,30の尺度で測定されたパターンを有する、類型的または序数的形質として扱われている、 31,32,33,34,35、 36,37 。これらの方法は、必然的に精度の欠如に悩まされており、色素沈着の主観評価に依存しているため、研究を通してデータを比較することは困難である。いくつかの著者は、色素沈着の空間的な大きさ38,39 、特定のキューティクルタイプの色素沈着の強度23,25,39,40、または腹部テルグタイト全体の色素沈着の平均強度を全体として41,42,43として定量化した。それにもかかわらず、これらの定量方法は、腹部色素沈着の強度および空間分布の両方を同時に測定するものではなく、従って、色素沈着がabd全体でどのように変化するかのニュアンス最終的なtergite。さらに、これらの定量化方法38,41,42,43のいくつかは、腹部キューティクルの解剖および装着を必要とする。これは時間がかかり、サンプルを破壊し、追加の形態学的解析に利用できなくなる。腹部色素沈着の発達および進展の理解が深まるにつれて、空間分布および色素沈着の強度の両方を迅速かつ正確に測定するより洗練されたツールが必要となる。
この方法の全体的な目標は、 D. melanogasterにおける腹部色素沈着の複製可能かつより正確な測定値を得るためにデジタル画像分析を利用することである。方法論は3つの段階を含む。まず、大人のフライは非破壊的に装着され、背面の腹部のデジタル画像が撮影されます。次に、ImageJマクロを使用して、ユーザー第3および第4の腹部セグメントの両方においてa2キューティクルの前部からa5キューティクルの後部（緑色のボックス、 図1G ）まで延在するピクセルの前 - 後部ストリップを画定する。次いで、このストリップの幅にわたる平均ピクセル値がその長軸に沿って抽出され、それがターゲットの前部から後部に変化する際の色素沈着の空間分布および強度を捕捉するプロファイルを生成する。第3に、Rスクリプトを使用して、三次スプラインを使用して数学的に色素沈着プロファイルを記述する。 Rスクリプトはスプラインとその1次微分と2次微分を使用してa2-a5キューティクルの幅、色素バンドの幅、色素沈着の最大レベルと最小レベルを抽出します。従って、本方法は、空間的特性と腹部色素沈着の深さの両方を定量化する。
この方法論は、第3および第4の腹部胸部の色素沈着を定量化し、排他的に、またはより多くの後部ヘルニアと組み合わせて、多数の先行研究1、15、23、24、25、28、33、39、42の焦点であった。第5および第6腹部テルゲイトよりも変化は少ないが、第3および第4テルゲイトは男性において完全に色素沈着していないので、このプロトコルは男性および女性の両方に適用することができる。それにもかかわらず、ここに示すように、プロトコルは、女性の第5および第6腹部腸内細菌の色素沈着を測定するために使用することができる。さらに、色素沈着プロフィールの特徴を抽出するために使用されるスクリプトのわずかな変更は、この方法を使用して、多種多様な色素沈着における変化を定量化することを可能にすべきである生物。
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Protocol
1.試料の取り付け
注：イメージングの前に、死んだハエを水中の70％エタノールに保存する。
- 60 mm×15 mmのペトリ皿に沸騰した水に溶解した1.25％寒天10 mLを注ぎ、セットします。
- 解剖顕微鏡の下で、細い鉗子のペアを使用して、ゲルの表面に〜20mm、幅2mm、深さ1mmの溝を作る。細かい鉗子を使用して、フライの背側がゲルの上に突き出た状態で、大人のフライの腹側を溝に埋め込む。
注記：ゲルの緩みにより、試料を損傷することなく簡単に再配置できます。同じ溝を複数の試験片に使用することはできますが、時間がたつにつれて汚れ、破損、および使用不能になります。ユーザーは同じゲルに別の溝を作ることができます。各プレートは〜200枚のハエをイメージングするために使用できます。 - ワックス状キューティクルからの光の反射を減らし、羽のダメージを防ぐために、水中の70％エタノールで標本を完全に覆う検体操作を行う。
2.顕微鏡セットアップ
注：画像は、画像取得制御ソフトウェアを実行しているコンピュータに取り付けられた解剖スコープ、透過光ベース、デジタルカメラ、およびグースネックコールド光源を使用して取得されます。ソフトウェアの説明は、ImageJ 45を組み込んだオープンソースソフトウェアであるMicro-Manager v1.4.20 44に固有のものです。
- 顕微鏡、デジタルカメラ、ダブルグースネックコールド光源、コンピュータの電源を入れます。
- イメージキャプチャソフトウェアを実行して、Micro-ManagerウィンドウとImageJウィンドウを開きます。 ImageJウィンドウで、「イメージ」>「タイプ」>「8ビット」をクリックして、すべてのイメージを8ビットとして設定します。マイクロマネージャウィンドウで「ライブ」をクリックすると、カメラからのリアルタイムプレビューを示す「スナップ/ライブ」ウィンドウが開きます。
- 「スナップ/ライブ」ウィンドウのサイズを最大にするセサリー。 Micro-Managerウィンドウの "Contrast"タブのプルダウン "Display mode"メニューで "Grayscale"を選択します。
- 冷たい光源を最大強度まで点灯させ、各グースネックの先端をステージから約120mmの位置に配置します.1つは左に、もう1つは右に配置します。
注：ユーザーは環状イルミネータを使用することもできますが、これはフライ腹の周りに反射光のリングを生成する可能性があります。 - 手動で顕微鏡倍率を60倍に設定し、視野がステージの直径約3 mmの領域をキャプチャするようにします。
- ステージ上に2 mmのステージマイクロメーターを置きます（必要に応じてバックグラウンドを白に切り替えます）。ライブプレビューを見ながら、ステージのマイクロメーターに焦点を当て、「露出」ボックスに露出時間をmsで入力してMicro-Managerウィンドウで露出を調整します。
- カメラを空間的に較正するには、tの "直線"ツールを選択します彼はImageJウィンドウとステージのマイクロメーターの長さを描く。 ImageJウィンドウで "Analyze"> "Set Scale"をクリックして "Set Scale"ウィンドウを開き、 "Known distance"ボックスにマイクロメートルの長さをμmで入力し、 "Unit of length"ボックス。
- "Set Scale"ウィンドウが "pixels /μm"でスケールを表示することを確認してください。スケールを書き留めて、[OK]をクリックします。
- 「スナップ/ライブ」ウィンドウで、「停止」をクリックし、「スナップ」をクリックしてステージマイクロメーターの画像をキャプチャします。
- 必要に応じてイメージを空間的に再キャリブレーションできるように、イメージを8ビットのグレースケールTIFFとして保存します。 ImageJウィンドウで「ファイル」>「名前を付けて保存」>「Tiff ...」をクリックします。ファイルブラウザでファイルを保存する場所を指定し、ファイルに名前を付けて「保存」をクリックします。
- ステージを黒と場所に切り替えるステージ上の寒天（ステップ1.1-1.2）にマウントされたフライを保持するペトリ皿。
- 顕微鏡を見て、色素のパターンを最もよく見るために、背中の正中線がまっすぐになるようにフライを配置します。腹部の眺めが妨げられないように、翼と付属器を動かしてください。色素沈着したキューティクル（a2-a5）が見えない場合は、腹部を横に絞ってください（ただし、通常は必要ないように、水中で70％エタノールに保存されたハエの腹部が伸びます）。
注：フライの位置を決めるとき、ユーザーは低倍率（20倍）を使用する必要があります。続行する前に倍率を60Xに戻す必要があります。 - 手動で背の背部の腹部に焦点を当てる。背側腹部の影や反射を最小限に抑えるために、光源の先端を手動で調整します。
- コンピュータ画面でライブプレビューを見ながら、Micro-Managerウィンドウの "Contrast"タブのピクセル値ヒストグラムを使って、プレビュー画像のピクセル値の範囲を最大にするには、手順2.4で説明したように露出を調整します。
- フライとペトリ皿を取り外し、フライと同じ位置で視野を中心とする電圧計に接続されたLED（分光出力430-660 nm）で置き換えます。 LEDと電圧計を測光計46として使用し、LEDに当たる光（〜125 mV）によって生成された電圧を記録します。
注記：LEDと電圧計は、1回の実験で複数のイメージングセッションにわたって光レベルが一定であることを保証するために使用されます。 - 実験期間中は、光源の位置や強度、顕微鏡の倍率、カメラの露出をさらに変更しないでください。
3.標本イメージング
- 黒い顕微鏡ステージ上に寒天（ステップ1.1~1.3）にマウントされたフライを保持してペトリ皿を置きます。フライの位置を調整して、3番目と4番目のステップ2.9に記載されているように、腹部セグメントが見え、背中線はまっすぐ上がっている。続行する前に倍率が60倍になっていることを確認してください。
- 3番目と4番目の背側腹部が合焦するように手動で顕微鏡に焦点を合わせます。ステップ2.6で説明したように、画像キャプチャソフトウェアを使用して、8ビットのグレースケールTIFFとして画像を取得します。
注記：画像をカラーでキャプチャし、その後、分析のためにグレースケールに変換することができます。 - 手順2.7で説明したように、イメージを "SESH000_sampleID.tiff"として保存します。
注：ここでは[SESH]は定数、[000]はセッション番号で変数は可変ですが3桁の長さでなければなりません。[sampleID]はユーザーの希望どおりですが、アンダースコア（_）一定の長さでなければならない。 [sampleID]には、色素沈着データ（温度や系統など）の分析に使用される因子の詳細が含まれていなければならず、特徴的な非アルファベットハイフン（ - ）などの大文字で始まります。これにより、標準統計ソフトウェアを使用して[sampleID]からこれらの要素を簡単に解析することができます。 - ステージからペトリ皿を取り出し、フライを次の標本と交換する。照明レベル、倍率、または露出をさらに調整することなく、すべての標本が画像化されるまで、ステップ3.1-3.3を繰り返します。
4.複数のセッションにわたるイメージング
- 複数のセッションにまたがって画像を取得する必要がある場合は、セッション間で光の強さ、露出、および倍率を維持します。各セッションの開始時に、カメラの空間較正（ステップ2.4）とステージでの光強度（LED /電圧メーターで測定される、ステップ2.12）を確認します。
- 必要に応じて、画像を空間的に較正する能力を確実にするために、ステージマイクロメーター（ステップ2.5-2.7）の画像をキャプチャーして保存します。
- 少なくとも15個のコントロール検体を使用し、各セッションでそれらを無作為に再イメージしてwを使用してセッション効果の検出と排除を行います。セッション間の重複対照検体が同じ[sampleID]であるが[SESH000]が異なることを確認する。
注：対照標本は、採取し、保存し、実験標本と同一にマウントしたハエであるが、複数のセッションにわたって再撮像する。コントロール標本の正確な数は、ユーザーの実験設定に依存します。詳細は、ディスカッションを参照してください。
5.画像解析
注：画像解析はImageJ 45で行われ、 "Pigmentation.ijmの測定"マクロが補足ファイルとして提供されます。
- 分析するすべての画像を同じフォルダに置きます。
- ImageJを起動し、 "Plugins"> "Macro"> "Run"をクリックし、ファイルブラウザーで "Pigmentation.ijmの測定"を選択して "開いた。"
注：以降のすべての手順はマクロ内にあります。各ステップは個々のマクロコマンドです。 - 「アクションが必要です」ダイアログボックスが開き、「画像が保存されているフォルダを選択してください」というメッセージが表示されます。 [OK]をクリックし、ファイルブラウザを使用して画像が保存されているフォルダを選択し、[選択]をクリックします。
- 「アクションが必要です」ダイアログボックスが開き、「データを保存するフォルダを選択してください」というメッセージが表示されます。 「OK」をクリックし、ファイルブラウザを使用して、色素沈着プロファイルを保存するためのフォルダを選択します。 「選択」をクリックします。
- ダイアログボックスが開き、「サンプルIDの文字数は何文字ですか？」と尋ねられます。データ入力ボックスに、ステップ3.3で指定した[SampleID]の文字数を入力し、[OK]をクリックします。
- ダイアログボックスが開き、「ROIはどのくらいですか」と尋ねます。データ入力ボックスに、前景画像のピクセル幅を入力します。（ 図1G 、 図2A 、および2A 'の緑色の矩形）を読み取るべきである。 [OK]をクリックします。デフォルトは20ピクセルです。
注：色素沈着プロファイルは、髪や髪の毛によるノイズを減らすために、ラインではなくキューティクルのストリップ全体にわたって読み取られます。このストリップの幅は画像の解像度に依存しますが、それは腹部の幅の約1/20である必要があります（ピクセル単位）。 - マクロは最初のフライの画像を開き、現在のフライを測定するか（「はい」をクリックするか）、次のフライに進むか（「いいえ」をクリックするか）、またはマクロ（「キャンセル」をクリック）。
- 「ANTERIORからPOSTERIORまで背側腹部の中線を定義する」というダイアログボックスが開きます。 「直線」ツールはすでに選択されています。前方から後方へ線を引く背側腹部の中線を定義する。 [OK]をクリックします。 図2Aおよび2A '、黄色の線を参照されたい。
注：これは、背面の正中線が画面上で水平に横たわるように画像の向きを変更するために使用され、左に前側が続き、後続のステップがより簡単になります。 - Tergite 4のPOSTERIORエッジをピグメントバンドのすぐ後ろに定義するダイアログボックスが開きます。 「直線」ツールはすでに選択されています。線の中心（白い四角でマークされている）が色素帯（クチクラa5）の後端にちょうど後方に位置するように、後中線の端から右の端に線を引く。 [OK]をクリックします。マゼンタの図2Aおよび2A 'を参照のこと。
注： Rスクリプトは、色素沈着プロファイルから色素バンドの後端を自動的に検出します。 - なお、ダイアログ「着色されたキューティクル（a2）の前縁にTergite 4のANTERIORエッジを定義する」というボックスが開きます。 「直線」ツールはすでに選択されています。ラインの中心（白い四角でマークされています）が着色されたキューティクル（キューティクルa2）の前縁にくるように、前中線エッジから右横エッジまで線を描きます。 [OK]をクリックします。シアンラインの図2Aおよび図2A 'を参照。
注： Rスクリプトは、この点をターガイトの着色キューティクルの前縁として定義します。画像上で、マクロは色素沈着プロファイルが読み取られる関心領域（ROI）を示す（緑色の矩形、 図2Aおよび2A '、 図2Bおよび2B 'に拡大）。マクロはまた、ROIの色素沈着プロファイルを示す第2のウィンドウを開く（ Figur e 2Cおよび2C '）であり、x軸はプロファイルの後端からのピクセル数で表される位置であり、y軸は各位置での平均ピクセル値である。 - マクロによって開かれる色素沈着プロファイルのプロットを表示します。必要に応じて、プロファイルウィンドウで「ライブ」をクリックして、ROIの位置を調整し、色素沈着プロファイルに影響を与える構造（ 例えば、毛）を含まないようにします。プロファイルが満足のいくものになったら、「OK」をクリックします。
- Tergite 3の手順5.8-5.11を繰り返します。
注：マクロは、それぞれ、 "SESH000_samplename_TX_profile.csv"という名前の2つのCSVファイルとして色素沈着プロファイルをエクスポートします。ここで、[SESH000_samplename]はイメージ名で、[TX]は3番目および4番目のタスクのT3またはT4です。 - マクロが次のイメージを開くように注意します。すべての画像が解析されるまで、手順5.7-5.13を繰り返します。
注：すべてのデータ分析はR47で実施され、提供された「分析のPigmentation.R」スクリプトを使用します。下の "L ..."は、分析の各部分に対して実行するスクリプトの行を示します。分析の実施方法の詳細については、補足情報を参照してください。
- Rスクリプトを編集して作業ディレクトリ（L6）を設定し、.csvプロファイル（L11）を含むフォルダへのファイルパスを定義します。
- L13-15を実行して、プロファイルフォルダに格納されている色素沈着プロファイルのリストを生成する。
- プロファイルを単一のデータフレームに読み込むには、 "reader"と "addPrimaryKey"関数（L17-41）をロードして実行します。
- L43でスクリプトを編集し、ステップ2.5で決定した画像の空間較正をμm/ピクセル単位で指定します。
- 読み込んで実行する "adjusプロファイル位置（x軸、 図2Cおよび2C '）をROIのピクセルからROIの前縁まで変換するための「機能」（L46-58）およびピクセル値（0 =黒、255 =白）から色素沈着値（0 =色素なし、255 =最大色素）のプロファイル値（y軸、 図2Cおよび2C '）を示す。
- 「spline.der.er」関数（L60-71）をロードして実行すると、色素沈着プロファイルとその1階と2階微分の3次スプラインが生成されます（ 図2D -2Fと2D ' -2F '）。
- まず、色素バンドの後部（T 3 ）と前部（T 2 ）エッジの位置を抽出するために、 "coord"関数と "assmbly.coord"関数（L74-163）をロードして実行します（ 図2Dと2D ';）およびa2キューティクルの後端（T1、 図2Dおよび2D '）を使用して、それぞれT 3およびT 1で取られた最大（P max ）および最小（P min ）色素価を抽出する。
注：a2キューティクルの前縁は、ステップ5.9で既に定義されています。 - オプション：「chek」機能（L165-175）をロードして実行して、ランダムに選択された色素沈着プロファイルについて、「coord」機能がポジションT 1-3を正確に識別しているかどうかをチェックします。
- 「Session」、「Sample」、「Tergite」、「id」（SampleとTergiteの連結）、「P max 」という見出しを持つデータテーブルを生成するために、インデックスとメトリック関数（L178-193） 「P min 」、「W band 」（色素帯の幅= T3-T 2 ）、および「W tergite 」（色素cの幅uticles a2-a5、= T3）。
- セッションの影響により発生する迷惑な要因に対してP maxとP minを補正するデータテーブルを生成するために、「訂正」機能（L196-234）をロードして実行します。時間的に隣接するセッション間で再撮像された対照標本からのP maxまたはP minの平均増加（または減少）を用いる。
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Representative Results
プロトコルは、腹部の色素沈着に飼育温度の効果を探索するために使用された。これまでの研究では、発生温度の上昇は、ショウジョウバエのいくつかの種（ D. melanogaster 30,32を含む）における腹部色素沈着の拡散を減少させることを示している。具体的には、腹部3および4において、色素沈着の程度（色素バンドの幅）は17℃から25℃に低下し、25℃から28℃まで同じままである24,36。これらの研究は、1-10スケール（0：顔料バンドなし、完全に黄色のテルグライト、5：テルグライトの50％を占める、10：完全に暗色のテルゲライト）で色素沈着の程度を評価した。定量的方法論がこの表現型可塑性を捕捉できるかどうかを立証するために、色素沈着をth17℃（7フライ）、25℃（9フライ）、28℃（9フライ）で卵から成虫まで飼育された、表情的に野生型のハエのアイソジェニック系統の第3および第4腹部腹部。セッション効果によって導入された厄介な因子を除去する際の補正手順の有効性を判定するために、同じハエの色素沈着を1日、2日、4日および8日後に再撮像し、再測定した。しかし、照明条件およびセッション間の暴露は、矯正処置のためのセッション効果が確実に除去されるように意図的に変更された。画像はDryadデジタルリポジトリに掲載されています。
最初の質問は、セッション間の色素沈着尺度に系統的な違いがあったかどうかであった。これは、 R48のlme4パッケージを使用して、混合モデルM ijk = S i + A j +Sはセッション（ランダム効果）、 Aは測定されている腹部のtergite（ランダム効果）、 εは次のようになります。εijkとM ij = A j + εijはP max とP minの両方に対応します。残差（下付き文字は変数内のレベル）。対数尤度比検定を用いて、ランダム因子としてのセッションの包含が適合を有意に改善したかどうかを試験した。 （ 表1 ）。予想通り、（REML48を介して生成された）分散成分の検討は、セッション効果による変動がそれぞれP max およびP minにおける全分散の67％および70％を占めていることを示した（ 表1 ）。
無作為に選択された15匹のコントロール層（3番目または4番目、17℃、25℃、または28℃で赤色）を選択し、平均P maxおよびP minの変化を用いて、セッション中の残りのタルガイトの色素沈着尺度を補正した。矯正された色素沈着尺度の分析を繰り返すことにより、セッション効果（ 表1 ）がなくなり、セッション効果による総分散の割合がゼロに減少した。残留誤差は推定値であり、セッション効果が除去された後の測定誤差であり、それぞれP maxおよびP minについて22％および27％であった （ 表1 ）
次に、補正されたデータを用いて、色素沈着およびサイズの異なる局面に対する温度の影響を検出できるかどうかを判定した。混合モデルM ijkm = T i * D j + X k + εijkmをデータに適合させた。ここで、 T D >はtergite（3番目または4番目）、 Xは個別フライ（random factor）である。色素沈着と温度との関係は直線的ではないので、 Tは分類因子として扱われた。色素沈着の最大および最小レベル（ P max およびP min ）ならびに色素バンドおよびテルゲライト（ W バンドおよびW tergite ）の幅を試験した。色素バンド（ R バンド = W バンド / W ターガライト ）の相対幅に対する温度の影響も試験した。データは、色素バンドの絶対（W バンド ）幅および相対（ R バンド ）幅が17℃から25℃に減少したことを示した（Tukeyポストホック試験、すべてについてP <0.05）、25から有意に変化しなかった°C〜28°C（Tukeyポストホック試験、
ターゲイトの幅に対する温度の影響はより複雑であった。 D.メラノガスターでは、身体および器官のサイズは、温度49で非直線的に低下する。これまでの研究では、第5腹部のターゲットの幅が16.5℃から25℃に10％、25℃から29℃にさらに4％減少することが示唆されている50 。幅の有意な減少はなかったが第4腹部胸焼けは17℃〜25℃であり、第3および第4腹部腹部ともに幅が25℃から28℃に増加した（ 表2 、 図3D ）。腹部隆起の幅は本質的にユーザによって定義されるので（プロトコルのステップ5.9〜5.10）、現在の研究と以前の研究との間の格差は、 Rスクリプトが色素形成プロフィールからW tergiteを抽出する方法によるものではない。むしろ、それは、腹部セグメントが測定される方法、ハエの遺伝子型、および測定される腹部タリガイトの正確な態様における差異を反映し得る。
次の疑問は、方法論が既存の色素沈着評価を用いて収集されたデータに匹敵するデータを生成できるかどうかであった。これらの方法は、通常、観測者に各フライを主観的にフィンの1つに割り当てるように求める色素沈着の程度に基づく表現型クラスの数は15,30,32,33,34であり、したがって、色素バンドの幅を評価する観察者の能力に依存する。この客観的方法が主観的方法とどれだけよく比較されているかを調べるために、5人の観察者に、第4腹部テルグ石の色素バンドの幅に基づいて女性の腹部の画像を45点ランク付けするように求められた。この方法論を用いて測定された観察者間の平均順位は、 W バンドに基づく順位と比較された。主観的および客観的ランキング（ Supplementary Information.pdf補足 図1 ）、Spearmen's = 0.7342、 P <0.0001）の間には強い相関があった。
別の質問が提起されたImageJの線形測定ツールを使用して色素バンドの幅を手動で視覚的に測定する方法（視覚的方法）と比較して、色素沈着スプラインからW バンドを抽出するこの方法がどのように行われたかです。再び、2つの方法論を用いて収集されたデータ間に強い相関が見られた（Supplementary Information.pdf、OLS、 r 2 = 0.49 、P <0.0001）。計算方法は、「視覚」法よりも狭く、色素バンドを一貫して測定したが、回帰係数は1と有意に異ならなかった（ P> 0.05）。
最終的な質問は、この方法論が他の文脈における腹部色素沈着を測定するために使用できるかどうかであった。この方法論は、f maxのP max 、P min 、W band 、およびW tergiteを抽出することができた女性の場合は第5および第6の腹部、第3および第4の腹部の場合は男性であった（ 図4 ）。さらに、この方法は、体全体にわたるクチクラ色素沈着の増加および色素の前方のクチクラの色素沈着の特異的増加を示すエボニー （ e 1 ）のためのハエの突然変異体におけるP maxおよびP minの増加を定量化するために使用され得るバンド28 （ 図4 ）。
図1： D.メラノガスターの腹部色素沈着 。 （ A〜F ）3つの温度（17℃、25℃および28℃）で飼育された2つの遺伝子型の雌における腹部色素沈着の変動。 A3およびA4は第3および第4の腹部痛みテス、それぞれ。 （ G ）背部の腹部腸骨瘤は、前部および後部区画を含み、その一部のみが伸張していない腹部において確実に目視可能である。区画はさらに別個のキューティクルタイプに細分される：a1：着色されていない、毛がない。 a2：薄く着色し毛髪。 a3：軽く着色した毛、毛、中程度の毛。 a4：濃い色、毛、中程度の毛。 a5：濃く着色し、毛髪、および大毛; a6：着色していない毛髪。 p3：色素なしおよび毛髪; p2：着色しておらず、髪の毛もない。 p1：着色されておらず、テッセレーションされている。ピグメントバンドはキューティクルa4とa5で構成されています。着色されたキューティクル（a2-a5、緑色のボックス）のみが分析に使用されます。スケールバー=200μm（AF）。すべての画像のコントラストを調整して色素沈着パターンを強調し、画像は例示的なものです。代表的な結果を生成するために使用される未調整の画像は、Dryadデジタルリポジトリに格納されます。.com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2：腹部色素沈着を定量化するための画像およびデータ分析。 （ A - F ）と（ A - F ）は異なる標本に対するものであり、異なる品質の画像を分析する方法を示しています。 （ A ）ユーザは、まず、腹部の中心線（黄色の線）、母斑の前縁（シアンの線）、および色素帯の後端の少し後ろの線（マゼンタ線）を定義する。 ImageJマクロは、前と後ろの線の中点（白い破線）から線を引いて、拡大してROI（黒いボックス）を形成し、（ B ）で拡大します。 （ C ）ImageJマクロ、exROIの前後軸に沿った平均画素値をトラッキングする。この段階で、プロファイルは、後方から前方に読み取られることに留意されたい。 （ D - E ） Rマクロは平均ピクセル値を色素価に変換し、色素沈着プロファイルの方向を逆転させ、3次スプライン（ S（x） ）（ D ）でフィットさせ、 ） ）（ E ）およびスプライン（ F ）の第2の（ S（x） ）微分である。次に、 S（x）が<0から> 0に遷移し、スプラインの後部から前方に移動する最大色素沈着の位置T 3 、 T 2 、色素沈着の減少が最大であり、 S（x）が最大である位置; tergite色素沈着が最小であり、 S（x）が> 0から<0に遷移する位置であるT 1 、前方に移動するfROM T 2 、。確実に目に見えるtergite（キューティクルa2の前）の前面は、ユーザによって定義される。 （AF） S（x）が色素帯の前方に0を横切らないために、1次微分がT 1を見つけるのに使用できない場合、スクリプトはS（x）が> T 2から前方へ移動するときは0から<0である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：メスのメラノガスターにおける腹部色素沈着の異なる局面に対する温度の影響 。 （ A ）色素バンドの幅（ W バンド 、 F図1）。 （ B ）テルゲイト（ R バンド ）の割合としての顔料バンド。 （ C ）最大（ P max 、上部ライン）および最小（ P min 、下部ライン）色素沈着。 （ D ）ターゲイトの幅（ W tergite ）。ポイントは線形混合効果モデルからの最小二乗平均である（表2）。エラーバーは標準誤差を表し、マーカーによって隠されることがあります。黒い線は第3の腹部テルグ石である。灰色の線は第4の腹部灰白色である。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図4：第3および第4の腹部胸部間の色素沈着の差。これは（ A エボニー1雌、（ B ）野生型雌、（ C ）野生型雄、および野生型雌における第5および第6腹部テルゲイトを含む。 （ D ）最大色素沈着、 P max 。 （ E）最小色素沈着、 P min 。 （ F ）色素バンドの幅、 W バンド 。 （ G ）色素バンドの相対幅、 R バンド 。異なる文字のバーは大きく異なる（Tukey HSD post-hoc試験、 P <0.05）。エボニー1以外のすべてについてN = 6、ここでN = 4（ A〜C ）のスケールバー=200μm。エラーバーは標準エラーを表します。すべての画像のコントラストを調整して色素沈着パターンを強調し、画像は例示的なものです。 してくださいこの図のより大きなバージョンを表示するにはここをクリックしてください。
| モデル比較 | 分散コンポーネント（合計の％） | ||||||
| 色素沈着特性 | モデル | df | 対数尤度 | X² |  （％） |  （％） |  （％） |
| P max未補正 | M ij = A i + εij | 3 | -678.28 | 1.94（14％） | 11.86（86％） | ||
| M ijk = S i + A j + εijk | 4 | -457.95 | 440.66 *** | 4.08（26％） | 10.71（67％） | 1.14（7％） | |
| P min Uncorrected | M ij = A i + εij | 3 | -875.03 | 6.05（9％） | 59.39（91％） | ||
| M ijk = S i + A j + εijk | 4 | -664.58 | 420.91 *** | 16.67（22％） | 53.08（70％） | 6.31（8％） | |
| P maxが修正されました | M ij = A i + εij | 3 | -445.05 | <td> 4.08（78％） | 1.15（22％） | ||
| M ijk = S i + A j + εijk | 4 | -444.88 | 0.3378 | 4.08（78％） | 0.01（<1％） | 1.14（22％） | |
| P min Corrected | M ij = A i + εij | 3 | -649.9 | 16.67（73％） | 6.24（27％） | ||
| M ijk = S i + A j + εijk | 4 | -649.9 | 0 | 16.67（73％） | 0 | 6.31（27％） | |
表1：tergiteとセッションの効果の線形混合効果モデル。 tergiteとセッションの効果の線形混合効果モデルREMLを介して推定された変動成分を用いて、5つのセッションにわたって再測定された50才の胸部の腹部色素沈着（ P maxおよびP min ）。モデルは線形混合効果モデルでした。 M ：色素沈着尺度; A ：個々のtergiteを測定した。 S ：セッション。 ε ：残留誤差。有意なX2は太字で示されている。 * p <0.05。 ** p <0.01。 *** p <0.001。
| 特性 | 温度 | Tergite | 温度 x Tergite | |
| P max | F比 | 8.14 | 55.59 | 6.6 |
| P | 0.002 | <0.001 | ||
| P min | F比 | 4.41 | 66.11 | 6.36 |
| P | 0.026 | <0.001 | 0.002 | |
| W バンド | F比 | 113.93 | 0.01 | 0.64 |
| P | <0.001 | 0.931 | 0.531 | |
| Wergier | F比 | 1.79 | 0.92 | 5.11 |
| P | 0.191 | 0.338 | 0.007 | |
| R バンド | F比 27.66 | 0.08 | 1.46 | |
| P | <0.001 | 0.782 | 0.23 |
表2：温度およびタージェットの同一性の影響。温度とtergiteの同一性の影響 5つのセッションにまたがって再測定された50才の老人の腹部色素沈着の異なる局面において、モデルは線形混合効果モデルで、個々のフライはランダムな要素として含まれていました。 P max ：最大色素沈着（補正）; P min ：最小色素沈着（補正）; W バンド ：色素バンドの幅; W tergite ： tergiteの幅; R バンド ：色素バンドの相対幅。有意な固定因子を太字で示す（ P < 0.05）。
| 傍受 | W バンド | 温度 | Tergite | |||
| 17℃ | 25℃ | 三番 | ||||
| P max | β | 234.35 | 0.069 | 0.063 | -1.178 | -0.588 |
| F | 29.93 | 5.97 | 54.82 | |||
| P | <0.001 | 0.008 | <0.001 | |||
| P min | β | 223.96 | -0.137 | 3.931 | -3.024 | -1.54 |
| F | 19.33 | span = "2"> 9.66 | 62.02 | |||
| P | <0.001 | 0.001 | <0.001 | |||
表3：色素沈着のレベルに対する色素バンド幅、温度、およびターゲイトの同一性の影響。色素帯の幅、温度、およびターゲットの同一性が、5つのセッションにわたって再測定された50のタルテイトにおける色素沈着のレベルに及ぼす影響。モデルは線形混合効果モデルで、個々のフライはランダムな要素として含まれていました。 P max ：最大色素沈着（補正）; P min ：最小色素沈着（補正）; W バンド ：色素バンドの幅; R バンド ：色素バンドの相対幅。
補足ファイル1.補足情報。y_Information.pdf "target =" _ blank ">ここをクリックしてこのファイルをダウンロードしてください。
補足ファイル2. Pigmentation.Rスクリプトの分析。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
補足ファイル3. Pigmentation.ijmの測定 ここをクリックしてこのファイルをダウンロードしてください。
シミュレーションRスクリプト。 このファイルをダウンロードするにはここをクリックしてください。
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Discussion
この方法論により、複数の下流分析に適した定量的形態での色素沈着データの正確で迅速かつ再現性のある取得が可能になる。この方法は、同種のハエの系統における腹部色素沈着に及ぼす温度の影響に関するデータを得るために使用されてきた。しかし、方法論は、個体、個体群、または種間の色素沈着の差異の基礎となる遺伝子、または色素沈着パターンに対する特定の遺伝子の影響を調べるための逆遺伝学的研究を行うために、フォワード遺伝学研究で使用することができる。上述のように、 D. melanogaster色素沈着の発達および進化を探究した多くの研究があったが、この方法論が色素沈着データを定量的形態で捕捉する精度は、より強力な統計学的アプローチを可能にする。これにより、研究者は色素沈着パターンを解析する際に使用する試料数を減らすことができ、より微妙な解明が可能になります色素沈着の局面。さらに、この方法は、フライの解剖を必要とせず、形態学的測定または遺伝子型決定のようなさらなる分析のために試料をその後使用することを可能にする。実際、この方法は、麻酔されたハエに使用される可能性があり、その後、その色素形成特性に基づいて選択的に繁殖することができる。
画像分析による色素沈着の測定に関する1つの潜在的な問題は、色素沈着値が、色素沈着自体のレベルではなく、画像が撮影された露光および照明条件を反映し得ることである。固定された照明レベル、光の位置、倍率、露出はこれらの問題を緩和するのに役立ちますが、セッション効果を完全に制御するためには、各セッションでいくつかの反復制御画像を取る必要があります。この方法は、各セッションで15個の対照検体を再撮像し、 P maxおよびP minを使用して、セッション効果を検出および除去する。しかし、再撮像すべき制御標本の正確な数は、使用される画像処理ハードウェアおよびソフトウェア、使用者が関心を持つ色素沈着の態様および処置間でどのように可変であるか、およびそれぞれに取られる画像の数セッション。同じ標本を5つのセッションにわたって再撮像する予備実験を行うことにより、セッション効果、標本の同一性による分散、および残留分散（これは補正後の測定誤差の推定値である）による分散をユーザが計算することを可能にするセッション効果について）（ 表1 ）。これらの値を使用して、セッション効果を検出して制御するために各セッションで取らなければならない制御イメージの数を推定することができます。シンプルなRスクリプトが書かれており、このような予備実験のデータを使用してセッション間の色素沈着措置をシミュレートします。それは使用することができますセッションごとの制御画像の数がセッション効果を除去するのに十分であることをチェックする。このスクリプトは補足ファイルとして提供されています。
ユーザーがセッション内に迷惑要因があると懸念される場合は、John et al。、 2016 41に記載されているように、セッション中に同じ標本を複数回再イメージすることもできます。この場合、単一のコントロール検体の[sampleID]は、セッション内で再撮影するたびに変更する必要があります（ 例えば control1、control2、control3 など ）。そうしないと、イメージングソフトウェアは以前のイメージを同じ名前の新しいイメージに置き換えます。補正機能は、時間的に隣接するセッション間で同じ[sampleID]を持つ重複画像に補正を適用し、同じ標本がセッション内およびセッション間で複数回再撮像されるかどうか、またはセッション間で同じ対照試料のセットが撮像されるかどうかを修正します。どのように関係なく制御画像が撮影され、セッションはブロックとして扱われ、可能であれば、ユーザは、修正後に残っているセッション効果を統計的に制御できるように、ランダム化されたブロック設計を採用すべきである。これに失敗すると、セッション効果が実験的要因と混同されないように標本をランダムにセッションに割り当てるべきである。
このプロトコールは、各tergiteの色素沈着の変化を表す色素形成プロフィールの生成に依存する。このプロファイルを生成する際の1つの問題は、腹部表皮を覆う黒っぽい毛であり、これは常に、ターガイトを横切る任意の前方 - 後方線によって二等分される。このプロトコルは、キューティクルのバンドにわたって色素形成プロファイルを平均化することによって、これらの毛髪によって生成されるノイズを低減する。それにもかかわらず、ユーザは、キューティクルの細い線に基づくプロファイルを生成したい場合、ステップ5.6でROIの幅を1ピクセルに設定することができる。さらに、ユーザは、同じ画像を複数回、セグメント内の色素バンドの幅の変化を捕らえるために色素沈着プロファイルの横方向の位置を変化させる。ただし、この場合は、ImageJマクロが同じ名前のプロファイルを上書きするため、手順5.1を実行する前に、同じイメージを複数回コピーして各コピーに固有の名前を付ける必要があります。
第2の重要な考慮事項は、色素形成プロファイルを生成する際に、Pigmentation Rスクリプトの解析におけるスプライン・デルダー関数（L63）内で定義される3次スプラインの平滑化パラメータである。適切な平滑化パラメータは、画像設定および解像度に依存する。プロファイルをオーバースムージングすると、 T 1 、T 2 、およびT 3の座標を計算するために使用されるスプラインプロファイルの特性が失われることがあります（ 図2Dおよび2D '）。逆に、アンダースムージングは、プロファイルのノイズ、ひいては座標抽出の精度が低下します。チーク関数は、スプラインとその派生物のグラフィカルな要約を生成し、適切な平滑化パラメータを選択する視覚的キューとして使用することができます。
本明細書に記載された方法論は、メスおよびオスのメラノガスターにおける第3および第4の腹部腸内細菌の色素沈着に関するデータの捕捉に焦点を当てている。しかし、代表的な結果は、それが女性の第5および第6腹部の色素沈着を測定するためにも使用できることを示している。さらに、この方法は、色素沈着に影響を与える遺伝子の突然変異体によって引き起こされる表現型の違いを検出することができる。 ImageJマクロとRスクリプトは、色素沈着パターンがステレオタイプであれば、異なるD. melanogaster種の腹部の色素沈着、または他の分類群における他の身体部分の色素沈着を測定するために容易に改変することができる。最後に、方法論RGBで画像を取り込み、各チャンネルを別々に分析することによって色素沈着色の局面を測定するように適合させることもできる。
一般に、この方法論は、フェノミクス51,52の新興分野の一部である。フェノミクスの目的は、疾患を含む表現型に影響を及ぼす遺伝的および環境的相互作用、およびこれらの相互作用がどのように生物多様性を生み出すために進化するかをよりよく理解するために、大きな多次元表現型データセットを生成および分析することである。しかし、その可能性を果たすためには、表現型データを取得するための方法論は、単純でなければならず、自由に利用できるだけでなく、様々な表現型に容易に適合しなければならない。標準的な機器を使用してキャプチャした画像をオープンソースソフトウェアを使用して分析することにより、この方法論はこの目標を達成するのに役立ちます。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、国立科学財団の助成金IOS-1256565とIOS-1557638がAWSに資金提供しました。このペーパーの以前のバージョンに対する彼らの有益なコメントについてPatricia Wittkoppと3人の匿名の批評家に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
| Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
| Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
| Base | Leica | MDG41 | |
| Camera | Leica | DFC280 | |
| Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
| Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
| Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
| LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
| Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
| 60 mm x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
| Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |
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