Summary
यह लेख व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों (PCPs) कि बांध एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स अल्फा (ERα) और/या बीटा (ERβ) में लाइगैंडों को बढ़ाता है के लिए एक अनुकूलित खमीर एस्ट्रोजन स्क्रीन प्रस्तुत करता है । विधि दो वर्णमिति सब्सट्रेट विकल्प शामिल हैं, स्नातक पाठ्यक्रमों में उपयोग के लिए एक छह दिन प्रशीतित मशीन, और डेटा विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय उपकरण ।
Abstract
खमीर एस्ट्रोजन स्क्रीन (हां) पर्यावरण के नमूनों में एस्ट्रोजन लाइगैंडों का पता लगाने के लिए प्रयोग किया जाता है और मोटे तौर पर अंत में स्रावी व्यवधान के अध्ययन में लागू किया गया है । एस्ट्रोजन लाइगैंडों दोनों प्राकृतिक और मानव निर्मित "पर्यावरणीय एस्ट्रोजन" (ईज) पर्सनल केयर उत्पाद (PCPs), प्लास्टिक, कीटनाशकों, और खाद्य पदार्थों सहित कई उपभोक्ता वस्तुओं में पाया शामिल हैं । मानव और अन्य जानवरों में ईज बाधित हार्मोन संकेत, संभावित प्रजनन क्षमता को कम करने और रोग जोखिम में वृद्धि. सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए ईज और अन्य अंत में खलल डालने वाले रसायनों (EDCs) के महत्व के बावजूद, अंत में स्रावी व्यवधान आमतौर पर स्नातक पाठ्यक्रम में शामिल नहीं है । यह कमिया आंशिक रूप से प्रासंगिक प्रयोगशाला गतिविधियों की कमी के कारण है जो शामिल सिद्धांतों का वर्णन करते हुए भी स्नातक छात्रों के लिए सुलभ है । यह लेख एक अनुकूलित हां व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों कि बाइंड एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स अल्फा (ERα) और/या बीटा (ERβ) में लाइगैंडों को बढ़ाता है के लिए प्रस्तुत करता है । विधि दो वर्णमिति सब्सट्रेट (ऑर्थो-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside (ONPG) या chlorophenol लाल-β-d-galactopyranoside (CPRG)) है कि β-galactosidase, एक 6 दिन प्रशीतित गर्मी कदम से सट रहे हैं में से एक को शामिल स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में उपयोग की सुविधा, LacZ गणना के लिए एक स्वचालित अनुप्रयोग, और संबद्ध 4-पैरामीटर उपस्कर प्रतिगमन विश्लेषण के लिए R कोड. प्रोटोकॉल के लिए स्नातक छात्रों को विकसित करने और प्रयोग जिसमें वे एस्ट्रोजन के लिए अपने को चुनने के उत्पादों के स्क्रीन नकल की अनुमति के लिए डिजाइन किया गया है । इस प्रक्रिया में, वे अंत में स्रावी व्यवधान, कोशिका संस्कृति, रिसेप्टर बाइंडिंग, एंजाइम गतिविधि, आनुवंशिक इंजीनियरिंग, सांख्यिकी, और प्रयोगात्मक डिजाइन के बारे में सीखते हैं । इसके साथ ही, वे मौलिक और मोटे तौर पर लागू प्रयोगशाला कौशल का अभ्यास करते हैं, जैसे: सांद्रता की गणना; समाधान बनाना; बाँझ तकनीक का प्रदर्शन; प्रश्नपत्र कमजोर मानक; निर्माण और interpolating मानक घटता; चर और नियंत्रण की पहचान; डेटा एकत्रित करना, व्यवस्थित करना और उसका विश्लेषण करना; निर्माण और रेखांकन की व्याख्या; और micropipettors और spectrophotometers के रूप में आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग । इस प्रकार, इस परख को लागू करने के छात्रों को जांच में संलग्न करने के लिए प्रोत्साहित करते हुए पर्यावरण विज्ञान और स्वास्थ्य में उभरते मुद्दों की खोज आधारित है ।
Introduction
खमीर एस्ट्रोजन स्क्रीन (हां) व्यापक रूप से लाइगैंडों है कि एस्ट्राडियोल (E2 या 17β-एस्ट्राडियोल) मैट्रिक्स की एक किस्म में पानी, संयंत्र के ऊतकों, उपभोक्ता उत्पादों, और खाद्य पदार्थ1,2,3शामिल है, की नकल करने के लिए प्रयोग किया जाता है, 4. सामूहिक रूप से, ऐसे लाइगैंडों "पर्यावरणीय एस्ट्रोजन (ईज)" हैं । हां मूल रूप से एक कम लागत के रूप में विकसित किया गया था, इन विट्रो वैकल्पिक vivo परीक्षणों में कुतर uterotrophic परख5,6 और इंद्रधनुष ट्राउट खिला परख7की तरह । इन परीक्षणों का उद्देश्य यदि एक उत्पाद रसायनों कि उत्तेजित या एस्ट्रोजन पर निर्भर तंत्र ब्लॉक शामिल है निर्धारित करने के लिए है । ईज का पता लगाना महत्वपूर्ण है, क्योंकि वे सामांय अंतर्जात एस्ट्रोजन संकेतन, विशेष रूप से भ्रूण के विकास के दौरान हस्तक्षेप कर सकते हैं । यह हस्तक्षेप मोटापा, बांझपन, कैंसर के जोखिम को बढ़ाने के द्वारा स्वास्थ्य समझौता, और संज्ञानात्मक हानि8।
सार्वजनिक स्वास्थ्य के लिए ईज और अन्य EDCs के महत्व के बावजूद, अंत में स्रावी व्यवधान आमतौर पर स्नातक पाठ्यक्रम में शामिल नहीं है । यह कमी आंशिक रूप से गतिविधियों की कमी के कारण है कि शामिल सिद्धांतों का वर्णन करते हुए भी स्नातक छात्रों के लिए सुलभ जा रहा है । इसके अतिरिक्त, हां प्रोटोकॉल के कई रूपांतरों मौजूद9,10,11,12,13, और इस विविधता परख अनुकूलन समय के लिए लेने वाली बनाता है प्रयोगशाला समन्वयकों विशेष रूप से प्रासंगिक तकनीकों में प्रशिक्षित नहीं. अंत में, हां, परख आमतौर पर पूरा कर रहे है 1 लंबे दिन या 2 लगातार दिन एक O/ इस समय स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रम है, जो आम तौर पर एक बार मिलने के प्रारूप के साथ संगत नहीं है/
इन जरूरतों के जवाब में, इस पांडुलिपि एक अनुकूलित ९६-अच्छी तरह से हां प्रोटोकॉल है कि व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों (PCPs) के लिए इथेनॉल निष्कर्षण तरीके शामिल है3 और एक 6 दिन प्रशीतन कदम साप्ताहिक प्रयोगशाला बैठकों को समायोजित करने के लिए रिपोर्ट । निरपेक्ष इथेनॉल एक बहुमुखी कार्बनिक विलायक कि ध्रुवीय और ध्रुवीय solutes की एक किस्म को भंग कर सकते है । इसके अलावा, यह स्नातक पाठ्यक्रमों के लिए उपयुक्त है, क्योंकि यह आसानी से उपलब्ध है, अपेक्षाकृत विषाक्त, सस्ती, और पानी के साथ मिश्रणीय; यह भी विशेष उपकरणों के बिना आसानी से वाष्पीकरण । हालांकि, इथेनॉल दृढ़ता से hydrophobic अंत-स्रावी अवरोधकों या कई तेलों और waxes, बाद दो PCPs में आम सामग्री जा रहा है निकालने के लिए आदर्श नहीं है । गरीब निष्कर्षण दक्षता झूठी नकारात्मक निष्कर्षों का खतरा बढ़ जाता है । मन में इस बाधा के साथ, जांचकर्ताओं निष्कर्षण प्रक्रियाओं का चयन करना चाहिए (उदा., इथेनॉल निष्कर्षण या ठोस चरण निष्कर्षण) कि पता नमूना विशेषताओं और अध्ययन के उद्देश्यों को पूरा (अनुसंधान बनाम स्नातक अनुदेश) ।
हां संयोजक पर निर्भर करता है Saccharomyces cerevisiae मूल रूप से Tulane विश्वविद्यालय में डॉ चार्ल्स मिलर के द्वारा बनाई गई । कृपया मिलर एट अल देखें । (२०१०) के लिए इंजीनियर प्लाज्मिड14का पूरा नक्शा । खमीर इन plasmids constitutively एक्सप्रेस मानव परमाणु ERα या ERβ (भी कहा जाता ESR1 और ESR2, क्रमशः) जब गैलेक्टोज (ERα के लिए) या तो ग्लूकोज या गैलेक्टोज (ERβ के लिए) युक्त मीडिया में हो के साथ तब्दील हो । यदि एस्ट्रोजन रसायन मीडिया में मौजूद हैं, वे रिसेप्टर्स को बांध, ligand रिसेप्टर कॉम्प्लेक्स कि सक्रिय β-galactosidase (lacZ) अभिव्यक्ति एक स्तर पर एस्ट्रोजन रसायनों की एकाग्रता के लिए आनुपातिक बनाने. खमीर कोशिकाओं तो जमा β-galactosidase जारी करने के लिए लीजड हैं । lysis बफ़र या तो ONPG या CPRG, जो β-galactosidase द्वारा पीले या लाल उत्पादों, क्रमशः उपज के लिए सट रहे हैं शामिल हैं । वर्णमिति उत्पादों एक microwell प्लेट spectrophotometer का उपयोग कर अवशोषक को मापने के द्वारा मात्रा जा सकता है । रंग बदलने की डिग्री एस्ट्रोजन लाइगैंडों जो खमीर उजागर किया गया था की एकाग्रता के लिए आनुपातिक है ।
सब्सट्रेट का चुनाव (CPRG या ONPG) परीक्षण किया जा रहा नमूनों से उत्पन्न होने वाली पृष्ठभूमि अवशोषण के लिए क्षमता पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, संयंत्र निष्कर्षों अक्सर मीडिया है कि कृत्रिम रूप से estrogenicity उपायों अगर ONPG (४०५ एनएम पर मात्रा) में β-galactosidase के लिए सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है फुलाने के लिए एक पीले रंग जोड़ देगा । संयंत्र निष्कर्षों के साथ, CPRG (५७४ एनएम पर मात्रा) एक अधिक उपयुक्त वर्णमिति सब्सट्रेट हो सकता है । CPRG ONPG से अधिक महंगा है, लेकिन एक दसवें molarity में प्रयोग किया जाता है । यह लेख PCP अर्क मात्रा दोनों ONPG और CPRG का उपयोग कर के estrogenicities प्रस्तुत करता है ।
ERα और ERβ दोनों का उपयोग कर पर्यावरण के नमूनों की estrogenicity बढ़ाता है इन रिसेप्टर्स में से केवल एक का उपयोग करने से एक अधिक व्यापक दृष्टिकोण है. पशुओं में, इन रिसेप्टर्स विभेदक ऊतक वितरण, विनियामक गतिविधियों, और एस्ट्रोजन और विरोधी एस्ट्रोजन लाइगैंडों के लिए बाध्यकारी समानताएं15प्रदर्शन. उदाहरण के लिए, संयंत्र आधारित phytoestrogens आमतौर पर ERβ अधिक दृढ़ता से बांध2, जबकि सिंथेटिक रसायनों या तो ERα या ERβ के लिए वरीयता दिखा सकते है या दोनों रिसेप्टर्स समान रूप से अच्छी तरह से15बांध कर सकते हैं । इसलिए, एक एस्ट्रोजन रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी जरूरी दूसरे के लिए बाध्यकारी भविष्यवाणी नहीं करता है ।
हालांकि ईज कई उपभोक्ता उत्पादों में पाए जाते हैं (जैसे, कीटनाशक, डिटर्जेंट, चिपकने वाला, स्नेहक, प्लास्टिक, खाद्य पदार्थ, और फार्मास्यूटिकल्स) के रूप में के रूप में अच्छी तरह से पौधों, प्रस्तुत डेटा PCPs के एक चयन का उपयोग कर प्राप्त किया गया । PCPs मजबूर कर रहे हैं, आसानी से उपलब्ध है, बजट के अनुकूल है, और पर्यावरण के स्नातक छात्रों के लिए प्रासंगिक । छात्रों को प्रयोगशाला में परीक्षण के लिए अपने मनपसंद PCPs को घर से लाने के लिए आमंत्रित किया जा सकता है । वे भी त्वचा को गहरी पर्यावरण कार्य समूह द्वारा विकसित डेटाबेस खोज कर सकते है16 उच्च और निंन विषाक्तता स्कोर के साथ PCPs की परिकल्पना चालित तुलना उत्पंन करने के लिए । इस तरह, छात्रों को एक साथ उन्नत प्रयोगशाला कौशल विकसित कर सकते हैं; स्वयं निर्देशित, जांच आधारित सीखने में संलग्न; और पर्यावरण विज्ञान और स्वास्थ्य में उभरते मुद्दों का पता लगाने ।
Protocol
1. रिएजेंट बनाना
- ६.७ ग्राम यीस्ट नाइट्रोजन बेस मिलाकर ग्लूकोज और गैलेक्टोज मीडिया तैयार करें, 20 ग्राम डेक्सट्रोज या गैलेक्टोज, 20 मिलीग्राम adenine सल्फेट (एक २०० मिलीग्राम के 10 मिलीलीटर के रूप में जोड़ा/100 मिलीलीटर जलीय स्टॉक समाधान), 20 मिलीग्राम uracil (एक २०० मिलीग्राम के 10 मिलीलीटर के रूप में जोड़ा/100 मिलीलीटर जलीय स्टॉक समाधान) , ६० मिलीग्राम leucine (एक 1 जी के 6 मिलीलीटर के रूप में जोड़ा/100 मिलीलीटर जलीय स्टॉक समाधान), और 20 मिलीग्राम histidine (एक 1 जी के 2 मिलीलीटर के रूप में जोड़ा गया/100 मिलीलीटर जलीय स्टॉक समाधान) 1 एल के एक अंतिम मात्रा निस्पंदन द्वारा (०.२ µm फ़िल्टर) द्वारा निष्फल । मीडिया कई हफ्तों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
- निर्जल इथेनॉल और कमजोर में पाउडर E2 को भंग करके एस्ट्राडियोल (E2) मानकों को तैयार करना (२२७.५ एनएम & #38; ९.७५ एनएम) में ५०% इथेनॉल ।
नोट: अगर एस्ट्राडियोल को 1 मिलीग्राम की शीशी के रूप में खरीदा गया है तो एस्ट्राडियोल पाउडर को भंग करने के लिए शीशी में सीधे 1 मिलीलीटर इथेनॉल डालें । इससे #1 ३.६७ एमएम स्टॉक की पैदावार होती है । ९९० μL इथेनॉल में शेयर #1 के 10 μL को पतला कर ३६.७१ माइक्रोन स्टॉक #2 की 1 मिलीलीटर बनाने के लिए । फिर, ९९० μL ५०% इथेनॉल में शेयर #2 के 10 μL पतला ३६७.१३ एनएम शेयर #3 की 1 मिलीलीटर बनाने के लिए । काम कर रहे शेयर बनाने के लिए, ३८०.३ μL ५०% इथेनॉल में ६१९.७ μL शेयर #3 पतला करने के लिए 1 २२७.५ एनएम काम कर रहे शेयर के लिए खमीर के साथ मानक curves ERα व्यक्त बनाने के लिए इस्तेमाल किया । पतला २६.५६ μL शेयर में #3 ९७३.४४ μL ५०% इथेनॉल के लिए 1 मिलीलीटर बनाने के लिए ९.७५ एनएम काम कर रहे शेयर खमीर के साथ मानक curves ERβ व्यक्त बनाने के लिए इस्तेमाल किया । -20 या-७० डिग्री सेल्सियस पर parafilm और स्टोर के साथ मानकों को सील.
सावधानी: E2 एक संदिग्ध यलो और प्रजनन विषाक्तता है. यह हानिकारक है अगर सांस, निगल लिया, या त्वचा के माध्यम से अवशोषित । E2 स्तनपान बच्चों और भ्रूण को नुकसान हो सकता है । E2 जलीय जीवन के लिए बहुत विषाक्त है । उचित व्यक्तिगत सुरक्षा (दस्ताने, धुएं डाकू, धूल मुखौटा) का प्रयोग करें और गर्भावस्था और स्तनपान के दौरान जोखिम से बचें । निपटान E2 के रूप में खतरनाक अपशिष्ट और पर्यावरण में जारी नहीं है । - ८.५२ g ना2HPO4को मिलाकर LacZ बफर तैयार करें, ५.५२ g णः2PO4• ज2O, ९५.२१ मिलीग्राम MgCl2, ७४५.५ मिलीग्राम KCl, 2 g N-lauroylsarcosine सोडियम नमक, और या तो ONPG (४०० मिलीग्राम) या CPRG (७७.७ मिलीग्राम) एक अंतिम करने के लिए जल में -20 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिलीलीटर aliquots में 1 एल स्टोर LacZ बफर की मात्रा ।
नोट: एक 20 मिलीलीटर aliquot १ ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए पर्याप्त है । - आरटी में 1 एल स्टोर के एक अंतिम मात्रा के लिए जल में १०५.९ ग्राम सोडियम कार्बोनेट को मिलाकर सोडियम कार्बोनेट तैयार करें ।
- 1 मीटर dithiothreitol (डीटीटी) को पानी में तैयार कर लें । -20 डिग्री सेल्सियस पर डीटीटी के 25 µ एल aliquots फ्रीज ।
चेतावनी: डीटीटी एक तीव्र त्वचा और आंख अड़चन है । उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (दस्ताने, धुएं हूड, धूल मुखौटा) का प्रयोग करने के लिए त्वचा और आंख से संपर्क करें, साँस लेना और घूस से बचने के ।
नोट: प्रत्येक aliquot १ ९६-well थाली के लिए पर्याप्त है ।
2. नमूनों और निष्कर्षण नियंत्रण की तैयारी
- परीक्षण के लिए नमूने का चयन करें ।
नोट: यह लेख साबुन, हेयर क्रीम, शैंपू, सनस्क्रीन, लिप, फाउंडेशन, शेविंग क्रीम, नेल पॉलिश, और लोशन सहित पंद्रह PCPs के लिए डेटा प्रस्तुत करता है । - एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में निर्जल इथेनॉल के 10 मिलीलीटर के साथ नमूना के 1 जी का मिश्रण । एक नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रण एक 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में इथेनॉल के 11 मिलीलीटर से मिलकर तैयार करें । आवश्यकतानुसार प्रतिकृति तैयार करें ।
नोट: प्रस्तुत प्रयोगात्मक डिजाइन के लिए, सभी 15 PCPs और तपसिल निष्कर्षण नियंत्रण समाधान के तीन aliquots तैयार थे, ४८ नमूनों की कुल उपज, जिनमें से प्रत्येक तपसिल में विश्लेषण किया गया था खंड 4 में प्रोटोकॉल का उपयोग कर । एक ही प्लेट triplicates में 23 नमूनों को समायोजित कर सकते हैं । निर्जल इथेनॉल इस कदम में प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह आसानी से लुप्त हो जाती है । यह सत्यापित करने के लिए ऋणात्मक निष्कर्षण नियंत्रणों का उपयोग करें कि शंकु ट्यूबों के नमूनों में एस्ट्रोजन नमकीन नहीं हैं । - Homogenize के लिए ट्यूब सामग्री 30 मिनट के लिए मैनुअल मिलाते और भंवर के संयोजन से या एक बहु ट्यूब भंवर पर ट्यूब मिलाते हुए ।
- एक बाल्टी में अधिक से अधिक स्वीकार्य गति पर शंकु ट्यूब केंद्रापसारक 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक । एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से एक ट्यूब से supernatant एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में खिचड़ी भाषा । एक ग्लास जुटाना शीशी में प्रत्येक ५० मिलीलीटर ट्यूब की खाली सामग्री ।
- छोड़ शीशियों एक सप्ताह के लिए एक हवादार डाकू में खुला इथेनॉल पूरी तरह से लुप्त हो जाना करने की अनुमति है । वैकल्पिक रूप से, एक हवादार हुड में नाइट्रोजन के तहत या एक रोटरी वाष्पक के साथ सूखे नमूने । प्रकाश संवेदनशील घटकों के क्षरण से बचने के लिए, प्रकाश से सुखाने नमूनों की रक्षा (उदा, हवादार हुड दरवाजे पर जगह अपारदर्शी कपड़े) ।
- homogenize के लिए ५०% इथेनॉल और भंवर के १.० मिलीलीटर में नमूनों का पुनर्गठन ।
3. संवर्धन और Subculturing खमीर14
- सक्रिय खमीर संस्कृतियों को बनाए रखने ( एस cerevisiae14के संयोजक W303a तनाव) में खमीर गर्मी के द्वारा फ़िल्टर-बंध्याकरण 30 डिग्री सेल्सियस पर ग्लूकोज मीडिया । ताजा फ़िल्टर में उपसंस्कृति खमीर साप्ताहिक-ग्लूकोज मीडिया निष्फल ।
- दो रातों (के बारे में ४२ ज) से पहले हां प्लेटें, उपसंस्कृति खमीर जोड़ने के लिए सक्रिय खमीर संस्कृतियों के ०.१ मिलीलीटर के 10 मिलीलीटर को जोड़कर-निष्फल ग्लूकोज मीडिया बाँझ तकनीक का उपयोग कर । दो रातों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर मशीन । झटकों की आवश्यकता नहीं है अगर खमीर बाँझ २५० मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी में उथले संस्कृतियों के रूप में विकसित कर रहे हैं ।
नोट: खमीर भी कई महीनों के लिए प्रशीतित आगार प्लेटों पर संग्रहीत किया जा सकता है । लंबी अवधि के भंडारण (वर्ष) के लिए, 15-50% बाँझ ग्लिसरॉल, भंवर के साथ हे/N संस्कृतियों गठबंधन, और-७० डिग्री सेल्सियस पर स्थिर । बाँझ ग्लिसरॉल तैयार करने के लिए, एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए एक cryovial में ३०० µ l ग्लिसरॉल हस्तांतरण और टोपी के साथ आटोक्लेव ढीला. फिर जोड़ें १,२०० µ l O/N खमीर संस्कृति बाँझ तकनीक का उपयोग कर ।
4. तैयारी हां प्लेट्स (परख के दिन 1)
- एक बाँझ चोंच में और बाँझ तकनीक का उपयोग कर, ३.२ कदम से खमीर पतला करने के लिए ०.०६५ ± ०.००५ के एक ऑप्टिकल घनत्व पर ६१० एनएम (ओडी६१०) में फ़िल्टर-निष्फल गैलेक्टोज मीडिया ।
- एक स्पष्ट गैलेक्टोज प्लेट (प्लेट बाँझ होने की जरूरत नहीं है) में तपसिल polystyrene कारतूस के साथ साथ तपसिल में प्रत्येक खमीर नमूने के १२० pipetting द्वारा ऑप्टिकल घनत्व की पुष्टि करें । एक प्लेट spectrophotometer का प्रयोग करें सत्यापित करें कि पतला खमीर संस्कृति ०.०६५ ± ०.००५ के एक शुद्ध आयुध डिपो६१० है खमीर ओडी६१० रीडिंग से गैलेक्टोज कारतूस के OD610 रीडिंग घटाना खमीर के नेट आयुध डिपो६१० का निर्धारण करने के लिए । प्रत्येक ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए कम से 30 मिलीलीटर पतला खमीर के एक अंतिम मात्रा तैयार करें ।
नोट: Spectrophotometer फिल्टर ५९५ और ६१० एनएम के बीच अवशोषण को मापने इस माप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
- एक स्पष्ट गैलेक्टोज प्लेट (प्लेट बाँझ होने की जरूरत नहीं है) में तपसिल polystyrene कारतूस के साथ साथ तपसिल में प्रत्येक खमीर नमूने के १२० pipetting द्वारा ऑप्टिकल घनत्व की पुष्टि करें । एक प्लेट spectrophotometer का प्रयोग करें सत्यापित करें कि पतला खमीर संस्कृति ०.०६५ ± ०.००५ के एक शुद्ध आयुध डिपो६१० है खमीर ओडी६१० रीडिंग से गैलेक्टोज कारतूस के OD610 रीडिंग घटाना खमीर के नेट आयुध डिपो६१० का निर्धारण करने के लिए । प्रत्येक ९६-अच्छी तरह से थाली के लिए कम से 30 मिलीलीटर पतला खमीर के एक अंतिम मात्रा तैयार करें ।
नोट: autoclaving दो स्टैक्ड प्लेटों पंनी में लिपटे द्वारा निष्फल प्लेटें हैं । शीर्ष प्लेट नमूना प्लेट के लिए एक ढक्कन के रूप में कार्य करता है और धोया जा सकता है, फिर से autoclaved, और पुनः प्रयोग किया ।
नोट: धारावाहिक कमजोर पड़ने के बाद पूरा हो गया है, वेल्स G1-3 से २०५ μL त्यागें । इस चरण के अंत में, सभी मानक कुओं १२० μL शामिल होना चाहिए । धारावाहिक कमजोर पड़ने अंतिम E2 तालिका 1में सूचीबद्ध सांद्रता उपज होगी । धारावाहिक कमजोर पड़ने के कदम के लिए, यह बाँझ सुझावों के साथ एक मल्टीचैनल pipettor का उपयोग करने के लिए उपयोगी है ।
नोट: वाहन नियंत्रण कुओं के लिए पृष्ठभूमि खमीर कोशिकाओं और मीडिया के साथ जुड़े अवशोषण यों तो इस्तेमाल कर रहे हैं । इसके अतिरिक्त, cytotoxicity या विकास परीक्षण नमूनों के प्रभाव को बढ़ावा देने के वाहन नियंत्रण कुओं के उन लोगों के साथ परीक्षण कुओं के आयुध डिपो६१० मूल्यों की तुलना द्वारा पता लगाया जा सकता है ।
नोट: जो नमूने या नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रण प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़े जाते है एक नोट बनाएं । जो कुओं के नमूने है और जो नहीं है ट्रैक रखने के लिए, सुझावों के एक ताजा बॉक्स के साथ शुरू और थाली में इसी कुओं के स्थानों के रूप में बॉक्स में एक ही स्थानों से सुझावों का उपयोग करें । १ ९६-खैर थाली तपसिल में 23 नमूनों को समायोजित कर सकते हैं ।
5. प्रसंस्करण हां प्लेटें (परख के दिन 2)
- 30 डिग्री सेल्सियस पर 17 एच की मशीन के बाद, मशीन से प्लेटों को हटा दें । अगर प्लेटों पर तुरंत कार्रवाई की जाएगी, तो कदम 5.1.1 पर आगे बढ़ें । यदि प्लेटें एक बाद की तारीख में संसाधित किया जाएगा, कदम 5.1.2 के लिए आगे बढ़ना ।
- एक मल्टीचैनल pipettor का प्रयोग करें कुओं की प्रत्येक पंक्ति की सामग्री मिश्रण है, और फिर एक अच्छी तरह से एक स्पष्ट, polystyrene, ९६-अच्छी तरह से microplate के इसी अच्छी तरह से खमीर निलंबन के ५० µ एल हस्तांतरण ।
नोट: Polystyrene प्लेट बाँझ होने की जरूरत नहीं है, लेकिन एक ढक्कन होना चाहिए. कुओं की प्रत्येक पंक्ति के लिए नए प्लास्टिक सुझावों का प्रयोग पार से बचने के लिए दूषित कुओं, हालांकि अगर pipetting triplicates भर में एक 8 टिप मल्टीचैनल पिपेट के साथ, सुझाव केवल तपसिल सेट के बीच बदलने की जरूरत है ।- नई प्लेट लेबल । ५.२ चरण के लिए आगे बढ़ें ।
- प्रसंस्करण से पहले प्लेटों को स्टोर करने के लिए, उन्हें प्लास्टिक रैप में लपेट लें । 6 डी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर लपेटा प्लेटें प्रशीतित, बाद में, फ्रिज से प्लेटें निकालें, उंहें खोलना, और pipetting द्वारा सभी कुओं की सामग्री के रूप में कदम 5.1.1 में स्थानांतरण । ५.२ चरण के लिए आगे बढ़ें ।
- एक मल्टीचैनल pipettor का प्रयोग करें कुओं की प्रत्येक पंक्ति की सामग्री मिश्रण है, और फिर एक अच्छी तरह से एक स्पष्ट, polystyrene, ९६-अच्छी तरह से microplate के इसी अच्छी तरह से खमीर निलंबन के ५० µ एल हस्तांतरण ।
- 1 एम डीटीटी की 20 मिलीलीटर, 1 मिमी डीटीटी के अंतिम एकाग्रता के लिए कमरे-तापमान LacZ बफर के 20 µ एल जोड़ें । मिश्रण LacZ बफर अच्छी तरह से । यदि एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग कर, एक एजेंट जलाशय में बांटना ।
चेतावनी: दस्ताने पहनें और एक हुड में डीटीटी के साथ काम करते हैं, यदि संभव हो तो - या तो एक मल्टीचैनल पिपेट या दोहरा pipettor का उपयोग करना, LacZ और या तो डीटीटी वाले बफर के २०० µ एल जोड़ने के लिए, और या ONPG CPRG प्लेट के सभी कुओं के लिए, और तुरंत उपाय और एक प्लेट polystyrene का उपयोग कर सभी कुओं के आयुध डिपो ६१० रिकॉर्ड । अतिरिक्त प्लेटों के लिए आवश्यकतानुसार दोहराएं ।
नोट: आयुध डिपो६१० रीडिंग LacZ गणना (चरण ६.१) के भाजक में उपयोग किया जाता है । इस कारण से, pipetting के बाद तुरंत और कक्ष बसने या LacZ बफ़र द्वारा लीजड है पहले रीडिंग प्राप्त करें । यदि नमूना कुओं के लिए ओडी६१० मूल्यों को ध्यान से उच्च या वाहन नियंत्रण कुओं के लिए आयुध डिपो६१० मूल्यों की तुलना में कम कर रहे हैं, नमूना निष्कर्षों या तो वृद्धि को बढ़ावा देने या खमीर के लिए साइटोटोक्सिक, क्रमशः कर रहे हैं । LacZ गणना कुओं के पार कोशिका घनत्व में छोटे मतभेदों के लिए सही है, लेकिन अगर मतभेद या तो दिशा में 30% से अधिक है, तो फिर से गठित नमूना पतला ५०% इथेनॉल में (२.६ कदम से) और नमूना वापस से परीक्षण करने के लिए चरण ३.२ 12. - ढक्कन के साथ प्लेटें कवर । खमीर युक्त प्लेटें कि एक्सप्रेस ERα14 पर 30 ° c ४० मिनट के लिए (ONPG के लिए) या 3 ज (CPRG के लिए) । खमीर युक्त प्लेटें कि एक्सप्रेस ERβ14 पर 30 ° c ७० मिनट के लिए (ONPG के लिए) या 4 ज (CPRG के लिए) ।
नोट: CPRG के साथ काम करते समय, मशीन समय लचीला कर रहे हैं; 2-4 एच पैदावार के लिए दोनों रिसेप्टर्स के साथ उपयुक्त परिणाम, अब गर्मी परख संवेदनशीलता में वृद्धि के साथ के लिए मशीन । - प्लेटिंग के बाद, एक मल्टीचैनल पिपेट या दोहरा pipettor एक अच्छी तरह से सोडियम कार्बोनेट के १०० µ एल जोड़ने के लिए उपयोग करें । सोडियम कार्बोनेट पीएच उठाती है और β-galactosidase प्रतिक्रिया रुक जाती है ।
- उपाय और आयुध डिपो४०५ (ONPG के लिए) या आयुध डिपो५७४ (CPRG के लिए) सभी कुओं की एक प्लेट spectrophotometer का उपयोग कर रिकॉर्ड ।
6.LacZ मानों की गणना करना
नोट: LacZ मूल्यों प्रत्येक नमूने के लिए रंग परिवर्तन की डिग्री और कई चर के लिए लेखांकन द्वारा अलग परख के बीच मूल्यों की तुलना की एक सामान्यीकृत विधि प्रदान करताहै (उदा., खमीर ऑप्टिकल घनत्व, मीडिया ऑप्टिकल घनत्व, और मशीन समय अगर यह एक ही प्लेट पर कुओं के बीच अलग है)12।
- मीडिया (गैलेक्टोज) नियंत्रण कुओं (H10-12) के लिए तपसिल आयुध डिपो६१० मूल्यों के साधन की गणना, और वाहन (५०% इथेनॉल) नियंत्रण (H1-3) के लिए तपसिल आयुध डिपो४०५ या ओडी५७४ मूल्यों के साधन की गणना । इन साधनों का उपयोग करें और प्लेट के लिए घंटे में मशीन समय (टी) रंग बदलने के लिए (चरण ५.५) LacZ मूल्यों की गणना करने के लिए (एक अच्छी तरह से रंग बदलने की डिग्री के लिए इसी) सभी मानक और नमूना कुओं के लिए निंनलिखित समीकरणों का उपयोग:
- वैकल्पिक रूप से, मानक और नमूनों के लिए LacZ मानों की गणना करने के लिए परिशिष्ट 1 में स्वचालित अनुप्रयोग का उपयोग करें ।
नोट: अनुप्रयोग के साथ उपयोग किया गया प्लेट लेआउट चित्रा 1में प्रस्तुत प्लेट लेआउट के समरूप होना चाहिए । यदि कुछ नमूने कुओं का उपयोग नहीं किया गया था, अवशोषण dataset में जगह धारकों के रूप में खाली कुओं से अवशोषक रीडिंग बनाए रखने के लिए परिशिष्ट 1 LacZ आवेदन में चिपकाया जा रहा है । यह अनुप्रयोग में प्लेट के स्थानिक लेआउट को बरकरार रखता है और यह सुनिश्चित करता है कि मीडिया नियंत्रण कुओं उनके आवश्यक स्थान में हैं । यदि रिक्त कक्ष हैं, तो इसके साथ ही, अनुप्रयोग निष्पादित नहीं करेगा ।
- वैकल्पिक रूप से, मानक और नमूनों के लिए LacZ मानों की गणना करने के लिए परिशिष्ट 1 में स्वचालित अनुप्रयोग का उपयोग करें ।
- प्रत्येक E2 मानक और प्रत्येक नमूने के लिए तपसिल LacZ मूल्यों के साधन की गणना. रिपोर्ट का अर्थ LacZ मान के रूप में µ l-1h-1. लॉग-प्रत्येक E2 मानक की सांद्रता रूपांतरण, और एक स्प्रेडशीट टेम्पलेट. csv फ़ाइल (परिशिष्ट 2) में के रूप में स्वरूपित दस्तावेज़ उत्पन्न.
7. Interpolating नमूना एस्ट्राडियोल समकक्ष (EEQs) 4-पैरामीटर रसद प्रतिगमन का उपयोग
नोट: EEQs से संबंधित नमूना LacZ मान (रंग परिवर्तन) E2 के साथ बनाए गए मानक वक्र के LacZ मानों के लिए । EEQs इस प्रकार निर्धारित कितना नमूना E2 के एक ज्ञात एकाग्रता के रूप में एक ही रंग परिवर्तन प्रतिक्रिया बटोरना करने के लिए आवश्यक है ।
- परीक्षण नमूनों के लिए EEQs की गणना करने के लिए, पहले मानक वक्र साजिश । e2 मानक (y-अक्ष) और संगत लॉग-रूपांतरित e2 (x-अक्ष) के लिए एक चार-पैरामीटर उपस्कर प्रतिगमन मॉडल के लिए LacZ मानों का अर्थ फ़िट करें ।
- परीक्षण नमूना LacZ मानों के लिए EEQs लगाना करने के लिए मॉडल का उपयोग करें । परिशिष्ट 2में उल्लिखित सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके EEQs की उपस्कर प्रतिगमन परिकलनों का संचालन करना.
8. मानकीकरण EEQs (एनजी/एमएल) को PCP नमुना जन
- PCP नमूना की राशि के लिए EEQs से संबंधित करने के लिए कदम ४.५ में एक अच्छी तरह से जोड़ा, EEQ गुणा (एनजी/एमएल) कुल मात्रा से नमूना कुओं (३२५ µ l) में चढ़ाया और फिर निकाले गए नमूने की मात्रा से विभाजित एक अच्छी तरह से (5 µ एल) को जोड़ा ।
नोट: ये मान निकाले गए नमूने के प्रति मिलीलीटर EEQ का प्रतिनिधित्व करते हैं । यदि नमूने PCP का 1 जी का उपयोग कर तैयार किया गया था, ये मान भी PCP के प्रति ग्राम EEQ प्रतिनिधित्व करते हैं (एनजी/ इस तरह से व्यक्त, EEQ मूल्यों (एनजी/जी) विभिंन PCPs में तुलना की जा सकती है । EEQ (एनजी/जी) व्यक्तिगत देखभाल के लिए मूल्यों इस अध्ययन में परीक्षण किए गए उत्पादों के लिए मान तालिका 2में दिखाए जाते हैं, और पूरे प्रोटोकॉल भर में एकत्रित नमूना डेटा में शामिल हैं परिशिष्ट ३.
Representative Results
इस यस प्रोटोकॉल का प्रयोग करते हुए 15 PCPs के तपसिल नमूनों का estrogenicities मूल्यांकन किया गया । के रूप में मिलर एट अल द्वारा नोट किया । (२०१०), ERβ के साथ परख व्यक्त कर रहे थे और अधिक परिमाण के एक आदेश खमीर के साथ परख से अधिक संवेदनशील ERα (चित्रा 2)14व्यक्त की तुलना में । इसलिए, एस्ट्रोजन गतिविधि अधिक बार ERβ-व्यक्त खमीर के साथ पता चला था (तालिका 2) । आठ PCPs ERβ और 5 PCPs के साथ एस्ट्रोजन गतिविधि का प्रदर्शन ERα के साथ एस्ट्रोजन गतिविधि का प्रदर्शन किया । हेयर क्रीम, सनस्क्रीन, लोशन, और लिप नमूने दोनों रिसेप्टर्स के साथ एस्ट्रोजन थे, जबकि फाउंडेशन, शेविंग क्रीम, और नेल पॉलिश परीक्षण सांद्रता पर ERβ के साथ ही एस्ट्रोजन थे. सात अंय PCPs (4 शैंपू, 2 साबुन, और 1 लिप) परीक्षण सांद्रता में या तो रिसेप्टर के साथ एस्ट्रोजन नहीं थे ।
रिसेप्टर संवेदनशीलता मतभेदों के अलावा, प्रत्येक नमूने के लिए EEQs वर्णमिति सब्सट्रेट (ONPG या CPRG) परख (2 तालिका) में इस्तेमाल के आधार पर मतभेद. सभी लेकिन एक नमूना में, EEQs ONPG का उपयोग कर निर्धारित उन CPRG का उपयोग निर्धारित से अधिक थे । इसके अलावा, निष्कर्षण की नकल के बीच भिंनता EEQs ERβ और CPRG और ERα और ONPG (तालिका 2) के साथ निर्धारित EEQs के लिए सबसे अधिक के साथ मापा के लिए सबसे कम था ।
वर्णमिति सब्सट्रेट तुलना करने के अलावा, वर्तमान अध्ययन के 1 उद्देश्य के लिए एक स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रम की अनुसूची के साथ संगत कर रहे हैं कि गर्मी की अवधि बार परीक्षण करने के लिए किया गया था. ठेठ हां परख एक 17 एच LacZ बफर में ४० मिनट के लिए-4 एच, एक कार्यक्रम है कि एक शिक्षण एक साप्ताहिक सत्र से विवश प्रयोगशाला में लागू करने के लिए असंभव है के लिए तुरंत बाद मशीन की आवश्यकता है । शिक्षण में इस परख के उपयोग की सुविधा के लिए, परख 17 एच मशीन के बाद एक 6 डी प्रशीतन अवधि (चरण 5.1.2) शुरू करने से संशोधित किया गया था । प्रशीतित प्लेटों से मानक घटता गैर-प्रशीतित प्लेटों (आंकड़े 2 & #38; 3) से उन लोगों के लिए तुलनीय थे, सिवाय इसके कि पैरामीटर्स की मानक त्रुटियां चार-पैरामीटर उपस्कर प्रतिगमन मॉडल का उपयोग करने का अनुमान था सभी प्रशीतित प्लेटों (तालिका 3) की तुलना में फ्रिज के लिए छोटे । इस प्रकार, 6 डी के लिए प्रशीतन प्लेटें त्रुटि को कम कर देता है और EEQ अनुमान की सटीकता में सुधार ।
चित्र 1. Microwell प्लेट लेआउट और मानक कमजोर पड़ने वक्र हां परख के लिए तैयारी । E2 मानकों (हल्के भूरे रंग के कुओं), नमूनों और नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रण (सफेद कुओं), और वाहन (H1-3) और गैलेक्टोज मीडिया (H10-12) नियंत्रण (डार्क ग्रे वेल्स) सभी तपसिल में परीक्षण किया गया । एक E2 मानक वक्र (हल्के भूरे रंग के कुओं) के माध्यम से वेल्स A1 में खमीर के ३२० µ एल चढ़ाना द्वारा निर्माण किया गया था A3 और १२० के माध्यम से बी 1 जी में खमीर के µ l G3 । फिर, E2 के 5 µ एल (खमीर के लिए २२७.५ एनएम कि एक्सप्रेस ERα; खमीर के लिए ९.७५ एनएम कि एक्सप्रेस ERβ) वेल्स A1 में खमीर के माध्यम से A3 में जोड़ा गया । खमीर + e2 निलंबन एक अच्छी तरह से यह नीचे से २०५ µ एल स्थानांतरित द्वारा प्रश्नपत्र पतला था, अंतिम E2 तालिका 1में सूचीबद्ध सांद्रता उपज । ध्यान दें कि, धारावाहिक कमजोर पड़ने की प्रक्रिया के अंत में, २०५ µ l G3 के माध्यम से वेल्स G1 से खारिज कर दिया जाना चाहिए एक अच्छी तरह से १२० µ एल के एक अंतिम मात्रा प्राप्त करने के लिए । नमूना और नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रण कुओं प्रत्येक निकालने के 5 µ एल जोड़कर तैयार किया गया (५०% इथेनॉल में भंग) खमीर के ३२० µ एल । वाहन नियंत्रण वेल्स (H1-3) खमीर के ३२० µ एल के लिए ५०% इथेनॉल के 5 µ एल जोड़कर तैयार थे । सभी नमूना और नियंत्रण कुओं pipetting द्वारा मिलाया गया था, और २०५ µ एल हटा दिया गया था और १२० µ एल के लिए अच्छी तरह से मात्रा समायोजित करने के लिए प्रत्येक । अंत में, मीडिया नियंत्रण वेल्स H10-12 में गैलेक्टोज मीडिया के १२० µ एल चढ़ाना द्वारा तैयार किए गए । परिशिष्ट 1 में LacZ कैलकुलेटर का उपयोग करने के लिए और परिशिष्ट 2में वर्णित आर-आधारित अनुप्रयोग, E2 मानक वक्र और वाहन और गैलेक्टोज मीडिया नियंत्रणों को दिखाया गया के रूप में चढ़ाया जाना चाहिए. नमूनों और नकारात्मक निष्कर्षण नियंत्रण चढ़ाना के क्रम के रूप में लंबे समय के रूप में सफेद कुओं में से किसी में चढ़ाया जा सकता है उल्लेख किया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2. हाँ 4-पैरामीटर रसद प्रतिगमन के माध्यम से उत्पन्न प्लेटों के लिए मानक घटता. दो सब्सट्रेट (ONPG & #38; CPRG) दो मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स (ERα या ERβ) दोनों (एक) के बिना और (ख) एक 6 डी प्रशीतन अवधि के साथ 17 एच 17β-एस्ट्राडियोल और नमूना निष्कर्षों के साथ मशीन के बाद से एक व्यक्त खमीर का उपयोग कर परीक्षण किया गया । सभी E2 मानकों और मीडिया और वाहन नियंत्रण तपसिल में परीक्षण किया गया । अंक तपसिल LacZ मूल्यों, जहां LacZ मूल्यों β-galactosidase द्वारा प्रेरित रंग परिवर्तन की डिग्री को प्रतिबिंबित के साधन का प्रतिनिधित्व करते हैं । उपस्कर प्रतीपगमन मॉडल पैरामीटर्स तालिका 3में सूचीबद्ध हैं । ONPG = ऑर्थो-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol लाल-β-D-galactopyranoside. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 3. विकसित हां प्लेट के उदाहरण । दो सब्सट्रेट (ONPG & #38; CPRG) खमीर व्यक्त मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स (ERα या ERβ) का उपयोग कर परीक्षण किया गया, या तो बिना (बाएँ) या के साथ (दाएँ) एक छह दिन प्रशीतन अवधि के बाद 17 एच मशीन के साथ 17β-एस्ट्राडियोल या नमूना अर्क. सभी E2 मानकों, मीडिया और वाहन नियंत्रण triplicates में परीक्षण किया गया । प्लेटों प्रत्येक प्लेट और नियंत्रण के शीर्ष पंक्ति में उच्चतम E2 एकाग्रता के साथ व्यवस्था की गई थी (५०% इथेनॉल + सही पर बाईं और गैलेक्टोज मीडिया पर खमीर) के अनुसार प्रत्येक प्लेट के नीचे पंक्ति में चित्रा 1। ONPG = ऑर्थो-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chlorophenol लाल-β-D-galactopyranoside.कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| मानक संख्या | [E2] ERα खमीर के लिए (प्रधानमंत्री) | [E2] ERβ खमीर के लिए (प्रधानमंत्री) |
| 1 | ३५०० | १५० |
| 2 | २२०८ | ९४.६ |
| 3 | १३९३ | ५९.७ |
| 4 | ८७८ | ३७.६ |
| 5 | ५५४ | २३.७ |
| 6 | ३४९ | 15 |
| 7 | २२० | ९.४५ |
तालिका 1. E2 हाँ में इस्तेमाल मानकों के अंतिम सांद्रता.
पाउडर E2 निर्जल इथेनॉल में भंग कर दिया गया था और फिर २२७.५ एनएम के शेयर सांद्रता काम करने के लिए पतला (खमीर के लिए कि एक्सप्रेस ERα) और ९.७५ एनएम (खमीर के लिए कि एक्सप्रेस ERβ) ५०% इथेनॉल में ।काम कर रहे शेयरों तो गैलेक्टोज मीडिया में खमीर युक्त microplate कुओं को जोड़ा गया और प्रश्नपत्र तालिका में दिखाया सांद्रता को पतला ।
| नमूनों का परीक्षण किया | परख शर्तों | PCPs के एस्ट्रोजन समकक्ष (EEQs) | |||||
| pcp# | नमूना प्रकार | रिसेप्टर | सब्सट्रेट | EEQ 1 (एनजी/ | EEQ 2 (एनजी/ | EEQ 3 (एनजी/ | मतलब EEQ (एनजी/ |
| 1 | हेयर क्रीम | ERα | ONPG | एनडी | ०.३७९ | एनडी | & #60; ०.३७९ |
| 1 | हेयर क्रीम | ERα | CPRG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 1 | हेयर क्रीम | ERβ | ONPG | ०.५२८ | ०.३३८ | ०.३६३ | ०.४१० |
| 1 | हेयर क्रीम | ERβ | CPRG | एनडी | ०.२१५ | एनडी | & #60; ०.२१५ |
| 4 | सनस्क्रीन | ERα | ONPG | ६.८०३ | १.३९० | एनडी | & #60; ४.०९७ |
| 4 | सनस्क्रीन | ERα | CPRG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 4 | सनस्क्रीन | ERβ | ONPG | १.३२१ | ०.८३८ | ०.८१८ | ०.९९२ |
| 4 | सनस्क्रीन | ERβ | CPRG | ०.६५१ | ०.५९१ | ०.७२५ | ०.६५६ |
| 7 | फाउंडेशन | ERα | ONPG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 7 | फाउंडेशन | ERα | CPRG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 7 | फाउंडेशन | ERβ | ONPG | एनडी | ०.१५८ | एनडी | & #60; ०.१५८ |
| 7 | फाउंडेशन | ERβ | CPRG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 9 | दाढ़ी क्रीम | ERα | ONPG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 9 | दाढ़ी क्रीम | ERα | CPRG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 9 | दाढ़ी क्रीम | ERβ | ONPG | एनडी | ०.२५६ | ०.२९५ | & #60; ०.२७६ |
| 9 | दाढ़ी क्रीम | ERβ | CPRG | ०.५०७ | ०.३९२ | ०.५६० | ०.४८६ |
| 10 | नेल पॉलिश | ERα | ONPG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 10 | नेल पॉलिश | ERα | CPRG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 10 | नेल पॉलिश | ERβ | ONPG | ०.९१६ | ०.५०३ | ०.५५४ | ०.६५८ |
| 10 | नेल पॉलिश | ERβ | CPRG | ०.५३२ | ०.६२८ | ०.५९४ | ०.५८५ |
| 11 | लोशन | ERα | ONPG | एनडी | एनडी | २.३२७ | & #60; २.३२७ |
| 11 | लोशन | ERα | CPRG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 11 | लोशन | ERβ | ONPG | जादा रेंज | २.५९९ | १.८४५ | & #62; २.२२२ |
| 11 | लोशन | ERβ | CPRG | -- | १.९८६ | १.२३६ | १.६११ |
| 13 | सनस्क्रीन | ERα | ONPG | १४.०६९ | ११.४९४ | १०.१८९ | ११.९१७ |
| 13 | सनस्क्रीन | ERα | CPRG | ४.७७३ | ५.७९० | ५.८५० | ५.४७१ |
| 13 | सनस्क्रीन | ERβ | ONPG | जादा रेंज | २.५८० | जादा रेंज | & #62; २.५८० |
| 13 | सनस्क्रीन | ERβ | CPRG | ०.२९२ | ०.२४० | एनडी | & #60; ०.२६६ |
| 15 | लिप बाम | ERα | ONPG | एनडी | एनडी | ०.४३१ | & #60; ०.४३१ |
| 15 | लिप बाम | ERα | CPRG | एनडी | एनडी | एनडी | एनडी |
| 15 | लिप बाम | ERβ | ONPG | १.२०२ | १.०६० | ०.८८७ | १.०५० |
| 15 | लिप बाम | ERβ | CPRG | ०.८२० | ०.८७१ | ०.८५१ | ०.८४७ |
तालिका 2. नॉन-जीरो EEQs के साथ PCPs का EEQs । 15 PCPs और तीन निष्कर्षण नियंत्रण के तीन aliquots निर्जल इथेनॉल में homogenized थे, सुखाया, और ४८ नमूनों की कुल के लिए ५०% इथेनॉल में पुनर्गठन, जिनमें से प्रत्येक तपसिल में विश्लेषण किया गया था हां परख का उपयोग कर । आठ PCPs में कम से कम 1 गैर-शून्य EEQ था, जबकि 7 PCPs का परीक्षण सांद्रता पर एस्ट्रोजन के लिए नहीं पाया गया । EEQ 1, EEQ 2, और EEQ 3 प्रत्येक PCP के तीन aliquots को देखें, प्रत्येक तपसिल में एक अलग प्लेट पर परीक्षण किया । EEQ 1, EEQ 2, और EEQ 3 के लिए मान प्रत्येक aliquot के लिए triplicates के साधन हैं । परख में प्रयुक्त खमीर मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स की 2 isoforms के 1 व्यक्त (ERα या ERβ) । दो वर्णमिति सब्सट्रेट, ONPG और CPRG, गैर प्रशीतित प्रोटोकॉल का उपयोग कर परीक्षण किया गया । EEQs चार-पैरामीटर उपस्कर प्रतिगमन (R2 मान ≥ ०.९८) के साथ LacZ मान E2 के 7 सांद्रता में से प्रत्येक का उपयोग कर निर्धारित किए गए थे । एन डी = परख की जांच सीमा से नीचे ।--= खो दोहराने ।
| परख शर्तों | मॉडल पैरामीटर्स | ||||||
| रिसेप्टर | सब्सट्रेट | 6 डी के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर गिरफ्तारी | मॉडल आर2 | विकास दर (LacZ इकाइयों/ | मोड़ पॉइंट (एनजी/एमएल) | लोअर Asymptote (LacZ यूनिट्स) | अपर Asymptote (LacZ इकाइयां) |
| ERα | ONPG | नहीं | & #62; ०.९९ | ८.५४८ ± १.६३३ | -०.५१२ ± ०.०२५ | -१.६२३ ± ४.४०८ | १२८.११ ± ६.३१ |
| ERα | ONPG | हाँ | & #62; ०.९९ | ७.६१८ ± ०.७५८ | -०.५८७ ± ०.०१४ | -८.३७८ ± २.२२३ | ९९.५३ ± २.५२८ |
| ERα | CPRG | नहीं | & #62; ०.९९ | ८.२५६ ± २.१८२ | -०.६१० ± ०.०३३ | ०.८५३ ± ३.३३३ | ६२.५२ ± ३.४७३ |
| ERα | CPRG | हाँ | & #62; ०.९९ | ५.०६८ ± ०.६१६ | -०.५२३ ± ०.०२२ | -३.१४७ ± १.९४६ | ६८.०६ ± ३.०६९ |
| ERβ | ONPG | नहीं | & #62; ०.९९ | १.०४१ ± २.००४ | -०.८९८ ± ४.४१० | -३२.९८ ± ८६.६२ | २४८.६ ± ७७८.९ |
| ERβ | ONPG | हाँ | & #62; ०.९९ | ४.३२७ ± १.२८९ | -१.७३६ ± ०.०८७ | ४.६५४ ± ३.०८७ | ६६.३७ ± १०.७५ |
| ERβ | CPRG | नहीं | = ०.९९ | ५.६७३ ± १.७६४ | -१.९१४ ± ०.०५२ | ३.९२५ ± १.६७९ | २८.०५ ± २.३३४ |
| ERβ | CPRG | हाँ | & #62; ०.९९ | ४.४१२ ± १.१४२ | -१.८९४ ± ०.०५१ | २.०५२ ± १.३०३ | २२.६४ ± २.०४७ |
तालिका 3. 4-पैरामीटर रसद प्रतिगमन के मॉडल पैरामीटर चित्रा 2 में मानक curves के लिए । दो सब्सट्रेट, ONPG और CPRG, 2 मानव एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स के 1 व्यक्त खमीर का उपयोग कर परीक्षण किया गया (ERα या ERβ) दोनों के बिना और के साथ एक छह दिन प्रशीतन अवधि के बाद 17 एच मशीन. पैरामीटर अनुमान ± मानक त्रुटि के रूप में रिपोर्ट की गई हैं ।
परिशिष्ट 1. LacZ मूल्यों की गणना के लिए आवेदन । आवेदन का उपयोग करने के लिए, पहले मुफ्त जावा सॉफ्टवेयर डाउनलोड (के रूप में सामग्री की तालिकामें उल्लेख किया है) । उसके बाद LacZ अनुप्रयोग खोलें । अनुप्रयोग के साथ उपयोग किया गया प्लेट लेआउट आरेख 1में प्रस्तुत प्लेट लेआउट के समरूप होना चाहिए । यदि कुछ नमूने कुओं का उपयोग नहीं किया गया था, खाली कुओं से अवशोषक रीडिंग बनाए रखने के रूप में अवशोषित dataset में LacZ अनुप्रयोग में चिपकाया जा रहा है । यह अनुप्रयोग में प्लेट के स्थानिक लेआउट को बरकरार रखता है और यह सुनिश्चित करता है कि मीडिया नियंत्रण कुओं उनके आवश्यक स्थान में हैं । यदि रिक्त कक्ष हैं, तो इसके साथ ही, अनुप्रयोग निष्पादित नहीं करेगा । ओडी में चिपकाएं४०५ रीडिंग (ONPG के लिए) या आयुध डिपो५७४ रीडिंग (CPRG के लिए) सभी कुओं का उपयोग कर कुंजीपटल आदेश "नियंत्रण (ctrl) + v" या "आदेश + v," कंप्यूटर प्लेटफॉर्म के आधार पर इस्तेमाल किया जा रहा. परख के लिए रंग का उत्पादन करने के लिए घंटे में मशीन समय की राशि दर्ज करें (५.४ कदम से, उदाहरण के लिए, ४० मिनट के लिए ०.६६६६७ एच) । अगलाक्लिक करें । चरण ५.३ से ओडी६१० रीडिंग में चिपकाएं । सबमिट करेंक्लिक करें । LacZ परिणाम प्रदर्शित किया जाएगा और उपयोग किया जा रहा कंप्यूटर प्लेटफॉर्म के आधार पर "नियंत्रण (ctrl) + c" या "कमांड + सी," दबाकर नकल की जा सकती है. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
परिशिष्ट 2. EEQs की गणना के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर विकल्प । EEQs तीन प्रस्तुत विकल्पों में से एक का उपयोग कर गणना की जा सकती है । 1 का उपयोग करने के लिए निर्देश । JMP software या 2. R कोड परिशिष्ट 2 में प्रदान की जाती हैं । R कोड को भी 3 में परिवर्तित कर दिया गया है । https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/पर उपलब्ध एक आवेदन प्रारूप । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
परिशिष्ट 3. नमूना डेटा खमीर का उपयोग कर एकत्र की है कि एक्सप्रेस ERα और सब्सट्रेट के रूप में CPRG । आयुध डिपो६१० और आयुध डिपो की माप सात E2 मानकों, वाहन और मीडिया नियंत्रण के प्रत्येक के लिए५७४ , और एक एकल प्रतिनिधि PCP नमूना शामिल हैं, के साथ गणना की LacZ मूल्यों । मानक वक्र का एक चार-पैरामीटर उपस्कर प्रतिगमन मॉडल का निर्माण करने के लिए LacZ मानों का उपयोग किया गया था जैसा कि चरण 7A & #38; B ऊपर है । मॉडल microplate वेल्स में एनजी/एमएल में प्रतिनिधि नमूने के EEQs के तपसिल अनुमान लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । ये मान तो EEQs में कनवर्ट किए गए के रूप में व्यक्त की गई एनजी/g का नमूना (चरण ८.१) । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
Discussion
हां, पानी, भोजन, संयंत्र के ऊतकों, या व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों के रूप में पर्यावरण के नमूनों में एस्ट्रोजन लाइगैंडों का पता लगाने के लिए इस्तेमाल एक कम लागत विधि है । डेटा यहां प्रस्तुत 2 एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स की तुलना (ERα और ERβ), 2 सब्सट्रेट (ONPG और CPRG), और 2 समय (प्रशीतन के साथ 2 डी प्रोटोकॉल और प्रशीतन के साथ सात दिन प्रोटोकॉल) के माध्यम से व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों में estrogenicity को मापने के लिए हां परख । 7 डी, प्रशीतित CPRG और खमीर व्यक्त ERα और/या ERβ सर्वश्रेष्ठ quantifies EEQs का उपयोग कर प्रोटोकॉल जबकि भी समय की कमी के साथ संगत जा रहा है स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रम है कि केवल एक बार मिलने/ वास्तव में, प्रशीतन के बिना 2 डी परख की तुलना में, सात दिन प्रशीतित परख प्लेट की नकल भर में कम विचरण के साथ जुड़ा हुआ था । इसके अलावा, मानक वक्र के रैखिक हिस्सा थोड़ा प्रशीतित परख का उपयोग एकत्र डेटा के लिए विस्तारित किया गया था । मानक वक्र के रैखिक भाग परख पता लगाने रेंज परिभाषित करता है और मानक वक्र है कि नमूना EEQs लगाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का ही हिस्सा है ।
सभी लेकिन परीक्षण नमूनों में से एक में, EEQs CPRG का उपयोग कर मापा ONPG के साथ उन मात्रा से कम थे. एक उच्च विलुप्त होने गुणांक और कम कश्मीरएम और वीमैक्सके साथ, CPRG दस गुना अधिक ONPG17से अधिक संवेदनशील है । इस प्रकार, CPRG कम सांद्रता पर इस्तेमाल किया जा सकता है और β-galactosidase की कम मात्रा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन कारणों के लिए, CPRG आम तौर पर ONPG18,19से अधिक पसंद है । हालांकि, अधिक सब्सट्रेट संवेदनशीलता CPRG के साथ पाया कम EEQ मान समझा नहीं है । उच्च EEQ मूल्यों ONPG के साथ पता चला मैट्रिक्स परख के साथ हस्तक्षेप के कारण हो सकता है, के रूप में अंय लेखकों2,18द्वारा उल्लेख किया । व्यक्तिगत देखभाल उत्पाद निष्कर्षों से पीला pigments EEQ ONPG के साथ पाया मूल्यों बढ़ सकता है । दूसरों को अपने प्रयोगात्मक डिजाइन2, एक दृष्टिकोण है कि एक प्रयोग में प्लेटों की संख्या डबल्स में वर्णक नियंत्रण सहित द्वारा इस समस्या को दरकिनार कर दिया है । जब मैट्रिक्स हस्तक्षेप समस्याग्रस्त हो सकता है, CPRG हां परख के लिए एक बेहतर सब्सट्रेट हो सकता है, हालांकि यह अधिक महंगा है और ONPG की तुलना में अब मशीन समय की आवश्यकता है । इसके अलावा, β-galactosidase द्वारा सब्सट्रेट की दरार से प्रेरित रंग परिवर्तन CPRG के साथ और अधिक नाटकीय है, यह आसान परिणाम कल्पना करने के लिए छात्रों के लिए बना रही है ।
मिलर एट अल. (२०१०), जो इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल खमीर इंजीनियर, नोट किया है कि खमीर व्यक्त ERβ 30x अधिक 17β के प्रति संवेदनशील थे-खमीर ERα, एक खोज हमारे डेटा द्वारा पुष्टि की से एस्ट्राडियोल व्यक्त14। प्लाज्मिड निर्माण में संभावित बारीकियों के अलावा मिलर एट अल. (२०१०) संवेदनशीलता में इस अंतर को14नहीं समझा जा सका. दो प्लाज्मिड निर्माण के बीच एक अंतर यह है कि ERα अभिव्यक्ति गैलेक्टोज द्वारा विनियमित है, जबकि ERβ अभिव्यक्ति या तो ग्लूकोज या गैलेक्टोज द्वारा विनियमित है । हां परख में इस्तेमाल खमीर ग्लूकोज मीडिया में संस्कृति और केवल गैलेक्टोज दिया जाता है जब वे परख के शुरू में पतला कर रहे हैं । इसलिए, खमीर व्यक्त ERβ रिसेप्टर प्रोटीन के उच्च प्रति संख्या जमा कर सकते है परख के शुरू करने से पहले, जिससे एस्ट्रोजन लाइगैंडों के लिए उच्च संवेदनशीलता प्रदान ।
ERα-व्यक्त खमीर की कम संवेदनशीलता ERβ के साथ तुलना में ERα के साथ मापा नमूनों में गैर-estrogenicity का पता लगाने की उच्च दर की व्याख्या कर सकते हैं । संभावना है कि नमूना EEQs का पता लगाया जाएगा बढ़ाने के लिए, उपयोगकर्ताओं को अलग निष्कर्षण सॉल्वैंट्स और तरीकों को रोजगार या खमीर के लिए नमूना के उच्च मात्रा में जोड़ सकते हैं । यदि उच्च नमूना मात्रा का उपयोग किया जाता है, E2 मानकों की सांद्रता समायोजित किया जाना चाहिए ऐसी है कि मानकों और नमूनों की एक ही मात्रा परख में इस्तेमाल किया जा सकता है । अधिक नमूना जोड़ने की एक सीमा है कि खमीर केवल 6-10% इथेनॉल बर्दाश्त कर सकते हैं, 30 बनाम ३५ डिग्रीसेल्सियस20 की मशीन तापमान पर बेहतर सहिष्णुता के साथ । खमीर पर इथेनॉल के प्रभाव के लिए नियंत्रण करने के लिए, जांचकर्ताओं तपसिल "प्लेट लेआउट के लिए खमीर केवल कुओं" जोड़ना चाहिए और पुष्टि करते है कि इन "केवल खमीर" कुओं के आयुध डिपो ६१० वाहन नियंत्रण कुओं के आयुध डिपो के लिए तुरंत तुलनीय है LacZ बफ़र के अलावा के बाद । वैकल्पिक रूप से, इथेनॉल में भंग नमूनों सूखी microwell प्लेटों को जोड़ा जा सकता है और इथेनॉल से पहले काफूर खमीर जोड़ रहे हैं । Dimethylsulfoxide (DMSO) भी हां परख में एक नमूना विलायक के रूप में प्रयोग किया जाता है, लेकिन अंतिम खमीर के साथ DMSO के काम एकाग्रता 1%12तक सीमित किया जाना चाहिए ।
हां परख पर्यावरण के नमूनों में estrogenicity का पता लगाने के लिए एक शक्तिशाली स्क्रीनिंग उपकरण है । विशेष रूप से, हां लाइगैंडों का पता लगाता है कि परमाणु एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स कि एस्ट्रोजन प्रतिक्रिया तत्वों के साथ बातचीत करने के लिए प्रत्यक्ष जीन अभिव्यक्ति14बाँध. हालांकि, हां भी महत्वपूर्ण सीमाएं हैं । हां पता नहीं ईज कि गैर परमाणु तंत्र के माध्यम से ऐसी झिल्ली एस्ट्रोजन रिसेप्टर्स या तंत्र है कि उत्प्रेरक प्रोटीन 1 (एपी-1) प्रतिलेखन कारकों के रूप में अतिरिक्त तत्वों को शामिल के रूप में काम करते हैं । इसके अलावा, क्योंकि खमीर स्तनधारी कोशिकाओं के रूप में एक ही चयापचय क्षमता नहीं है, हां लाइगैंडों कि चयापचय सक्रियण के लिए एस्ट्रोजन की आवश्यकता का पता लगाने नहीं कर सकते ।
इसके अलावा, हां परख आसानी से एस्ट्रोजन और विरोधी के बीच अंतर जटिल नमूनों में एस्ट्रोजन लाइगैंडों नहीं कर सकते । इसके बजाय, यह शुद्ध estrogenicity उपाय है, जो एस्ट्रोजन और विरोधी एस्ट्रोजन लाइगैंडों का योग प्रभाव है । एर विरोधी की एकाग्रता मात्रा या मिश्रण के निरोधात्मक गतिविधि का मूल्यांकन करने के लिए, परख दोनों मानक एगोनिस्ट (17β-एस्ट्राडियोल) और परीक्षण नमूना सांद्रता की एक श्रेणी के साथ खमीर गर्मी द्वारा संशोधित किया जा सकता है12। नमूनों में विरोधी एगोनिस्ट-प्रेरित रिपोर्टर गतिविधि कम कर सकते हैं और नमूनों में ईआर विरोधी की उपस्थिति की पहचान के लिए एक उपयोगी स्क्रीन प्रदान करता है, तो यह प्रक्रिया निर्धारित करता है ।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल नमूना प्रकार की एक किस्म को समायोजित कर सकते हैं, हालांकि कुछ नमूनों निष्कर्षण और नमूना तैयारी चरणों में संशोधनों की आवश्यकता हो सकती है । उदाहरण के लिए, EEQs कुछ व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों की प्रतिकृति के बीच व्यापक रूप से विविध । अधिक चर नमूने तेल बूंदों को शामिल करने के लिए या अंयथा पूरी तरह से सजातीय नहीं थे, यह दर्शाता है कि एक और अधिक lipophilic विलायक जैसे diethyl ईथर के रूप में उपयोगी होगा । वैकल्पिक रूप से, तेल और व्यक्तिगत देखभाल उत्पादों में मोम के बजाय १००% इथेनॉल के ५०% इथेनॉल के साथ नमूने निकालने से बाहर रखा जा सकता है ।एक ५०% इथेनॉल निष्कर्षण भी अधिक पानी में घुलनशील एस्ट्रोजन लाइगैंडों (जैसे, कुछ pigments) पर कब्जा होगा । हालांकि, ५०% इथेनॉल और धीरे से १००% इथेनॉल वाष्पीकरण और इस तरह निष्कर्षण समय का विस्तार हो सकता है । इसके अतिरिक्त, (जैसे साबुन के रूप में) कुछ नमूने खमीर, कम सेल घनत्व माप (ओडी६१०) में जिसके परिणामस्वरूप साइटोटोक्सिक थे । फॉक्स एट अल । (२००८) सुझाव है कि इस तरह के नमूनों और पतला किया जाना चाहिए अगर सेल घनत्व मतभेद 30% से अधिक वाहन नियंत्रण वेल्स12की तुलना में ।
यदि हां परख विश्लेषणात्मक अनुसंधान प्रयोजनों के लिए प्रयोग किया जाता है, नमूना पूल के कमजोर पड़ने curves preemptively करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है निकालने के उचित मात्रा निर्धारित करने के लिए कदम ४.५ में खमीर के लिए जोड़ा जाएगा । वैकल्पिक रूप से, अर्क एक साथ कई संस्करणों में परीक्षण किया जा सकता है (उदा, 5 µ एल और 20 µ एल निकालने ४.५ कदम में खमीर के लिए जोड़ा) या कमजोर पड़ने वाली है कि परिमाण के आदेश अवधि (उदा, ०.२ µ एल, 2 µ एल, और 20 µ एल) । निकालने के "उपयुक्त" खंड उन है कि मानक वक्र के रैखिक भाग के साथ LacZ मूल्यों का मिलान करके estrogenicity की पहचान कर रहे हैं । अनुकूलन खमीर, जैसे cytotoxicity, झूठी नकारात्मक, या मानक वक्र से अधिक है कि estrogenicity के लिए बहुत अधिक या बहुत कम नमूना जोड़ने के कारण समस्याओं से बचाता है । जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है, नमूनों की मात्रा और E2 मानकों समायोजित किया जाना चाहिए जब ligand के विभिंन मात्रा में उपयोग किया जाता है ऐसी है कि खमीर एक सुसंगत मात्रा और थाली भर में इथेनॉल या अंय वाहन की एकाग्रता को उजागर कर रहे हैं ।
झूठी नकारात्मकता के लिए क्षमता के बावजूद, हां परख Schug एट अल द्वारा अंत-स्रावी अवरोधकों के लिए एक टीयर 3 परीक्षण उपकरण के रूप में पहचान की गई है । (२०१३), जो अंत में स्रावी व्यवधान (TiPED)21के लिए एक व्यापक tiered प्रोटोकॉल विकसित की है । स्नातक शिक्षा के लिए, परख के अंत में स्रावी व्यवधान, कोशिका संस्कृति, रिसेप्टर बाइंडिंग, एंजाइम गतिविधि, आनुवंशिक इंजीनियरिंग, सांख्यिकी, और प्रयोगात्मक डिजाइन से संबंधित अवधारणाओं शिक्षण के लिए मूल्यवान है । छात्र जो परख का उपयोग भी मौलिक और मोटे तौर पर लागू प्रयोगशाला कौशल ऐसे प्रश्नपत्र कमजोर मानकों के रूप में अभ्यास; नमूने निकालने; समाधान बनाना; निर्माण और interpolating मानक घटता; सांद्रता की गणना; समाधान बनाना; बाँझ तकनीक का प्रदर्शन; संवर्धन कोशिकाओं; चर और नियंत्रण की पहचान; डेटा एकत्रित करना, व्यवस्थित करना और उसका विश्लेषण करना; निर्माण और रेखांकन की व्याख्या; और micropipettors और spectrophotometers के रूप में आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग ।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह परियोजना लुइसियाना टेक यूनिवर्सिटी और Furman यूनिवर्सिटी से टीएमई और AMR को क्रमशः स्टार्ट-अप फंडिंग से वित्तपोषित थी । अतिरिक्त धन AMR और टीएमई को दक्षिण के संबद्ध कॉलेजों, एक लुइसियाना EPSCoR Pfund अनुदान के लिए एक २०१५ संकाय उंनति अनुदान द्वारा प्रदान की गई थी राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन और टीएमई के लुइसियाना बोर्ड से रीजेंट्स, और एक यात्रा पुरस्कार से टीएमई को दक्षिण के विश्वविद्यालय । हम सांख्यिकीय विश्लेषण और श्री क्रिस्टोफर मूर के लिए "हमें एक हाथ दे" फिल्माने के दौरान के साथ सहायता के लिए डॉ डेविड Eubanks (Furman) धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Vortex Mixer (for single or multiple tubes) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-215-365 | Any mixer will suffice. |
| Bucket centrifuge | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 75-063-839 | Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm. |
| Bunsen burner | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 17-012-823 | Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead. |
| Incubator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 50125590H | Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C. |
| Microplate reader | BioTek (www.biotek.com) | EPOCH2 | A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm. |
| Gen5 microplate reader and imager software | BioTek (www.biotek.com) | GEN5 | Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader. |
| Refrigerator | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05LREEFSA | Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C. |
| Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-681-15E | Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets. |
| P10 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144562G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl. |
| P200 micropipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F144565G | Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl. |
| P300 multichannel pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FBE1200300 | Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl. |
| Repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164001G | Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Sterile 15 mL conical tubes with caps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 05-539-801 | |
| Glass scintillation vials | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 03-337-4 | |
| Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12565501 | |
| Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid | Cole-Parmer (www.coleparmer.com) | EW-01728-81 | |
| 100 mL glass beakers | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-539H | Any glass beakers will suffice if they are autoclavable. |
| 250 mL glass Erlenmeyer flasks | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB500250 | Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable. |
| Sterile, adhesive, porous film | VWR (www.vwr.com) | 60941-086 | |
| Metal forceps | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 12-000-157 | Any metal forceps will suffice. |
| Reagent reservoir | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 07-200-127 | |
| Filtration units (0.2 µm) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 09-761-52 | |
| Squirt bottle (for ethanol) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 02-897-10 | Any laboratory squirt bottles will suffice. |
| Autoclavable storage bottles | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 06-414-1D | Any autoclavable glass storage bottles will suffice. |
| 10 mL glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27F | Any glass serological pipets will suffice. |
| 1 mL glass serological pipets (sterile) | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | 13-678-27C | Any glass serological pipets will suffice. |
| P10 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-3810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| P200 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-8810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| P300 micropipettor tips | USA Scientific (www.usascientific.com) | 1120-9810 | Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above. |
| Syringe tips for repeating pipettor | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | F164150G | Only required if a repeating pipettor is used. |
| Sterile petri dishes | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | FB0875712 | Any sterile petri dishes will suffice. |
| Parafilm | Fisher Scientific (www.fishersci.com) | S37440 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Yeast | |||
| Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a) | American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org) | MYA-151 | Recombinant yeast are also available upon request from the authors. |
| Receptor/reporter plasmid for ERα | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061) | |
| Receptor/reporter plasmid for ERβ | Addgene (www.addgene.org) | pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Difco agar | BD (www.bd.com) | 214530 | |
| Dithiothreitol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | D0632 | CAUTION: Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant. Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion. |
| Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | N1127 | |
| Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | 10884308001 | |
| Yeast nitrogen base | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | Y0626 | |
| Glucose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G8270 | |
| Galactose | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | G5388 | |
| Adenine sulfate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | A9126 | |
| Uracil | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | U0750 | |
| Leucine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L8000 | |
| Histidine | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | H8000 | |
| 17 β-Estradiol | Sigma (www.sigmaaldrich.com) MP Biomedicals | E8875-250 mg 0219456401 - 1 mg | CAUTION: Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant. It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin. Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses. Estradiol is very toxic to aquatic life. Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation. Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment. |
| 100% ethanol | Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com) | 111000200 | |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic (anhydrous) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S0876 | |
| Magnesium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | P9333 | |
| Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt) | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | L5125 | |
| Sodium carbonate | Sigma (www.sigmaaldrich.com) | S7795 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis. | |
| Java software (required for Appendix 1 application) | Oracle Corporation | To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1. LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards. | |
| JMP statistical software version 13.0.0 | SAS Institute | Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve. The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve. | |
| R statistical computing and graphics software | R Foundation | Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/. Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2. |
References
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