Detta arbete presenterar en metod för att snabbt och exakt kvantifiera abdominal pigmentering av Drosophila melanogaster med hjälp av digital bildanalys . Denna metod effektiviserar förfarandena mellan fenotypförvärv och dataanalys och innefattar provmontering, bildförvärv, pixelvärdesutvinning och egenskapsmätning.
Pigmentering är ett morfologiskt enkelt men mycket variabelt drag som ofta har adaptiv betydelse. Den har fungerat i stor utsträckning som en modell för att förstå utvecklingen och utvecklingen av morfologiska fenotyper. Abdominal pigmentering i Drosophila melanogaster har varit särskilt användbar, så att forskare kan identifiera de loci som ligger till grund för inter- och intraspecifika variationer i morfologi. Hittills har D. melanogaster bukpigmentering i stor utsträckning analyserats kvalitativt, genom scoring, snarare än kvantitativt, vilket begränsar formerna för statistisk analys som kan appliceras på pigmentationsdata. Detta arbete beskriver en ny metod som möjliggör kvantifiering av olika aspekter av abdominalpigmenteringsmönstret hos vuxen D. melanogaster . Protokollet innehåller provmontering, bildinspelning, datautvinning och analys. All programvara som används för makroer för bildinspelning och analysfunktionSkrivet för open-source bildanalys. Fördelen med detta tillvägagångssätt är möjligheten att exakt mäta pigmenteringsegenskaper med hjälp av en metod som är mycket reproducerbar över olika bildsystem. Medan tekniken har använts för att mäta variation i tergalpigmenteringsmönstren hos vuxen D. melanogaster är metoden flexibel och i stor utsträckning tillämplig på pigmenteringsmönster i otaliga olika organismer.
Pigmentering visar enorm fenotypisk variation mellan arter, populationer och individer, och även inom individer under ontogeni 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Även om det finns otaliga studier av pigmentering i ett stort antal djur har pigmentering kanske bäst studerats i Drosophila melanogaster , där molekylärgenetics fulla kraft har använts för att belysa de utvecklings- och fysiologiska mekanismer som reglerar pigmentering och hur dessa mekanismer utvecklas 1 , 6 . Mycket är känt om gener som reglerar den biokemiska syntesen av pigment i D. melanogaster 7 , 8 och de gener som styr den tidsmässiga och rumsliga diFördelning av denna biosyntes 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Vidare har genetisk kartläggning identifierat de genetiska loci som ligger bakom intra- och interspecifika skillnader i pigmentering i D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Förhållandena mellan pigmentering och pleiotropa egenskaper, såsom beteende 18 , 19 och immunitet 19 , 20 har också undersökts, liksom den adaptiva betydelsen av pigmenteringsmönstren 15 , 21 , 22 . Som sådan har pigmentering i D. melanogaster framkommit som en kraftfull men enkel mOdel för utveckling och utveckling av komplexa fenotyper.
Pigmentering i vuxen D. melanogaster kännetecknas av tydliga mönster av melanisering över kroppen, särskilt på vingarna och dorsalt thorax och buken. Det är pigmentering av varje kutikulär platta (tergit) på dorsaltabben, men det har fått mest forskningsinspektion. Det finns stor variation i denna pigmentering ( Figur 1A- F ), på grund av både genetiska 17 , 23 och miljömässiga 24 , 25 faktorer. Kutiklet i en buk-tergit består av främre och bakre utvecklingsfack ( Figur 1G ), som var och en kan vidareuppdelas beroende på pigmentering och ornamentation 26 . Det främre facket innehåller sex nagelbandTyperna (a1-a6) och det bakre facket innehåller tre (p1-p3) ( figur 1G ). Av dessa foldas pl, p2 och a1-kutiklet typiskt under tergiten i osträckta buken så att de är gömda. Den tillförlitliga synliga nageln kännetecknas av ett band av tung pigmentering, här kallad "pigmentband", bestående av nageltyper a4 (hårig med måttliga borstar) och a5 (håriga med stora borstar) med bandets bakre kant Mer intensivt pigmenterad än den främre kanten ( figur 1G ). Anterior till detta band är en region av lätt pigmenterad hårig kutikula, som har borst posteriorly (a3) men inte främre (a2). Variation i pigmentering mellan flugor observeras både i pigmentens intensitet och i pigmentbandets bredd. I allmänhet är variationen störst i de mest bakre segmenten (buksegment 5, 6 och 7) och är lägre i de mer främre segmenten (bukSegment 3 och 4) 24 . Vidare finns det en sexuell dimorfism vid D. melanogasterpigmentering , där män generellt har fullpigmenterad femte och sjätte buk-tergit ( Figur 4C ).
I de flesta studier av bukpigmentering i D. melanogaster har pigmentering behandlats som en kategorisk eller ordinär egenskap, mönstret mätt kvalitativt 27 , 28 , 29 eller halvkvantitativt i en skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Dessa metoder har oundvikligen en brist på precision, och eftersom de är beroende av den subjektiva bedömningen av pigmentering är det svårt att jämföra data mellan studier. Flera författare har kvantifierat de rumsliga dimensionerna för pigmentering 38 , 39 , intensiteten av pigmentering av en särskild kutikeltyp 23 , 25 , 39 , 40 eller pigmentens genomsnittliga intensitet över hela buk-tergiten som helhet 41 , 42 , 43 . Ändå mäter dessa kvantifieringsmetoder inte både intensiteten och den rumsliga fördelningen av bukpigmentering samtidigt och därmed fångar inte nyanser av hur pigmentering varierar över abdomenOminal tergit. Vidare fordrar flera av dessa kvantifieringsmetoder 38 , 41 , 42 , 43 dissektion och montering av bukpartikeln. Detta är både tidskrävande och förstör provet, vilket gör det otillgängligt för ytterligare morfologiska analyser. Eftersom förståelsen för utveckling och utveckling av bukpigmentering fördjupas, kommer mer sofistikerade verktyg att snabbt och exakt mäta både rumsfördelningen och pigmentens intensitet.
Det övergripande målet med denna metod är att utnyttja digital bildanalys för att erhålla ett replikerbart och mer exakt mått på bukpigmenteringen i D. melanogaster . Metoden omfattar tre steg. För det första är den vuxna flyget icke destruktivt monterad, och en digital bild av dorsal buken tas. För det andra använder användaren ett ImageJ-makroDefinierar en främre-posterior remsa av pixlar som sträcker sig från framsidan av a2-kutiklet till den bakre delen av a5-kutiklet (grön lådan, figur 1G ) på både det tredje och det fjärde buksegmentet. Det genomsnittliga pixelvärdet över bredden av denna remsa extraheras sedan längs sin längdaxel, vilket alstrar en profil som fångar rumsfördelningen och intensiteten av pigmenteringen när den ändras från den främre till den bakre delen av tergiten. För det tredje används ett R-skript för att beskriva pigmenteringsprofilen matematiskt med hjälp av en kubisk spline. R-skriptet använder sedan spline och dess första och andra derivat för att extrahera bredden på a2-a5-kutiklet, pigmentbandets bredd och pigmentens maximala och minsta nivåer. Metoden kvantifierar därför både de rumsliga egenskaperna och djupet av bukpigmenteringen.
Denna metod kvantifierar pigmenteringen av den tredje och fjärde buken tergiten,Som har varit i fokus för många tidigare studier 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , antingen exklusivt eller i kombination med mer bakre tergiter. Även om det är mindre variabelt än den femte och sjätte buk-tergiten, är den tredje och fjärde tergiten inte helt pigmenterad hos män, så detta protokoll kan tillämpas på både män och kvinnor. Trots detta kan protokollet användas för att mäta pigmentering i femte och sjätte buk-tergiten hos kvinnor. Vidare bör mindre modifieringar av de skript som används för att extrahera pigmenteringsprofilens egenskaper låta metoden användas för att kvantifiera variationen i pigmentering i en mängd andraorganismer.
Denna metod möjliggör det exakta, snabba och repeterbara förvärvet av pigmenteringsdata i en kvantitativ form som är lämplig för flera nedströmsanalyser. Metoden har använts för att erhålla data om effekten av temperatur på abdominal pigmentering i en isogen linje av flugor. Metoden kan emellertid användas i fram-genetikstudier för att identifiera gener som ligger till grund för pigmentationsskillnader mellan individer, populationer eller arter eller omvandlingsgenetiska studier för att utforska effekter…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Science Foundation beviljar IOS-1256565 och IOS-1557638 till AWS. Vi tackar Patricia Wittkopp och tre anonyma granskare för deras hjälpsamma kommentarer till en tidigare version av detta dokument.
Dumont #5 Biology Forceps | FST | 11252-30 | |
Agar | Sigma-Aldrich | 5040 | |
Dissecting Scope | Leica | MZ16FA | |
Base | Leica | MDG41 | |
Camera | Leica | DFC280 | |
Gooseneck Cold Light Source | Schott | ACE 1 | |
Image Acquisition Control Software | Micro-Manager v1.3.20 | https://micro-manager.org/ | |
Image Analysis Software | ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
Data Analysis Software | R 3.3.2 | https://www.r-project.org/ | |
LED | Thor Labs | LEDWE-15 | |
Multimeter | Fluke | Fluke 75 Series II | |
60 x 15 mm Petri dish | Celltreat Scientific Products | 229663 | |
Stage micrometer | Klarman Rulings, Inc. | KR-867 |