Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

جليكونجينيرينج الأيض حمض اللعابي استخدام N-الأسيل-تعديل مانوسامينيس

Published: November 25, 2017 doi: 10.3791/55746
Automatic Translation
1,2, 3
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

Summary

حمض اللعابي وحدة أحادي نموذجية الموجودة في جليكوكونجوجاتيس. أنها تشارك في عدد كبير تفاعلات الجزيئية والخلوية. هنا نقدم طريقة لتعديل التعبير الحامض اللعابي سطح الخلية باستخدام جليكونجينيرينج الأيضية مع مشتقات N-أسيتيلمانوساميني.

Abstract

حمض اللعابي (سيا) مكوناً هاما جداً من جليكوكونجوجاتيس، مثل ن-و يا--جليكانس أو جليكوليبيدس. نظراً لموقعها في تيرميني الحد من غير اليغو-والسكريات، فضلا عن الخصائص الكيميائية الفريدة، وحمض اللعابي تشارك في العديد من التفاعلات يجند مستقبلات مختلفة. عن طريق تعديل التعبير عن الحامض اللعابي على سطح الخلية، سيتأثر وبالتالي التفاعلات تعتمد على الحامض اللعابي. وهذا يمكن أن يكون مفيداً للتحقيق في التفاعلات تعتمد على الحامض اللعابي ولديه القدرة على التأثير على بعض الأمراض بطريقة مفيدة. عن طريق التمثيل الغذائي جليكونجينيرينج (MGE)، يمكن أن يكون التضمين التعبير عن الحامض اللعابي على سطح الخلية. هذه الوثيقة، خلايا أو أنسجة الحيوانات كامل حتى يتم التعامل مع تعديل C2 مشتقات N-أسيتيلمانوساميني (مانك). هذه السكريات الأمينية تعمل كجزيئات السلائف حمض اللعابي ولذلك إلى الأنواع الحامض اللعابي المقابلة وأعربت عن جليكوكونجوجاتيس. تطبيق هذا الأسلوب ينتج تأثيرات مثيرة للاهتمام على مختلف العمليات البيولوجية. على سبيل المثال، فإنه يمكن إجراء تخفيض جذري في التعبير عن حمض بوليسياليك (بوليسيا) في تعامل الخلايا العصبية، ومما يؤثر على نمو الخلايا العصبية والتمايز. وهنا نعرض التوليف الكيميائي لاثنين من المشتقات الأكثر شيوعاً-أسيلمانوساميني تعديل C2 N، N-بروبيونيلمانوساميني (مانبروب) فضلا عن ن-بوتانويلمانوساميني (مانبوت)، وكذلك إظهار كيف أن هذه غير الطبيعية ويمكن تطبيق السكريات الأمينية في خلية ثقافة التجارب. التعبير عن الأنواع المعدلة الحامض اللعابي كمياً من كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) وكذلك تحليل عبر الطيف الكتلي. يتم توضيح آثار على التعبير حمض بوليسياليك عبر وصمة عار الغربية استخدام جسم حمض بوليسياليك متاحة تجارياً.

Introduction

حمض اللعابي هو أحادي التي ترد عادة في تيرميني عدم الحد من جليكوكونجوجاتيس، مثل ن-و يا--جليكانس أو جليكوليبيدس. من بين جميع السكريات الأحادية، قد الحامض اللعابي بعض الخصائص الكيميائية الفريدة. أنها العمود الفقري ذرة ج 9، مجموعة كاربوكسيليك في موقف C-1، ديبروتوناتيد ومشحونة سلبا وبالتالي تحت الظروف الفسيولوجية، ووظيفة أمينية في موقف C-5. على الرغم من أن ما يزيد على 50 طبيعيا متغيرات حامض اللعابي اتسمت بتاريخ1، الشكل السائد للحامض اللعابي وجدت في البشر حمض ن-أسيتيلنيورامينيك (Neu5Ac). ثدييات أخرى أيضا مقادير أعلى من N-جليكوليلنيورامينيك الحمضية (Neu5Gc)2،3.

نظراً لموقعها المكشوفة في جليكوكونجوجاتيس، وحمض اللعابي تشارك في عدد كبير من مستقبلات-يجند التفاعلات، مثلاً، ملزمة تعتمد هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا إلى الخلايا المضيفة4. حانمه حامض اللعابي مع الوظائف البيولوجية الهامة، وبخاصة أثناء امبريوجينيسيس وفي الجهاز العصبي، حمض بوليسياليك. حمض بوليسياليك بوليمر ليصل إلى 200 ألفا 2، 8-ترتبط اللعابي الأحماض. الناقل البروتين الرئيسي لحمض بوليسياليك هو جزيء التصاق الخلايا العصبية (نكام). التعبير حمض بوليسياليك ينظم الملكية لاصقة من نكام في هذا التعبير حمض بوليسياليك يقلل الالتصاق ويزيد اللدونة مع الجهاز العصبي5.

سوف تؤثر التغييرات في التعبير عن الحامض اللعابي (بولي) في نهاية المطاف العديد من التفاعلات البيولوجية المختلفة. يمكن استخدام هذا لدراسة العمليات المعروفة اللعابي حمض تعتمد على مستوى جزيئي، للكشف عن التفاعلات جليكوكونجوجاتي الرواية، أو استكشاف النهج العلاجية الممكنة. وهناك أساليب مختلفة المتاحة التي يمكن أن يكون التضمين التعبير عن الحامض اللعابي على سطح الخلية، على سبيل المثال في المعاملة مع الحامض اللعابي محددة جليكوسيداسيس (سياليداسيس)، تثبيط الإنزيمات المشاركة في التركيب الحيوي الحامض اللعابي6 ،،من78، أو هدمت أو تغيير التعبير عن إنزيم رئيسي من الحامض اللعابي الحيوي9.

هو أسلوب تنوعاً آخر تعدل التعبير الحامض اللعابي MGE (الهندسة الأيضية المعروف أيضا oligosaccharide، وزارة التربية والتعليم). هنا، تعامل مع مشتقات مانك غير الطبيعية التي تتحمل تعديلات C2 الأمينية الخلايا أو الأنسجة، أو حتى الحيوانات. يجري السلائف جزيئات للحامض اللعابي، بعد امتصاص الخلوية، النظير مانك هذه الأحماض اللعابي يستقلب إلى غير الطبيعي أحادي الاتجاه ويمكن التعبير عنها في جليكوكونجوجاتيس سياليلاتيد. الخلايا تعامل مع مشتقات مانك تحمل الاليفاتيه C2-التعديلات، مثل مانبروب أو مانبوت، إدراج حمض ن-بروبيونيلنيورامينيك (Neu5Prop) أو حمض--بوتانويلنيورامينيك ن(Neu5But) في جليكوكونجوجاتيس على10 , 11-باستخدام المجموعات الوظيفية التي أدخلت إلى C2-موقف مانك، ويمكن أن يقترن الأحماض اللعابي غير الطبيعية التي تحدث، مثلاً، عن طريق ربط شتاودنغر أو سيكلواديشن الكن أزيد، مع الأصباغ الفلورية، وبالتالي تصور على سطح الخلية12.

التعبير عن هذه الأحماض اللعابي غير الطبيعي له تأثيرات مثيرة للاهتمام في العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التهابات الممرض والالتصاق والهجرة للخلايا السرطانية والتصاق الخلايا عامة، فضلا عن الأوعية الدموية والتمايز (للمراجعة انظر: راتيل et al. 13)-من المثير للاهتمام، MGE مع ن-اشيل تعديل مانوسامينيس يمكن أيضا أن تتداخل مع التعبير عن حمض بوليسياليك. حمض بوليسياليك تم إنشاؤه بواسطة بوليسياليلترانسفيراسيس مختلفة اثنين (ST8SiaII و ST8SiaIV). وقد ثبت، تحول دون أن بوليسياليلترانسفيراسي ST8SiaII بالسلائف حمض اللعابي غير طبيعية، مثل مانبروب أو مانبوت،من1415. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد ثبت في الخلايا البشرية نيوروبلاستوما أن تطبيق مانبروب أو مانبوت كما يقلل من سياليليشن في مجموع15.

MGE مع N-اشيل تعديل مانوسامينيس هو وسيلة سهلة لتطبيق الأسلوب الذي تم استخدامه بنجاح، ليس فقط في الثدييات وثقافة الخلية البكتيريا بل أيضا في جميع الحيوانات من مختلف الأنواع، مثل ايليجانس كاينورهابديتيس16، الزرد17، أو الفئران18،19،،من2021. خصوصا المشتقات ماناك تحمل التعديلات الاليفاتيه، بما في ذلك مانبروب ومانبوت، ماما السامة للخلايا، حتى في تركيزات ميليمولار في خلية ثقافة متوسطة أو بلازما الدم. وعلاوة على ذلك، فسهلة نسبيا لتوليف.

هنا، يمكننا تقديم تفاصيل عن كيفية استخدام MGE مع ن-أسيتيل تعديل مانوسامينيس. أولاً، يتم شرح التوليف الكيميائي لاثنين من المشتقات مانك الأكثر استخداماً في هذا المجال، مانبروب ومانبوت،. وبعد ذلك، نعرض كيف يمكن تطبيق MGE في تجربة في فيفو . وكمثال على ذلك، اختير خط الخلية نيوروبلاستوما كيلي لإثبات انخفاض التعبير عن حانمه بوليسياليك الغربية لطخة بعد العلاج مع مشتقات مانك. الأحماض اللعابي غير طبيعية على سطح الخلية كمياً من [هبلك] وكذلك تحليل عبر الطيف الكتلي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة

  1. إعداد حل ميثوكسيد الصوديوم 3 مم
    1. حل ميثوكسيد الصوديوم ملغ 8.1 في الميثانول 50 مل (3 مم) في زجاجة زجاج 100 مل مع شريط إثارة. تخزين في درجة حرارة الغرفة (RT) لعدة أسابيع.
  2. إعداد المخزن المؤقت تريس-HCl
    1. الجمع بين 8.766 ز كلوريد الصوديوم و 157 مغ تريس-HCl 146 مغ يدتا في زجاجة زجاج 100 مل مع شريط ضجة وتذوب في الماء 80 مل.
    2. إضافة هيدروكسيد الصوديوم (1 م، في الماء) أو HCl (20%، في المياه) إلى الحل إثارة، مع مراعاة درجة الحموضة مع مقياس الأس الهيدروجيني، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
    3. إضافة كمية المياه اللازمة لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 100 مل. تصفية الحل باستخدام نظام تصفية عقيمة 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: سوف تحتوي على 100 مل تريس-HCl المخزن المؤقت 150 مم كلوريد الصوديوم، 10 تريس-HCl، و 5 ملم يدتا (pH 8.0). ويمكن تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  3. إعداد حل أبروتينين
    1. حل aprotinin ملغ 10 في 1 مل من الماء (1.54 مم). قاسمة الحل أبروتينين إلى 10 × 1.5 مل البلاستيكية أنابيب (100 ميليلتر في كل). تخزين في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  4. إعداد حل ليوبيبتين
    1. حل ليوبيبتين 10 ملغ في 2 مل من الماء (10 مم). قاسمة الحل ليوبيبتين 10 × 1.5 مل البلاستيكية أنابيب. تخزين في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  5. إعداد الحل فلوريد (بمسف) فينيلميثيلسولفونيل
    1. حل 34.8 ملغ بمسف في 2 مل إيثانول (100 ملم). قاسمة الحل بمسف في 10 × 1.5 مل البلاستيكية أنابيب. تخزين في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  6. إعداد حل 1، 2-ديامينو-4، 5-ميثيلديوكسيبينزول-هيدروكلوريد (DMB)
    1. الجمع بين مغ 15.62 DMB، 352 ميليلتر β-ميركابتوثانول، وميليلتر 48 بيكبريتيت الصوديوم-الحل (39 في المائة)، وإضافة 9.6 مل من الماء (6.9 مم DMB و 500 مم β-mercaptoethanol وبيكبريتيت الصوديوم 0.19 في المائة). قاسمة الحل DMB في 40 × 1.5 مل البلاستيكية أنابيب (250 ميليلتر في كل). مخزن محمية من الضوء في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  7. إعداد حل حمض (تفا) تريفلورواسيتيك م 1
    1. إضافة ميليلتر 770.3 100% تفا إلى 9.23 مل من الماء في أنبوب بلاستيك 15 مل (1 م). تخزين في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.
  8. إعداد حل تفا 120 مم
    1. إضافة ميليلتر 92.4 تفا (100 في المائة) إلى 9.91 مل من الماء (120 ملم) في أنبوب بلاستيك 15 مل. تخزين في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.
  9. إعداد حل هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) 400 مم
    1. حل 160 مجم هيدروكسيد الصوديوم في 10 مل من الماء (400 ملم) في أنبوب بلاستيك 15 مل. تخزين في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.
  10. إعداد المخزن المؤقت لتحلل لطخة غربية
    1. حل 5.84 غ كلوريد الصوديوم، 0.1 غ تريس (هيدروكسيميثيل)-أمينوميثان (تريس) و 0.1 غ كاكل2ز 0.95 مجكل2ز 1 X100 تريتون في 100 مل المياه وضبط درجة الحموضة إلى 7.8. مخزن في 4 درجات مئوية. إضافة 100 ميليلتر من كل مثبط البروتياز (أبروتينين وليوبيبتين وبمسف) قبل استخدام المخزن المؤقت تحلل.
  11. إعداد الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) المخزن المؤقت
    1. حل 0.3 ز تريس، جليكاين ز 1.5، و 0.1 ز الحزب الديمقراطي الصربي في 100 مل من الماء وضبط درجة الحموضة إلى 7.3. مخزن في الرايت
  12. إعداد المخزن المؤقت لطخة غربية
    1. حل ز 0.3 تريس، جليكاين ز 1.1 في 90 مل من الماء، وإضافة 10 مل الإيثانول. مخزن في الرايت
  13. إعداد لعرقلة الحل
    1. حل ز 1 السلطة الدهون الحليب مجاناً في 25 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). دائماً إعداد جديدة.

2-تجميع مانبروب و ما يتصل نون-الأسيل-تعديل مانوسامينيس

  1. حل 431.2 ملغ هيدروكلوريد مانوساميني في 10 مل 3 مم صوديوم ميثوكسيد الحل في زجاجة زجاج 50 مل مع شريط إثارة.
  2. تبريد المخلوط على الجليد إلى 0 درجة مئوية. أن الحل الذي إثارة، إضافة ببطء dropwise 210 ميليلتر بروبيونيل الكلوريد (2.4 ميللي مول)، أو كلوريد بوتانويل ميليلتر 248 (2.4 ميللي مول) لتجميع مانبروب أو مانبوت، على التوالي. احتضان الخليط إثارة في 0 درجة مئوية ح 4.
  3. نقل الحل في أنبوب بلاستيكي 50 مل. كزة 4-8 ثقوب في غطاء أنبوب بلاستيكي بإبرة رقيقة. سرعة تجميد الحل باستخدام النتروجين السائل وبعد ذلك ليوفيليزي (تجميد جاف) فإنه لمدة 48 ساعة أو حتى أنها قد جفت تماما.
  4. مزيج هلام السليكا 350 غ 60 مع 750 مل الإيثيل وخلات/الميثانول/المياه (15:2:1) (هذا تعليق). تعبئة عمود زجاج (35 ملم وقطرها 70 سم طول) مع تعليق السليكا هلام 60 وتغسل العمود مستعدة مع إضافية 100 مل إيثيل اسيتات/ميثانول/مياه (15:2:1) قبل الاستخدام.
  5. حل المنتجات المجففة من الخطوة 2، 3 (5 غ المجفف المنتج) في 10 مل إيثيل اسيتات/الميثانول/المياه (15:2:1) وتحميل لهم باستخدام ماصة على السيليكا هلام العمود. جمع الكسور 4 مل بعد 500 مل (مانبروب). ملاحظة: سوف الوت مانبوت من العمود بعد ما يقرب من 700 مل.
  6. نقل التيد الكسور في أنابيب بلاستيكية 15 مل. كزة 3-6 فتحات في غطاء أنبوب بلاستيكي بإبرة رقيقة. السريع تجميد الحل باستخدام النتروجين السائل وبعد ذلك ليوفيليزي حتى أنها قد جفت تماما.
    ملاحظة: يمكن تخزين المنتجات المجففة بالتبريد لعدة أشهر في الرايت
  7. التحقق من نقاء المنتجات من الطيف الكتلي (انظر القسم 9).
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، النقاء يمكن أيضا التحقق من أن 1ح الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي).

3-خلية ثقافة

  1. الثقافة كيلي نيوروبلاستوما الخلايا في المتوسط معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين، 100 البنسلين يو، ستربتوميسين 100 ملغ، 2 مم L-الجلوتامين التي تحتوي على 5 مم مانك أو 5 مم مانبروب مم 5 مانبوت، في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    ملاحظة: يتم استخدام الخلايا المستزرعة في المتوسط دون مانك أو نظائرها كعنصر تحكم.
  2. قبل تطبيق مانوسامينيس، فصل الخلايا نيوروبلاستوما كيلي التي تفرخ لهم لمدة 10 دقائق مع التربسين/يدتا (0.25%، 0.02 في المائة، في برنامج تلفزيوني) والاعتماد على استخدام عداد نويباور الدائرة أو الخلية. بذور الخلايا في أرقام محددة استناداً إلى حجم اللوحة/الطبق.
    1. لقياس حمض اللعابي السكريات الأحادية، البذور 1 × 105 خلايا في 500 ميليلتر المتوسطة إلى طبق استنبات الأنسجة 48-جيدا. لتحليل الأحماض بوليسياليك، البذور 1 × 106 خلايا في المتوسط 3 مل على طبق ثقافة خلية قطرها 6 سم. احتضان CO 37 درجة مئوية و 5%2. استبدال المتوسطة كل 24 ساعة.
      ملاحظة: تأثير MGE يزداد مع الوقت الإجمالي للعلاج. لكفاءة الأيض عالية علاج الخلايا لمدة 5-7 أيام.
  3. وبعد العلاج، صب في المتوسط. غسل الأطباق/اللوحات مع برنامج تلفزيوني. فصل الخلايا التي تفرخ لهم لمدة 10 دقائق مع التربسين/يدتا (0.25%، 0.02 في المائة، في برنامج تلفزيوني). تحييد التربسين بإضافة نفس الحجم من مستنبت الخلية إلى خلايا منفصلة. نقل الخلايا المنفصلة في أنابيب بلاستيكية 15 مل. الطرد المركزي في نماذج لمدة 3 دقائق في 500 x ز وتجاهل المادة طافية.
    1. إضافة خلايا 5 مل برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي (راجع الخطوة 3، 3). كرر الإجراء الغسيل مرتين أخريين.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه خلية غسلها دون المادة طافية في-20 درجة مئوية لعدة أيام. إذا كان تعبير حمض بوليسياليك توضيح الاستمرار في الباب 10.

4-خلية تفسخ لتحليل [هبلك]

  1. إعداد المخزن المؤقت لتحلل [هبلك]
    1. تجمع المخزن المؤقت 5 مل تريس-HCl، 5 ميليلتر aprotinin الحل، 20 ميليلتر ليوبيبتين الحل، والحل بمسف 50 ميليلتر.
      ملاحظة: سوف تحتوي على 5 مل [هبلك] تحلل المخزن المؤقت 150 مم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس-HCl، 5 ملم يدتا، 1.54 ميكرومتر aprotinin، 40 ميكرومتر ليوبيبتين، و 1 مم بمسف (pH 8.0). هذا المخزن المؤقت يجب أن تكون مستعدة دائماً طازجة قبل تحلل الخلية.
  2. إعادة تعليق الخلية التي تم جمعها الكريات (الخطوة 3، 3) كل 500 ميليلتر المثلج [هبلك] تحلل-المخزن المؤقت، وفائقة-sonicate العينات مع إبرة معالج فائقة سونيك ثلاث مرات لمدة 30 ثانية في الاتساع متوسطة-عالية. تبريد العينات في الثلج لمدة 1 دقيقة على الأقل ما بين الدورات.

5-فصل كسر الغشاء

  1. الطرد المركزي في نماذج تفكيك خلية ح 2 000 20 شخص × ز و 4 درجة مئوية. فصل المادة طافية (حوالي 480 ميليلتر)، تمثل البروتينات سيتوسوليك، في أنابيب بلاستيكية 1.5 مل. تحديد تركيز البروتين هذه الكسور باستخدام، مثلاً، في برادفورد أو المقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك.
    ملاحظة: يمكن أن يرتبط تركيز البروتين (حوالي 1 ملغ/مل) من الكسور سيتوسوليك لاحقاً بقياس كميات الأنواع الحامض اللعابي محترمة. بيليه يمثل الكسر الغشاء، الذي يستخدم في الخطوة 6، 1.

6. حموضة التحلل المائي

ملاحظة: يتم تحلل اليغو-والسكريات في أغشية الخلايا بالسكريات الأحادية. علاوة على ذلك، أمكن س-تعديلات السكريات الأحادية هي تحلل، كذلك. وهذا ضروري للتحليل الكمي [هبلك]، لأن الأغلبية الساحقة من الأحماض اللعابي في كسور غشاء مدرجة بطبيعة الحال في جليكوكونجوجاتيس وربما قد تحمل س-أسيتيل أو التعديلات-لاكتوليل س.

  1. إضافة 150 ميليلتر 1 م تفا-حل للكسور غشاء المنفصلين (بيليه من القسم 5). احتضان هذه العينات ح 4 في 80 درجة مئوية مع الهز 200-600 لفة في الدقيقة.
  2. الطرد المركزي العينات لحوالي 30 دقيقة 000 20 شخص × ز و 21 درجة مئوية، استخدام أنابيب التصفية 0.5 مل مع 3 أغشية الاستبعاد كاتشين، حتى يصبح حجم المرحلة العليا أقل من 20 ميليلتر.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة للتخلص من الحطام الجزيئي أعلى.
  3. نقل المرحلة الدنيا التي تحتوي على جزيئات أصغر حجماً، بما في ذلك الأنواع الحامض اللعابي، في أنابيب بلاستيكية 2 مل. كزة 2-4 ثقوب في أغطية الأنابيب البلاستيكية بإبرة رقيقة. وتجميد العينات باستخدام النتروجين السائل السريع ثم ليوفيليزي عليها بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات المجففة لعدة أيام في الرايت استبدال غطاء دون ثقوب لتخزين أطول.

7. وسم فلوري

  1. تعليق إعادة العينات المجففة في 10 ميليلتر 120 مم تفا الحل وإضافة 50 ميليلتر DMB الحل. نقل العينات إلى أنابيب الظلام 1.5 مل لحمايتهم من الأشعة فوق البنفسجية.
  2. لمعايير، حل 1 ميليلتر Neu5Ac (60 نانوغرام/ملليلتر، في الماء) أو 1 ميليلتر Neu5Gc (60 نانوغرام/ملليلتر، في المياه) في 10 ميليلتر 120 مم تفا الحل في أنابيب الظلام 1.5 مل. إضافة 50 ميليلتر DMB الحل.
  3. احتضان هذه العينات غشاء الخلية ومعايير ح 1.5 في 56 درجة مئوية محمية من الضوء. بعد التفريخ، إضافة ميليلتر 4 مم 400 حل هيدروكسيد الصوديوم لكل عينة التوقف عن رد فعل وضع العلامات.

8. تحليل [هبلك]

ملاحظة: يتم تحليل عينات المسمى على نظام [هبلك] مزودة بعمود C18 RP (110، حجم جسيمات 3 ميكرومتر، 4.6 × 150 مم)، كاشف الأسفار، وجامع كسر. المذيبات المستخدمة هي الميثانول والاسيتو الانيتريل والمياه. تأكد من ديغا جميع المذيبات قبل القياسات، إذا كان النظام [هبلك] يفتقر ديجاسير داخلية.

  1. تعيين درجة حرارة العمود إلى 40 درجة مئوية وتكوين الكاشف ومضان مع 373 نانومتر للإثارة و 448 nm للانبعاثات، على التوالي. حقن 10 حجم العينة ميليلتر وفصل تحقيقات لمدة 50 دقيقة بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع الميثانول/الاسيتو الانيتريل/المياه (6:8:86) كما الوينت. لتحليل الطيف الكتلي، جمع قمم الفائدة.
    ملاحظة: من المتوقع Neu5Gc إلى النذرة بعد 6-8 دقيقة، Neu5Ac بعد 9-12 دقيقة، Neu5Prop بعد 17-23 دقيقة، و Neu5But بعد 38-44 دقيقة. ويمكن تخزين العينات هورمونات لعدة ح في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  2. بعد قياس كل عينة، يغسل في عمود 7.5 دقيقة في معدل تدفق 1.0 مل/دقيقة (وحدات تخزين العمود 1.5 ≈) مع الميثانول/الاسيتو الانيتريل/المياه (6:25:69) وإعادة توازن نظام 7.5 دقيقة بمعدل تدفق 1.0 مل/دقيقة مع الميثانول/الاسيتو الانيتريل/المياه (6:8:86).
  3. للتحليل الكمي، حساب المساحة تحت منحنى قمم الحامض اللعابي من اهتمام باستخدام برامج التشغيل من النظام [هبلك] كل منهما22.
    ملاحظة: يمكن أن ترتبط البيانات التي تم الحصول عليها Neu5Ac أو معيار Neu5Gc والتركيزات المقاسة البروتين في الكسور سيتوسوليك (انظر الفرع 5، 1).

9-الكتلي تحليل الحامض اللعابي السكريات الأحادية

ملاحظة: [هبلك] الاحتفاظ بقمم من الفائدة يمكن كذلك تحليلها اللوني السائل (ش) اليكتروسبراي-التأين الكتلي (أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد)، بغية التحقق من الأنواع الحامض اللعابي غير طبيعي.

  1. لتحليل الطيف الكتلي، ضخ 20 ميليلتر من العينات التي تم جمعها في نظام كاشف انتقائية LC/قداس (MSD) مع الميثانول 79.9 في المائة، وكحول الأيزوبروبيل 20%، وحمض الفورميك 0.1% الوينت ومعدل التدفق 0.5 مل/دقيقة، 4 كيلو فولت الشعرية الجهد ودرجة حرارة 350 درجة مئوية الشعرية 22 , 23.
  2. في برنامج تقييم نظام LC/MSD كل منهما، حدد ذروة الاهتمام في chromatogram أيون المجموع. عرض الطيف الشامل لذروة حلها. عرض نسبة إيجابية الجماهيري وشحن بين 300 و 700 شخص.
    ملاحظة: الوسم DMB الأحماض اللعابي يؤدي إلى زيادة في الكتلة الجزيئية من 116.2 غ/مول. الأنواع المسماة DMB الحامض اللعابي لها الجماهير الجزيئية التالية: DMB-Neu5Ac = 424.2 غ/مول، DMB-Neu5Gc = 441.8 غ/مول، DMB-Neu5Prop = 436.2 غ/مول، DMB-Neu5But = 453.2 ز/adducts الجزيئية المشتركة هي الاسيتو الانيتريل أو الصوديوم أو كحول الأيزوبروبيل.

10-الغربية وصمة عار تحليل حمض بوليسياليك في خلايا Neuroblastoma كيلي

  1. إعداد خلية ليساتيس
    1. إضافة 1 مل لطخة غربية تحلل المخزن المؤقت إلى حبيبات الخلية من الخطوة 3، 3 ودوامه. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد. دوامة كل 5 دقائق. الطرد المركزي في النماذج ل 1.5 ح 000 20 شخص × ز و 4 درجة مئوية. جمع المادة التي تحتوي على البروتينات من خلايا ليسيد طافية.
    2. تحديد تركيز البروتين الكسور البروتين، مثلاً، في برادفورد أو المقايسة اتفاق التعاون الأساسي. تمييع العينات لتركيز 1.5 ميكروغرام/ميليلتر في المخزن المؤقت لتحلل بروتين.
    3. إعداد العينات للحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة بإضافة 10 ميليلتر لايملي عينة المخزن المؤقت إلى 90 جزء من البروتين ميليلتر (1.5 ميكروغرام/ميليلتر) وتغلي العينة لمدة 5 دقائق24.
  2. إيمونوبلوتينج
    1. استخدام المواد الهلامية صحيفة بيانات السلامة-اكريلاميد 8% مع جيوب ميليلتر 20-30 والسماكة 0.75 أو 1 ملم. تشغيل الهلام في 25 mA ح 2 في الرايت
    2. بعناية إزالة الغطاء الزجاج من الجل. قطع وتجاهل الجزء العلوي من جل يحتوي على جيوب التحميل. ضع الجل على غشاء النيتروسليلوز (0.2 ميكرومتر)، كانت غارقة في المخزن المؤقت لطخة غربية. نقل البروتينات إلى النيتروسليلوز وفقا لتوصية النظام (مثلاً 250 mA ح 1 في 4 درجات مئوية).
    3. إزالة الغشاء النيتروسليلوز من النظام بلوتينج. وصمة عار وصمة عار مع بونسو الأحمر أن تصور البروتينات. نقل الغشاء النيتروسليلوز إلى غرفة بلاستيكية وإضافة 10 مل عرقلة الحل. احتضانها ح 1 في الرايت أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
    4. صب حل حظر وإضافة جسم [مونوكلونل] مكافحة-بوليسيا 735 (1 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني. احتضان الغشاء ح 1 في الرايت أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية. وبعد الحضانة، يغسل الغشاء ثلاث مرات على الأقل لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
    5. إضافة IgG المضادة الماوس [بولكلونل] جسم الثانوي (1 ميكروغرام/مل) بالإضافة إلى الفجل البيروكسيديز (HRP) أو علامة مضيئة في برنامج تلفزيوني. احتضان الغشاء ح 1 في الرايت وبعد الحضانة، يغسل الغشاء ثلاث مرات على الأقل لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
    6. نقل الغشاء على طبق من ذهب تصوير المناسبة. الكشف عن الإشارة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 2تشروماتوجرامس [هبلك] من الفلورسنت المسمى Neu5Ac، ومعايير Neu5Gc. باستخدام الأسلوب هو موضح هنا، المسمى DMB Neu5Gc عادة التيس بين 7-9 دقيقة شطف وقت، و DMB-Neu5Ac بين 10-12 دقيقة. عدة قمم أصغر في chromatogram تظهر عادة بين 2-6 دقيقة. وتمثل هذه القمم DMB الممتص ورد فعل وسيطة25.

ويبين الشكل 3 تشروماتوجرامس الممثل لخلية ليساتيس. تشروماتوجرامس المعايير المسمى DMB (الشكل 2)، بالمقارنة مع مرئية في هذه تشروماتوجرامس عدة قمم غير معرف. هذا الأكثر احتمالاً بسبب الشوائب الداخلية للخلية ليساتيس، وإلى حقيقة أن DMB لا يتفاعل مع حمض اللعابي الأنواع، ولكن أيضا مع الأحماض α-keto الأخرى الموجودة في الخلية ليساتيس، بما في ذلك بيروفات وسوكسيناتي و α-كيتوجلوتاراتي26. أن وجود كميات صغيرة من الأحماض اللعابي تحمل س-أسيتيل التعديلات التي قد لا تم المشقوق بالتحلل المائي الخليك يمكن أن يناقش أيضا كسبب لهذه القمم غير معرف23. تشروماتوجرامس من تفكيك الخلايا غير المعالجة مقارنة مع تشروماتوجرامس من الخلايا التي عولجت سابقا مع مانك أو النظير. كما هو موضح هنا، والمعاملة مع مانك غالباً ما يؤدي إلى استنفاد كامل تقريبا من Neu5Gc على سطح الخلية. قمم مرئية في تشروماتوجرامس لتفكيك الخلايا تعامل مع Neu5Prop أو Neu5But، التي لا تظهر في تشروماتوجرامس خلايا غير المعالجة. هذه القمم (تعامل الخلايا في حوالي 19 دقيقة شطف الوقت مانبروب ومانبوت للتعامل مع الخلايا في 42 دقيقة) تشير إلى ظهور الأحماض اللعابي المقابلة غير الطبيعية، Neu5Prop و Neu5Gc. كما هو موضح في القسم 8.3 من البروتوكول، يمكن تحليل تشروماتوجرامس [هبلك] من أجل تحديد مقدار مبالغ الأنواع المختلفة الحامض اللعابي في ليساتيس الخلية.

تم التحقق من حقيقة أن قمم استبقاء [هبلك] متميزة تتوافق مع أنواع معينة من الحامض اللعابي عبر الطيف الكتلي. بيانات الممثل أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد من قمم [هبلك] التي تم جمعها للفائدة ويرد في الشكل 4: طيف ذروة الاحتفاظ DMB-Neu5Ac التي تم جمعها في اللوحة اليسرى العلوية، DMB-Neu5Gc في اللوحة اليسرى العلوية، ونوعين من أنواع حمض اللعابي غير الطبيعية، DMB-Neu5Prop و Neu5But DMB في لوحات اليمنى واليسرى السفلي. رد فعل مع DMB يؤدي إلى زيادة في الكتلة الجزيئية دا 116.2، مقارنة بالأنواع الحامض اللعابي غير المسماة بهذه الصبغة. في الأطياف الشامل، عند عرض نسبة إيجابية الجماهيري وشحن العينات التي تم إدراجها بين 300 و 700، عدة قمم مرئية. وهذا يرجع إلى adduct تكوين المسبار المسمى DMB احتراما. وإلى جانب أيون البروتونية [M + H]+، أدوكتس الصوديوم [M + Na]+ و [M + 2Na-H]+ تظهر. كما الاسيتو الانيتريل (ACN) غير موجود أثناء تحليل LC، وجد adduct في أطياف الشامل (سيظهر ل DMB-Neu5Gc، الرقم 4: لوحة الأيمن العلوي). بسبب تجزئة الناجمة عن decompensation الاصطدامية التنشيط التي تم إنشاؤها في منطقة النقل اليكترونسبراي بين الشعرية والمصفاة الأولى، نزعت الحامض اللعابي ويمكن أيضا ملاحظة الأنواع [M + H]+-ح2س (كما هو موضح DMB-Neu5Ac، الرقم 4: اللوحة اليسرى العلوية)23،27. في إعداد LC، التيس DMB-Neu5Gc بعد وقت قصير من الأنواع DMB الممتص أو جزئيا رد فعل. ولذلك، قد يحتوي على مسبار DMB-Neu5Gc التي تم جمعها الشوائب التي تسببها هذه المواد الوسيطة رد فعل. وهذا بمثابة تفسيراً للمظهر من قمم غير معرف في الطيف الشامل من DMB-Neu5Gc (الشكل 4: اللوحة اليمنى العلوية).

العلاج كيلي نيوروبلاستوما الخلايا التي تحتوي على مانبروب أو مانبوت يؤدي إلى التعبير مخفض من حمض بوليسياليك في نكام، كما يتضح من تحليل لطخة غربية لغشاء الخلية من تفكيك الخلايا (الشكل 5). عادة ما تظهر حمض بوليسياليك بالقيام تشويه عدم التجانس في الحجم والمسؤول عن (≈ كاتشين 200). المعاملة مع النظير مانك يؤدي إلى الحد حمض بوليسياليك على سطح الخلايا: يعد الاليفاتيه N-سلسلة جانبية اشيل، أقوى تخفيض28.

Figure 1
الشكل 1: المبدأ العام ل MGE مع N-تعديل اشيل مانوسامينيس. بعد العلاج مع N-تعديل اشيل مانوسامينيس، وهي النظير هذه مانك يستقلب أونيديريكتيونالي (الأيض داخل الخلايا) للأحماض اللعابي غير الطبيعية المقابلة. هذه تنقل إلى غولجي، نقل إلى يقبلون oligosaccharide كل من سياليلترانسفيراسيس، ومعبرا عنه سيالوسيديس (هنا، بروتين سكري) على سطح الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تشروماتوجرامس الممثل لمعايير المسمى DMB الحامض اللعابي. Neu5Ac المسمى DMB (اللوحة العلوية) و Neu5Gc (أسفل اللوحة) تم تحليلها بواسطة [هبلك]. الاحتفاظ بأوقات (خطوط متقطعة) ومناطق ذروة كل الأحماض اللعابي حددت بعد الحقن 10 نانوغرام الأنواع المسماة DMB محترمة في النظام [هبلك]. في تشروماتوجرامس هو موضح هنا الممثل، DMB-Neu5Gc التيد بعد حوالي دقيقة 8 الاحتفاظ بالوقت و DMB Neu5Ac في 11 دقيقة، على التوالي. عدة قمم أصغر في chromatogram تظهر عادة بين 2-6 دقيقة، يمثلون الممتص وسيطة DMB ورد فعل. يظهر جزء صغير من Neu5Ac المسمى DMB كشوائب طفيفة في معيار DMB-Neu5Gc (أسفل اللوحة). يتم تعديل هذا الرقم من المرجع22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: وصف الغشاء زمنياً اللعابي الأحماض قبل DMB-[هبلك]- كانت استزراع الخلايا في غياب (لوحة غير المعالجة، والعلوي) أو وجود مع 5 مم مانك (الفريق الثاني من أعلى)، مانبروب (الفريق الثالث من أعلى)، أو مانبوت (اللوحة السفلي)، لمدة 7 أيام على التوالي. المتوسط تم تغيير كل حاء 24 خلايا تم حصادها والكسور غشاء وأعدت، المسمى مع DMB، وتحليلها بواسطة [هبلك]. واعتبرت قمم في الأوقات الاحتفاظ بين 8-9 دقيقة مقارنة تشروماتوجرامس المسمى DMB الحامض اللعابي المعايير (الشكل 2)، DMB-Neu5Gc، وقمم بين 10-11 دقيقة ك DMB-Neu5Ac. بالمقارنة مع القمم التي تم الحصول عليها من الحقن المعايير الحامض اللعابي المسمى DMB، تشروماتوجرامس من ليساتيس خلية إظهار قمم إضافية، غير معروف. هذا سبب الشوائب الداخلية التحقيقات، وكذلك إلى حقيقة أن DMB يمكن أن يتفاعل مع الحامض اللعابي في ليساتيس الخلية، بل أيضا مع الأحماض α-keto الأخرى الموجودة في الخلية ليساتيس، بما في ذلك بيروفات وسوكسيناتي و α-كيتوجلوتاراتي. القمم التي تظهر فقط في تشروماتوجرامس لعينات من الخلايا المزروعة حضور N-اشيل تعديل النظير مانوساميني تشير إلى الأحماض اللعابي غير الطبيعي المسمى DMB المقابلة. يتم تعديل هذا الرقم من المرجع22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: قداس أطياف أنواع المسماة DMB الحامض اللعابي الموجودة في خلية ليساتيس. [هبلك] الاحتفاظ بقمم من الفائدة (انظر الشكل 3) وقد جمعت وتحليلها من قبل السيدة ESI 20 ميليلتر من ضمانات الأداء التي تم جمعها في وقت لاحق قمم تم حقن النظام LC-MSD. رد فعل مع DMB يؤدي إلى زيادة في الكتلة الجزيئية 116.2 دا مقارنة بالأنواع الممتص اللعابي حمض المقابلة. يصور سبيكتروجرامس نسبة الجماهيري وشحن الإيجابية التي تم الحصول عليها من أنواع مختلفة من حمض اللعابي (DMB-Neu5Ac: اللوحة اليسرى العلوية، DMB-Neu5Gc: اللوحة اليمنى العلوية، DMB-Neu5Prop: اللوحة اليسرى السفلي، DMB-Neu5But: اللوحة اليسرى السفلي). الواجب adduct تكوين عدة قمم مرئية. وإلى جانب أيون البروتونية [M + H]+، أدوكتس الصوديوم [M + Na]+ و [M + 2Na-H]+ تظهر. الاسيتو الانيتريل، الذي موجود أثناء تحليل LC، ويمكن أيضا الاطلاع على أدوكت (اللوحة اليمنى العلوية). ويمكن ملاحظة المجففة DMB-Neu5Ac، الذي تم إنشاؤه بواسطة التجزئة في الصك [M + H]+-ح2س (اللوحة اليسرى العلوية). التحقيق DMB-Neu5Gc التي تم جمعها قد تحتوي على الشوائب التي تسببها الممتص DMB، فضلا عن رد فعل المواد الوسيطة التي ينظر إليها على أنها قمم غير معرف إضافية (اللوحة اليمنى العلوية). تزاول، الاسيتو الانيتريل؛ ح، الهيدروجين؛ نا، الصوديوم. يتم تعديل هذا الرقم من المرجع22. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحليل بوليسياليليشن نكام. كانت مثقف كيلي نيوروبلاستوما الخلايا في غياب أو وجود 5 مم مانك أو مانبروب، أو مانبوت لمدة 7 أيام. كانت تحصد الخلايا والبروتينات تم فصل في المواد الهلامية صحيفة بيانات السلامة-اكريلاميد 8% وتحليلها بواسطة لطخة غربية استخدام بوليسيا مكافحة [مونوكلونل] جسم 735. لاحظ أن بوليسيا يظهر تشهير سبب عدم التجانس في عدد سيا، مما أدى إلى أحجام مختلفة ورسوم بوليسيا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

إذا كان يتم تحليل المشتقات مانك مركباً كيميائيا، مانبروب ومانبوت عبر الطيف الكتلي، ينبغي تحديد ذروة الجماعي الصحيح فقط لكل العينات. ولذلك، يمكن افتراض المنتجات بدرجة نقاء لأكثر من 99%. تم الكشف عن كميات صغيرة من Neu5Gc، التي عادة ما لم يتم العثور على الخلايا البشرية29، في كسور غشاء الخلايا ليسيد. وهذا يحدث على الأرجح من خلال مسار إنقاذ أن المجندين Neu5Gc من سيالوجليكوكونجوجاتيس المصل البقري الجنين في وسائل الإعلام30. المعاملة مع السلائف الطبيعية تخليق حامض اللعابي الحيوي، ماناك، يخفض جذريا على التعبير عن حانمه Neu5Gc على سطح الخلية.

تطبيق مانوسامينيس المعدلة ماما سمية على كافة الخلايا التحقيق حتى الآن. تقبل خلايا السكر ميليمولار زيادة تركيزات داخل الوسط، هو أمر ضروري، نظراً لوجود لا نواقل محددة ل N-أسيلمانوسامينيس. وقد ثبت أن يتم تنشيط ممرات توصيل الإشارات بناء على طلب من N-أسيلمانوسامينيس، التي يمكن أن تؤثر على الخلية النمو أو التمايز31،32. ولم يعرف ما إذا كان هذا هو سبب سياليليشن تغير نمط أو يعكس الآثار المباشرة على سياليليشن تم التعديل حتى الآن. يؤدي نمو الخلايا حضور النظير مانك تعديل C2، مانبروب أو مانبوت في التعبير عن الأنواع الحامض اللعابي غير طبيعية تحمل المقابلة N-استبدال اشيل. اختبار كفاءة التمثيل الغذائي وهما N-تعديل اشيل مانوسامينيس يختلف. عادة ما يؤدي العلاج مع مانبروب للتعبير عن Neu5Prop المقابلة على سطح الخلية وتعبير انخفاض Neu5Ac، فضلا عن Neu5Gc. الأخرى ن-اشيل تعديل مانوساميني النظير، مثل مانوساميني-سيكلوبروبيلكارباميل ن، تميل إلى أن تكون كفاءة الأيض أعلى حتى22.

وكشفت دراسات سابقة أن السلائف سياليك تتداخل مع بوليسياليليشن. يتم التعبير عن الأحماض بوليسياليك تقريبا حصرا على نكام. من المثير للاهتمام، يمكن نكام بوليسياليلاتيد باثنين بوليسياليلترانسفيراسيس متميزة في غولجي (ST8SiaII و ST8SiaIV). اتضح أن مانبروب، مانبوت، وأخرى ن-الأسيل-مانوسامينيس معدلة تتداخل مع بوليسياليليشن، وأن ذلك يعزى أساسا إلى التفاعل مع ST8SiaII14. هذا سياليلترانسفيراسي هو أعرب أثناء التطوير والمهم لتطوير الدماغ. من المثير للاهتمام أيضا، العديد من أورام من الخلايا العصبية المنشأ إعادة التعبير عن زيادة ST8SiaII بهم خبيثة وكذلك جعلها غير قابلة للكشف من الجهاز المناعي33. وفي المقابل، يؤدي تطبيق مانك بزيادة قدرها بوليسيا، نظراً لأنه يؤدي إلى زيادة قدرها CMP-Neu5Ac، الذي هو الركيزة الطبيعية لكلا بوليسياليلترانسفيراسيس.

MGE طريقة فريدة لتقديم رواية اللعابي الأحماض على البروتينات للفائدة (الاريثروبويتينمثلاً ) وتعدل وظيفتها وبالتالي. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامه لتعدل glycosylation سطح الخلية، التي قد تكون ذات فائدة في العديد من الأمراض مثل السرطان، نظراً للعديد من الخلايا السرطانية في محاولة للهروب الجهاز المناعي بالتعبير عن مستويات عالية من حمض اللعابي. تسمح هذه الطريقة المعروضة هنا: أولاً، هندسيا لأداء جليكونجينيرينج استخدام الثقافات الخلية، وثانيا، لتحليل جليكانس لإثبات نجاح جليكونجينيرينج. الأسلوب قوي جداً وحتى الآن، يقال لا المزالق؛ وفي المقابل، تم توسيع الأسلوب لإدخال مجموعات كيميائية نشطة لتنفيذ نقرة-الكيمياء على خلايا13.

نقدم هنا هما مانك النظير مع الاليفاتيه N-اشيل الجانب سلسلة التعديلات التي بسيطة نسبيا لتوليف، حتى من قبل مختبرات مع أقل من المعدات، وأقل خبرة في التوليف الكيميائي. المجموعات التي أكثر دراية بالكيمياء العضوية يمكن توليف النظير مانك الأخرى مع هياكل أكثر تعقيداً، وتستخدم هذه ل MGE، بما في ذلك النظير ما يسمى 'بيورثوجونال'، التي يمكن أن تستخدم، على سبيل المثال، تصور سياليلاتيد جليكوكونجوجاتيس. وهناك مقالات المراجعة إعطاء لمحة عامة عن ن-أسيتيل-مشتقات مانوساميني التي قد تم تصنيعه حتى الآن13،34. ن-أزيدواسيتيل مانوساميني (منز)، مادة يستخدم بشكل متكرر، تصور جليكانس سياليلاتيد، متاح تجارياً. بسبب نفاذية الغشاء منخفضة من النظير مانك، يمكن أن يكون مفيداً لاستخدام مشتقات هذه السكريات مع جذور الهيدروكسيل المجموعات المحمية، مثلاً، بيراسيتيلاتيد مانك النظير. بعد دخول السيتوبلازم، المشقوق مجموعات حماية من هيولى esterases، ثم الإفراج عن36،35،السكريات الأحادية النشطة37. ومع ذلك، كشف النظير مانك بيراسيتيلاتيد سيتوتوكسيسيتي أعلى مقارنة بالمشتقات غير المحمية المقابلة.

في هذه المخطوطة، اخترنا خلايا neuroblastoma مخلدة لتجاربنا مع MGE. وبصفة عامة، يمكن تطبيق MGE (وخاصة مع مانبروب ومانبوت) في مجموعة متنوعة واسعة من خطوط الخلايا، بما في ذلك خطوط الخلايا مخلدة (انظر راتيل et al. 13 للحصول على أمثلة) والخلايا الابتدائية38،39. وعلاوة على ذلك، استخدمت بنجاح MGE لتغيير سياليليشن في فيفو في40 C. ايليجانس، الزرد17،41والماوس19،،من2042والفئران 43 , 44-يمكن أن تختلف وقت المعالجة وتركيز النظير مانك في تجارب MGE تؤثر على كفاءة التمثيل الغذائي لهذا الأسلوب. من خلال تجربتنا، العلاج أطول، وتركيزات أعلى تتوافق مع أفضل استبدال الأنواع الحامض اللعابي طبيعيا في جليكوكونجوجاتيس من Neu5R المعدلة. إذا كانت تركيزات مرتفعة جداً من مشتقات مانك لاستخدامه، يجب أن يتم تقييم سيتوتوكسيسيتي للعلاج، مثلاً، بفحص MTT أو مقايسة الحد ريسازورين.

في هذه المخطوطة، فإننا نقترح استخدام الترا-سونيكيشن لتجانس الخلية. طرق تحلل الخلية الأخرى تم اختبارها في المختبر، بما في ذلك دونسينج على الجليد (حوالي 250 السكتات الدماغية) والفرنسية تعطل الصحافة (10,000 رطل/بوصة مربعة، والممرات 4) مع نتائج مماثلة فيما يتعلق بكمية الحامض اللعابي اكتشف في العينات. وميزة التجانس فائق الصوت هو أنه يحتاج إلى القليل من الوقت ولا تتطلب إضافة دنيز للعينات قبل تفسخ.

ركزنا تحليلنا على كسور غشاء الخلية ليساتيس، لأننا أردنا أن تظهر التعديلات في سياليليشن غشاء ملزمة جليكوكونجوجاتيس. يمكن أيضا قياس مشتقات الحامض اللعابي وتركزاتها في سيتوسول الخلايا، بعد أن تم فصل جزء الغشاء بالطرد المركزي عالية السرعة، باستخدام نفس الأسلوب كما هو موضح أعلاه. ومع ذلك، تركيزات حمض اللعابي في سيتوسول يصل إلى 100 س أقل مقارنة بالتعبير الحامض اللعابي على غشاء الخلية7. وهكذا، تلزم كميات أكبر من الخلايا لتوليد نتائج يمكن الاعتماد عليها. يمكن قياس تجمع حمض CMP سيليك سيتوسوليك، وتنشيط غير مباشر من قبل علاج كسور سيتوسوليك ليساتيس الخلية مع بورهيدريد الصوديوم قبل التحلل7،45. كي يتحلل الحامض اللعابي في جليكوكونجوجاتيس والحامض اللعابي مع جذور الهيدروكسيل التعديلات، كان المحتضنة الخلايا مع 1 م تفا. يمكن استخدام حلول أخرى حمضية للتحلل المائي، كذلك، مثلاً من حمض البروبيونيك م 2، وحمض الخليك م 2 أو 1 M HCl.

قضية مواجهة ممكنة أثناء تحليل [هبلك] أن القمم للفائدة متداخلة مع قمم غير معرف. وهذا مشكلة خاصة عندما يكون مقدار الحامض اللعابي في عينة حسابه بالمنطقة الواقعة تحت المنحنى لذروة معينة. لفصل ذروة الاهتمام ذروة غير معرف، قد ضبط تركيز الاسيتو الانيتريل في المذيب [هبلك] (± 3%). أننا نقترح استخدام تركيزات المذيبات المطرد لتحليل [هبلك]، إعطاء ميزة إعداد الخليط المذيبات قبل الفصل اللوني. ولذلك، لدينا أسلوب يتطلب واحد فقط [هبلك] مضخة وعملياً لمجموعة واسعة من نظم مختلفة [هبلك]. في حالة توفر في النظام [هبلك] مضخة واحدة أو أكثر، يمكن تطبيقها تدرج isocratic مع التركيزات المتزايدة الاسيتو الانيتريل، مثلاً، 4-9% في 35 دقيقة45. باستخدام هذا الأسلوب، سوف تتغير وقت الاحتفاظ ببعض قمم [هبلك] إلى حد كبير. هذه الاستراتيجية يمكن أن يساعد أيضا في تحقيق الانفصال أفضل من التداخل الذري. الليزر ساعد مصفوفة الامتزاز التأين الكتلي (استخدام--مرض التصلب العصبي المتعدد) أنشئت بنجاح التحقق من التعبير عن تعديل الأنواع الحامض اللعابي على سطح الخلية45، ومن ثم يخدم كمكافئ إلى الأسلوب ESI MS المعروضة هنا .

بسبب هيدروفيليسيتي النظير مانك وعدم وجود نواقل محددة لاستيعاب هذه مشتقات46، تلزم تركيزات عالية في تجارب MGE مع هذه المركبات. ولذلك، في تحجيم حتى التجارب، ولا سيما في المحاكمات في فيفو ، كميات كبيرة من النظير مانك كل منهما ضرورية إظهار حد ممكن من هذه التقنية. من ناحية أخرى، اعتماداً على خطوط الخلية المستخدمة، عدد أدنى معين من الخلايا المعالجة اللازمة للحصول على نتائج يمكن الاعتماد عليها في التحليل [هبلك]. من خلال تجربتنا، الحد أدنى من الخلايا ملتصقة حوالي 100,000 أو 150,000 تعليق الخلايا (1-2 الآبار من صفيحة 96-جيدا مع خلايا الجلد) كافية. هذا يمكن أن تصبح عقبة، إذا كان التحليل تقليص، على سبيل المثال في فحص النهج.

مع طرق عرض في هذه المخطوطة، يمكن اكتشاف الحامض اللعابي ومشتقاته في الخلية ليساتيس. ومع ذلك، لا يمكن تقييم هيكل وتكوين جليكوكونجوجاتيس في الخلايا تعامل مع مشتقات مانك مع تقنية هو موضح هنا. حل هيكل جليكوكونجوجاتيس، e.g.,N-و يا--جليكانس، عموما يتطلب خبرة أكبر و مرفق جليكوميكس47. على حد علمنا، حتى الآن، لا تتوافر بيانات على هيكل جليكوكونجوجاتيس من الخلايا التي تم علاج مع النظير ماناك متميزة.

تحليل لطخة غربية لحمض بوليسياليك طريقة سريعة وسهلة جداً. ومع ذلك، البيانات التي تم الحصول عليها بهذه الطريقة ليست الكمية، حيث يستخدم الكشف عن الأجسام المضادة وتشيميلومينيسسينسي. ولذلك، باستخدام أساليب [هبلك] ميزة على النشاف الغربية. ومع ذلك، فإننا نقترح استخدام أسلوب إيمونوبلوتينج، نظراً لأنها سهلة التطبيق والمعروفة العمل بشكل موثوق جداً.

يمكن أن يغير التعبير عن الحامض اللعابي على سطح الخلية أيضا أساليب خلاف MGE. كما هو موضح أعلاه، يمكن أن تعامل الخلايا مع سياليداسي، إنزيم كليفس بقايا الحامض اللعابي من جليكوكونجوجاتيس بطريقة غير محدد نسبيا. ونتيجة لذلك يدفع المعاملة سياليداسي هيبوسياليليشن في الخلايا المعالجة. لسوء الحظ، العلاج سياليداسي تقنية محدودا نوعا ما، كما السامة للخلايا وغير مجدية للعلاج وقت طويل وغير قابل للتطبيق في تجارب في فيفو . أسلوب آخر لحمل هيبوسياليليشن في الخلايا باستخدام مثبطات تخليق حامض اللعابي الحيوي. تتوفر مجموعة متنوعة من مثبطات أما استهداف الإنزيم الرئيسي تخليق حامض اللعابي الحيوي، UDP-N-أسيتيلجلوكوساميني-2-ابيميراسي/N-أسيتيلمانوساميني-كيناز (جن/منك)، أو المجموعة من، سياليلترانسفيراسيس6 7،،من848. واحدة من هذه المركبات، حامض اللعابي مفلورة C3 تناظرية، وأبدى إلى انخفاض التعبير عن الحامض اللعابي في معيشة الفئران49. الحيوانات تعامل مع هذا المضمون، ومع ذلك، أظهرت ضعف الكبد، وضعف الكلي الذي لا رجعة فيه، وعدم تزدهر49. هذه النتائج تؤكد على الدور الحاسم ل Neu5Ac في وظيفة الكبد والكلى وكذلك الإشارة إلى حدود مثبطات سياليليشن لإجراء تجارب عليها في فيفو . هناك طريقة ثالثة لتوليد الخلايا مع خلية غيرت سياليليشن السطحية طريق التداخل مع التعبير عن الإنزيمات التي تعتبر حاسمة بالنسبة تخليق حامض اللعابي الحيوي. وأبدى تدق منسدلة من جن/منك في الخلايا مخلدة، على سبيل المثال، لجعل هذه الخلايا هيبوسياليلاتيد 9. إمكانية نسبيا بسهولة طريقة الكبس والجينات في الخلوي و في فيفو استخدام الرواية ومعروف جيدا كريسبر-Cas9 تقنية قد تؤدي إلى اكتشافات جديدة فيما يتعلق تخليق حامض اللعابي الحيوي والخلية السطحية سياليليشن.

ميزة MGE مقارنة بالأساليب الموصوفة هنا، أنها سهلة التطبيق وقابلة للتكيف لعدد هائل تجارب المختلفة، من تجارب في المختبر الخلية استناداً إلى فحوصات وتجارب في فيفو . أسلوب بديل لقياس التعبير وتركيزات حمض اللعابي مختلفة الأنواع في عينات الخلايا بتبادل شاردة عالية الأداء اللوني (هبايك) مع كشف الكهروكيميائية نابض50. باستخدام هذا الأسلوب، التعبير عن الحامض اللعابي يقاس مباشرة والعلامات بعد لا مع صبغة فلورسنت. وميزة هذا الأسلوب أن فإنه يمكن أن تستخدم أيضا لتحليل السكريات الأحادية عدا الحامض اللعابي ومشتقاته في عينات الخلايا والبروتين. لسوء الحظ، هو أقل مقارنة حساسية هبايك للكشف عن فلوروميتريك من حمض DMB سيليك. وهكذا، هبايك محدود للتجارب مع توافر كميات كبيرة عينة51.

يمكن استخدام الأساليب الموصوفة هنا للكشف عن خصائص غير معروفة من جليكوكونجوجاتيس. يوجد العديد من الأمثلة لاستخدام MGE للتحقيق الحامض اللعابي تعتمد التفاعلات بين الفعل13، تبين جدوى هذه التقنية في سياق مجموعة واسعة من الأجهزة التجريبية.

في الوقت الحاضر، تستخدم MGE مع N-أسيتيلمانوسامينيس أساسا من الباحثين في مجال غليكوبيولوغي. ونأمل أن هذا الأسلوب يتم التعرف بجمهور أوسع نطاقا كأداة مرنة لتعديل جليكوكونجوجاتيس. الميادين الأخرى، بما في ذلك علم المناعة، وعلم الفيروسات، علم الأعصاب، أو الأورام سوف تستفيد من خلال تكييف هذه التقنية لأغراض خاصة بهم. هذه البحوث على الصليب قد تمكين اكتشاف مناطق مجهولة حتى الآن، وتعطي ولذلك فهم أفضل للصحة والمرض. في وقت مبكر من الدراسات، على سبيل المثال، استخدام هذه التقنية لإنتاج جليكوبروتينس مع جليكوسيليشن المعدلة، التي تشكل في وقت لاحق للتطعيم في فيفو . وفي بعض الحالات، تؤدي المعاملة مع هذه اللقاحات جليكونجينيريد لإنتاج الأجسام المضادة التي كشفها اللذة المتقدمة وسمية ل أهداف كل منها52،53. أخرى استخدمت بنجاح MGE لوضع نموذج لعلاج الورم المستهدفة في الفئران54. وأظهرت دراسة أخرى أن المنهجية في فيفو حقن مانبروب عززت العصب تجديد55. وفي حالة بوليسيا، تبين أن تناقص التعبير عن هذا حانمه في خلايا neuroblastoma بالأساليب التي عرضت في هذه المخطوطة، يزيد من حساسية هذه الخلايا السرطانية للإشعاع أو العلاج بالعقاقير السرطان56.

قد تختلف مبالغ الحامض اللعابي يقاس داخل عينات تبعاً للطريقة المستخدمة لفصل الخلايا المعالجة. وفي هذه المخطوطة، استخدمت الحضانة مع التربسين لفصل الخلايا. إذا كانت تقنيات أخرى لاستخدامها، مثل إلغاء الخلايا أو العلاج منذ فترة طويلة مع برنامج تلفزيوني + يدتا، قد تختلف كميات الحامض اللعابي تقاس في العينات. حتى تكييف وقت الحضانة مع التربسين يمكن أن يكون لها تأثير على الحامض اللعابي التركيزات المقاسة في وقت لاحق. من خلال تجربتنا، أثر الأسلوب مفرزة الخلايا على كميات حمض اللعابي قياس أقل من 15 في المائة، ولكن في حالة تطبيع ومقارنة النتائج، وهذا قد يصبح اختناق هامة. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر على طريقة تحلل الخلايا نتائج التحليل [هبلك]. وبالتالي، نوصي بالقارئ إلى توحيد مفرزة الخلية وتحلل في التجارب التي تقوم بها.

لتحقيق انفصال كسر غشاء في الخلية ليساتيس، نحن نستخدم الطرد المركزي ح 2 في 20,000 x ز و 4 درجة مئوية (الفرع 5، 1). قد تؤثر البروتوكولات الأخرى للطرد المركزي الفصل وبالتالي الكميات من الحامض اللعابي اكتشف في العينات. مجمع حاسمة ضمن هذا البروتوكول هو DMB، لأنها حساسة جداً للضوء ويحط على مر الزمن. هنا أوصينا إلى أجزاء صغيرة الكوة DMB، الحل ومخزن مخزون في-20 درجة مئوية، ومحمية من الضوء (قسم 1.6.1). ويمكن تخزين هذه الطريقة DMB-الحل لعدة أسابيع. إذا كان إظهار النتائج من تحليل DMB-[هبلك] تخفيض إشارات للأنواع الحامض اللعابي أو زيادة إشارات ضمن أول 6 دقيقة للقياس [هبلك]، تمثل DMB ومنتجاتها، ورد فعل حل DMB جديد ينبغي إعداد. عدم إعادة تجميد وإعادة استخدامها DMB، الحل بعد ذوبان الجليد هو. بعد DMB العلامات، يجب أن يتم تحليل جميع العينات فورا. إذا كان عدد أكبر من العينات (> 10) أن يتم تحليلها، ينبغي تقسيمها إلى أصغر شارات هذه العينات والمسمى تدريجيا مع DMB. رد فعل وضع العلامات على حد سواء، فضلا عن تحقيقات المسمى DMB ينبغي حمايتها من الضوء في جميع الأوقات. وبعد شطف، الأنواع المسماة DMB الحامض اللعابي ينبغي تحليله فورا قبل "مباشرة" أي إس أي-السيدة اقتران من [هبلك] مع نظام أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد (في إعداد LC-ESI-MS) ليس من الضروري، ولكن يمكن أن يكون مفيداً لتحقيق أعلى جودة الطيف الكتلي تحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر نغوين د. ل. لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط ومناقشات مثمرة. وعلاوة على ذلك، ونحن نشكر ديرنيدي ياء وحاء زاي نغوين لمساعدتنا في إعداد الفيديو تبادل لإطلاق النار. وقتل معظم مشاهد الفيديو في مختبرات تاوبر ر. ونشكر أيضا معهد ماكس بلانك الغروية والواجهات، وعلى إعطائنا حرية الوصول إلى مرفق الكتلي بهم. وأيد RH DFG (برومواجي).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cells Sigma-Aldrich 92110411
RPMI medium Sigma-Aldrich R8758
75 ml tissue culture flasks Greiner 690175
48-well plates Corning 3548
FCS PAA A15-102
Pen/Strep Gibco 15140-122
Trypsine Gibco 15400-054
EDTA Roth X986.1
Tris Serva 37190.03
SDS Roth 2326.2
SDS-PAGE equipment (tanks, glassware etc., machine VWR SDS Gel/Blot
Acrylamide Roth 3019.1
Protein ladder Fisher Scientific 267620
Nitrocellulose GE Healthcare 10600002
Ponceau red Roth 5938.2
Milk powder Roth T145.3
ECL Millipore WBLUF 0500
0.5 ml Centrifugal Filter Unit with 3 kDa membrane Merck-Millipore UFC500324
15 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430791-500EA
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250-10ML
2-Propanol Sigma-Aldrich 34965-1L HPLC gradient grade
4,5-Methylenedioxy-1,2-phenylenediamine dihydrochloride Sigma-Aldrich D4784-50MG
48 well, flat bottom tissue culture plate Sigma-Aldrich (Corning) CLS3548-100EA
50 mL centrifuge tubes Sigma-Aldrich (Corning) CLS430829-500EA
Acetonitrile Sigma-Aldrich 34967-1L HPLC gradient grade
Aprotinin from bovine lung Sigma-Aldrich A1153-10MG lyophilized powder, 3-8 TIU/mg solid
Butyryl chloride Sigma-Aldrich 109614-250G
C18 RP column Phenomenex 00F-4435-E0 110 Å, 3 µm particle size, 4.6 x 150 mm
D-Mannosamine hydrochloride Sigma-Aldrich M4670-1G
Dulbecco`s Phosphate Buffered Salt Solution PAN Biotech P04-36500
Ethylenediaminetetraacetic acid Sigma-Aldrich E9884-100G
Formic acid Sigma-Aldrich 56302-50ML-GL
Hydrochloric acid solution Sigma-Aldrich H1758-100ML 36.5-38.0%, in water
Leupeptin Sigma-Aldrich L2884-10MG
Methanol Carl-Roth T169.2 HPLC gradient grade
N-Acetyl-D-mannosamine Sigma-Aldrich A8176-250MG
N-Acetylneuraminic acid Sigma-Aldrich A0812-25MG
N-Glycolylneuraminic acid Sigma-Aldrich G9793-10MG
Phenylmethanesulfonyl fluoride Sigma-Aldrich P7626-250MG
Propionyl chloride Sigma-Aldrich P51559-500G
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, amber (light protection) Eppendorf 30120191
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, colorless Eppendorf 30120086
Sodium bisulfite solution Sigma-Aldrich 13438-1L-R-D 40%, in water
Sodium chloride Sigma-Aldrich 746398-500G-D
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 795429-500G-D
Sodium hydroxide solution Sigma-Aldrich 319511-500ML 1.0 M, in water
Sodium methoxide Sigma-Aldrich 164992-5G
Trifluoroacetic acid Sigma-Aldrich T6508-100ML-D
Tris hydrochloride Sigma-Aldrich T5941-100G
Trypsin 0.25 %/EDTA 0.02 % in PBS PAN Biotech P10-019100
Water Carl-Roth T905.1 HPLC gradient grade
Silica Gel 60 Carl-Roth 9779.1
HPLC Agilent
ESI-MSD-System Agilent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10 (2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575 (2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700 (2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289 (2016).

Tags

الهندسة الحيوية، 129 قضية، الحامض اللعابي، حمض بوليسياليك، كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء، وزراعة الخلايا، جليكونجينيرينج الأيضية، الهندسة oligosaccharide الأيضية
جليكونجينيرينج الأيض حمض اللعابي استخدام <em>N</em>-الأسيل-تعديل مانوسامينيس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wratil, P. R., Horstkorte, R.… More

Wratil, P. R., Horstkorte, R. Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines. J. Vis. Exp. (129), e55746, doi:10.3791/55746 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter