Summary
يصف لنا هنا بروتوكولا ل microinjection في الدماغ القوارض يستخدم الكوارتز الإبر. هذه الإبر لا تنتج تلف الأنسجة القابلة للكشف والتأكد من تسليم موثوق بها حتى في المناطق العميقة. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييفها وفقا لاحتياجات البحوث بتصاميم شخصية، ويمكن إعادة استخدام.
Abstract
وقد استخدمت ميكروينجيكشنز لفترة طويلة لإيصال المخدرات أو السموم داخل مناطق محددة من الدماغ، وفي الآونة الأخيرة، فقد استخدمت لتقديم منتجات العلاج بالجينات أو الخلايا. لسوء الحظ، استخدام التقنيات الحالية التي microinjection الإبر الفولاذية أو الزجاجية التي دون المستوى الأمثل لأسباب متعددة: الإبر الصلب قد يسبب تلف الأنسجة بوجه خاص، وقد ثني الإبر الزجاج عندما خفضت عميق في الدماغ، والمنطقة المستهدفة في عداد المفقودين. في هذه المقالة، نحن تصف وضع بروتوكول لإعداد واستخدام الإبر الكوارتز التي تجمع بين عدد من الميزات المفيدة. لا تنتج هذه الإبر تلف الأنسجة القابلة للاكتشاف، ويجري صارم جداً، ضمان التسليم موثوق بها في منطقة الدماغ المطلوب حتى عند استخدام الإحداثيات العميق. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لتخصيص تصميم الإبرة بأحداث فتحات متعددة للقطر المطلوب. ثقوب متعددة تسهل ضخ كميات كبيرة من حل داخل مساحة أكبر، بينما ثقوب كبيرة تيسير حقن الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن تنظيف هذه الإبر الكوارتز وإعادة استخدامها، مثل أن تصبح الإجراءات فعالة من حيث التكلفة.
Introduction
استخدمت ميكروينجيكشنز لفترة طويلة لتسليم مركبات عقاقيري النشط لتعدل نشاط الخلايا العصبية في مناطق معينة من الدماغ. وباﻹضافة إلى ذلك، فقد استخدمت لحقن السموم قرب السكان العصبية خاصة، لتقليد الأعصاب الأحداث المميزة لبعض الأمراض، على سبيل المثال 6-هيدروكسي-الدوبامين في نظام الدوبامين نيجروسترياتال لتقليد مرض باركنسون 1 , 2 أو سابورين مفتش immunotoxin 192 على آفة نظام اتروبين3. في الآونة الأخيرة، استخدمت microinjection إجراءات لتسليم الطعوم ناقلات أو الخلايا الفيروسية للعلاج بالجينات أو الخلايا من اضطرابات الدماغ التجريبية4،5.
نوع الإبر المستخدمة في هذه الدراسات الكلاسيكية مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ. على الرغم من السهل والعملي لاستخدام الإبر الصلب لديها عدد من المشاكل6: هي كبيرة نسبيا وقد يسبب تلف الأنسجة، مع تسرب حاجز الدم في الدماغ وتنشيط astrocytes؛ علاوة على ذلك، فإنها قد تنتج الحفر من أنسجة المخ الذي يحصل في الإبرة خلق عقبة أو حتى تماما تجنب تدفق الحل المنشود. في الآونة الأخيرة، استخدام الإبر الزجاج أدخلت مستعدين المخصص من الشعيرات الدموية في7،8. هذه لا تسبب تنشيط أنسجة كبيرة الضرر ولا أستروسيتي، بل هي مرنة نسبيا وقد ينحني عند عرضه في هياكل العميق، وتقليل دقة الترجمة (الملاحظات الشخصية).
ولذلك هناك حاجة تقليل قدر الضرر المحتمل (خاصة عند إجراء التجارب لمداواة الضرر) مع زيادة الدقة وإمكانية تكرار نتائج (أي، ضمان أن يتم تسليم كل حل والترجمة الصحيحة). وعلاوة على ذلك، سيكون من المرغوب فيه استخدام تصاميم مختلفة الإبرة لضمان التوزيع الأمثل للحل حقن في مناطق الدماغ مع الهندسات متفاوتة. في هذه المقالة، نحن تصف وضع بروتوكول لإعداد واستخدام الإبر الكوارتز ميكروينجيكتيونس في الدماغ القوارض. بسبب نقطة انصهار عالية، الكوارتز الشعيرات الدموية لا يمكن سحبها على ساحبة تقليدية ولذلك لا قد استخدمت في الماضي لتوليد الإبر. ومع ذلك، يوفر الكوارتز، بعض المزايا الهامة عبر الزجاج، ولا سيما ارتفاع صلابة وكسر المقاومة9. بسبب تلك الصلابة، الإبر الكوارتز هي مناسبة بشكل مثالي للحقن في مناطق الدماغ البطني. بسبب مقاومتها عالية للكسر أنها يمكن أن تكون على غرار لتشمل عدة ثقوب، الحصول على التصاميم التي قد تكون الأكثر فعالية حتى عند استهداف مناطق الدماغ مع مجمع الهندسيات10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد أقر جميع البروتوكولات التجريبية بجامعة فيرارا اللجنة الأخلاقية "التجارب الحيوانية" ووزارة الصحة الإيطالية. سيصلون (بحوث الحيوان: "الإبلاغ في تجارب فيفو"11) قد اتبعت المبادئ التوجيهية.
1-إعداد الإبر الكوارتز
- تنظيف وتعقيم الكوارتز الشعيرات الدموية (انظر الجدول للمواد) بوضعها لمدة 5 دقائق في الماء المقطر و 5 دقائق في الإيثانول 99% 5 دقيقة في الاثير ثنائي إثيل.
- اترك الشعيرات الدموية تحت غطاء محرك السيارة على الأقل 1 ح السماح لهم الجافة تماما.
- تعد الإبر باستخدام ساحبة ليزر وفقا للمعايير التي تسمح بإنتاج إبرة رقيقة طويلة بما فيه الكفاية، بما فيه الكفاية، تبعاً للاحتياجات الفردية.
ملاحظة: نحن نستخدم ساحبة ليزر (انظر الجدول للمواد). استخدام برنامج خطين للانسحاب. السطر الأول يستخدم الطاقة العالية ومدة المسح أكبر (المقابلة لقيمة خيوط) ولا قوة شد. هذا المزيج من المعلمات يؤدي إلى ذوبان الجزء الأكبر من شعري مع أقل سرعة التمديد، مما يسمح لتشكيل إبرة طويلة مع حجم كبير من الداخلية والخارجية، وخفض شأنك. وبهذه الطريقة، يحتفظ الإبرة مقاومة ميكانيكية عالية والقطر الداخلي الواسع الذي يسمح بمرور الخلايا الجذعية أو الجسيمات الفيروسية دون انسداد. السرعة والتأخير هذا السطر البرنامج ينبغي وقف تمديد الشعرية قبل أن يصبح نصيحة صغيرة جداً وطويلة، المفقودة المطلوبة الميكانيكية وخصائص الشكل. السطر الثاني من البرنامج سحب يتم تنفيذها تلقائياً، عندما يبرد الكوارتز (5 ق). المعلمات من السلطة وخيوط وسحب القوة الوظيفية قص تلميح مع أقصر طول ممكن نصيحة وعرقوب حاد، تجنب الفصل بين الإبر اثنين مع تمزق تلميح. بشكل روتيني، مع المعدات لدينا نحن نستخدم ما يلي: (أ) 1 سطر = الطاقة 990، خيوط 5، سرعة 130، تأخير سحب 110، 0؛ (ب) خط 2 = الطاقة 970، خيوط 3، السرعة 0، وتأخير 70، سحب 0. - وضع الإبر في طبق بتري تنظيفها مسبقاً مع الإيثانول 70%.
- تغطية الطبق مع فيلم بارافين بلاستيك.
- قص الشعيرات الدموية في الدقيقة-ديسيكتور.
- عند بدء التشغيل، السماح لليزر تشغيل عملية أوتوكاليبريشن للتحقق من الطاقة والطاقة الموردة. قم بتعيين المعلمات القطع.
ملاحظة: نحن نستخدم الدقيقة-ديسيكتور (انظر الجدول للمواد) والمعلمات التالية: ليزر نبض الطاقة (µJ 63)، قطر شعاع الليزر من 20% الفتحة القصوى (الفتحة القصوى: 1.0 ميكرومتر)، وخفض سرعة 10% السرعة القصوى (القصوى السرعة: 30 ميكرون/s). - إيمانا راسخا إصلاح الإبرة على الطاولة مجهر ووضع طرفها في وسط شاشة الكمبيوتر.
- على شريط القوائم، انقر على رمز القلم الرصاص واستخدامه لرسم علامة لقطع الليزر من الإبرة.
ملاحظة: ينبغي أن يكون الخفض بزاوية حوالي 45 درجة فيما يتعلق بالسطح الإبرة. - في الدالة شريط الجانب، حدد العلم الذي يحتوي على الزر ابدأ "قص" للسماح بالليزر قطع الفور ملحوظ سابقا.
- إذا لزم الأمر، قطع الجانب hole(s) بتكرار الإجراءات الوارد وصفها في 1.5.2-3؛ ليس هناك حاجة لإعادة تعيين موضع الإبرة (الشكل 1).
- عند بدء التشغيل، السماح لليزر تشغيل عملية أوتوكاليبريشن للتحقق من الطاقة والطاقة الموردة. قم بتعيين المعلمات القطع.
- بعد قطع التنظيف.
- قم بتوصيل الإبرة مضخة الفراغ من خلال أنبوب بلاستيكي.
- تشغيل المضخة ويدويًا بتعيين معدل التدفق إلى الأمام بسرعة معتدلة (3 ميليلتر/دقيقة).
- نضح الإيثانول 99% أولاً ثم الماء المقطر لإزالة الشوائب بسبب القطع.
- نضح الإيثانول 99% مرة أخرى لتخفيف حدة الجفاف.
ملاحظة: كل خطوة يجب أن تستمر على الأقل 3 دقيقة.
- تخزين الإبر في طبق بتري مغطاة بشكل صحيح حتى اليوم لعملية جراحية.
- يمكن إعادة استخدام الإبر؛ في نهاية التجربة، نظيفة مع التبييض والايثانول لإزالة بقايا الأنسجة الحل وممكن. لتنظيف أكثر اكتمالا، وضع الإبر في جرة تخزين ميكروبيبيتي مع طرف مشيراً إلى أسفل، ملء الجرة بالماء المقطر حتى يتم تغطية النصائح، تغلي لمدة 1.5 دقيقة لإزالة أي بقايا الأنسجة، ثم يغسل مع الإيثانول.
2-الإجراء
- اتباع الإرشادات المقدمة من دليل المستخدم مضخة، حدد من القائمة إعدادات معايرة المضخة حسب القطر/حجم المحاقن microinjection وتعيين معدل التدفق في 0.3 ميليلتر/دقيقة.
- ملء حقنه 10 مل (مزودة بإبرة حادة (مثلاً، إبرة هاملتون، 30 غ) وأنبوب تترافلوروايثيلين قصيرة) مع الماء المعقم واستخدامها لملء المحاقن microinjection (بعد بحذر شديد بعد إزالة المكبس) وحقن الجمعية عدة أجزاء للمضخة اليدوية microinjection (MMP).
ملاحظة: يتم استخدام مجموعة أدوات نظام التمثيل التناسبي المختلط أمن جبل الإبرة في الإطار المناظير باستخدام الأشعة (الشكل 2). وتشمل هذه المجموعة: أنابيب تترافلوروايثيلين، مقرنة اللوير للأنابيب، وحامل ماصة وأطواق منع التسرب الماصات مع أقطار خارجية مختلفة. - قم بتوصيل الإبرة عدة نظام التمثيل التناسبي المختلط.
- تدفق المزيد من المياه عبر النظام عن طريق حقنه 10 مل، والتحقق من ما إذا كان الماء يخرج من الإبرة.
ملاحظة: تأكد من إزالة أي فقاعة هواء داخل النظام بتكرار الخطوات الملء.
- تدفق المزيد من المياه عبر النظام عن طريق حقنه 10 مل، والتحقق من ما إذا كان الماء يخرج من الإبرة.
- قم بفصل حقنه 10 مل من المحاقن microinjection بينما يدفع المكبس ببطء كي يترك قطره الماء في الجزء العلوي من المحاقن microinjection. إدراج المكبس في المحاقن microinjection.
- الاتصال المحاقن microinjection المضخة وتعيين معدل التدفق في 0.3 ميليلتر/دقيقة.
ملاحظة: انتظر حتى يكون هناك انخفاض تسريب من طرف الإبرة وثم ندعه يذهب لآخر 3 دقائق. - ضبط التدفق في 0.1 ميليلتر/دقيقة وبدء إجراء عملية جراحية. يجب أن تكون المضخة الجارية أثناء إجراء عملية جراحية.
ملاحظة: للتجارب التي ذكرت في هذه المقالة، نحن نستخدم ذكور الفئران "سبراغ داولي" من 300 غرام (3 أشهر عمر). ومع ذلك، الإجراء ينطبق على الأنواع الأخرى، والفئران خاصة. - حمل التخدير العام باستخدام أسلوب الموافقة على اللوائح المحلية.
ملاحظة: نحن نستخدم مزيجاً حقن داخل (القائمة) xylazine الكيتامين و 8 ملغ/كغ 85 مغ/كغ لمدة 20-50 دقيقة من التخدير. من المهم أن تستخدم القرصات الذيل و/أو أخمص القدمين لضمان الحيوان هو مخدراً تماما. ويتم تقييم مستوى التخدير ويفتك الأساسية قبل أن يبدأ جراحة ورصد كل 10 دقائق أثناء إجراء عملية جراحية. يتم الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان المستمر من قبل، أثناء وبعد العمليات الجراحية باستخدام مياه إعادة تعميم التدفئة لوحة. وتراقب الحيوانات حتى شُفي تماما (مثلاً وتستقيم والاسعافية). وبالإضافة إلى ذلك، تتلقى الحيوانات المسكنات (ترامادول، القائمة 5 – 7 مغ/كغ) قد كل 24 ساعة لمدة ثلاثة أيام.- يحلق رأس الحيوان وإعداد موقع الجراحية على نحو كاف لعملية جراحية معقمة. أداء فرك مرحلتين مع الحل القائم على اليود (تدين) تليها إيثانول 70%. وعلاوة على ذلك، للحفاظ على أسيبسيس، التفاف الموقع الجراحي مع ثني جراحية (في الفيديو تم حذف لأغراض العرض التوضيحي).
- ضع الفئران في الإطار ستيريوتاكسيك فوق مياه إعادة تعميم شامل التدفئة. توفير لتخفيف الآلام الإضافية، في موقع الجراحة تطبيق الحل ليدوكائين 0.5% (لا تتجاوز 7 مغ/كغ). قبل تعقيم جميع الأدوات الجراحية استخدام حبة تعقيم باردة معقم أو سائل من إيميرجينج المعدات أما 2 ٪ glutaraldehyde بالإضافة إلى 7.05% الفينول (سبوروديسين أو سانحة) متبوعاً شطف مع الماء المعقم أو المحلول الملحي. يجب أن يتم التطهير حتى بين الإجراءات. إجراء قطع طولية عبر الجمجمة باستخدام مشرط معقم. أن يكون لطيف لتجنب النزيف. فتح فروة الرأس باستخدام ملعقة مسطحة وتطبيق مقاطع الجراحية في اللوحات الجلد إبقائه مفتوحاً. بلطف جداً، فصل السمحاق لفضح في بريجما ومنطقة الجمجمة سيتم من خلالها إدراج الإبرة.
- جبل الذراع على الإطار ستيريوتاكسيك (بينما التدفق مستمر) ونقل غيض الإبرة بالضبط على رأس بريجما، اهتماما لا للخروج من طرفها. إضافة تعليق توضيحي إحداثيات أنتيرو الخلفي والجانبي ميديو بريجما وترجمة للإحداثيات المطلوبة. تسترشد ستيريوميكروسكوبي، أقل الإبرة حتى يلامس طرفها تقريبا في الجمجمة، ومارك حفر بقعة بعد رفع ذراع ستيريوتاكسيك قليلاً.
- الحفر (حفر نصيحة Ø: 0.8 مم؛ وسرعة التصفح: 1,000 لفة في الدقيقة) الجمجمة على الفور ملحوظ. ويجب الحرص لا لاختراق دوراً في أثناء إجراءات الحفر. أثناء الحفر، بالتنقيط سالين معقم لتفادي تلف العظام ونخر.
- قص قطعة صغيرة من الفيلم البارافين البلاستيك ووضعه في الجمجمة. استخدام بيبيت ميليلتر 10، جعل قطره من الحل لحقن على الفيلم البارافين البلاستيك. إيقاف المضخة وقليلاً استرداد دافع المضخة وإنشاء فقاعة هواء قليلاً في شعري بسحب المكبس للمحاقن microinjection برفق.
- خفض الذراع المناظير باستخدام الأشعة حتى غيض الإبرة يبلغ القطرة. رسم العينة عن طريق سحب المكبس للمحاقن microinjection، تجنب أي تشكيل فقاعة (ببطء شديد). استبدال دافع مضخة على اتصال بالمكبس وتشغيل المضخة بمعدل تدفق 0.3 ميليلتر/دقيقة الانتظار حتى تشكيل قطره (بضع دقائق) قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
ملاحظة: في هذا المثال التجربة، السائل الدماغي النخاعي الاصطناعية (قام) كان غرست في المخطط (AP: + 1.5، مل: ±2.7؛ العنف المنزلي:-5.0) وفي قرن آمون الظهرية (AP:-3، 5، مل: ±2.1؛ العنف المنزلي:-3، 5؛ مم من دوراً)، 2 ميليلتر/الموقع. لتسهيل المقارنة بين أساليب حقن اثنين، كان غرست كل منطقة الدماغ باستخدام إبرة كوارتز في واحدة من نصف الكرة الغربي وتلميح فجة ز 26 أو إبرة فولاذ المقاوم للصدأ نصيحة مجسم مشطوف الحواف ز 30 في الآخر. - انخفاض تدفق إلى 0.1 ميليلتر/دقيقة، نك في بلده دوراً بإبرة مجسم مشطوف الحواف-نصيحة فولاذ المقاوم للصدأ وانخفاض ببطء في الذراع المناظير باستخدام الأشعة في فاس دورسو البطني، دخول أنسجة المخ. عند الوصول إلى الموضع المطلوب، انتقل لأسفل 0.1 ملم إضافية، تتوقف المضخة، رفع الذراع المناظير باستخدام الأشعة من 0.1 ملم والبدء من جديد المضخة في التدفق إلى 0.3 ميليلتر/دقيقة.
ملاحظة: هو السبب الحفاظ على تدفق بطيء بينما خفض الإبرة لضمان ضغط إيجابي التي تتجنب اختراق شظايا صغيرة من الأنسجة بالإبرة نفسها. أن عرقلة مثل هذا حدث تلميح، عرقلة إيصال الحل. نظراً لأن معدل تدفق بطيء جداً بينما خفض الإبرة وسرعة تخفيض حوالي 10 s/مم، وهذا يعني أن كميات الحل التي تبقى على طول مسار إبرة لا تذكر مقارنة بتلك التي تحقن في الموقع المستهدف. يمكن تجنب هذه الاحتياطات عند استخدام الإبر ذات ثقوب جانبية. - بدء تشغيل جهاز ضبط الوقت والانتظار الوقت اللازم يعتمد على وحدة التخزين المطلوبة لحقن (على سبيل المثال، 6 دقيقة 40 ثانية إذا كان الحقن 2 ميليلتر). رصد حركة فقاعة أثناء الحقن. في النهاية، توقف المضخة والانتظار مدة 5 دقائق قبل استرداد الإبرة ببطء. عندما يتم استخراج الإبرة الكوارتز تماما، بدء تشغيل المضخة مرة أخرى وتحقق من تكوين قطره في طرف الإبرة.
- ختم الافتتاح في سطح الجمجمة بالشمع العظام وإزالة القصاصات مرقئ وخياطة فروة الرأس، ومعطف المنطقة المحيطة بالجرح بكريم مضاد حيوي (مثلاً، نيوسبورين) وإرجاع الحيوان إلى القفص المنزل.
ملاحظة: في أعقاب القتل الرحيم بروتوكول أقرته اللجنة الأخلاقية المؤسسية، للتجارب الموضحة في هذه المقالة، الحيوانات عميق تخديره مع حقن القائمة من الكيتامين 43 مغ/كغ و xylazine 7 مغ/كغ، وقطع رأسه. وأزيلت العقول، بوستفيكسيد في الفورمالين ح 48 والبارافين المضمنة. كانت شرائح مقاطع الاكليلية (8 ميكرومتر) من العقول باستخدام مبضع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نحن مقارنة الأضرار الناجمة عن microinjection المباشر في الفئران الحصين الظهرية والمخطط باستخدام إبرة كوارتز (60 نصيحة القطر الخارجي ميكرومتر؛ ثقب الجانب قطرها 20 واحد ميكرومتر؛ نوع ج، الشكل 1) مقارنة مع اثنين الكلاسيكية، ز 26 نهاية حادة وحافة المجسم مشطوف الحواف ز 30 الفولاذ المقاوم للصدأ الإبر. لتحقيق هذا الهدف، علينا حقن 2 ميليلتر من قام بحق وترك الحصين الظهرية والمخطط استخدام الكوارتز وابرة الصلب و، ح 48 على التوالي بعد الحقن، نحن تقييم تلف الأنسجة باستخدام صبغة الهيماتوكسيلين ويوزين (هو). لقد اخترنا نقطة وقت مبكر بعد الحقن بشكل أفضل تقدير الأضرار الميكانيكية الحادة التي تنتجها الإبر المختلفة (في الوقت المناسب، يمكن أن يحجب آليات إصلاح الأنسجة الضرر الأولى)7.
عقب البروتوكول، المذكورة أعلاه، الإبرة الكوارتز لم ينتج أي ضرر لا يمكن اكتشافها، ومسار إبرة بالكاد يمكن كشفها، بينما أظهرت مناطق الدماغ حقنه من خلال إبرة حادة نهاية 26 ز الصلب ضرر ملحوظ (الشكل 3). زاوية (30 °) مجسم مشطوف الحواف ز 30 إبرة الفولاذ المقاوم للصدأ الناجم عن آفة المخ أكثر محدودية، بعد الكشف الواضح في المخطط (الشكل 4 باء) وفي قرن آمون الظهرية (الشكل 5). لإثبات أن حقن قام بنفس القدر من النجاح مع كلا الإبر، في مجموعة منفصلة من التجارب نحن حقن 2 ميليلتر تريبان الأزرق (الشكل 4 أ). الأهم من ذلك، كانت جميع الكوارتز المستردة الإبر سليمة تماما، أيأننا لم يلاحظ أي ضرر بسبب المناورات الإدراج.
رقم 1: صورة مجهرية من طرف إبرة الكوارتز، تظهر أقطار مختلفة من نصيحة والثقوب المستخدمة لحقن السوائل. انخفاض الصورة التكبير في (A) وأعلى التكبير في (ب) و (ج). يمكن إعداد الإبرة في مختلف الآداب (طول مختلفة وأرقام ثقب وثقب الأبعاد) وفقا للتشريح في منطقة الدماغ، بهدف نشر واللزوجة من الحل، كما هو موضح في (ب) و (ج). لاحظ قطع ناعمة الثقوب ومعلومات تم الحصول عليها باستخدام ميكروديسيكشن الليزر منخفض الطاقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إعداد ميكروينجيكشنز- صورة تظهر مجموعة أدوات تستخدم لتأمين ماصة الكوارتز (يسار) وابرة الفولاذ المقاوم للصدأ (يمين) إلى ميكروبوسيتيونير المناظير باستخدام الأشعة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الاكليلية مقاطع تظهر أقل ضررا باستخدام إبرة الكوارتز. أقسام الاكليلية (8 ميكرون سمك) من أدمغة الفئران على مستوى المخطط عرض مقارنة بين إنتاج الضرر عن طريق الحقن من 2 ميليلتر قام باستخدام إبرة كوارتز مثل واحد يظهر في الشكل 1 (الجانب الأيسر) وابرة فولاذ المقاوم للصدأ ز 26 نهاية غير حادة (تلاعب الجانب ht). وأنتج بعض الأضرار في قشرة على جانب الإبرة الكوارتز، سبب غير صحيح عمق الحفر في الجمجمة. هذه الصور، التي اتخذت من اثنين من الحيوانات المختلفة، تمثل جميع الحيوانات 5 المدرجة في التجربة (شريط المقياس = 500 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الأضرار تنتشر والأنسجة. (أ) "التوزيع تريبان" الأزرق حقن في المخطط إبرة كوارتز (يسار)، بالمقارنة مع 30 جرام مشطوف حافة فولاذ المقاوم للصدأ إبرة (يمين). (ب) قسم الاكليلية من دماغ الفئران على مستوى المخطط، ملطخة بأنه عرض مقارنة بين إبرة كوارتز وابرة فولاذ المقاوم للصدأ حافة مجسم مشطوف الحواف ز 30 (شريط المقياس = 500 ميكرومتر). في المربعين (اليسار واليمين)، تكبير أعلى من الضرر (شريط المقياس = 200 ميكرومتر، 10 X). هذه الصور هي الممثل للحيوانات 5 المدرجة في هذه التجربة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: الضرر الناجم عن إبرة كوارتز وابرة فولاذ المقاوم للصدأ حافة مجسم مشطوف الحواف ز 26 على مستوى الحصين الظهرية. هاتين القضيتين هو موضح هنا هي الممثل للحيوانات 5 المدرجة في التجربة (شريط المقياس = 400 ميكرون). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الأسلوب الموصوفة في هذه المقالة يفي بالاحتياجات الواردة في مقدمة للاستفادة المثلى من ميكروينجيكشنز التي يتم تنفيذها لمختلف الأغراض12. الإبر الموصوفة هنا تقليل الضرر إلى مستوى الحد الأدنى، وأساساً غير القابلة للاكتشاف؛ في تباين مع الإبر الزجاجية (التي عرضه لثني)، الإبر الكوارتز جامدة وضمان ضرب موثوق بها لمنطقة الدماغ المطلوبة حتى في إحداثيات العميق. وعلاوة على ذلك، يضمن ثقب الجانب تسليم الحل حتى لو يحصل تغطي الحفرة تلميح أثناء الإدراج في أنسجة المخ.
القيود والبدائل. بسبب انصهار عالية، لا يمكن سحبها الكوارتز الشعيرات الدموية على ساحبة تقليدية، أي، أنها تتطلب الوصول إلى معدات مكلفة. الزجاج الشعيرات الدموية جيدة على قدم المساواة فيما يتعلق بتجنب الأضرار بالانسجة، ولكن أقل موثوقة للحقن في هياكل عميقة وأكثر هشاشة (أي، أقل مرونة من حيث التصميم). ومع ذلك، إذا كان الهدف هو حقن في هياكل سطحية مثل القشرة أو الحصين الظهرية ولا يوجد أي شرط الثقوب المتعددة التي من شأنها زيادة خطر كسر الإبرة، الإبر الزجاج التأكيد تمثل بديلاً صالحاً ورخيصة.
حد للابر الكوارتز والزجاج أن لا تسمح حقنات متعددة في نقاط زمنية مختلفة، مثل الإبر الفولاذ المقاوم للصدأ، بالإضافة إلى توجيه cannulas. ولذلك، تظل الإبر الصلب أفضل خيار لهذه التطبيقات، مع تقديم المشورة لتجنب كبيرة نسبيا (26 ز) و/أو الإبر حافة حادة.
خطوات حاسمة في البروتوكول. عموما، أن البروتوكول، المذكورة أعلاه واضحة جداً وينبغي أن لا تكون صعبة الاستخدام لأي باحث من ذوي الخبرة في ميكروينجيكشنز. وبمجرد إتاحة الإبر، سيكفل الاحتياطات العادية المستخدمة للتخدير، والجراحة، والإدراج بطيئة وإزالة الإبرة، المستمر وبطء معدل ضخ تنظمه مينيبومب، نتائج جيدة واستنساخه.
المزايا والمزيد من التطورات. وكما ذكر أعلاه، أن الميزة الأساسية للابر الكوارتز الزوجين الحد الأدنى من الضرر الميكانيكي مع إمكانية تخصيص تصميم الإبرة. نحن على استعداد الإبر مع ثقوب متعددة وأقطار مختلفة، التي يمكن تكييفها لاحتياجات تجريبية محددة. على سبيل المثال، قد يلزم أقطار مختلفة لحقن النواقل الفيروسية والخلايا مقارنة بالمخدرات أو السموم؛ قد تكون مفيدة لضمان حقن كميات أكبر من حل داخل مساحة أكبر ثقوب متعددة ويمكن أن تصبح مفيدة بشكل خاص لمناطق الدماغ الهندسة صعبة. ويمكن استغلال براعة كبيرة في هذا الأسلوب أيضا لتحسين الانتشار في أنسجة النواقل الفيروسية للعلاج بالجينات أو الخلايا. في الواقع، نحن نستخدم هذه الإبر لحقن النواقل الفيروسية أو الخلايا.
وتشمل المزايا الأخرى إمكانية إعادة استخدام الإبر. للقيام بذلك، يمكن تنظيف الإبر مع الإيثانول والتبييض لإزالة بقايا الأنسجة الحل وممكن. تكرار استخدام إبرة واحدة يمكن جعل الإجراء فعال من حيث التكلفة وعلى الرغم من الارتفاع النسبي لتكلفة الإنتاج.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وقد دعمت هذا العمل بمنحه مقدمة من "الجماعة الأوروبية" [مشروع FP7--الناس--2011--IAPP 285827 (ابيكستشانجي)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
References
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
