Denne protokol beskriver en detaljeret metode til den langsigtede ex vivo kultur og levende billeder af en Drosophila imaginal disk. Det viser fotoreceptordifferentiation og ommatidial rotation inden for 10 timer periode af levende billeddannelse af øjet disken. Protokollen er enkel og kræver ikke dyre opsætning.
Live-billedbehandling giver mulighed for løbende at spore dynamiske cellulære og udviklingsprocesser i realtid. Drosophila larval imaginalskiver er blevet anvendt til at undersøge mange biologiske processer, såsom celleproliferation, differentiering, vækst, migration, apoptose, konkurrence, celle-cellesignalering, og kompartmental grænse formation. Imidlertid har metoder til langsigtet ex vivo kultur og levende billeder af de imaginalskiver ikke været tilfredsstillende, trods mange anstrengelser. For nylig har vi udviklet en metode til den langsigtede ex vivo kultur og levende billeder af imaginalskiver i op til 18 timer. Ud over at anvende en høj koncentration af insulin i dyrkningsmediet, blev en lav-smeltende agarose også til at integrere disken for at forhindre det i at glide under billeddannelse periode. Denne rapport benytter øjet-antennal diske som eksempel. Fotoreceptor R3 / 4-specifik mδ0.5-GA4 ekspression blev fulgt for at vise, at fotoreceptorer differenkan observeres dybde og kan og ommatidial rotation i løbet af en 10 timer direkte billedvisning periode. Dette er en detaljeret protokol, der beskriver denne simple metode.
Drosophila larval imaginalskiver har været et yndet forsøgssystem til undersøgelse af en lang række biologiske mekanismer. Disse diske invaginere fra den embryoniske epitel og blive sac-lignende strukturer bygget op af to epiteliale lag, Peripodial epitel (PE) og Disc Korrekt (DP) 1, 2. De imaginal disc prolifererer og progressivt differentiere under larve- og puppe stadier og i sidste ende udvikle sig til den voksne krop strukturer. På grund af den flade og enkel tolagsstruktur af imaginalskiver de er lette at observere, når dissekeret fra larver. Men på trods af flere indsats fra mange grupper, de nuværende metoder til langsigtet kultur af de imaginalskiver har ikke været tilfredsstillende. Vi har for nylig udviklet en kultur metode, der kan opretholde den normale udvikling af flere imaginalskiver i op til 18 timer, og som gør det muligt direkte billedvisning 3 </sop>. Dyrkningsmetoden kan støtte celledifferentiering og migration, men det kan støtte celleproliferation for kun 7-12 timer og kan ikke understøtte disken vækst. Den største forskel i dyrkningsmediet er den høje koncentration af insulin 3. Fremgangsmåden er enkel, og ingen særlig luftning eller medium cirkulation er påkrævet.
En af de bedst undersøgte imaginalskiver er øjet-antennal disk. Drosophila øje er opbygget af ca. 800 ommatidia. Hver ommatidium består af otte fotoreceptorceller (R1-R8). I larve øje disken, differentiere fotoreceptorceller efter passagen af morphogenetisk Furrow (MF), som fejer hen over øjet disken fra posterior til anterior 4, 5. Fotoreceptorerne i en ommatidium differentiere i rækkefølge, begyndende med R8, efterfulgt af R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6 og R7 6. Den ommatidia i ryg og ventral halvdele af øjet skiven gennemgå en 90 ° drejning i modsatte retninger, hvilket resulterer i modsat chiralitet 7, 8. Rotation proces sker i to trin: først en 45 ° drejning begynder på og er afsluttet på det sjette ommatidia række bag MF; den anden 45 ° rotation er afsluttet ved ca. række 16 9, 10. Denne undersøgelse anvendte ommatidial rotation, kendetegnet ved det R3 / 4-specifik mδ0.5-GA4 11, for at demonstrere den normale celledifferentiering og dynamik, der kan observeres gennem denne metode til kultur og leve-image øjet disken.
I denne undersøgelse, giver vi en detaljeret protokol for en langsigtet direkte billedvisning eksperiment på Drosophila imaginalskiver. Vi har brugt meget tid på at øve omhyggelig dissektion for at undgå disc skader og for at give mulighed for fastgørelse af skiven tæt på dækglas. Vi forsøgte Poly-L-lysin (PLL) og lav-smeltende agarose at holde væv; i sidste ende, den lavtsmeltende agarose viste en bedre evne til at holde vævet. Selv om kun øjet disken blev anvendt i denne at påvise normale forekomst af fotoreceptordifferentiation og ommatidial rotation under den 10 timer direkte billedvisning periode, kan denne fremgangsmåde også anvendes til i det mindste en anden skive, vingen disken, som påvist i en tidligere undersøgelse 3. Desuden dyrkningsmediet forberedelse og levende billedbehandling setup er enkle og ikke kræver luftning eller medium cirkulation.
Kontinuerlig billeddannelse kan give en klar tidsmæssig sekvens af biologisk eveNTS. I vores tidligere rapport af glia differentiering og migration i øjet skive, forudsat vi direkte bevis på, at indpakning glia skelne fra eksisterende glia efter overgangen til den forreste af øjet skive 3. Langsigtet ex vivo kultur muliggør den specifikke laser-aktiverede mærkning af celler, såsom foto-omdannelse af KAEDE fluorescerende protein, at følge deres adfærd 3. Det kan også rumme testning af kemikalier, der tilsættes direkte til dyrkningsmediet; således kan det anvendes som et lægemiddel screening platform. Da nogle dynamisk proces forekomme inden for minutter eller sekunder, høj tidsopløsning påkrævet. For at forbedre den tidsmæssige opløsning, lys ark mikroskopi 15, 16 eller spinning disc mikroskopi 17 kan være en god mulighed.
Den nuværende kultur betingelse er ikke perfekt. Den understøtter ikke disk vækst. Cell pSpaltning understøttes kun i op til 12 timer 3 . Efter 12 timer i ex vivo- kultur begynder hastigheden af fotoreceptor differentiering at falde 3 . Dette kan skyldes manglen på visse næringsstoffer eller hormoner. Da den største forskel i dette dyrkningsmedium er den høje koncentration af insulin, kan pattedyrinsulinet delvis efterligne funktionen af endogene insulinlignende peptider. Tilsætningen af flyveekstrakt, insektblodsukker trehalosen og forskellige koncentrationer af molthormonet 20-hydroxyecdyson var ikke gavnlige 3 . Dog er 12-18 h kulturperioden tilstrækkelig til at studere mange udviklingsprocesser. Alternative kultiveringsmetoder til dyrkning af larve-imaginale diske er blevet sammenlignet 3 , og vores dyrknings- og billedbetingelse giver det længste tidsvindue og mest klarhed for levende billeddannelse. Selvom diske i levende larver og pupper kan billedbeskyttes direkte18, 19, 20, 21, 22, opløsning og tidsvindue for observationer er begrænset. Sent larver og puppe diske kan dyrkes i lang tid 23, 24, men diskene undergår signifikant morfogenese. At drage fordel af de flade, 2D larve diske, vores dyrkning og billedbehandling metode er den bedste løsning indtil videre.
The authors have nothing to disclose.
Vi er taknemmelige for Chun-lan Hsu og Yu-Chi Yang for at udarbejde fluen mad og opretholde fluen lagre, og til Su-Ping Lee og IMB Imaging Core for deres hjælp med konfokal mikroskopi. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud til YHS (NSC 101-2321-B-001 -004, NSC 100-2321-B-001 -012, NSC 102-2321-B-001 -002, MEST 103-2311-B-001 -035 -MY3) fra National Science Rådet og Ministeriet for Videnskab og Teknologi i Kina.
Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |