Summary
Wir beschreiben hier ein Protokoll für die Mikroinjektion im Nagetier Gehirn, das Quarz-Nadeln verwendet. Diese Nadeln nicht nachweisbar Gewebeschäden zu produzieren und zuverlässige Lieferung auch in tiefen Regionen zu gewährleisten. Darüber hinaus können sie Forschungsbedarf durch personifizierte Entwürfe angepasst und können wiederverwendet werden.
Abstract
Mikroinjektionen werden für eine lange Zeit für die Lieferung der Medikamente oder Giftstoffe in bestimmten Hirnarealen, und in jüngerer Zeit, sie wurden verwendet, um gen oder Zelle Therapie-Produkte zu liefern. Leider, aktuelle Mikroinjektion Techniken verwenden, Stahl oder Glas Nadeln, die aus mehreren Gründen suboptimal sind: insbesondere Stahl Nadeln können dazu führen, dass Gewebeschäden und Glas Nadeln können verbiegen, wenn tief ins Gehirn, senkte die Zielregion fehlt. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll zur Vorbereitung und Quarz-Nadeln, die eine Reihe von nützlichen Funktionen kombinieren verwenden. Diese Nadeln produzieren keine nachweisbaren Gewebeschädigung und als sehr steif, zuverlässige Lieferung in die gewünschte Hirnregion zu gewährleisten, auch wenn Sie Tiefe Koordinaten verwenden. Darüber hinaus ist es möglich, das Design der Nadel zu personalisieren, indem man mehrere Löcher von den gewünschten Durchmesser. Mehrere Bohrungen erleichtern die Injektion von großen Mengen der Lösung innerhalb eines größeren Bereichs, während große Löcher die Injektion von Zellen erleichtern. Darüber hinaus können diese Quarz-Nadeln gereinigt und wiederverwendet, so dass das Verfahren kostengünstiger wird.
Introduction
Mikroinjektionen wurden für eine lange Zeit für die Lieferung von pharmakologisch wirksamen Verbindungen zur neuronalen Aktivität in bestimmten Hirnarealen zu modulieren. Darüber hinaus wurden sie zur Giftstoffe in der Nähe von bestimmten neuronalen Populationen, um Neurodegenerative Veranstaltungen charakteristisch für bestimmte Krankheiten, z. B. 6-hydroxy-Dopamin im Nigrostriatal Dopaminsystem der Parkinson-Krankheit zu imitieren zu imitieren injizieren 1 , 2 oder Immunotoxin 192 IgG Saporin, Läsion der cholinergen System3. Vor kurzem wurden Mikroinjektion Verfahren zur viralen Vektoren oder Zellen Transplantate für experimentelle Gehirn Störungen4,5gen oder Zelle Therapie liefern.
Die klassische Art der Nadeln, die in diesen Studien beschäftigt ist aus Edelstahl gefertigt. Obwohl einfach und praktisch in der Handhabung, Stahl Nadeln haben eine Reihe von Problemen6: sie sind relativ groß und kann dazu führen, dass Gewebeschäden, mit Austritt von Blut - Hirn-Schranke und Aktivierung der Astrozyten; Darüber hinaus können sie produzieren, Entkernung des Hirngewebes, die in die Nadel ein Hindernis oder sogar ganz vermeiden Strömung der gewünschten Lösung kommt. In jüngerer Zeit, verwenden Glas Nadeln bereit ad hoc aus Kapillaren wurden eingeführt in7,8. Diese verursachen keine signifikante Gewebe Schaden oder Astrozyten Aktivierung, aber sind relativ flexibel und können verbiegen als Tiefenstrukturen, reduziert die Genauigkeit der Lokalisierung (persönliche Beobachtungen) eingeführt.
Daher besteht die Notwendigkeit, so viel wie möglich Schaden zu reduzieren (vor allem bei Experimente, um Schaden zu heilen) und Erhöhung der Genauigkeit und Reproduzierbarkeit (d.h., sicherzustellen, dass alle Lösung geliefert wird und korrekte Lokalisierung zu gewährleisten). Darüber hinaus wäre es wünschenswert, verschiedenen Nadel Designs zu verwenden, zur Gewährleistung einer optimalen Verteilung der injizierten Lösung in Hirnarealen mit unterschiedlichen Geometrien. In diesem Artikel beschreiben wir ein Protokoll um vorzubereiten und Quarz Nadeln für Mikroinjektionen im Nagetier Gehirn. Aufgrund der hohen Schmelzpunkt Quarz Kapillaren können nicht auf einem herkömmlichen Abzieher gezogen werden und daher nicht verwendet wurden in der Vergangenheit, um Nadeln zu generieren. Quarz, bietet jedoch einige wichtige Vorteile gegenüber Glas, insbesondere eine hohe Steifigkeit und Pause Widerstand9. Infolge ihrer Unbeugsamkeit sind Quarz Nadeln geeignet für Injektionen in ventralen Hirnregionen. Durch ihre hohe Beständigkeit gegen Bruch können sie modelliert werden, um mehrere Löcher, Erlangung Designs, die am effektivsten erweisen, selbst wenn Gehirnregionen mit komplexen Geometrien10gezielt erweitert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentelle Protokolle wurden von der Ethikkommission der Universität von Ferrara für Tier-Experimente und das italienische Gesundheitsministerium genehmigt. Die Ankunft (Animal Research: Berichterstattung In Vivo Experimente11) Richtlinien befolgt wurden.
1. Vorbereitung des Quarz-Nadeln
- Reinigen Sie und sterilisieren Sie die Quarz-Kapillaren (siehe Tabelle der Materialien), indem man sie für 5 min in destilliertem Wasser, 5 min in Ethanol 99 % und 5 min in Diethylether.
- Lassen Sie die Kapillaren unter der Haube für mindestens 1 h bis sie vollständig trocknen lassen.
- Bereiten Sie die Nadeln mit einem Laser Abzieher nach Parametern, die die Produktion von einer ausreichend langen, ausreichend dünnen Nadel, je nach den individuellen Bedürfnissen zu ermöglichen.
Hinweis: Wir verwenden einen Laser-Puller (siehe Tabelle der Materialien). Verwenden Sie ein zwei Zeilen Programm zum ziehen. Die erste Zeile verwendet high-Power, der größte Scan Länge (Filamente Wert entspricht) und keine Zugkraft. Diese Kombination von Parametern führt zum Schmelzen des größten Teils der Kapillare mit die niedrigsten Ausschubgeschwindigkeit, so dass für die Gestaltung einer langen Nadel mit großen inneren/äußeren Größe und Schaft reduziert. Auf diese Weise bewahrt die Nadel eine hohe mechanische Festigkeit und breit Innendurchmesser, die im Laufe der Stammzellen oder Viruspartikel ohne zu verstopfen kann. Geschwindigkeit und Verzögerung von dieser Programmzeile sollte die Kapillarleitung stoppen, bevor die Spitze zu klein und lang, fehlen die erforderlichen mechanischen und Formcharakteristik wird. Die zweite Zeile des Programms ziehen wird automatisch ausgeführt, sobald die Quarz abkühlt (5 s). Parameter der macht, Filament und Zugkraft sind funktionell, schneiden Sie einen Tipp mit der kürzesten möglichen Spitzenlänge und steilen Schaft, die Trennung der beiden Nadeln mit einem Tipp-Bruch zu vermeiden. Routinemäßig, mit unserem Equipment verwenden wir Folgendes: (a) Linie 1 = Power 990, Filament 5, Geschwindigkeit 130, Verzögerung 110, ziehen 0; (b) Linie 2 = Power 970, Filament 3, Geschwindigkeit 0 Verzögerung 70, 0 zu ziehen. - Setzen Sie die Nadeln in einer Petrischale mit Ethanol 70 % zuvor gereinigt.
- Bedecken Sie die Schüssel mit einem Kunststoff Paraffin-Film.
- Geschnitten Sie die Kapillaren an der Mikro-Sezierer.
- Lassen Sie bei der Inbetriebnahme der Laser führen einen Selbstkalibrierung Prozess um zu überprüfen, Kraft und Energie geliefert. Legen Sie die Bearbeitungsparameter.
Hinweis: Wir verwenden eine Mikro-Sezierer (siehe Tabelle der Materialien) und die folgenden Parameter: laser macht Pulsenergie (63 µJ), Laser Strahldurchmesser von 20 % der maximalen Öffnung (maximale Blende: 1,0 µm), und Schnittgeschwindigkeit von 10 % der maximalen Geschwindigkeit (maximal Geschwindigkeit: 30 µm/s). - Fest fixieren Sie die Nadel auf den Mikroskoptisch und positionieren Sie seine Spitze in der Mitte des Bildschirms.
- Klicken Sie in der Menüleiste auf das Bleistift-Symbol und verwenden Sie, um ein Zeichen für das Laserschneiden der Nadel ziehen.
Hinweis: Der Schnitt sollte in einem Winkel von ca. 45° in Bezug auf die Nadel Oberfläche sein. - Wählen Sie auf der Seite Bar-Funktion die Flagge enthält die "START CUT"-Schaltfläche, um den Laser auf die vorher markierte Stelle schneiden lassen.
- Bei Bedarf schneiden Sie Seite Fehlerzustand durch Wiederholung in 1.5.2-3 beschriebenen Verfahren; Es gibt keine Notwendigkeit, die Nadel (Abbildung 1) neu zu positionieren.
- Lassen Sie bei der Inbetriebnahme der Laser führen einen Selbstkalibrierung Prozess um zu überprüfen, Kraft und Energie geliefert. Legen Sie die Bearbeitungsparameter.
- Nach dem Schneiden Sie, Reinigung.
- Verbinden Sie die Nadel auf eine leere Pumpe durch ein Kunststoffrohr.
- Schalten Sie die Pumpe ein und legen Sie manuell die Vorlauf-Rate mit mäßiger Geschwindigkeit (3 µL/min).
- Aspirieren das 99 % Ethanol zuerst und dann das destillierte Wasser Verunreinigungen durch Schneiden zu entfernen.
- Aspirieren Sie die 99 % Ethanol wieder um die Trocknung zu erleichtern.
Hinweis: Jeder Schritt sollte mindestens 3 min dauern.
- Speichern Sie die Nadeln in einer richtig bedeckten Petrischale bis zum Tag der Operation.
- Nadeln können wieder verwendet werden; am Ende des Experiments reinigen Sie mit Bleichmittel und Ethanol, die Lösung und mögliche Gewebe entfernen. Füllen Sie für eine vollständigere Reinigung, setzen Sie die Nadeln in einer Mikropipette Vorratsgefäß mit der Spitze nach unten das Glas mit destilliertem Wasser, bis die Spitzen bedeckt sind, Kochen Sie für 1,5 min alle übrig gebliebenen Gewebe zu entfernen, dann waschen mit Ethanol.
(2) Verfahren
- Wählen Sie das Menü "Einstellungen", um die Pumpe nach dem Durchmesser/Volumen der Mikroinjektion Spritze zu kalibrieren und Einstellen der Durchflussmenge bei 0,3 µL/min, nach den Anweisungen der Bedienungsanleitung der Pumpe.
- Füllen Sie eine 10-mL-Spritze (ausgestattet mit einer stumpfen Nadel (z.B.Hamilton Nadel, 30 G) und einem kurzen Polytetrafluorethylen-Rohr) mit sterilem Wasser und es verwenden Sie, um die Mikroinjektion Spritze (nach den Kolben vorsichtig entfernen) und die Injektion zu füllen Montage-Teilesatz für die manuelle Mikroinjektion Pumpe (MMP).
Hinweis: Das MMP-Kit wird verwendet, um die Nadel in der stereotaktische Rahmen (Abbildung 2) sicher zu montieren. Das Kit besteht aus: einem Polytetrafluorethylen-Schläuche, Luer-Anschluss-Schläuche-Koppler, Pipette Halter und Dichtungen für Pipetten mit verschiedenen Außendurchmesser. - Verbinden Sie die Nadel mit dem MMP-Kit.
- Spülen Sie mehr Wasser über das System zu, durch die 10-mL-Spritze, und überprüfen Sie, ob das Wasser aus der Nadel kommt.
Hinweis: Stellen Sie sicher Luftblase im Inneren des Systems entfernen indem Sie die Füllung Schritte wiederholen.
- Spülen Sie mehr Wasser über das System zu, durch die 10-mL-Spritze, und überprüfen Sie, ob das Wasser aus der Nadel kommt.
- Trennen Sie die 10-mL-Spritze aus der Mikroinjektion Spritze drücken Sie langsam den Kolben um einen Tropfen Wasser an der Spitze der Mikroinjektion Spritze zu verlassen. Setzen Sie den Kolben in der Mikroinjektion Spritze.
- Die Mikroinjektion Spritze an die Pumpe anschließen und die Durchflussmenge bei 0,3 µL/min eingestellt.
Hinweis: Warten Sie, bis ein Tropfen Austritt aus der Spitze der Nadel und dann für weitere 3 Minuten gehen lassen. - Legen Sie den Fluss bei 0,1 µL/min und starten Sie die Operation. Die Pumpe sollte während der Durchführung der Operation laufenden.
Hinweis: Für die Experimente berichtet in diesem Artikel verwenden wir männliche Sprague-Dawley Ratten 300 g (3 Monate alt). Das Verfahren ist jedoch insbesondere anwendbar auf andere Arten, Mäuse. - Induzieren Sie Vollnarkose mit einer Methode, die von örtlichen Vorschriften genehmigt.
Hinweis: Wir verwenden eine Mischung aus intraperitonealer Injektion (i.p.) von 85 mg/kg Ketamin und 8 mg/kg Xylazin für 20-50 min der Anästhesie. Es ist wichtig, dass Rute und/oder Zehen Prisen verwendet werden, um sicherzustellen, dass das Tier völlig sediert ist. Ebene der Anästhesie und grundlegende Eingeweide sind geprüft, bevor Chirurgie beginnt und alle 10 Minuten während der Durchführung der Operation überwacht. Tierischen Körpertemperatur ist konstant vor, während und nach chirurgischen Eingriffen mit einem Wasser wieder zirkulierenden Heizkissen gehalten. Tiere werden überwacht, bis vollständig erholt (z. B. sie sind aufrecht und ambulante). Darüber hinaus erhalten Tiere Analgetika (Tramadol, 5 – 7 mg/kg i.p) postoperativ alle 24 h für drei Tage.- Der Kopf des Tieres zu rasieren und angemessene Vorbereitung der Operationsstelle für aseptische Chirurgie. Führen Sie eine zwei-Phasen-Peeling mit Jod-Lösung (Betadine) gefolgt von 70 % igem Ethanol. Darüber hinaus um Asepsis zu halten, wickeln die Operationsstelle mit einem chirurgischen Tuch (in dem Video wurde zu Demonstrationszwecken weggelassen worden).
- Positionieren Sie die Ratte in der stereotaktischen Rahmen über ein Wasser wieder zirkulierenden Wärme-Unterbett. Um zusätzliche Schmerzfreiheit am Ort der Operation gelten 0,5 % Lidocain-Lösung (7 mg/kg nicht überschreiten). Sterilisieren Sie vorab alle chirurgischen Instrumente mit einer Wulst Sterilisator oder Flüssigkeit kalt Desinfektion von selbstvergessen die Ausrüstung entweder 2 % Glutaraldehyd plus 7,05 % Phenol (Sporodicin oder Cidex) gefolgt von Spülen mit sterilem Wasser oder Kochsalzlösung. Die Desinfektion muss auch zwischen Verfahren durchgeführt werden. Machen Sie einen längs-Schnitt über den Schädel mit einem sterilen Skalpell. Seien Sie sanft, übermäßige Blutung zu vermeiden. Öffnen Sie die Kopfhaut mit einem flachen Spatel und chirurgische Clips auf die Hautlappen es geöffnet zu halten. Lösen Sie sehr sanft das Periost, aussetzen der Bregma und den Bereich des Schädels durch die Nadel eingeführt wird.
- Montieren Sie den Arm auf der stereotaktischen Rahmen (während die Strömung läuft) und bewegen Sie die Spitze der Nadel genau auf Bregma, die Aufmerksamkeit nicht auf die Spitze zu brechen. Kommentieren Sie die Antero-posterioren und Medio-lateralen Koordinaten der Bregma und übersetzen Sie, um die gewünschten Koordinaten. Geleitet von einem Stereomikroskop, senken Sie die Nadel, bis seine Spitze berührt fast den Schädel, markieren Sie die Bohrungen nach Anhebung des stereotaktischen Arms ein wenig vor Ort.
- Bohren (Spitze Ø Bohren: 0,8 mm; Drehzahl: 1.000 u/min) den Schädel auf der markierten Stelle. Vorsicht ist geboten, nicht zu die Dura bei den Bohrungen zu durchdringen. Während des Bohrens Tropfen Sie sterilen Kochsalzlösung zur Vermeidung von Knochenschädigung und Nekrose.
- Schneiden Sie ein kleines Stück Kunststoff Paraffin Film und legen Sie es auf den Schädel. Mit 10 µL pipettieren, machen Sie einen Tropfen der Lösung auf dem Kunststoff Paraffin-Film zu injizieren. Stoppen Sie die Pumpe leicht Abrufen der Drücker der Pumpe und erstellen eine kleine Luftblase in der Kapillare durch leichtes Ziehen des Kolbens der Spritze Mikroinjektion.
- Senken Sie die stereotaktischen Arm, bis die Spitze der Nadel die Tropfen erreicht. Zeichnen Sie die Probe durch ziehen (sehr langsam) den Kolben der Spritze Mikroinjektion, Blasenbildung zu vermeiden. Ersetzen Sie die Pumpe Drücker in Kontakt mit dem Kolben und schalten Sie die Pumpe mit einer Durchflussrate von 0,3 µL/min Wartezeit bis zur Bildung eines Tropfens (wenige Minuten) bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
Hinweis: Im vorliegenden Beispiel Experiment wurde künstliche Liquor cerebrospinalis (ACFS) im Striatum infundiert (AP: 1,5 ML: ±2.7; DV: -5,0) und im dorsalen Hippocampus (AP: -3,5, ML: ±2.1; DV:-3.5; in mm von Dura) 2 µL/Website. Um den Vergleich zwischen den beiden Methoden zu erleichtern, wurde jeder Bereich des Gehirns infundiert mit einer Quarz-Nadel in einer Hemisphäre und eine stumpfe Spitze 26 G oder 30 G Abschrägung-Tip Edelstahl Nadel in die andere. - Senken Sie der Fluss auf 0,1 µL/min, nick die Dura mit einer Edelstahl-Fase-Tip-Nadel und senken Sie langsam die stereotaktischen Arm auf die dorsal-Ventral-Axt, Eintritt in das Hirngewebe. Wenn die gewünschte Position erreicht ist, gehen Sie unten zusätzliche 0,1 mm, die Pumpe zu stoppen, die stereotaktischen Arm von 0,1 mm zu erhöhen und starten Sie erneut die Pumpe an den Fluss auf 0,3 µL/min.
Hinweis: Der Grund, eine langsame Strömung pflegen und senken die Nadel soll einen positiven Druck sichergestellt, der Eindringen von kleinen Fragmente von Gewebe in die Nadel selbst vermeidet. Ein solches würde den Tipp, beeinträchtigen die Lieferung der Lösung behindern. Da die Durchflussmenge sehr langsam ist, während die Nadel und die Geschwindigkeit der Senkung zu senken ca. 10 s/mm ist, bedeutet dies, dass die Mengen der Lösung, die entlang der Strecke Nadel bleiben vernachlässigbar im Vergleich zu denen an den Zielstandort injiziert. Diese Vorsichtsmaßnahme kann vermieden werden, wenn Nadeln mit seitlichen Bohrungen zu verwenden. - Starten Sie die Stoppuhr und warten Sie, die benötigte Zeit je nach der gewünschten Lautstärke zu injizieren (z. B. 6 min 40 s wenn 2 µL injizieren). Überwachen Sie die Blase Bewegung während der Injektion. Am Ende stoppen Sie die Pumpe zu und warten Sie 5 min, bevor die Nadel langsam abrufen. Wenn die Quarz-Nadel vollständig extrahiert wird, starten Sie die Pumpe wieder und überprüfen Sie für die Bildung eines Tropfens an der Spitze der Nadel.
- Verschließen der Öffnung in der Oberfläche der Schädel mit Knochen Wachs, hämostatischen Clips entfernen und Naht der Kopfhaut, das Gebiet rund um die Wunde mit einer antibiotischen Creme (z.B. Neosporin) zu beschichten und das Tier zu Hause Käfig zurückkehren.
Hinweis: Im Anschluss an die Euthanasie-Protokoll genehmigt durch die institutionellen Ethik-Ausschuß für die Experimente, die in diesem Artikel beschriebenen Tiere waren tief mit einer Injektion i.p. 43 mg/kg Ketamin und 7 mg/kg Xylazin betäubt und enthauptet. Gehirne wurden entfernt, postfixed in Formalin für 48 h und Paraffin eingebettet. Koronalen Abschnitte des Gehirns (8 µm) wurden mit einem Mikrotom geschnitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Wir verglichen Schäden induziert durch direkte Mikroinjektion in der Ratte dorsalen Hippocampus und Striatum mit einer Quarz-Nadel (60 µM Außendurchmesser Tipp; 20 µM Durchmesser Bohrung Typ C, Abbildung 1) verglichen mit zwei Klassiker, stumpfen Ende 26 G und 30 G schräge Kante Edelstahl-Nadeln. Zu diesem Zweck wir injiziert 2 µL der ACFS rechts und links dorsalen Hippocampus und Striatum mit bzw. Quarz und Stahlnadel und 48 h nach der Injektion, wir Gewebeschäden mit Hämatoxylin-Eosin (HE) Färbung ausgewertet. Wir entschieden uns für einen frühen Zeitpunkt nach der Injektion besser schätzen die akute mechanische Beschädigungen durch die verschiedenen Nadeln produziert (in der Zeit, Gewebe-Reparatur-Mechanismen konnte den ursprünglichen Schaden verdecken)7.
Nach dem oben beschriebenen Protokoll produzieren die Quarz-Nadel nicht nachweisbaren Schäden und eine Spur kaum nachweisbaren Nadel während Hirnregionen durch die 26 G Stahl stumpfen Ende Nadel injiziert eine deutliche Schäden (Abbildung 3) ausgestellt. 30 G schräge Winkel (30°) aus rostfreiem Stahl Nadel induziert eine begrenztere jedoch eindeutig nachweisbar Gehirn Läsion im Striatum (Abbildung 4 b) und im dorsalen Hippocampus (Abbildung 5). Um zu beweisen, dass die Injektion von ACFS ebenso erfolgreich mit den beiden Nadeln, in einem separaten Satz von Experimenten war injiziert wir 2 µL Trypan blau (Abb. 4A). Wichtig ist, alle abgerufenen Quarz Nadeln waren unversehrt, d. h., wir nie beobachtet jeden möglichen Schaden wegen der Einfügung Manöver.
Abbildung 1: mikroskopische Bild von einer Quarz-Nadelspitze, mit unterschiedlichen Durchmessern aus Spitze und Löcher für die Injektion von Flüssigkeiten eingesetzt. Niedrige Vergrößerung Bild in (A) und höhere Vergrößerung (B) und (C). Die Nadel kann vorbereitet werden, in verschiedenen Manieren (unterschiedlicher Länge, Loch Zahlen und Lochmaße) entsprechend der Anatomie der Region des Gehirns, das sich ausbreitenden Ziel und die Viskosität der Lösung, wie in (B) und (C). Beachten Sie die glatten Schnitt der Löcher und Spitze mit low-Power-Laser-Mikrodissektion erzielt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: richten Sie für Mikroinjektionen. Bild zeigt das Kit verwendet, um die Quarz-Pipette (links) und die Edelstahl-Nadel (rechts), die stereotaktische Micropositioner sichern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: koronalen Abschnitte zeigen weniger Schaden mit Quarz Nadel. Koronalen Abschnitte (8 µm Dicke) der Ratte Köpfe auf der Ebene des Striatums zeigt einen Vergleich zwischen den Schaden erzeugen durch Injektion von 2 µL ACFS mit einer Quarz-Nadel wie die in Abbildung 1 (linke Seite) und einen stumpfen Ende Edelstahl Nadel 26 G (rig HT-Seite). Einige Schäden entstand in der Rinde auf der Seite der Quarz-Nadel aufgrund unsachgemäß tief bohren den Schädel. Diese Bilder, aufgenommen von zwei verschiedene Tiere stehen stellvertretend für alle 5 Tiere in das Experiment einbezogen (Maßstabsleiste = 500 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Verbreitung und Gewebeschäden. (A) Verteilung der Trypan blau im Striatum mit einer Quarz-Nadel (links), im Vergleich zu einer (rechts) 30 G schräge Kante Edelstahl Nadel injiziert. (B) koronalen Abschnitt Rattengehirn auf der Ebene des Striatums, gebeizt mit er zeigt einen Vergleich zwischen einer Quarz-Nadel und einer 30 G schräge Kante aus rostfreiem Stahl Nadel (Maßstabsleiste = 500 µm). In den Feldern (links und rechts), eine höhere Vergrößerung des Schadens (Maßstabsleiste = 200 µm, 10 X). Diese Bilder sind repräsentativ für 5 Tiere in das Experiment einbezogen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5: Schäden infolge einer Quarz-Nadel und eine 26 G schräge Kante Edelstahl Nadel auf der Ebene der dorsalen Hippocampus. Die beiden Fälle gezeigt, hier stehen stellvertretend für 5 Tiere in das Experiment einbezogen (Maßstabsleiste = 400 µm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In diesem Artikel beschriebene Verfahren erfüllt die Bedürfnisse dargelegt in der Einleitung zur Optimierung Mikroinjektionen, die für verschiedene Zwecke12ausgeführt werden. Die hier beschriebenen Nadeln reduzieren Schäden auf ein minimum, im Wesentlichen nicht detektierbare Niveau; an der Abweichung mit Glas-Nadeln (, die anfällig für biegen), Quarz-Nadeln sind starr und gewährleisten einen zuverlässige Hit von der gewünschten Hirnregion sogar in tiefen Koordinaten. Zudem sorgt die seitliche Öffnung Bereitstellung der Lösung, auch wenn die Tipp-Loch beim Einführen in das Hirngewebe verdeckt wird.
Grenzen und alternativen. Aufgrund hoher Schmelzpunkt Quarz Kapillaren können nicht gezogen werden, auf einem konventionellen Abzieher, d. h., sie benötigen Zugriff auf kostspielige Ausrüstung. Glaskapillaren sind gleich gut in Bezug auf die Vermeidung von Schäden an Gewebe, aber weniger zuverlässig für Injektionen in Tiefenstrukturen und zerbrechlicher (d.h.weniger flexibel in Bezug auf Design). Jedoch wenn das Ziel Injektion in oberflächliche Strukturen wie den Kortex oder dorsalen Hippocampus und besteht kein Erfordernis für mehrere Löcher, die das Risiko einer Nadel brechen erhöhen würden, dar Glas Nadeln sicherlich eine gültige und billige Alternative.
Eine Einschränkung von Quarz und Glas Nadeln ist, dass sie nicht mehrere Injektionen zu unterschiedlichen Zeitpunkten wie Edelstahl-Nadeln, Kanülen führen gekoppelt gestatten. Stahl Nadeln bleiben daher die beste Option für diese Anwendungen mit dem Rat um relativ groß (26 G) und/oder Schlagkante Nadeln zu vermeiden.
Die kritische Schritte in das Protokoll. Alles in allem das oben beschriebene Protokoll ist sehr einfach und sollte nicht schwer sein, verwenden Sie für jeden Forscher in Mikroinjektionen erlebt. Sobald die Nadeln zur Verfügung gestellt werden, sorgt die regelmäßige Vorkehrungen für Anästhesie, Chirurgie, langsam einführen und Entfernen der Nadel, konstant und langsam Rate Infusion reguliert durch eine Minipump eingesetzt für gute und reproduzierbare Ergebnisse.
Vor- und Weiterentwicklungen. Wie bereits erwähnt, ist der entscheidende Vorteil der Quarz Nadeln paar minimale mechanische Beschädigung mit der Möglichkeit, das Design der Nadel zu personalisieren. Wir vorbereitet Nadeln mehrere Löcher mit verschiedenen Durchmessern, die auf die spezifischen experimentellen Bedürfnisse angepasst werden können. Unterschiedliche Durchmessern erforderlich z. B. virale Vektoren und Zellen im Vergleich zu Drogen oder Toxine injizieren; mehrere Löcher können sinnvoll sein, die Injektion größerer Mengen der Lösung innerhalb eines größeren Bereichs zu gewährleisten und werden besonders für schwierige Geometrie Hirnareale. Die große Vielseitigkeit dieser Technik kann auch genutzt werden, um die Ausbreitung im Gewebe des viralen Vektoren für die Gentherapie oder Zellen zu optimieren. In der Tat, verwenden wir diese Nadeln, um virale Vektoren oder Zellen zu injizieren.
Weitere Vorteile sind die Möglichkeit, die Nadeln wieder zu verwenden. Dazu können die Nadeln mit Ethanol und Bleichmittel, die Lösung und mögliche Gewebe entfernen gereinigt werden. Der wiederholte Einsatz von einer einzigen Nadel kann das Verfahren trotz der relativ hohen Kosten der Produktion kostengünstig machen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus der Europäischen Gemeinschaft [RP7-Menschen-2011-IAPP Projekt 285827 (EPIXCHANGE)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Quartz capillaries | Sutter Instruments, Novato, CA USA | Q100-50-10 | Without filament |
| Puller | Sutter | P2000 | |
| Micropipette storage jar | World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA | E210 | |
| Laser microdissector | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | LMD6500 | |
| Hamilton syringe | Hamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸtzerbach, Germany | 19138-U | |
| Microinfusion pump | Univentor, Zejtun, Malta | Model 864 | |
| Manual microinjection pump kit | WPI | Item#: MMP-KIT | Kit allowing for micropipettes to be securely mounted to the stereotactic frame |
| Precision Drill | Proxxon | 28510 MicroMot 50/E | Ball bearing drive shaft with variable speed |
| Artficial Cerebral Spinal Fluid | Tocris | 3525 | |
| Needles 26 G Blunt and 30 G Bevel | Hamilton | 26 G Blunt: 19138-U 30 G Bevel: 20757 |
|
| Microtome | Leica, Germany | LEICA RM212RT |
References
- Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
- Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
- Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
- Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
- Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
- Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
- Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
- Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
- Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
- Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
- Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
- Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).
