Denne protokollen beskriver en detaljert fremgangsmåte for langtids ex vivo kultur og direkte avbildning av et Drosophila imaginal plate. Det viser fotoreseptoren differensiering og ommatidial rotasjon inne i 10 timers periode for direkte avbildning av øyet platen. Protokollen er enkel og krever ikke dyrt oppsett.
Live-avbildning gir mulighet til kontinuerlig å spore dynamiske cellulære og utviklingsprosesser i sanntid. Drosophila larve imaginal plater er blitt anvendt for å undersøke mange biologiske prosesser, slik som celleproliferasjon, differensiering, vekst, migrering, apoptose, konkurranse, celle-cellesignalering, og compartment grensedannelse. Men metoder for langsiktig ex vivo kultur og levende avbildning av imaginal plater har ikke vært tilfredsstillende, til tross for mange forsøk. Nylig er det utviklet en metode for langtids ex vivo kultur og direkte avbildning av imaginal plater i opp til 18 timer. I tillegg til å bruke en høy insulinkonsentrasjon i dyrkningsmediet, ble en lavtsmeltende agarose også brukes til å legge platen for å hindre den i å drive løpet av avbildningsperioden. I denne rapporten benytter øye-antennal plater som et eksempel. Fotoreseptorlidelser R3 / 4-spesifikk mδ0.5-Ga4 ekspresjon ble fulgt for å vise at fotoreseptoren differenfor handling og ommatidial rotasjon kan observeres i løpet av en 10 timers periode levende avbildning. Dette er en detaljert protokoll beskriver denne enkle metode.
Drosophila-larve imaginal skiver har vært et favorisert eksperimentelt system for undersøkelse av en rekke forskjellige biologiske mekanismer. Disse platene invaginate fra den embryoniske epitel og blir sekkelignende strukturer bygget opp av to lag epitelceller, Peripodial epitel (PE) og platen Proper (DP) 1, 2. De imaginal skive prolifererer og differensierer progressivt i løpet av larvestadier og pupal og etter hvert legger seg inn i voksen kroppsstruktur. På grunn av den flate og enkel to-lags struktur av imaginal plater, er de lette å observere når dissekert fra larver. Men til tross for flere forsøk fra mange grupper, dagens metoder for langsiktig kultur av imaginal plater har ikke vært tilfredsstillende. Vi har nylig utviklet en kultur metode som kan opprettholde normal utvikling av flere imaginal plater i opptil 18 timer, og som gjør at levende avbildning 3 </sopp>. Kulturmetoden kan støtte celledifferensiering og migrasjon, men det kan understøtte celleformering i bare 7-12 timer, og kan ikke understøtte platen vekst. Den store forskjellen i dyrkningsmediet er den høye konsentrasjon av insulin tre. Metoden er enkel, og ingen spesiell lufting eller medium sirkulasjon er nødvendig.
En av de mest studerte imaginal plater er øyet-antennal plate. Drosophila øyet er bygd opp av ca 800 ommatidia. Hver ommatidium består av åtte fotoreseptorcellene (R1-R8). I larve øyet platen, differensiere fotoreseptorcellene etter passering av morfogenetiske fure (MF), som feier over øyet platen fra bakre til fremre 4, 5. Fotoreseptorene i en ommatidium skille i sekvens, som begynner med R8, etterfulgt av R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6, R7 og 6. Den ommatidia i rygg og ventral halvdeler av øyet skiven gjennomgår en 90 ° rotasjon i motsatte retninger, noe som resulterer i motsatt kiralitet 7, 8. Rotasjonen prosessen skjer i to trinn: for det første, begynner en 45 ° rotasjon til og fullføres ved den sjette ommatidia rad bak MF; den andre 45 ° dreining er fullført ved omtrent rad 16 9, 10. Denne studien brukt ommatidial rotasjon, preget av R3 / 4-spesifikk mδ0.5-Ga4 11, for å demonstrere den normale celledifferensiering og dynamikk som kan observeres gjennom denne metoden til kulturen og leve-bilde øyet platen.
I denne studien gir vi en detaljert protokoll for en langsiktig levende avbildning eksperiment på Drosophila imaginal plater. Vi brukte mye tid på å trene forsiktig disseksjon for å unngå disk skade og for å tillate festing av platen nær Dekk. Vi forsøkte Poly-L-lysin (PLL) og lavtsmeltende agarose for å holde vevet; til slutt, den lavtsmeltende agarose viste en bedre evne til å holde vevet. Selv om det bare øyet skive ble brukt i denne artikkelen for å demonstrere den normale forekomst av fotoreseptoren differensiering og ommatidial rotasjon i løpet av 10 timer direkte avbildning periode, kan denne fremgangsmåte også anvendes på minst en annen plate, vingen plate, som demonstrert i en tidligere studie tre. Videre kulturmediet preparatet og direkte avbildning oppsett er enkel og krever ikke lufting eller medium sirkulasjon.
Kontinuerlig direkte avbildning kan gi en klar tidsmessig sekvens av biologisk events. I vår tidligere rapport fra gliaceller differensiering og migrasjon i øyet platen, forutsatt at vi direkte bevis på at innpakning gliaceller skille fra eksisterende gliaceller etter å migrere til fremre av øyet skive tre. Long-term ex vivo kultur tillater den spesifikke laseraktiverte merking av celler, slik som den foto omdannelse av KAEDE fluorescerende protein, for å følge deres atferd 3. Den kan også romme testing av kjemikalier som tilsettes direkte til dyrkningsmediet; således kan den anvendes som et medikament screenings plattform. Siden noen dynamisk prosess forekomme i løpet av minutter eller sekunder, blir høy tidsoppløsning er nødvendig. For å øke tidsoppløsningen, lys-mikroskopi ark 15, 16 eller en roterende disk mikroskopi 17 kan være et godt alternativ.
Den nåværende kultur tilstand er ikke perfekt. Den støtter ikke platen vekst. Cell pRulliferering støttes kun i opptil 12 timer 3 . Etter 12 timer i ex vivo- kultur begynner frekvensen av fotoreceptor-differensiering å redusere 3 . Dette kan skyldes mangel på visse næringsstoffer eller hormoner. Siden den store forskjellen i dette kulturmediet er den høye konsentrasjonen av insulin, kan pattedyrinsulinet delvis etterlikne funksjonen til endogene insulinlignende peptider. Tilsetningen av flyekstrakte, insekts blodsukker trehalose og forskjellige konsentrasjoner av moltingshormonet 20-hydroksy-eksson, var ikke fordelaktige 3 . Men 12-18 h kulturperioden er nok til å studere mange utviklingsprosesser. Alternative kultiveringsmetoder for dyrking av larve-imaginale plater er blitt sammenlignet 3 , og vår kultur- og bildebehandlingstilstand gir det lengste tidsvinduet og mest klarhet for levende bildebehandling. Selv om plater innenfor levende larver og pupper kan avbildes direkte18, 19, 20, 21, 22, oppløsning og tidsvinduet for observasjonene er begrenset. Sen larve og pupal plater, kan dyrkes i lang tid 23, 24, men skivene gjennomgå betydelige morfogenese. For å dra nytte av de flate, 2D larve plater, er vår dyrking og avbildningsmetode den beste løsningen så langt.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for Chun-lan Hsu og Yu-Chi Yang for å forberede flymat og vedlikeholde flybestandene, og til Su-Ping Lee og IMB Imaging Core for deres hjelp med konfokalmikroskopien. Denne studien ble støttet av tilskudd til YHS (NSC 101-2321-B-001-004, NSC 100-2321-B-001-012, NSC 102-2321-B-001-002, MOST 103-2311-B-001 -035 -MY3) fra Nasjonalt vitenskapsråd og departementet for vitenskap og teknologi i Republikken Kina.
Low-melting agarose | AMRESCO | 0815-25G | |
Phosphate buffered saline | AMRESCO | 0780-2PK | |
42×0.17 mm cover slips | PST | G401-42 | |
Schneider’s Drosophila medium | Thermo | 21720-024 | |
Fetal bovine serum | Sigma | F9665 | |
Penicillin-streptomycin | GIBCO | 759 | |
Insulin | Sigma | I9278 | |
Culture chamber | PECON | POC-R2 Cell Cultivation System | |
40x objective | C-Apochromat 40x/1.2W Korr objective | ||
Fly strain:nls.GFP | Bloominggton | 4775 |