Summary
Biz burada mikroenjeksiyon kuvars iğneleri kullanan kemirgen beyin için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu iğneler değil algılanabilir doku hasarı üretmek ve derin bölgelerde bile güvenilir teslim edilmesini sağlamak. Ayrıca, araştırma ihtiyaçlarına tarafından kişiselleştirilmiş tasarımlar adapte edilebilir ve yeniden kullanılabilir.
Abstract
Microinjections uyuşturucu ya da toksinlerin belirli beyin bölgeleri içinde teslim etmek için uzun süre kullanılmıştır ve daha yakın zamanlarda, bunlar gen veya hücre terapi ürünleri teslim etmek için kullanılmıştır. Ne yazık ki, şu anki mikroenjeksiyon teknikleri için birden çok nedeni suboptimal çelik veya cam iğne kullanın: özellikle, çelik iğneler doku hasarına neden olabilir ve cam iğne eğmek derinden hedef bölge eksik beyin düşürdü. Bu makalede, biz hazırlamak ve yararlı özellikleri birleştirmek kuvars iğne kullanmak için bir iletişim kuralı tanımlamak. Bu iğneler tespit doku hasarı üretmek değildir ve çok sert olmak, güvenilir teslim istenen beyin bölgesinde derin koordinatları kullanırken bile olun. Ayrıca, birden fazla delik istenilen çap yaparak iğne tasarımını kişiselleştirmek mümkündür. Enjeksiyon hücrelerinin büyük delikler kolaylaştırmak, ancak birden fazla delik çözüm daha büyük bir alan içinde büyük miktarda enjeksiyon kolaylaştırmak. Buna ek olarak, bu kuvars iğneler temizlenmesi ve kullanılan, yeniden öyle ki yordamı maliyet-etkin hale gelir.
Introduction
Microinjections farmakolojik aktif bileşikler teslim etmek için uzun bir süre için belirli beyin alanlarda nöronal aktivite modüle için kullanılmıştır. Buna ek olarak, toksinler nörodejeneratif olaylar karakteristik bazı hastalıkların, örneğin 6-hidroksi-Parkinson hastalığı taklit etmek için nigrostriatal dopamin sisteminde dopamin taklit etmek için belirli nöron popülasyonları yakınındaki enjekte kullanılmıştır 1 , 2 veya anma 192 IgG saporin lezyon kolinerjik sistemi3için. Daha yakın zamanlarda, mikroenjeksiyon işlemleri viral vektörler veya hücreleri Greftler deneysel beyin bozuklukları4,5gen veya hücre tedavisi için teslim etmek için kullanılmaktadır.
Bu çalışmalarda kullanılan iğneler klasik tip paslanmaz çelikten imal edilmiştir. Ne kadar kolay ve pratik kullanmak, bir dizi sorunları6çelik iğneler var: onlar nispeten büyük ve doku hasarı, kan - beyin bariyerini kaçağı ve astrocytes; aktivasyonu ile neden Ayrıca, onlar bir engel oluşturmak veya hatta tamamen kaçınmak istediğiniz çözüm akışının iğne alır beyin dokusunun Asitleme üretebilir. Daha yakın zamanlarda, hazırlanan özel kılcal damarlar üzerinden tanıtıldı içinde cam iğne7,8kullanın. Bunlar önemli doku hasarı ne de astrocyte harekete geçirmek, neden olmaz ama nispeten esnek ve yerelleştirme (kişisel gözlemler) doğruluğunu azaltarak derin yapılarını tanıttığında viraj.
Bu nedenle olası hasar olduğu kadar hassasiyet ve tekrarlanabilirlik artırırken (özellikle hasar iyileşir deneyler yaparken) azaltmak için bir ihtiyaç olduğunu (Yani, tüm çözüm iletilmesini sağlamak ve doğru yerelleştirme emin olun). Ayrıca, en iyi beyin alanlarda değişen geometrileri ile enjekte çözüm dağıtımını sağlamak için farklı iğne tasarımları kullanmak arzu olacaktır. Bu makalede, biz hazırlamak ve kuvars iğneler microinjections kemirgen beyin için kullanmak için bir iletişim kuralı tanımlamak. Yüksek erime noktası nedeniyle kuvars kılcal bir geleneksel çektirmenin çekti ve bu nedenle, geçmişte iğneler oluşturmak için kullanılmamış. Kuvars, ancak, cam, özellikle yüksek sertlik ve ara direnç9bazı önemli avantaj sunar. Onların sertlik nedeniyle kuvars iğneler ideal enjeksiyonları ventral beyin bölgeleri için uygundur. Onların kırılma direnci nedeniyle onlar bile karmaşık geometriler10ile beyin bölgeleri hedefleme en etkili kanıtlayabilir tasarımlar elde birden fazla delik eklemek modellenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel protokoller Ferrara Üniversitesi etik kurul için hayvan deney ve İtalyanca Sağlık Bakanlığı tarafından kabul edildi. VARIŞ (hayvan araştırma: Raporlama In Vivo deneyler11) yönergeleri takip etti.
1. kuvars iğneler hazırlanması
- Temiz ve distile suda 5 dk, 5 dk etanol % 99 ve 5 dakika içinde Dietil eter yerleştirerek ( Tablo malzemelerigörmek) kuvars kılcal sterilize.
- Kılcal koyup tamamen kuruyuncaya kadar bırakın en az 1 h için başlık altında bırakın.
- Bir lazer çektirmenin bireysel ihtiyaçlarına bağlı olarak yeterince uzun, yeterince ince bir iğne imalatı izin parametrelere göre kullanarak iğneler hazır olun.
Not: Biz bir lazer çektirmenin kullanın (bkz. Tablo malzeme). Bir iki satır program çekmek için kullanın. Yüksek güç, en büyük tarama uzunluğu (FİLAMENTLER DEĞERİNE karşılık gelen) ve çekerek güç kullanmaya ilk satırını kullanır. Bu parametreler birleşimi kılcal büyük iç/dış boyutu uzun bir iğneyle şekillendirme için izin en düşük uzantısı hızı ile en büyük bölümü erime yol açar ve şaft düşük. Bu şekilde, bir yüksek mekanik direnci ve tıkanma olmadan kök hücre veya viral parçacıkların geçişini sağlayan geni iç çapı iğne korur. Ucu çok küçük ve uzun, gerekli mekanik ve şekil özellikleri eksik olmadan önce hız ve gecikme bu program satırının kapiller uzantısı durdurmanız gerekir. Kuvars soğuduktan sonra çekerek programının ikinci satır otomatik olarak çalıştırılmasına (5 s). Güç, filaman ve kuvvet çekme bir ucu kısa olası ipucu uzunluğu ve bir ipucu kopma iki iğnelerle ayrılması kaçınarak dik shank ile kesmek için fonksiyonel parametreleridir. Düzenli olarak, bizim ekipman ile aşağıdakileri kullanın: (a) Line 1 = güç 990, filaman 5, hız 130, gecikme 110, çekme 0; (b) satır 2 = güç 970, gecikme 70, filament 3, hız 0 0 çekin. - İğneler daha önce % 70 etanol ile temizlenmiş Petri kabına koyun.
- Bir plastik parafin film ile çanak kapağı.
- Kılcal mikro-tetkik kes.
- Başlangıç lazer güç doğrulamak için bir hazneler süreç çalıştırmak ve teslim enerji ver. Sonra kesme parametreleri ayarlayın.
Not: Biz bir mikro-tetkik kullanın (bkz. Tablo reçetesi) ve aşağıdaki parametreleri: lazer güç darbe enerji (63 µJ), lazer ışın çapı maksimum diyafram % 20 (maksimum diyafram: 1.0 µm) ve kesme hızı maksimum hız (maksimum % 10 hız: 30 µm/s). - Sıkıca iğne mikroskop tablosunu düzeltmek ve ucu bilgisayar ekranın ortasına konumlandırın.
- Menü çubuğunda kalem simgesine tıklayın ve bir işareti iğne lazer kesme için çizmek için kullanın.
Not: Cut iğne yüzeyi ile ilgili yaklaşık 45 ° açılı olması gerekir. - Yan çubuğu işlevi önceden işaretlenmiş nokta kesmek lazer izin vermek için "kesin Başlat" düğmesini içeren bayrağı seçin.
- Gerekirse, yan hole(s) 1.5.2-3 içinde açıklanan yordamları yineleyerek kesilmiş; iğne (şekil 1) yeniden konumlandırmak için gerek yoktur.
- Başlangıç lazer güç doğrulamak için bir hazneler süreç çalıştırmak ve teslim enerji ver. Sonra kesme parametreleri ayarlayın.
- Temizlik sonrası kesti.
- İğne geçersiz bir pompa ile bir plastik tüp takın.
- Pompa açmak ve el ile ılımlı bir hızda (3 µL/dak) ileriye doğru akış oranını ayarlamak.
- % 99 etanol Aspire kesme nedeniyle kirleri çıkarmak için ilk ve daha sonra distile su.
- Tekrar kurutma kolaylaştırmak için % 99 etanol Aspire edin.
Not: Her adım en az 3 dakika sürmelidir.
- İğneler düzgün kapalı kabında cerrahi güne kadar saklayın.
- İğne yeniden kullanılabilir; deney sonunda, temiz çamaşır suyu ve etanol çözüm ve olası doku artıklarını çıkarın. Bir daha eksiksiz, iğne ucunu aşağı doğru işaret eden bir micropipette depolama kavanoza koyup temizlik için ipuçları kaplıdır kadar kavanoz distile su ile doldurun, kalan herhangi bir doku kaldırın, sonra etanol ile yıkamak için 1,5 dakika kaynatın.
2. yordam
- Pompa kullanım kılavuzu tarafından sağlanan yönergeleri izleyerek, pompa çapı/hacim mikroenjeksiyon şırınganın göre kalibre ve 0.3 µL/dak akış hızı ayarlamak için Ayarlar menüsünü seçin.
- ((Örneğin, Hamilton iğne, 30 G) künt bir iğne ve kısa politetrafloroetilen tüp ile donatılmış) bir 10 mL şırınga steril su ile doldurun ve mikroenjeksiyon şırınga (sonra çok dikkatli piston çıkarmak) ve enjeksiyon doldurmak için kullanın Montaj parçaları kiti için el ile mikroenjeksiyon pompa (MMP).
Not: MMP kit stereotaksik çerçeve (Şekil 2) iğnede güvenli bir şekilde bağlamak için kullanılır. Kiti içerir: politetrafloroetilen boru, radarı boru coupler, pipet tutucu ve contalar Pipetler farklı dış çapı için. - İğne MMP teçhizat-e doğru bağlamak.
- Daha fazla su sistemi genelinde 10 mL şırınga temizler ve su dışında iğne gelir olup olmadığını kontrol edin.
Not: doldurma adımları tekrar uygulayarak sistem içinde herhangi bir hava kabarcığı kaldırdığınızdan emin olun.
- Daha fazla su sistemi genelinde 10 mL şırınga temizler ve su dışında iğne gelir olup olmadığını kontrol edin.
- 10 mL şırınga yavaş yavaş piston bir damla su mikroenjeksiyon şırınga üstündeki bırakmak için bastırıyor ise mikroenjeksiyon şırıngadan çıkarın. Piston mikroenjeksiyon şırıngada yerleştirin.
- Mikroenjeksiyon şırınga pompa bağlanmak ve 0.3 µL/dak akış hızı ayarlayın.
Not: bir damla iğneyi ucundan sızıntı tamamlanana kadar bekleyin ve sonra başka bir 3 dakikadır gidelim. - Akış 0.1 µL/dk az ayarlayın ve cerrahisi prosedürü başlatın. Pompa ameliyat yaparken sürekli olması gerekir.
Not: Bu makalesinde bildirilen deneyler için biz erkek Sprague Dawley Rat 300 g (3 ay-in yaş) kullanın. Ancak, yordamı özellikle fareler diğer türler için geçerlidir. - Genel anestezi yerel düzenlemelere tarafından onaylanmış bir yöntemi kullanarak neden.
Not: Anestezi için 20-50 dk 85 mg/kg ketamin ve 8 mg/kg xylazine mayi enjeksiyon (IP) bir karışımı kullanın. Kuyruk ve/veya ayak Pinch hayvan tamamen uyuşturulmuş emin olmak için kullanılır önemlidir. Anestezi ve temel hayati önce ameliyat başlar ve ameliyat yaparken her 10 min izlenen değerlendirildi. Hayvan vücut ısısı sırasında ve sonrasında cerrahi işlemler yeniden Isıtma yastığını dolaşan bir su kullanarak daha önce sabit tutulur. Hayvanlar kadar tamamen iyileşti izlenir (örneğin dik ve Ambulatuvar vardır). Ayrıca, hayvanlar üç gün boyunca post-operatively her 24 h analjezikler (tramadol, 5-7 mg/kg ı.p.) alırsınız.- Hayvanın kafasını tıraş ve yeterince için aseptik cerrahi cerrahi site hazırlamak. Bir iki aşamalı bodur iyot tabanlı çözüm (betadin) % 70 etanol tarafından takip ile gerçekleştirin. Ayrıca, asepsis korumak için cerrahi sitesi cerrahi örtüsü ile sarın (video gösterim amacıyla çıkarılmıştır).
- Fareyi stereotaksik çerçevede yeniden Isıtma battaniye dolaşan bir su üzerinde konumlandırın. Ek ağrı sağlamak için % 0.5 lidokain çözüm ameliyat yerinde geçerli (7 mg/kg fazla olamaz). Önceden tüm cerrahi aletler sterilize de %2 oxazolidin artı %7.05 fenol (Sporodicin veya Cidex) aletleri immerging tarafından bir boncuk Sterilizatör veya sıvı soğuk dezenfeksiyon kullanarak durulama steril su veya serum fizyolojik ile izledi. Dezenfeksiyon prosedürleri arasında bile gerçekleştirilmelidir. Bir boyuna kesim kafatası üzerinde steril neşter kullanarak yapmak. Aşırı kanama önlemek için nazik ol. Düz bir spatula kullanarak kafa derisi açın ve cerrahi klipleri onu açık tutmak için cilt kapakları üzerinde uygulayın. Çok yavaşça bregma ve hangi aracılığıyla iğne eklenir kafatası alan duyurmak kapaklarini bağlantısını kesin.
- (Akış devam eden ise) stereotaksik karede kol mount ve tam olarak bregma, ucu kırmamaya dikkat üzerine iğne ucu taşıyın. Bregma antero-posterior ve medio-lateral koordinatlarını açıklama ekleyin ve istediğiniz koordinatları tercüme. Bir stereomicroscope tarafından yönlendirilen, iğne ucu neredeyse kafatası dokunuyor kadar düşük, sondaj spot mark biraz stereotaksik kol yükseltme sonra.
- Matkap (matkap ucu Ø: 0.8 mm; matkap hızı: 1000 devir/dakika) işaretli nokta kafatasında. Beyin zarı Delme işlemler sırasında nüfuz değil bakım alınması gerekir. Delme sırasında kemik hasarı ve nekroz önlemek için steril serum fizyolojik damla.
- Plastik parafin film küçük bir parça keser ve kafatasında yerleştirir. 10 µL damlalıklı kullanarak, plastik parafin filmde enjekte için çözüm teslimatı yap. Pompa kes, biraz itici pompa almak ve mikroenjeksiyon şırınga piston hafifçe çekerek kılcal içinde küçük bir hava kabarcığı oluşturun.
- İğne ucu damla ulaşıncaya kadar stereotaksik kolu indir. Örnek (çok yavaş) herhangi bir kabarcık oluşumu kaçınarak mikroenjeksiyon şırınga piston çekerek çizin. Pompa itici piston ile temas halinde eski yerine koymak ve pompanın debisi 0,3 µL/dak bekle, bir sonraki adıma devam etmeden önce bir damla (bir kaç dk) oluşumu kadar açın.
Not: mevcut örnek deneyde, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) içinde striatum infüzyon (AP: +1.5, ML: ±2.7; DV:-5.0) ve dorsal hippocampus (AP:-3.5, ML: ±2.1; DV:-3.5; dura üzerinden mm), 2 µL/site. İki enjeksiyon yöntemleri arasında karşılaştırma kolaylaştırmak için her beyin alan bir Yarımküre ve 26 G künt bahşiş kuvars iğne veya diğer 30 G eğim-tip paslanmaz çelik iğne kullanarak infüzyon. - Daha düşük akış 0.1 µL/dk, dura bir paslanmaz çelik eğim uçlu iğneyle nick ve beyin dokusu girerek dorso-ventral balta stereotaksik kolunda yavaşça indirin. İstediğiniz konuma geldiğinde, bir ek 0,1 mm pompa durdurmak, stereotaktik kol tarafından 0,1 mm yükseltmek ve 0.3 µL/dk akış istasyonlarında baştan gidin.
Not: iğne düşürürken bir yavaş akış sağlamak için neden küçük parçaları iğne kendisi doku penetrasyonu önler bir pozitif basınç sağlamaktır. Böyle bir durumda çözüm teslimini bozulması uç, engel. İğne ve düşürücü hızını düşürerek yaklaşık 10 s/mm ise akış hızı çok yavaş olduğu için bu iğne parça kalır çözüm miktarda bu hedef sitede enjekte karşılaştırıldığında yok denecek kadar azdır anlamına gelir. Bu önlem iğneler ile yan delik kullanırken gerek kalmayabilir. - Sayacı başlatmak ve enjekte etmek için istenen birimde bağlı olarak ihtiyaç duyduğu zaman (2 µL enjekte Eğer örneğin, 6 dk 40 sn) bekleyin. Kabarcık hareketi enjekte ederken izlemek. Sonunda, pompa durdurun ve yavaş yavaş iğne almadan önce 5 dakika bekleyin. Kuvars iğne tamamen ayıklandığında, pompa yeniden başlatın ve iğne ucunda bir damla oluşumu için kontrol edin.
- Kafatası yüzey kemik balmumu ile açılış mühür, Kan durdurucu sargı küçük resimleri kaldırmak ve kafa derisi dikiş, yara bir antibiyotik krem (örneğin, neosporin) ile çevresini kat ve hayvan ev kafese döndürür.
Not: Bu makalede açıklanan deneyler için kurumsal etik kurul tarafından onaylanmış ötenazi Protokolü hayvanlar derin 43 mg/kg ketamin ve 7 mg/kg xylazine bir ı.p. enjeksiyon ile anestezi ve kesti. 48 h ve parafin gömülü için formalin postfixed beyin çıkarıldı. Koronal bölümler (8 µm) beyin bir microtome kullanarak dilimlenmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Biz fare dorsal Hipokampus ve striatum iki klasik, 26 G künt end ve 30 G eğimli kenar ile karşılaştırıldığında bir kuvars iğne (60 µM dış çapı uç; bir 20 µM çapı yan delik; tip C, şekil 1) kullanarak doğrudan mikroenjeksiyon tarafından indüklenen zarar göre Paslanmaz çelik iğneler. Bu amaç için aCSF sağ 2 µL enjekte ve dorsal Hipokampus ve sırasıyla kuvars ve çelik iğne ve, 48 saat sonra enjeksiyon kullanarak striatum yaptı, Hematoksilen-Eozin (HE) Boyama kullanarak doku hasarı değerlendirildi. Enjeksiyon daha iyi takdir sonra farklı iğne tarafından üretilen akut mekanik hasar biz erken bir saat noktası seçti (zamanında, karanlık doku tamir mekanizmaları ilk hasar)7.
Beyin bölgeleri 26 G çelik künt son iğne enjekte işaretli hasar (şekil 3) sergilenen ise yukarıda açıklanan Protokolü kuvars iğne tespit herhangi bir hasar ve bir ancak algılanabilir iğne parça üretmek değildi. 30 G eğim açısı (30 °) paslanmaz çelik iğne bir daha sınırlı, henüz açıkça tespit beyin lezyon striatum (4B rakam) ve dorsal oluşur (şekil 5) indüklenen. ACSF enjeksiyon deneyler ayrı bir kümesi içinde her iki iğne ile aynı derecede başarılı olduğunu kanıtlamak için biz Trypan mavi (şekil 4A) 2 µL enjekte. Önemlisi, tüm alınan kuvars iğneler mükemmel olduğu gibi Yani, biz hiçbir zaman herhangi bir hasar nedeniyle ekleme manevralar gözlenen.
Şekil 1: ipucu ve sıvı enjeksiyon için istihdam delik farklı çaplarda gösterilen bir kuvars iğne ucu mikroskobik görüntü. Düşük büyütme resim(a)ve (B) daha yüksek büyütme ve (C). İğne farklı hazır görgü (farklı uzunlukta, delik numaraları ve delik boyutları) anatomisi beyin bölgesi, Yayilim amaç ve (B) gösterildiği gibi çözüm, viskozite ve (C). Delik ve düşük güç lazer mikrodiseksiyon kullanılarak elde ipucu düzgün kesme dikkat edin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: microinjections için tuzak kurdu. Kuvars pipet (solda) ve stereotaktik micropositioner için (sağ) paslanmaz çelik iğne güvenliğini sağlamak için kullanılan kit gösteren resim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: kuvars iğne kullanarak daha az hasar gösterilen koronal bölümler. Koronal sıçan beyin hasar üretmek bir kuvars iğne şekil 1 c (sol taraf) ve 26 G künt bitiş paslanmaz çelik iğne (teçhizat gösterildiği gibi kullanarak 2 µL aCSF iğne ile arasında bir karşılaştırma gösterilen striatum düzeyde bölümlerini (8 µm kalınlık) HT yan). Biraz hasar uygun olmayan şekilde derin sondaj kafatası nedeniyle kuvars iğneyi tarafında kortekste üretildi. Bu görüntüleri iki farklı hayvanlardan alınan, temsilcisi denemeye dahil tüm 5 hayvanların çoğu (ölçek çubuğu 500 µm =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: yaymak ve doku hasarı. (A)dağıtım, striatum (solda), 30 G eğimli kenar paslanmaz çelik iğne ile karşılaştırıldığında (sağda) kuvars iğneyle enjekte Trypan mavi. (B) Koronal bölümünde sıçan beyin striatum, düzeyde lekeli bir kuvars iğne ve 30 G eğimli kenar paslanmaz çelik iğne arasında bir karşılaştırma gösterilen o ile (ölçek çubuğu 500 µm =). (Sol ve sağ), daha yüksek bir büyütme hasar kutularındaki (ölçek çubuğu 200 µm, 10 X =). Bu görüntüler denemeye dahil 5 hayvanların temsilcisi vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: zarar indüklenen bir kuvars iğne ve 26 G eğimli kenar paslanmaz çelik iğne dorsal Hipokampus düzeyde. Temsilcisi denemeye dahil 5 hayvanların burada gösterilir iki olgu (ölçek çubuğu 400 µm =). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede açıklanan tekniği için çeşitli amaçlar12gerçekleştirilen microinjections optimize etmek için giriş bölümünde özetlenen ihtiyaçlarını yerine getirir. Burada açıklanan iğneler zarar en az, aslında algılanabilir seviyeye azaltmak; varyans (viraj eğilimli olduğunu) cam iğneler ile kuvars iğneler sert ve derin koordinatlarındaki bile istenen beyin bölgesi güvenilir bir doz emin olun. Ayrıca, ucu delik beyin dokusu içinde ekleme sırasında tıkandı bile yan delik çözüm olarak dağıtılmasını sağlar.
Sınırlamalar ve alternatifleri. Nedeniyle yüksek erime noktası, kuvars kılcal bir geleneksel çektirmenin, Yaniçekti, onlar pahalı ekipmana gerektirir. Cam kılcal damarlar hasar doku, ama daha az enjeksiyonları derin yapılar için güvenilir ve daha kırılgan (Yani, tasarım açısından daha az esnek) kaçınmak açısından aynı derecede iyi. Ancak, Eğer amaç yüzeysel yapılarda enjeksiyon gibi korteks veya dorsal Hipokampus ve iğne kırılma riskini artıracak birden fazla delik için bir gereksinim, cam iğneler kesinlikle geçerli ve ucuz bir alternatif temsil.
Bir kuvars ve cam iğneler onlar birden fazla enjeksiyonu Kanüller kılavuzunu birleştiğinde paslanmaz çelik iğneler gibi farklı zaman noktalarda izin vermez olduğunu kısıtlamasıdır. Bu nedenle, çelik iğneler ile nispeten büyük (26 G) ve/veya künt kenar iğne önlemek için tavsiye bu uygulamalar için en iyi seçenek kalır.
İletişim kuralında kritik adımlar. Genel olarak, yukarıda açıklanan protokol çok basittir ve microinjections içinde deneyimli herhangi bir araştırmacı için kullanmak zor olmamalı. İğneler kullanılabilir yapıldıktan sonra istihdam için anestezi, ameliyat, yavaş ekleme ve kaldırma iğne, bir minipump tarafından düzenlenir infüzyon sürekli ve yavaş oranı normal önlemler iyi ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayacak.
Avantajları ve daha fazla gelişmeler. Yukarıda belirtildiği gibi kuvars iğneler önemli avantajı çift iğne tasarımını kişiselleştirmek imkanı ile en az mekanik zarar etmektir. Birden fazla delik ve belirli deneysel ihtiyaçlarına adapte edilebilir farklı çaplarda iğne hazırladık. Örneğin, farklı çaplarda viral Vektörler ve uyuşturucu veya toksinler ile karşılaştırıldığında hücreleri enjekte için gerekli olabilir; birden fazla delik enjeksiyon çözüm daha büyük bir alan içinde büyük miktarda sağlamak yararlı olabilir ve zor geometri beyin bölgeleri için özellikle yararlı olabilir. Bu teknik çok yönlülük gen terapisi veya hücreler için viral vektörler dokusunda yayılmış en iyi duruma getirmek için yararlanabilir. Nitekim, bu iğneler viral vektörler veya hücreleri enjekte etmek için kullanın.
Diğer avantajı iğneler yeniden kullanma imkanı içerir. Bunu yapmak için iğne etanol ve çözüm ve olası doku artıklarını çıkarın çamaşır suyu ile temizlenebilir. Bir tek iğne tekrarlanan kullanımı yordamı nispeten yüksek maliyetli üretim rağmen düşük maliyetli yapabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser Avrupa Topluluğu [FP7-insanlar-2011-IAPP proje 285827 (EPIXCHANGE)] bir hibe tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
References
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
