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Genetics

पेट में रंजकता को बढ़ाते हुए doi: 10.3791/55732 Published: June 1, 2017

Summary

यह काम डिजिटल छवि विश्लेषण का उपयोग करके ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर की पेट की रंजकता को जल्दी और सटीक रूप से मापने के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है। इस विधि में फेनोटाइप अधिग्रहण और डेटा विश्लेषण के बीच प्रक्रियाएं सुव्यवस्थित होती हैं और नमूना बढ़ते हुए, छवि अधिग्रहण, पिक्सेल मूल्य निष्कर्षण, और गुण माप शामिल हैं।

Abstract

रंजकता एक morphologically सरल लेकिन उच्च चर विशेषता है जो अक्सर अनुकूली महत्व है यह morphological phenotypes के विकास और विकास को समझने के लिए एक मॉडल के रूप में बड़े पैमाने पर सेवा की है। ड्रोसोफिला मेलेनोगास्टर में पेट की रंजकता विशेष रूप से उपयोगी रही है, शोधकर्ताओं को स्थानीय की पहचान करने की अनुमति दी गई है जो आकृति विज्ञान में अंतः- और अंतःस्थापित विविधताएं शामिल हैं। अब तक, हालांकि, डी। मेलानोगस्टर पेट में रंजकता को काफी हद तक मात्रात्मक रूप से स्कोरिंग के माध्यम से गुणात्मक रूप से परख लिया गया है, जो सांख्यिकीय विश्लेषण के रूपों को सीमित करता है जो कि pigmentation डेटा पर लागू किया जा सकता है। यह काम एक नई पद्धति का वर्णन करता है जो वयस्क डी। मेलेनोगास्टर के पेट की रंजकता पैटर्न के विभिन्न पहलुओं की मात्रा का ठहराव करने की अनुमति देता है। प्रोटोकॉल में नमूना बढ़ते, छवि कैप्चर, डेटा निष्कर्षण, और विश्लेषण शामिल हैं। छवि कैप्चर और विश्लेषण सुविधा मैक्रोज़ के लिए उपयोग किए गए सभी सॉफ्टवेयरखुले स्रोत छवि विश्लेषण के लिए लिखा इस दृष्टिकोण का लाभ विभिन्न इमेजिंग प्रणालियों में अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने वाली एक पद्धति का उपयोग करके वर्णक गुणों को ठीक करने की क्षमता है। जबकि प्रौढ़ डी। मेलेनोगस्टर के टीर्जल रंजकता पैटर्न में विविधता को मापने के लिए तकनीक का उपयोग किया गया है, इस पद्धति में लचीला है और असंख्य जीवों में वर्णक पैटर्न पर मोटे तौर पर लागू होता है।

Introduction

रंजकता प्रजातियों, आबादी, और व्यक्तियों के बीच, और यहां तक ​​कि 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 के दौरान व्यक्तियों के बीच बहुत अधिक प्रोनोटीपिक विविधता दिखाती है। यद्यपि विभिन्न प्रकार के जानवरों में रंजकता के असंख्य अध्ययन हैं, ड्रगोफिला मेलेनोगास्टर में वर्णक का सबसे अच्छा अध्ययन किया गया है, जहां परमाणु आनुवांशिकी की पूरी शक्ति का उपयोग विकासशील और शारीरिक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए किया गया है, जो कि रंजकता को विनियमित करते हैं और ये तंत्र कैसे विकसित होते हैं 1 , 6 डी। मेलेनोगस्टर 7 , 8 में जीवाणुओं के जैव रासायनिक संश्लेषण को विनियमित करने वाली जीन के बारे में बहुत कुछ पता चला है और जीन जो अस्थायी और स्थानिक डायल को नियंत्रित करते हैंइस जैवसंश्लेषण 9 , 10 , 11 , 12 , 13 का वितरण इसके अलावा, आनुवांशिक मानचित्रण ने डी। मेलेनोगास्टर 14 , 15 , 16 , 17 में पेग्मेंटेशन में अंतर्निहित अंतर्-अंतर्निहित आनुवंशिक स्थान को पहचान लिया है। रंजकता और प्लीमेन्ट्रोपिक गुण, जैसे व्यवहार 18 , 1 9 और प्रतिरक्षा 1 9 , 20 , के बीच रिश्तों का पता लगाया गया है, जैसा कि रंजकता पैटर्न 15 , 21 , 22 के अनुकूली महत्व है। जैसे, डी। मेलेनोगास्टर में रंजकता एक शक्तिशाली अभी तक सरल मी के रूप में उभरी हैजटिल फेनोटाइप के विकास और विकास के लिए ओड

वयस्क डी। मेलेनोगास्टर में रंजकता, पूरे शरीर में विशेष रूप से पंखों और पृष्ठीय छाती और पेट पर मेलेनाइजेशन के विशिष्ट पैटर्न की विशेषता है। यह पृष्ठीय पेट पर प्रत्येक कटरिकली प्लेट (ट्रिगाइट) के रंगद्रव्य है, हालांकि, जिसने सबसे अधिक शोध ध्यान प्राप्त किया है। आनुवंशिक 17 , 23 और पर्यावरण 24 , 25 कारक दोनों के कारण, इस रंगद्रव्य ( चित्रा 1 ए- एफ ) में काफी भिन्नता है। पेट के ट्रिगाइट की छल्ली को पूर्वकाल और पीछे के विकास वाले डिब्बों ( चित्रा 1 जी ) से बना होता है, जिनमें से प्रत्येक को पगमेंटेशन और अलंकरण 26 के आधार पर आगे विभाजित किया जा सकता है। पूर्वकाल डिब्बे में छह छल्ली शामिल हैंप्रकार (ए 1-ए 6), और पीछे के डिब्बे में तीन (पी 1-पी 3) ( चित्रा 1 जी ) शामिल हैं। इनमें से, पी 1, पी 2, और ए 1 छल्ली आमतौर पर गैर-फैला पेट में ट्रिगेट के नीचे जोड़ दी जाती है ताकि वे छिपे रहें। भरोसेमंद रूप से दिखाई देने वाली छल्ली को भारी रंजकता के एक बैंड द्वारा चिह्नित किया जाता है, जिसे यहां "वर्णक बैंड" के रूप में संदर्भित किया जाता है, जिसमें छल्ली प्रकार ए 4 (मध्यम बाष्प के साथ बालों वाली) और ए 5 (बड़े बालों वाला बालों वाला), बैंड के पीछे की ओर पूर्वकाल किनारे ( चित्रा 1 जी ) की तुलना में अधिक तीव्रता से वर्णित। इस बैंड के पूर्वकाल में हल्के वर्णित बालों वाली छल्ली का क्षेत्र होता है, जो बाद में (ए 3) बरसता है, लेकिन पूर्वकाल में नहीं (ए 2)। मक्खियों के बीच रंगद्रव्य में बदलाव वर्णक की तीव्रता और वर्णक बैंड की चौड़ाई में दोनों में मनाया जाता है। सामान्य तौर पर, सबसे अधिक पश्चानुक्रमिक खंड (पेट के सेगमेंट 5, 6, और 7) में अंतर सबसे अधिक है और अधिक पूर्वकाल सेगमेंट में कम है (उदर सेGments 3 और 4) 24 इसके अलावा, डी। मेलेनोगास्टर पगमेन्टेशन में एक लैंगिक दिमाख़वाद होता है, आम तौर पर पुरुषों के पांचवें और छठे पेट वाले ट्रिग्रेट्स ( चित्रा 4 सी ) के रूप में वर्णित होते हैं।

डी। मेलेनोगास्टर में पेट में रंजकता के अधिकांश अध्ययनों में, वर्णक को एक स्पष्ट या अनुक्रमिक विशेषता के रूप में माना गया है, साथ ही पैटर्न 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 के पैमाने पर 27 , 28 , 29 या अर्द्ध मात्रात्मक रूप से मापा गया है। , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 ये विधियां अनिवार्य रूप से परिशुद्धता की कमी से पीड़ित हैं, और क्योंकि वे pigmentation के व्यक्तिपरक मूल्यांकन पर भरोसा करते हैं, सभी अध्ययनों में डेटा की तुलना करना मुश्किल है। कई लेखकों ने रंजकता 38 , 3 9 के स्थानिक आयामों को एक विशिष्ट छल्ली प्रकार 23 , 25 , 39 , 40 या पूरे पेटी ट्रिगाइट के पूरे 41 , 42 , 43 के रूप में रंगद्रव्य की औसत तीव्रता की तीव्रता को बढ़ाया है। इसके बावजूद, ये मात्रा का ठहराव विधियां एक तरफ पेट की रंजकता के तीव्रता और स्थानिक वितरण दोनों को मापने नहीं देती है और इसलिए इस बात की बारीकियों पर कब्जा नहीं है कि कैसे abdomen में pigmentation भिन्न होता हैओमिनल ट्रिग्रेट इसके अलावा, 38 , 41 , 42 , 43 में इन मात्रात्मक विधियों में से कई को पेट की छल्ली के विच्छेदन और बढ़ते जाने की आवश्यकता होती है। यह दोनों समय लगता है और नमूना को नष्ट कर देता है, जिससे यह अतिरिक्त रूपात्मक विश्लेषणों के लिए अनुपलब्ध हो जाता है। पेट के रंगद्रव्य के विकास और विकास की समझ के रूप में, अधिक परिष्कृत औजार जल्दी और सटीक दोनों को स्थानिक वितरण और रंगद्रव्य की तीव्रता को मापने की आवश्यकता होगी।

डी मेलेनोगास्टर में पेट की रंजकता के एक प्रतिकृति और अधिक सटीक उपाय प्राप्त करने के लिए इस पद्धति का समग्र लक्ष्य डिजिटल छवि विश्लेषण का उपयोग करना है । कार्यप्रणाली में तीन चरणों शामिल हैं सबसे पहले, वयस्क उड़ान गैर विनाशकारी रूप से घुड़सवार होती है, और पृष्ठीय पेट की एक डिजिटल छवि ली जाती है। दूसरा, एक ImageJ मैक्रो, उपयोगकर्ता का उपयोग करपिक्सेल की एक पूर्वकाल-पीछे वाली पट्टी को परिभाषित करता है जो कि ए 2 छल्ली के पूर्वकाल से तीसरी और चौथे पेट के दोनों हिस्सों पर ए 5 छल्ली (हरे रंग का बॉक्स, चित्रा 1 जी ) के पीछे के ऊपर फैली हुई है। इस पट्टी की चौड़ाई के ऊपर औसत पिक्सेल मूल्य उसके लंबे अक्ष के साथ निकाला जाता है, एक प्रोफ़ाइल तैयार करता है जो स्थानिक वितरण और रंगद्रव्य की तीव्रता को प्राप्त करता है क्योंकि यह पूर्वकाल से टरगाइट के पीछे के स्थान पर परिवर्तित होता है। तीसरा, एक आर स्क्रिप्ट का उपयोग ग्यारहवीं पट्टी का उपयोग करके गणितीय रूप से वर्णक चित्र को वर्णित करने के लिए किया जाता है। आर स्क्रिप्ट फिर ए 2-ए 5 छल्ली की चौड़ाई, वर्णक बैंड की चौड़ाई, और रंजकता के अधिकतम और न्यूनतम स्तर को निकालने के लिए स्पलाइन और उसके पहले और दूसरे व्युत्पन्न का उपयोग करता है। इसलिए विधि दोनों स्थानिक विशेषताओं और पेट में रंजकता की गहराई को बढ़ाती है।

इस पद्धति में तीसरे और चौथे पेट के tergites के pigmentation quantifies,जो 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 3 9 , 42 के कई पिछला अध्ययनों का ध्यान केंद्रित किया गया है, या तो अधिकतर पश्चवर्ती टरगेट्स के साथ या संयोजन में है। यद्यपि पांचवें और छठे पेट के टरगेट्स की तुलना में कम परिवर्तनीय, तीसरे और चौथे टरगेट पूरी तरह से नर में वर्णित नहीं हैं, इसलिए यह प्रोटोकॉल दोनों पुरुषों और महिलाओं के लिए लागू किया जा सकता है। फिर भी, जैसा कि यहां दिखाया गया है, प्रोटोकॉल का उपयोग महिलाओं में पांचवें और छठे पेट के ट्रिगिट में वर्णक को मापने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, रंजकता प्रोफाइल की विशेषताओं को निकालने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली लिपियों में मामूली संशोधनों के लिए विधि को अन्य प्रकार की विविधता में रंगद्रव्य में भिन्नता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिएजीवों।

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Protocol

1. नमूना बढ़ते

नोट: इमेजिंग से पहले पानी में 70% इथेनॉल में मृत मक्खियों को स्टोर करें।

  1. उबलते पानी में 60 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में 10 मिलीलीटर 1.25% अघार डालो और इसे सेट करने की अनुमति दें।
  2. विदारक माइक्रोस्कोप के तहत, जेल की सतह में ~ 20 मिमी ओएनजी, 2 मिमी चौड़ा, 1 मिमी गहरी नाली बनाने के लिए ठीक-ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें। ठीक संदंश का उपयोग करते हुए, जेल से ऊपर उड़ने वाले मक्खी के पृष्ठीय पक्ष के साथ, नाली में एक वयस्क मक्खी की उदर तरफ एम्बेड करें।
    नोट: जेल की ढीला नमूना क्षतिग्रस्त बिना आसान repositioning के लिए अनुमति देता है। एक ही नाली का उपयोग कई नमूनों के लिए किया जा सकता है, हालांकि यह समय के साथ गंदी, टूटी-अप और व्यर्थ हो जाएगा। उपयोगकर्ता एक ही जेल में अन्य नाली बना सकता है। प्रत्येक प्लेट का उपयोग छवि ~ 200 मक्खियों के लिए किया जा सकता है।
  3. मोमी छल्ली से हल्के प्रतिबिंब को कम करने के लिए पानी में 70% इथेनॉल में नमूना पूरी तरह से कवर करें और विंग नुकसान को रोकने के लिएनमूना हेरफेर आईएनजी

2. माइक्रोस्कोप सेटअप

नोट: छवियां एक विदारक दायरे, संचरित प्रकाश आधार, डिजिटल कैमरा और बुलोनीक ठंड लाइट स्रोत का उपयोग करके कंप्यूटर पर चलने वाली छवि अधिग्रहण नियंत्रण सॉफ़्टवेयर से प्राप्त की गई हैं। सॉफ्टवेयर निर्देश माइक्रो-मैनेजर v1.4.20 44 के लिए विशिष्ट हैं, जो ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर है जो ImageJ 45 को शामिल करता है

  1. सूक्ष्मदर्शी, डिजिटल कैमरा, डबल गोसीनक ठंड प्रकाश स्रोत, और कंप्यूटर चालू करें।
  2. माइक्रो-मैनेजर विंडो और एक छवि जेड विंडो खोलने के लिए छवि कैप्चर सॉफ्टवेयर चलाएं। ImageJ विंडो में "छवि"> "प्रकार"> "8-बिट" पर क्लिक करके सभी छवियों को 8-बिट के रूप में सेट करें कैमरे से एक वास्तविक-समय पूर्वावलोकन दिखाने वाला "स्नैप / लाइव" विंडो खोलने के लिए माइक्रो-मैनेजर विंडो में "लाइव" पर क्लिक करें
    1. यदि "स्नैप / लाइव" विंडो के आकार को अधिकतम करेंcessary। माइक्रो-मैनेजर विंडो के "कंट्रास्ट" टैब में पुलडाउन "डिस्प्ले मोड" मेनू में "ग्रेस्केल" चुनें।
  3. ठंड प्रकाश स्रोत को इसकी अधिकतम तीव्रता से चालू करें और मंच से लगभग 120 मिमी तक प्रत्येक बोजसीनक के सुझावों की स्थिति को छोड़ दें, एक बाईं ओर और एक दायीं ओर
    नोट: प्रयोक्ता भी एक कुंडलाकार प्रकाशक का उपयोग कर सकते हैं, हालांकि यह मक्खी पेट के आसपास प्रतिबिंबित प्रकाश की अंगूठी उत्पन्न कर सकता है।
  4. मैन्युअल रूप से माइक्रोस्कोप बढ़ाई को 60x में सेट करें ताकि दृश्य के क्षेत्र में मंच पर लगभग 3 मिमी व्यास व्याप्त हो।
  5. मंच पर एक 2 मिमी चरण की सुक्ष्ममापी रखें (यदि आवश्यक हो तो पृष्ठभूमि को पृष्ठभूमि में बदलना)। लाइव पूर्वावलोकन को देखते हुए, मंच माइक्रोमीटर पर ध्यान केंद्रित करें और "एक्स्पोज़र" बॉक्स में एमएस में एक्सपोज़र का समय दर्ज करके माइक्रो-मैनेजर विंडो में एक्सपोजर को समायोजित करें।
  6. कैमरे को अलग-अलग जांचने के लिए, टी में "सीधी रेखा" टूल चुनेंवह ImageJ खिड़की और एक पंक्ति को स्टेज माइक्रोमीटर की लंबाई खींचें। ImageJ खिड़की में "विश्लेषण करें"> "सेट स्केल" पर क्लिक करें "सेट स्केल" विंडो को खोलने के लिए, "ज्ञात दूरी" बॉक्स में सुक्ष्ममापी की लंबाई दर्ज करें, और "लंबाई का यूनिट" में "माइक्रोन" दर्ज करें डिब्बा।
    1. देखें कि "सेट स्केल" विंडो फिर "पिक्सेल / माइक्रोन" में स्केल दिखाती है। पैमाने का एक नोट बनाएं और "ठीक है" पर क्लिक करें।
  7. "स्नैप / लाइव" विंडो में, "स्टॉप" पर क्लिक करें और फिर स्टेज माइक्रोमीटर की एक छवि को कैप्चर करने के लिए "स्नैप" पर क्लिक करें।
  8. चित्र को 8-बिट ग्रेस्केल TIFF के रूप में सहेजें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि चित्रों को फिर से जांचना आवश्यक हो, यदि आवश्यक हो। ImageJ खिड़की में "फ़ाइल"> "इस रूप में सहेजें"> "झल्लाहट ..." फ़ाइल ब्राउज़र में फाइल को सहेजने के लिए निर्दिष्ट करें, फ़ाइल नाम दें, और "सहेजें" पर क्लिक करें।
  9. मंच को काला और स्थान पर स्विच करेंएक पेट्री डिश, जिस पर मंच पर चरण (1.1-1.2 चरण) अगर में घुड़सवार एक मक्खी होती है।
  10. खुर्दबीन के माध्यम से देखो और मक्खी की स्थिति सुनिश्चित करने के लिए कि पृष्ठीय midline सीधे pigmentation पैटर्न को देखने के लिए सीधे ऊपर है। यह सुनिश्चित करने के लिए किसी भी पंख और एपेंडेस को स्थानांतरित करें कि पेट का दृश्य बिना किसी अवरुद्ध है। यदि वर्णक छल्ली (ए 2-ए 5) दिखाई नहीं दे रहा है, तो यह पेट तक बाद में निचोड़ लें (जब तक कि मक्खियों का पेट 70% इथेनॉल में पानी के खंड में संग्रहीत होता है, इसलिए यह आमतौर पर आवश्यक नहीं है)।
    नोट: उड़ने की स्थिति में, उपयोगकर्ता को कम बढ़ाई (20X) का उपयोग करने की आवश्यकता हो सकती है। आगे बढ़ने से पहले आवर्धन को 60 एक्स में लौटा दिया जाना चाहिए।
  11. मैन्युअल रूप से मक्खी के पृष्ठीय पेट पर ध्यान केंद्रित। पृष्ठीय पेट पर छाया और प्रतिबिंब को कम करने के लिए प्रकाश स्रोत के सुझावों को मैन्युअल रूप से समायोजित करें
  12. कंप्यूटर स्क्रीन पर लाइव पूर्वावलोकन को देखते हुए और सूक्ष्म-प्रबंधक विंडो के "कंट्रास्ट" टैब में पिक्सेल मान हिस्टोग्राम का उपयोग करते हुए,पूर्वावलोकन छवि के पिक्सेल मूल्यों की सीमा को अधिकतम करने के लिए चरण 2.4 में वर्णित एक्सपोजर को समायोजित करें।
  13. मक्खी और पेट्री डिश को निकालें और उन्हें एक वोल्टेज मीटर से जुड़े एक एलईडी (430-660 एनएम) के स्पेक्ट्रल आउटपुट के साथ बदलें, मक्खी के समान स्थिति में देखने के क्षेत्र में केंद्रित। लाइट मीटर 46 के रूप में एलईडी और वोल्टेज मीटर का उपयोग करें और एलईडी (~ 125 एमवी) को हल्का प्रकाश से उत्पन्न वोल्टेज रिकॉर्ड करें।
    नोट: एलईडी और वोल्टेज मीटर का उपयोग यह सुनिश्चित करने के लिए किया जाता है कि एक प्रयोग के भीतर कई इमेजिंग सत्रों में हल्के का स्तर स्थिर हो।
  14. प्रयोग की अवधि के लिए, प्रकाश स्रोत की स्थिति या तीव्रता, सूक्ष्मदर्शी की बढ़ाई, या कैमरे के प्रदर्शन को आगे नहीं बदलें।

3. नमूना इमेजिंग

  1. काले सूक्ष्मदर्शी चरण पर अगर (1-1-1.3 चरणों में) घुड़सवार एक मक्खी युक्त एक पेट्री डिश रखें। मक्खी की स्थिति को समायोजित करें ताकि तीसरी और चौथीएच पेट के क्षेत्र दिखाई देते हैं और पृष्ठीय midline सीधे ऊपर है, जैसा चरण 2.9 में वर्णित है। सुनिश्चित करें कि आगे बढ़ने से पहले बढ़ाई 60x है।
  2. मैन्युअल रूप से माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें कि तीसरे और चौथे पृष्ठीय पेट के टरगेट्स फोकस में हैं एक छवि को 8-बिट ग्रेस्केल TIFF के रूप में प्राप्त करने के लिए छवि कैप्चर सॉफ्टवेयर का उपयोग करें, जैसा कि चरण 2.6 में वर्णित है।
    नोट: छवि को रंग में कैप्चर किया जा सकता है और बाद में विश्लेषण के लिए ग्रेस्केल में कनवर्ट किया जा सकता है।
  3. छवि को "SESH000_sampleID.tiff" के रूप में सहेजें, जैसा चरण 2.7 में वर्णित है।
    नोट: यहां, [एसईएसएच] निरंतर है, [000] सत्र संख्या है और वह चर है, लेकिन वह तीन अंक लंबा होना चाहिए, और [नमूनाइड] उपयोगकर्ता चाहे जो चाहे, हालांकि इसमें कोई अतिरिक्त अंडरस्कोर (_) वर्ण नहीं होना चाहिए और एक निरंतर लंबाई का होना चाहिए [नमूनाइड] में वर्णक डेटा ( उदाहरण, तापमान या वंश) के विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले कारकों का विवरण, एक विशिष्ट गैर-वर्णमाला से अलग होना चाहिएकैल चरित्र, जैसे कि हाइफ़न (-) यह इन कारकों को [sampleID] से मानक सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके आसानी से पार्स होने की अनुमति देता है।
  4. मंच से पेट्री डिश निकालें और अगले नमूने के साथ मक्खी की जगह। चरण 3.1-3.3 को दोहराएं जब तक सभी नमूने इमेज न किए जाएं, बिना प्रकाश स्तर, आवर्धन, या एक्सपोजर को समायोजित किए बिना।

4. एकाधिक सत्रों में इमेजिंग

  1. अगर छवियों को कई सत्रों में लेने की ज़रूरत होती है, तो पूरे सत्र में हल्की तीव्रता, जोखिम और बढ़ाई बनाए रखें। प्रत्येक सत्र की शुरुआत में, कैमरे के स्थानिक अंशांकन (चरण 2.4) और चरण में प्रकाश तीव्रता की जांच करें (जैसा कि एलईडी / वोल्टेज मीटर द्वारा मापा गया, चरण 2.12)।
  2. मंच की सुक्ष्ममापी (चित्रा 2.5-2.7) की एक छवि को कैप्चर और सहेजकर यह सुनिश्चित करने के लिए कि छवियों को फिर से जांचना, यदि आवश्यक हो
  3. कम से कम 15 नियंत्रण नमूनों का उपयोग करें और प्रत्येक सत्र में यादृच्छिक रूप से उन्हें पुन: चित्रित करेंसत्र प्रभावों का पता लगाने और उन्मूलन के लिए सुनिश्चित करें कि सत्रों के बीच डुप्लिकेट नियंत्रण नमूनों का एक ही [नमूनाइडा] है लेकिन अलग [एसईएचएचएच]
    नोट: नियंत्रण नमूने मक्खियों को संग्रहीत, संग्रहीत, और समान रूप से प्रयोगात्मक नमूनों में घुमाए जाते हैं, लेकिन सभी सत्रों में पुन: चित्रित किए जाते हैं। नियंत्रण नमूने की सटीक संख्या उपयोगकर्ता के प्रयोगात्मक सेटअप पर निर्भर करेगी। अधिक विवरण के लिए चर्चा देखें

5. छवि विश्लेषण

नोट: छवि विश्लेषण ImageJ 45 में आयोजित किया जाता है और एक पूरक फ़ाइल के रूप में प्रदान की गई "मैक्रोमेंटेशन ऑफ पिग्मेंटेशन.आईजीएम" मैक्रो का उपयोग करता है।

  1. एक ही फ़ोल्डर में सभी छवियों का विश्लेषण करें।
  2. ImageJ को प्रारंभ करें और फ़ाइल ब्राउज़र में "Pigmentation.ijm के मापन" का चयन करके "प्लगइन"> "मैक्रो"> "भागो" पर क्लिक करके "Pigmentation.ijm का मापन" मैक्रो चलाएं और "खुला।"
    नोट: सभी बाद के चरणों मैक्रो के भीतर हैं प्रत्येक चरण एक व्यक्तिगत मैक्रो कमांड है
  3. ध्यान दें कि "आवश्यक कार्यवाही" संवाद बॉक्स खुलता है, जिसमें "फ़ोल्डर चुनें जहां छवियाँ संग्रहीत हैं" चुनें। "ठीक" पर क्लिक करें और फ़ाइल ब्राउज़र का उपयोग करने वाले चित्रों का चयन करने के लिए फ़ाइल ब्राउज़र का उपयोग करें और फिर "चुनें" पर क्लिक करें।
  4. ध्यान दें कि "आवश्यक कार्रवाई" संवाद खुले बॉक्स होगा, जिसमें "फ़ोल्डर चुनें जहां आप डेटा संग्रहीत करना चाहते हैं।" "ओके" पर क्लिक करें और फाइल ब्राउज़र का उपयोग करने के लिए रंगीन प्रोफाइल को बचाने के लिए वांछित फ़ोल्डर का चयन करें। "चुनें" पर क्लिक करें।
  5. ध्यान दें कि एक संवाद बॉक्स खुल जाएगा, "आपके नमूना आईडी में कितने अक्षर हैं?" डेटा इनपुट बॉक्स में, [नमूनाइड] में वर्णों की संख्या दर्ज करें, जैसा कि चरण 3.3 में निर्दिष्ट है, और "ओके" पर क्लिक करें।
  6. ध्यान दें कि एक संवाद बॉक्स खुल जाएगा, "आपका आरओआई कितना चौड़ा है?" डेटा इनपुट बॉक्स में, पूर्वकाल की पिक्सेल चौड़ाई दर्ज करें-पोस्टर पट्टी जिसके साथ पिंगमेन्टेशन प्रोफाइल को पढ़ा जाना है (हरी आयत, चित्रा 1 जी , चित्रा 2 ए , और 2 ए ')। ओके पर क्लिक करें;" डिफ़ॉल्ट 20 पिक्सल है
    नोट: बाल निकालना और बालियों के कारण शोर को कम करने के लिए, वर्णक प्रोफ़ाइल को रेखा के बजाय छल्ली की एक पट्टी में पढ़ा जाता है। इस पट्टी की चौड़ाई छवि के संकल्प पर निर्भर करती है, लेकिन यह पेट की चौड़ाई के 1/20 वें , पिक्सल में होनी चाहिए।
  7. ध्यान दें कि मैक्रो पहली मक्खी की छवि खुल जाएगा, और एक डायलॉग बॉक्स पूछेगा कि क्या वर्तमान मक्खी को मापना है ("हाँ" पर क्लिक करें), अगली उड़ान भरने के लिए ("नहीं" क्लिक करें), या बाहर निकलने के लिए मैक्रो ("रद्द करें" क्लिक करें)
  8. ध्यान दें कि एक डायलॉग बॉक्स खुल जाएगा, जिसमें "पृष्ठीय पेट की मिडलाइन परिभाषित करें, एन्टीर से पोस्टरियर तक।" "सीधी रेखा" टूल पहले से ही चुना जाएगा। पूर्वकाल से पोस्टर तक की रेखा खींचनापृष्ठीय पेट की मिडलाइन परिभाषित करने के लिए ओके पर क्लिक करें;" चित्रा 2 ए और 2 ए 'देखें, पीला लाइन।
    नोट: इसका उपयोग छवि को फिर से दोहराने के लिए किया जाता है ताकि पृष्ठीय मिडलाइन स्क्रीन पर क्षैतिज रूप से क्षैतिज स्थित हो, बाईं ओर पूर्वकाल के साथ, बाद के चरणों को आसान बना दे।
  9. ध्यान दें कि एक डायलॉग बॉक्स खुल जाएगा, "वर्णक बैंड के ठीक पीछे टर्गेइट 4 के पोस्टरिएयर किनारे को परिभाषित करें।" "सीधी रेखा" टूल पहले से ही चुना जाएगा। पीछे के मध्य किनारे से दाएं-पार्श्व किनारों पर एक रेखा खींचना, जैसे कि रेखा का केंद्र (एक सफेद वर्ग द्वारा चिह्नित किया गया) वर्णक बैंड (छल्ली ए 5) के पीछे के किनारे पर पीछे स्थित होता है। ओके पर क्लिक करें;"। चित्र 2 ए और 2 ए 'देखें, मैजेंटा लाइन।
    नोट: आर स्क्रिप्ट स्वचालित रूप से वर्णक प्रोफ़ाइल से वर्णक बैंड के पीछे के किनारे का पता लगाएगा।
  10. ध्यान दें कि एक संवादबॉक्स खुल जाएगा, "वर्णक छल्ली (ए 2) के पूर्वकाल किनार पर ट्रिगेट 4 के एन्टीरियल किनारे को परिभाषित करें"। "सीधी रेखा" टूल पहले से ही चुना जाएगा। पूर्वकाल की मिडलाइन किनारे से दाएं-पार्श्व किनारों पर एक रेखा खींचना, जैसे कि रेखा (एक सफेद वर्ग द्वारा चिह्नित) का केंद्र पिग्मेंटेड छल्ली (छल्ली ए 2) के पूर्वकाल किनारे पर बैठता है। ओके पर क्लिक करें;"। चित्रा 2 ए और 2 ए 'देखें , सियान लाइन।
    नोट: आर स्क्रिप्ट इस बिंदु को ट्रिगेट के वर्णक छल्ली के पूर्वकाल किनारे के रूप में परिभाषित करेगा। छवि पर, मैक्रो रुचि के क्षेत्र को प्रदर्शित करेगा (आरओआई) जिसके साथ वर्णक प्रोफ़ाइल पढ़ी जाती है (हरे रंग का आयत, चित्रा 2 ए और 2 ए ', चित्रा 2 बी और 2 बी ' में विस्तारित) मैक्रो आरओआई के लिए रंजकता प्रोफाइल दिखाने वाली दूसरी विंडो भी खोल देगा ( Figur ई 2 सी और 2 सी '), जहां एक्स-अक्ष स्थिति है, प्रोफ़ाइल के पीछे की ओर से पिक्सेल की संख्या के रूप में व्यक्त की गई है, और y- अक्ष प्रत्येक स्थिति में औसत पिक्सेल मान है।
  11. रंजकता प्रोफ़ाइल के भूखंड देखें जो मैक्रो द्वारा खोला जाएगा। यदि आवश्यक हो, तो ROI की स्थिति को समायोजित करने के लिए प्रोफ़ाइल विंडो में "लाइव" पर क्लिक करें ताकि इसमें कोई संरचना शामिल न हो ( उदाहरण के लिए, ब्रिसल) जो कि pigmentation प्रोफ़ाइल को प्रभावित करेगा प्रोफ़ाइल संतोषजनक होने पर, "ठीक है" पर क्लिक करें।
  12. ट्रिगर 3 के लिए चरण 5.8-5.11 दोहराएं
    नोट: मैक्रो फिर दो सीएसवी फाइलों के रूप में वर्णक प्रोफाइल निर्यात करता है, प्रत्येक नाम "SESH000_samplename_TX_profile.csv," जहां [SESH000_samplename] छवि का नाम है और [TX] क्रमशः तीसरे और चौथे टरगेट के लिए T3 या T4 है।
  13. ध्यान दें कि मैक्रो अगले छवि को खोलता है। जब तक सभी छवियों का विश्लेषण नहीं किया जाता है तब तक 5.7-5.13 के चरण दोहराएं।
6. डेटा प्रीप्रोसेसिंग, विश्लेषण, और सत्र सुधार

नोट: सभी डेटा विश्लेषण आर 47 में आयोजित किया जाता है और "पगमेन्टेशन। आर का विश्लेषण" स्क्रिप्ट प्रदान करता है। नीचे, "एल ..." इंगित करता है कि विश्लेषण के प्रत्येक भाग के लिए कौन सी पंक्ति (स्क्रिप्ट) चलती है विश्लेषण कैसे किया जाता है पर अतिरिक्त जानकारी के लिए पूरक जानकारी देखें।

  1. कार्य निर्देशिका (L6) सेट करने के लिए R स्क्रिप्ट को संपादित करें और फ़ाइलपथ को csv प्रोफाइल (L11) युक्त फ़ोल्डर में परिभाषित करें।
  2. प्रोफ़ाइल फ़ोल्डर में संग्रहीत pigmentation प्रोफाइल की एक सूची बनाने के लिए L13-15 चलाएं।
  3. प्रोफाइल को एकल डेटा फ्रेम में पढ़ने के लिए "रीडर" और "एडप्रैमिरी के" फ़ंक्शन (एल 17 -41) को लोड और चलाएं।
  4. स्टेज 2.5 में निर्धारित के अनुसार, μm / पिक्सेल में छवियों के स्थानिक अंशांकन को निर्दिष्ट करने के लिए L43 पर स्क्रिप्ट संपादित करें।
  5. लोड करें और चलाने के लिए "adjusटेंशन "समारोह (एल 46-58) को प्रोफ़ाइल की स्थिति (एक्स-अक्ष, चित्रा 2 सी और 2 सी ') को पिक्सेल-से-पोस्टियर-एज-की-आरओआई से माइक्रोन-टू-एस्टरियर-एजेन्स-आरओआई और कन्वर्ट करने के लिए पिक्सेल मूल्य (0 = काला, 255 = श्वेत) से पगमेन्टेशन मान (0 = कोई वर्णक, 255 = अधिकतम वर्णक) से प्रोफ़ाइल मान (y- अक्ष, चित्रा 2 सी और 2 सी ')
  6. पिग्मेंटेशन प्रोफाइल की क्यूबिक स्पलाइन और इसके पहले और दूसरे डेरिवेटिव ( चित्रा -2 डी -2 एफ और 2 डी ' -2 एफ ') को उत्पन्न करने के लिए "स्पलाइन.डर.र" फ़ंक्शन (एल 60-71) को लोड और चलाएं।
  7. वर्णक बैंड के पीछे (टी 3 ) और पूर्वकाल (टी 2 ) किनारों की स्थिति को निकालने के लिए सबसे पहले "समन्वयन" और "एसिम्बली। कॉओडोर" फ़ंक्शंस (एल 74-163) को लोड और चलाएं ( चित्रा 2 डी और 2 डी ';) और ए 2 छल्ली (टी 1 , चित्रा 2 डी और 2 डी ) के पीछे की ओर, और उसके बाद क्रमशः टी 3 और टी 1 पर ले जाने वाले अधिकतम (पी अधिकतम ) और न्यूनतम (पी मिन ) रंजकता मूल्यों को निकालने के लिए।
    नोट: ए 2 छल्ली के पूर्वकाल के किनारे को पहले ही चरण 5.9 में परिभाषित किया गया है।
  8. वैकल्पिक: "समन्वय" फ़ंक्शन सही तरीके से पहचानने योग्य है या नहीं, यह जांचने के लिए "1 9 65-175" लोड करें और "चेक" फ़ंक्शन (एल -165-175) को चलाएं।
  9. हेडिंग "सत्र," "नमूना," "टीरगाइट," "आईडी" (नमूना और टीरगाइट का एक संयोजन), "पी मैक्स ", के साथ एक डेटा तालिका बनाने के लिए इंडेक्स और मीट्रिक फ़ंक्शंस लोड करें और चलाएं (L178-193) "पी मिनट ," "डब्लू बैंड " (वर्णक बैंड की चौड़ाई, = टी 3 - टी 2 ), और "डब्लू टीर्जेइट " (पिगमेंट सी की चौड़ाईयूटिकल्स ए 2-ए 5, टी = 3 )
  10. डेटा प्रभाव उत्पन्न करने के कारण पैदा होने वाले किसी भी उपद्रव कारक के लिए पी अधिकतम और पी मिनट को सही करने वाले डेटा तालिका को उत्पन्न करने के लिए "सुधार" फ़ंक्शन (L196-234) को लोड और चलाएं। पी अधिकतम या पी मिनट में औसत वृद्धि (या कमी) का प्रयोग करें, नियंत्रण के नमूने, अस्थायी आसन्न सत्रों में फिर से इमेज किए गए।

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Representative Results

प्रोटोकॉल का उपयोग पेट के रंगद्रव्य पर पालन करने के तापमान के प्रभाव का पता लगाने के लिए किया गया था। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि डी। मेलेनोगस्टर 30 , 32 सहित ड्रोसोफिला की कई प्रजातियों में पेट की रंजकता के फैलाव में कमी के कारण विकास के तापमान में वृद्धि हुई है। विशेष रूप से, पेट के ट्रिगिट 3 और 4 में, रंगद्रव्य (वर्णक बैंड की चौड़ाई) की सीमा 17 डिग्री से 25 डिग्री सेल्सियस से घट जाती है और 25 डिग्री सेल्सियस से 28 डिग्री सेल्सियस 24 , 36 तक ही रहती है। इन अध्ययनों ने एक 1-10 स्केल पर रंजकता की सीमा (0: कोई रंगद्रव्य बैंड, पूरी तरह से पीले रंग का ट्रिगर; 5: रंगद्रव्य बैंड में ट्रिगाइट का 50% हिस्सा है; 10: पूरी तरह से अंधेरा ट्रिगर)। यह निर्धारित करने के लिए कि मात्रात्मक पद्धति इस फीनोटाइपिक प्लास्टिसिटी को कैप्चर कर सकती है, pigmentation वें में मापा गया थाअंडा से 17 डिग्री सेल्सियस (सात मक्खियों), 25 डिग्री सेल्सियस (नौ मक्खियों), और 28 डिग्री सेल्सियस (नौ मक्खियों) में वयस्कों की पैदावार के लिए आयताकार रूप से बेतहाशा मादा की एक आयोजीनिक रेखा के तीसरे और चौथे पेट के ट्राइजेक्ट हैं। सत्र प्रभाव द्वारा पेश किए गए उपद्रव कारकों को हटाने में सुधार प्रक्रिया की प्रभावशीलता को निर्धारित करने के लिए, एक ही मक्खियों के pigmentation को फिर से इमेजेट किया गया और एक, दो, चार और आठ दिन बाद पुन: मापा गया। हालांकि, प्रकाश व्यवस्था की स्थिति और सत्रों के बीच एक्सपोजर को, यह सुनिश्चित करने के लिए जानबूझकर बदल दिया गया था कि निकालने के लिए सुधार प्रक्रिया के लिए सत्र प्रभाव हो। चित्रों को ड्रैड डिजिटल रिपॉजिटरी पर पोस्ट किया गया है।

पहला सवाल यह हुआ कि क्या सत्रों में रंजकता उपायों में व्यवस्थित अंतर था। मिश्रित मॉडल एम आईजेक = एस i + जे + में फिट होने के लिए आर 48 में एलएम 4 पैकेज का उपयोग करके इसकी जांच की गई थीपी अधिकतम और पी मिनट , जहां एम वर्णक उपाय है, एस सत्र है (यादृच्छिक प्रभाव), पेट पेटी ट्रिगाइट (यादृच्छिक प्रभाव) मापा जा रहा है, और ε है, दोनों के लिए ε ijk और M ij = A j + ε ईज। अवशिष्ट त्रुटि (सब्स्क्रिप्स चर के भीतर का स्तर हैं) एक लॉग-संभावना अनुपात परीक्षा का उपयोग परीक्षण करने के लिए किया गया था कि क्या सत्र को एक यादृच्छिक कारक के रूप में शामिल करने में काफी सुधार हुआ है; यह ( तालिका 1 ) था अपेक्षित रूप में, विचरण घटकों (आरईएमएल 48 के माध्यम से उत्पन्न) की परीक्षा से संकेत मिलता है कि सत्र प्रभाव के कारण बदलाव क्रमशः पी मैक्स और पी मिन में कुल विचलन के 67% और 70% के लिए क्रमशः ( तालिका 1 ) के बराबर है।

पंद्रह यादृच्छिक रूप से चयनित ट्राइगेट्स (या तो तीसरे या चौथे, मक्खियों की वजह से17 डिग्री सेल्सियस, 25 डिग्री सेल्सियस, या 28 डिग्री सेल्सियस पर लाल) का चयन किया गया था, और उनके औसत पी अधिकतम और पी मिनट में परिवर्तन पूरे सत्रों के दौरान शेष टरगिट के रंगद्रव्य के उपायों को सुधारने के लिए किया गया था। सही pigmentation उपायों पर विश्लेषण दोहराते हुए सत्र प्रभाव ( तालिका 1 ) का सफाया कर दिया और सत्र के प्रभाव के कारण कुल विचलन का प्रतिशत शून्य तक घटा दिया। अवशिष्ट त्रुटि एक अनुमान है, सत्र प्रभाव हटा दिए जाने के बाद एक माप त्रुटि है, और पी अधिकतम और पी मिनट के लिए 22% और 27% थी, क्रमशः ( तालिका 1 )

इसके बाद, सही डेटा का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया गया था कि क्या रंजकता और आकार के विभिन्न पहलुओं पर तापमान का प्रभाव पता लगाया जा सकता है। मिश्रित मॉडल एम ijkm = T i * डी जे + एक्स कश्मीर + ε ijkm डेटा के लिए फिट था, जहां टी डी टीर्गट (तीसरा या चौथा) है, और एक्स व्यक्तिगत मक्खी (यादृच्छिक कारक) है। क्योंकि रंजकता और तापमान के बीच का संबंध रैखिक 24 , 36 नहीं है , टी को एक सामान्य कारक माना जाता है। रंजकता के अधिकतम और न्यूनतम स्तर ( पी अधिकतम और पी मिनट ) और रंगद्रव्य बैंड की चौड़ाई और ट्रिग्रेट ( डब्लू बैंड और डब्लू टीर्जेइट ) का परीक्षण किया गया था। वर्णक बैंड ( आर बैंड = डब्लू बैंड / डब्ल्यू टीरगाइट ) की सापेक्ष चौड़ाई पर तापमान का प्रभाव भी परीक्षण किया गया था। डेटा से पता चला है कि वर्णक बैंड के पूर्ण (डब्लू बैंड ) और रिश्तेदार ( आर बैंड ) की चौड़ाई 17 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस (ट्यूकी पोस्ट-हाक टेस्ट, पी <0.05 सभी के लिए) की कमी हुई और 25 से काफी बदलाव नहीं हुआ डिग्री सेल्सियस से 28 डिग्री सेल्सियस (टुके के बाद-हाक टेस्ट, तालिका 2 , चित्रा 3 ए और 3 बी ), जो पिछले अध्ययनों के अनुरूप है 24 , 36 । पीगमेंटेशन के अधिकतम और न्यूनतम स्तर, पी अधिकतम और पी मिनट ( तालिका 2 , चित्रा -3 सी ) के लिए इसी पैटर्न को देखा गया था। रंजकता के स्तर पर तापमान का प्रभाव पहले वर्णित नहीं किया गया है, लेकिन यह शुरू में अन्य अध्ययनों के अनुरूप दिखाई देता है जो दर्शाती है कि चौथे पेट के ट्रिगेट में रंजकता का न्यूनतम स्तर जंगली प्रकार की आबादी में वर्णक बैंड की चौड़ाई के साथ सकारात्मक संबंध है। । हालांकि, इस अध्ययन के डेटा में पी मैक्स और डब्लू बैंड के बीच सकारात्मक संबंध का संकेत मिलता है, तो वे पी मिनट और डब्ल्यू बैंड के बीच एक नकारात्मक संबंध दिखाते हैं( तालिका 3 ) वर्तमान और पिछले अध्ययनों के बीच अंतर इस बात पर निर्भर हो सकता है कि आनुवंशिक और पर्यावरणीय कारकों में पेट की रंजकता के स्तर और सीमा के बीच के संबंध को कैसे प्रभावित किया गया है। इसके बावजूद, इन प्रतिनिधि के परिणाम बताते हैं कि प्रोटोकॉल न केवल गुणात्मक पद्धतियों के जरिये पहले से स्थापित रंजकता के पैटर्न की पहचान करने में सक्षम है, बल्कि नए लोगों को खुलासा करने की भी है जो गुणात्मक तरीकों का पता लगाने में सक्षम नहीं हैं।

ट्रिग्रेट की चौड़ाई पर तापमान का प्रभाव अधिक जटिल था। डी। मेलेनोगस्टर में , शरीर और अंग आकार तापमान 49 के साथ गैर-रैखिक रूप से गिरावट देता है। पिछला अध्ययनों से पता चलता है कि पांचवें पेट के ट्रिगर की चौड़ाई 16.5 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस तक 10% कम हो जाती है, और 25 डिग्री सेल्सियस से 29 डिग्री सेल्सियस 50 के मुकाबले एक और 4% कम हो जाती है। जबकि चौड़ाई में एक महत्वपूर्ण कमी हुई थी17 डिग्री सेल्सियस से 25 डिग्री सेल्सियस तक के चौथे पेट के ट्रिगाइट, तीसरे और चौथे पेट के टर्रोगिट दोनों, 25 डिग्री सेल्सियस से 28 डिग्री सेल्सियस ( तालिका 2 , चित्रा 3 डी ) की चौड़ाई में बढ़ोतरी हुई। चूंकि उदर टरगेट की चौड़ाई मूल रूप से उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित की गई है (प्रोटोकॉल में 5.9-5.10 कदम), मौजूदा और पिछले अध्ययनों के बीच असमानता आरजी स्क्रिप्ट के कारण वर्णक प्रोफ़ाइल से डब्लू टीर्गाइट को निकालती है। इसके बजाय, यह मक्खियों के जीनोटाइपों में, और पेट के टरगेट्स के सटीक पहलुओं में मापा जाता है, जिस प्रकार पेट के क्षेत्र को मापने के तरीके में अंतर को दर्शाया जा सकता है।

अगला सवाल यह सामने आया था कि क्या पद्धति में डेटा को जुड़ा हुआ है, जो कि पगमेन्टेशन के मौजूदा आकलन के जरिये एकत्र किया जाता है। ये विधियां आम तौर पर पर्यवेक्षक से पूछते हैं कि प्रत्येक फ्लाई को फ़िन के लिए एक विशेष रूप से आवंटित करेंरंजकता 15 , 30 , 32 , 33 , 34 की मात्रा के आधार पर फेनोटाइपिक वर्गों की संख्या और इसलिए वर्णक बैंड की चौड़ाई का आकलन करने की प्रेक्षक की क्षमता पर निर्भर करती है। इस उद्देश्य पद्धति को व्यक्तिपरक तरीकों की तुलना में कितनी अच्छी तरह से जांचना है, पांच पर्यवेक्षकों को चौथे पेट के ट्राइजैट के वर्णक बैंड की चौड़ाई के आधार पर महिला पेट के 45 चित्रों को रैंक करने के लिए कहा गया था। पर्यवेक्षकों में औसत रैंकिंग की तुलना डब्ल्यू बैंड पर आधारित रैंकिंग के साथ की गई थी , जो इस पद्धति का उपयोग करके मापा गया था। व्यक्तिपरक और उद्देश्य रैंकिंग ( अनुपूरक चित्रा 1 , पूरक सूचना पीडीएफ में), स्पैर्मन के = 0.7342, पी <0.0001) के बीच एक मजबूत सहसंबंध था।

एक और प्रश्न पूछेयह कैसे था कि पीजीमेंट बैंड की चौड़ाई (दृश्य विधि) की चौड़ाई को मापने की तुलना में ImageJ में रैखिक माप उपकरण का उपयोग करके डब्ल्यू बैंड को निकालने के लिए यह विधि थी। फिर, दो तरीकों ( अनुपूरक सूचना 2. पीडीएफ, ओएलएस, आर 2 = 0.4 9 , पी <0.0001) में दो आयामों का उपयोग कर एकत्र किए गए आंकड़ों के बीच एक मजबूत सहसंबंध पाया गया था। यद्यपि कम्प्यूटेशनल पद्धति ने लगातार "विज़ुअल" विधि की तुलना में रंगद्रव्य बैंड को मापने के लिए मापा था, फिर भी प्रतिगमन गुणांक 1 ( पी> 0.05) से काफी अलग नहीं था।

अंतिम प्रश्न यह समझा गया था कि क्या इस पद्धति का इस्तेमाल अन्य संदर्भों में पेट में रंजकता को मापने के लिए किया जा सकता था। पद्धति पी के लिए पी अधिकतम , पी मिनट , डब्ल्यू बैंड , और डब्लू टीर्गाइट निकाल सकती हैमहिलाओं में इथथ और छठे पेट के ट्राइजेस और पुरुषों में तीसरे और चौथे पेट के टर्रोगिट ( चित्रा 4 )। इसके अलावा, आइबीन ( 1 ) के लिए मक्खियों के उत्परिवर्तण में पी मैक्स और पी मिन में वृद्धि की पद्धति का इस्तेमाल किया जा सकता है, जो पूरे शरीर में कटेक्टिकुलर रंजकता में वृद्धि और रंगद्रव्य के पूर्वकाल के छेद के रंजकता में एक विशिष्ट वृद्धि दर्शाते हैं। बैंड 28 ( चित्रा 4 )।

आकृति 1
चित्रा 1: डी। मेलेनोगास्टर में पेट में रंजकता ( - एफ ) दो जीनोटाइप की महिलाओं में पेट में रंजकता में भिन्नता तीन तापमान (17 डिग्री सेल्सियस, 25 डिग्री सेल्सियस और 28 डिग्री सेल्सियस) में पैदा हुई थी। ए 3 और ए 4 तीसरे और चौथे पेट की तीर हैं टीईएस, क्रमशः ( जी ) पृष्ठीय पेट के ट्रिग्रेट में एक पूर्वकाल और पीछे वाला कम्पार्टमेंट शामिल होता है, जिसमें से कुछ ही हिस्सों को बिना तराजू के पेट में दिखाई देता है। डिब्बों को अलग-अलग छल्ली प्रकारों में विभाजित किया जाता है: ए 1: संयुक्त राष्ट्र, कोई बाल नहीं; ए 2: हल्के ढंग से वर्णित और बाल; ए 3: हल्के ढंग से वर्णित, बाल, और मध्यम बाल खड़े; ए 4: काले रंग का, बाल, और मध्यम बाल खड़े; ए 5: अंधेरे में वर्णित, बाल, और बड़े बाल खड़े; ए 6: संयुक्त राष्ट्र और बाल; पी 3: संयुक्त राष्ट्र और बाल; पी 2: संयुक्त राष्ट्र और कोई बाल नहीं; और पी 1: अनार-पिगमेंट और टेसेल्लेटेड वर्णक बैंड कणों a4 और a5 से बना होता है। केवल pigmented cuticles (a2-a5, हरा बॉक्स) विश्लेषण में उपयोग किया जाता है। स्केल बार = 200 माइक्रोन (एएफ) में। सभी छवियों के विपरीत को pigmentation पैटर्न को उजागर करने के लिए समायोजित किया गया है, और छवियां बोधगम्य हैं। प्रतिनिधि परिणामों को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किए गए अनजस्टेड छवियों को ड्रैड डिजिटल रिपॉजिटरी पर जमा किया जाता है।.com / files / ftp_upload / 55732 / 55732fig1large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: पेट और रंगद्रव्य को मापने के लिए चित्र और डेटा विश्लेषण। ( - एफ ) और ( - एफ ) विभिन्न नमूनों के लिए हैं और यह दिखाते हैं कि विश्लेषण विभिन्न गुणवत्ता वाले चित्रों के साथ कैसे निपटता है। ( ) उपयोगकर्ता पहले पेट (पीले रंग की रेखा), ट्राइगेट (सियान रेखा) के पूर्वकाल किनारे, और रंजक बैंड (मेजेन्टा लाइन) के पीछे के किनारे पर थोड़ा पीछे की रेखा की मिडलाइन को परिभाषित करता है। इमेजजे मैक्रो फिर पूर्वकाल और पोस्टर लाइनों (सफेद डैश्ड लाइन) के मध्यबिंदु से एक रेखा खींचना करता है, जो इसे आरओआई (ब्लैक बॉक्स) के रूप में बढ़ाता है, ( बी ) में बढ़ाई जाती है। ( सी ) ImageJ मैक्रो तो पूर्वआरओआई के पूर्वकाल-पीछे वाला अक्ष के साथ औसत पिक्सेल मूल्य का ट्रैक्ट करता है ध्यान दें कि इस स्तर पर, प्रोफ़ाइल को पीछे से पूर्वकाल तक पढ़ा जाता है। ( डी - ) आर मैक्रो औसत पिक्सेल मूल्यों को एक pigmentation मान में कनवर्ट करते हैं, pigmentation प्रोफ़ाइल की दिशा को उलट देता है, यह क्यूबिक स्पलाइन ( एस (x) ) ( डी ) के साथ फिट बैठता है, और पहले की गणना करता है ( एस (x) ) ) ( ) और दूसरा ( एस (एक्स) ) पट्टी के व्युत्पन्न ( एफ )। स्क्रिप्ट तब पहचानता है: टी 3 , अधिकतम रंजकता की स्थिति, जहां एस (एक्स) परिवर्तन <0 से> 0 से, पूर्वकाल से आगे बढ़कर पट्टी के पीछे से; टी 2 , स्थिति जहां रंजकता में गिरावट सबसे बड़ी है और एस (एक्स) अधिकतम है; और टी 1 , स्थिति जहां टीरगिट रंजकता अपने न्यूनतम और एस (एक्स) संक्रमण> 0 से <0 पर है, पूर्वकाल में चलती हैरोम टी 2 ,। भरोसेमंद रूप से दिखाई देने वाली ट्रिग्रेट के पूर्वकाल (छल्ली ए 2 के पूर्वकाल) उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित किया गया है। (एएफ) उन मामलों में जहां पहले व्युत्पन्न टी 1 का उपयोग नहीं किया जा सकता है, विशेषकर क्योंकि एस (एक्स) वर्णक बैंड के पूर्वकाल को पार नहीं करता है, स्क्रिप्ट टी 1 को स्थिति के रूप में परिभाषित करेगी जहां एस (एक्स) संक्रमण> 0 से <0 जब पूर्व 2 से टी 2 से आगे बढ़ते हैं इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: महिला डी। मेलेनोगास्टर में पेट में रंजकता के विभिन्न पहलुओं पर तापमान का प्रभाव। ( ) वर्णक बैंड की चौड़ाई ( डब्ल्यू बैंड , एफIigure 1)। ( बी ) वर्णक बैंड ट्राइगेस ( आर बैंड ) के अनुपात के रूप में ( सी ) अधिकतम ( पी अधिकतम , ऊपरी रेखाएं) और न्यूनतम ( पी मिन , निचला लाइन) pigmentation। ( डी ) ट्रिग्रेट की चौड़ाई ( डब्ल्यू टीरगाइट ) अंक कम से कम वर्ग का मतलब रैखिक मिश्रित प्रभाव वाले मॉडल (तालिका 2) से होता है। त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं और मार्करों द्वारा छिपा हो सकता है। काली रेखा तीसरा पेट तिरछा है। ग्रे लाइन चौथा पेट के टरगाइट है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: तीसरे और चौथे पेट के टरगेट्स के बीच रंगद्रव्य में अंतर। यह ( में दिखाया गया है आबनूस 1 मादा, ( बी ) जंगली मिट्टी, ( सी ) जंगली सूजन, और जंगली मादाओं में पांचवें और छठे पेट के टर्रगियां ( डी ) अधिकतम रंजकता, पी अधिकतम ( ई) न्यूनतम रंजकता, पी मिनट ( एफ ) वर्णक बैंड, डब्ल्यू बैंड की चौड़ाई ( जी ) वर्णक बैंड, आर बैंड की सापेक्ष चौड़ाई अलग-अलग पत्रों के साथ बार्स काफी अलग हैं (ट्यूके एचएसडी पोस्ट-हाक टेस्ट, पी <0.05)। एन = 6 को छोड़कर सभी के लिए आबनूस 1 , जहां N = 4. स्केल सलाखों = 200 माइक्रोन ( - सी ) में त्रुटि सलाखों मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। सभी छवियों के विपरीत को pigmentation पैटर्न को उजागर करने के लिए समायोजित किया गया है, और छवियां बोधगम्य हैं। कृपया क्लीइस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए यहां क्लिक करें

<टीडी> 4.08 (78%)
मॉडल तुलना भिन्न घटक (कुल का%)
पगमेन्टेशन विशेषता आदर्श df लघुगणक जैसा समीकरण (%) समीकरण (%) समीकरण (%)
पी मैक्स अनकोरक्टेड एम आईजे = ए आई + एआईटी आईजे 3 -678.28 1.94 (14%) 11.86 (86%)
एम ijk = एस i + ए जे + ε आईजेक 4 -457.95 440.66 *** 4.08 (26%) 10.71 (67%) 1.14 (7%)
पी मिनट अछूता हुआ एम आईजे = ए आई + एआईटी आईजे 3 -875.03 6.05 (9%) 59.39 (91%)
एम ijk = एस i + ए जे + ε आईजेक 4 -664.58 420.91 *** 16.67 (22%) 53.08 (70%) 6.31 (8%)
पी अधिकतम सुधार किया एम आईजे = ए आई + एआईटी आईजे 3 -445.05 1.15 (22%)
एम ijk = एस i + ए जे + ε आईजेक 4 -444.88 0.3378 4.08 (78%) 0.01 (<1%) 1.14 (22%)
पी मिन सही एम आईजे = ए आई + एआईटी आईजे 3 -649.9 16.67 (73%) 6.24 (27%)
एम ijk = एस i + ए जे + ε आईजेक 4 -649.9 0 16.67 (73%) 0 6.31 (27 प्रतिशत)

तालिका 1: ट्रिगर और सत्र के प्रभाव के रैखिक मिश्रित प्रभाव मॉडल ट्रिगर और सत्र के प्रभाव के रैखिक मिश्रित प्रभाव मॉडलपांच सत्रों में 50 टरगेट्स की पीढ़ी रंजकता ( पी मैक्स और पी मिन ) री-मापी गईं, जिसमें रेयल के माध्यम से अनुमानित घटकों का अनुमान लगाया गया था। मॉडल रैखिक मिश्रित प्रभाव वाले मॉडल थे। एम : रंजकता माप; : व्यक्तिगत tergite मापा; एस : सत्र; Ε : अवशिष्ट त्रुटि महत्वपूर्ण X² बोल्ड में दिखाए जाते हैं। * पी <0.05 ** पी <0.01 *** पी <0.001

विशेषता तापमान tergite तापमान
एक्स तेरगाइट
पी अधिकतम एफ- आरटीओ 8.14 55.59 6.6
पी 0.002 <0.001
पी मिनट एफ- आरटीओ 4.41 66.11 6.36
पी 0.026 <0.001 0.002
डब्ल्यू बैंड एफ- आरटीओ 113.93 0.01 0.64
पी <0.001 0.931 0.531
डब्ल्यू टीरगाइट एफ- आरटीओ 1.79 0.92 5.11
पी 0.191 0.338 0.007
आर बैंड एफ- आरटीओ 27.66 0.08 1.46
पी <0.001 0.782 0.23

तालिका 2: तापमान और ट्रिग्रेट पहचान का प्रभाव तापमान और ट्रिग्रेट पहचान का प्रभाव पांच सत्रों में 50 टरगेट्स में पेट की रंजकता के विभिन्न पहलुओं को पुन: मापा गया। मॉडल रेखीय मिश्रित-प्रभाव वाले मॉडल थे, जिनमें व्यक्तिगत उड़ानें एक यादृच्छिक कारक के रूप में शामिल थीं। पी अधिकतम : अधिकतम रंजकता (सही); पी मिनट : न्यूनतम रंजकता (सही); डब्ल्यू बैंड : वर्णक बैंड की चौड़ाई; डब्ल्यू टीरगाइट : ट्रिग्रेट की चौड़ाई; आर बैंड : रंजक बैंड की सापेक्ष चौड़ाई महत्वपूर्ण निश्चित कारक बोल्ड ( पी < 0.05) में दिखाए जाते हैं।

अवरोधन डब्ल्यू बैंड तापमान tergite
17c 25C तीसरा
पी अधिकतम β 234.35 0.069 0.063 -1.178 -0.588
एफ 29.93 5.97 54.82
पी <0.001 0.008 <0.001
पी मिनट β 223.96 -0.137 3.931 -3.024 -1.54
एफ 19.33 अवधि = "2"> 9.66 62.02
पी <0.001 0.001 <0.001

तालिका 3: रंगद्रव्य बैंड की चौड़ाई, तापमान, और pigmentation के स्तर पर तिरछा पहचान का प्रभाव। पांच सत्रों में 50 टरगेट्स में रंजकता के स्तर पर रंगद्रव्य बैंड की चौड़ाई, तापमान और ट्रिग्रेट पहचान का प्रभाव फिर से मापा जाता है। मॉडल रेखीय मिश्रित-प्रभाव वाले मॉडल थे, जिनमें व्यक्तिगत उड़ानें एक यादृच्छिक कारक के रूप में शामिल थीं। पी अधिकतम : अधिकतम रंजकता (सही); पी मिनट : न्यूनतम रंजकता (सही); डब्ल्यू बैंड : वर्णक बैंड की चौड़ाई; आर बैंड : रंजक बैंड की सापेक्ष चौड़ाई

पूरक फ़ाइल 1. अनुपूरक जानकारीY_Information.pdf "target =" _ blank "> कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2. विश्लेषण Pigmentation.R स्क्रिप्ट का कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 3. Pigmentation.ijm का माप कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुकरण आर स्क्रिप्ट कृपया इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह पद्धति कई डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए उपयुक्त मात्रात्मक रूप में वर्णक डेटा के सटीक, तेज़ और पुनरावर्तनीय अधिग्रहण के लिए अनुमति देता है। मक्खियों की एक isogenic लाइन में उदर pigmentation पर तापमान के प्रभाव पर डेटा प्राप्त करने के लिए विधि का इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, पद्धति का इस्तेमाल जीवाणुओं की पहचान करने के लिए आगे-आनुवंशिकी के अध्ययनों में किया जा सकता है, जो वर्णक पैटर्नों पर विशिष्ट जीन के प्रभावों का पता लगाने के लिए व्यक्तियों, आबादी या प्रजातियों या रिवर्स-आनुवंशिक अध्ययनों के बीच रोधक मतभेदों को विकसित करते हैं। यद्यपि, जैसा कि ऊपर चर्चा की गई है, वहाँ भी कई पढ़ाई हुई हैं जो डी। मेलेनोगास्टर पगमेन्टेशन के विकास और विकास का पता लगाया है, सटीक जिसकी यह पद्धति एक मात्रात्मक रूप में वर्णक डेटा को कैप्चर करती है, वह अधिक शक्तिशाली सांख्यिकीय दृष्टिकोण की अनुमति देती है। इससे बदले में शोधकर्ताओं को कम नमूनों का उपयोग करने की अनुमति देता है, pigmentation पैटर्न का विश्लेषण, या उन्हें अधिक सूक्ष्म को स्पष्ट करने की अनुमति देता हैरंजकता के पहलुओं इसके अलावा, इस विधि को मक्खी के विच्छेदन की आवश्यकता नहीं होती है, जिससे नमूना को अतिरिक्त विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे कि आकारिकी माप या जीनोटाइपिंग दरअसल, इस पद्धति का उपयोग संभवतः अनैतिक घावों पर किया जा सकता है, जो उसके बाद उनके रंगद्रव्य लक्षणों के आधार पर चुनिंदा रूप से नस्ल जा सकता है।

छवि विश्लेषण के माध्यम से वर्णक को मापने के साथ एक संभावित मुद्दा यह है कि pigmentation मान एक्सपोजर और रोशनी की स्थिति के तहत प्रतिबिंबित कर सकते हैं जिसके तहत एक छवि ली गई थी, बजाय रंजकता के स्तर के बजाय निश्चित प्रकाश स्तरों का उपयोग करते हुए, प्रकाश की स्थिति, बढ़ाई, और जोखिम इन मुद्दों को कम करने में मदद करता है, यह संभावना है कि सत्र प्रभावों के लिए पूरी तरह से नियंत्रित करने के लिए प्रत्येक सत्र में कई दोहराने नियंत्रण छवियां लेने के लिए अभी भी आवश्यक होगा। इस पद्धति में प्रत्येक सत्र में पुन: इमेजिंग पन्द्रह नियंत्रण नमूने शामिल हैं और पी मा में से-सत्र परिवर्तन का उपयोग करते हुएसत्र और प्रभाव का पता लगाने और खत्म करने के लिए एक्स और पी मिनट । हालांकि, नियंत्रण नमूने की सटीक संख्या को पुनः इमेज किया जाना चाहिए इमेजिंग हार्डवेयर और सॉफ़्टवेयर का उपयोग किया जा रहा है, उपयोगकर्ता के लिए ब्याज की रंजकता के पहलू और उपचार के बीच कितनी परिवर्तनीय है और प्रत्येक में कितनी छवियां ली जाती हैं सत्र। एक प्रारंभिक प्रयोग का आयोजन करना जिसमें पांच सत्रों से एक ही नमूने पुनः इमेज किए जाते हैं, उपयोगकर्ता सत्र प्रभाव के कारण भिन्नता, नमूना पहचान के कारण विचरण, और अवशिष्ट विचरण (जो सुधार के बाद माप त्रुटि का अनुमान है) की अनुमति देगा सत्र प्रभाव के लिए) ( तालिका 1 ) इन मानों का उपयोग अनुमान लगाने के लिए किया जा सकता है कि प्रत्येक सत्र में कितने नियंत्रण चित्रों को सत्र प्रभाव के लिए पता लगाने और नियंत्रित करने की आवश्यकता है। एक सरल आर स्क्रिप्ट लिखा गया है और इस तरह के प्रारंभिक प्रयोग से डेटा का इस्तेमाल पूरे सत्र में वर्णक उपायों को अनुकरण करने के लिए किया गया है। इसे इस्तेमाल किया जा सकता हैजांचने के लिए कि सत्र प्रति सत्र नियंत्रण छवियों की संख्या सत्र प्रभाव को दूर करने के लिए पर्याप्त है। यह स्क्रिप्ट अनुपूरक फ़ाइल के रूप में प्रदान की जाती है।

यदि उपयोगकर्ता चिंतित हैं कि सत्र के भीतर उपद्रव कारक हैं, तो वे जॉन एट अल, 2016 41 में वर्णित सभी सत्रों में एक ही नमूना कई बार फिर से बदल सकते हैं। इस मामले में, एक नमूना नमूना के लिए [sampleID] को प्रत्येक बार एक सत्र के भीतर पुनः इमेजेट किया जाना चाहिए ( जैसे, कंट्रोल 1, कंट्रोल 2, कंट्रोल 3, आदि ); अन्यथा, इमेजिंग सॉफ्टवेयर एक ही नाम की नई छवि के साथ पिछली छवि को बदल देगा। सुधार कार्य डुप्लिकेट छवियों पर अपने सुधारों को समान रूप से आसन्न सत्रों के बीच [sampleID] के साथ रखता है और यह सही होगा, चाहे एक ही नमूना कई सत्रों में और सत्रों के बीच फिर से इमेज हो या नियंत्रण सत्रों का एक ही सेट सत्रों के बीच चित्रित किया जाए या नहीं। भले ही कैसे वेंई नियंत्रण छवियों को लिया जाता है, सत्रों को ब्लॉक के रूप में माना जाना चाहिए, और जहां संभव हो, उपयोगकर्ताओं को एक यादृच्छिक ब्लॉक डिजाइन का उपयोग करना चाहिए ताकि सुधार के बाद रहने वाले किसी भी सत्र के प्रभाव को सांख्यिकीय रूप से नियंत्रित किया जा सके। इसे नाकाम रहने के लिए, नमूने को सत्रों को बेतरतीब ढंग से सौंपा जाना चाहिए ताकि सत्र प्रभाव प्रायोगिक कारकों से नहीं चकित हो।

प्रोटोकॉल एक pigmentation प्रोफ़ाइल की पीढ़ी पर निर्भर करता है जो कि प्रत्येक टीरगाइट में रंगद्रव्य में परिवर्तन को दर्शाता है। इस प्रोफाइल को पैदा करने के साथ एक मुद्दा पेट की छल्ली को कवर करने वाले काले बाल हैं, जो ट्रिगेट पार करने वाले किसी भी पूर्वकाल-पश्चरीय रेखा से निरंतर रूप से विभाजित होते हैं। प्रोटोकॉल छेद के एक बैंड भर में pigmentation प्रोफ़ाइल औसत लेने के द्वारा इन बालों द्वारा उत्पन्न शोर कम कर देता है। इसके बावजूद उपयोगकर्ता आरओआई की चौड़ाई चरण 5.6 में 1 पिक्सेल पर सेट कर सकते हैं यदि वे प्रोफाइल बनाना चाहते हैं जो छल्ली की पतली रेखा पर आधारित हैं। इसके अलावा, उपयोगकर्ता टी का विश्लेषण कर सकते हैंवह एक ही छवि कई बार, एक खंड के अंदर वर्णक बैंड की चौड़ाई में परिवर्तन पर कब्जा करने के लिए pigmentation प्रोफ़ाइल की पार्श्व स्थिति बदल रहा है इस मामले में, हालांकि, प्रयोक्ताओं को एक ही चित्र को कई बार प्रतिलिपि बनाने की आवश्यकता होगी और चरण 5 के संचालन के पहले प्रत्येक प्रति एक अनूठी नाम देना होगा, क्योंकि ImageJ मैक्रो उसी नाम की प्रोफाइल को अधिलेखित करेगा।

Pigmentation प्रोफ़ाइल का निर्माण करते समय एक दूसरा महत्वपूर्ण विचार है, क्यूबिक स्पलाइन के चौरसाई पैरामीटर, जो कि pigmentation R स्क्रिप्ट के विश्लेषण में spline.der.er फ़ंक्शन (एल 63) के भीतर परिभाषित किया गया है। उचित चिकनाई पैरामीटर इमेजिंग सेटअप और रिजोल्यूशन पर निर्भर करता है। प्रोफ़ाइल को चौरसाई करने के परिणामस्वरूप टी 1 , टी 2 और टी 3 ( चित्रा 2 डी और 2 डी ') के निर्देशांक की गणना करने के लिए इस्तेमाल की गई स्पलाइन प्रोफ़ाइल की विशेषताओं का नुकसान हो सकता है। इसके विपरीत, अंडर-चौरसाई बढ़ जाती हैप्रोफ़ाइल का शोर और परिणामस्वरूप समन्वय निष्कर्षण की सटीकता। चेक फंक्शन पट्टी और उसके डेरिवेटिव का एक ग्राफ़िकल सारांश तैयार करता है और इसका उपयोग किसी उपयुक्त चौरसाई पैरामीटर को चुनने के लिए दृश्य क्यू के रूप में किया जा सकता है।

यहां वर्णित कार्यप्रणाली महिला और पुरुष डी। मेलेनोगास्टर में तीसरे और चौथे पेट के ट्राइगेट के रंगद्रव्य पर डेटा कैप्चर करने पर केंद्रित है। हालांकि, प्रतिनिधि के परिणाम यह दर्शाते हैं कि यह महिलाओं के पांचवें और छठे पेट वाले क्षेत्रों के रंगद्रव्य को मापने के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, कार्यप्रणाली जीन के म्यूटेंट के कारण फेनोटाइप में भिन्नता का पता लगा सकती है जो कि रंजकता को प्रभावित करती है। छवि जे मैक्रो और आर स्क्रिप्ट आसानी से अलग डी। मेलेनोगस्टर प्रजातियों के पेट में या दूसरे करों में अन्य शरीर के अंगों के रंजकता को मापने के लिए रंगद्रव्य को मापने के लिए आसानी से संशोधित किया जा सकता है, बशर्ते पिगमेंटेशन पैटर्न रूढ़िवादी है। अंत में, पद्धतिआरजीबी में छवियों को कैप्चर करके और अलग-अलग प्रत्येक चैनल का विश्लेषण करके वर्णक रंग के पहलुओं को मापने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

सामान्य तौर पर, यह पद्धति , फीनॉमिक्स 51 , 52 के उभरते हुए क्षेत्र का हिस्सा है। Phenomics का लक्ष्य जन्यिक और पर्यावरणीय परस्पर क्रियाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए बड़े रोग-आयामी फ़ॉरिफ़ाइपिक डाटासेट उत्पन्न और विश्लेषण करना है, जो रोग सहित फ़नोटाइप को प्रभावित करते हैं और जैविक विविधता उत्पन्न करने के लिए ये इंटरैक्शन कैसे विकसित होते हैं। अपनी संभावनाओं को पूरा करने के लिए phenomics के लिए, हालांकि, phenotypic डेटा प्राप्त करने के लिए तरीकों सरल और आसानी से विभिन्न phenotypes के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, साथ ही आसानी से उपलब्ध है मानक उपकरण का उपयोग कर लिया गया छवियों का विश्लेषण करने के लिए ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, यह पद्धति इस लक्ष्य को हासिल करने में सहायता करती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा IOS-1256565 और IOS-1557638 को ऐडवर्ड्स से वित्त पोषित किया गया था। हम पेट्रीसिया विटकोप और तीन अनाम समीक्षकों को इस पत्र के पहले संस्करण पर उनकी सहायक टिप्पणियों के लिए धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867

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पेट में रंजकता को बढ़ाते हुए<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
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Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).More

Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).

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