Nachweis Estrogenic Liganden in Körperpflege-Produkte mit einer Hefe Östrogen Bildschirm optimiert für Undergraduate Teaching Labor

Summary

Dieser Artikel stellt einen optimierte Hefe Östrogen Bildschirm zur Quantifizierung der Liganden in Körperpflegeprodukten (PCP), die Östrogen-Rezeptoren Alpha (ERα) und/oder Beta (ERβ) binden. Die Methode umfasst zwei farbmetrischen Substrat Optionen einer sechstägigen gekühlten Inkubation für den Einsatz in grundständige Studiengänge und statistische Werkzeuge zur Datenanalyse.

Abstract

Die Hefe Östrogen Bildschirm (ja) wird verwendet, um Östrogene Liganden in Umweltproben zu erkennen und im großen und ganzen in Studien von endokrinen Störungen angewendet wurde. Östrogene Liganden sind natürliche und künstliche "Environmental Östrogene" (EBS) in vielen Konsumgütern wie Körperpflegeprodukte (PCP), Kunststoffe, Pestizide und Lebensmitteln gefunden. EBS stören Hormon Signalisierung bei Menschen und anderen Tieren, potenziell Fruchtbarkeit reduzieren und erhöhen Erkrankungsrisiko. Trotz der Bedeutung der EBS und andere endokrine Störung Chemikalien (EDZ) für die öffentliche Gesundheit endokrine Störung nicht in der Regel Bachelor Curricula gehört. Dieses Manko ist teilweise ein Mangel an entsprechenden Labor-Aktivitäten, die die Grundsätze zu veranschaulichen beteiligt, aber auch für Studenten zugänglich. Dieser Artikel stellt eine optimierte ja zur Quantifizierung der Liganden in Körperpflegeprodukten, die Östrogen-Rezeptoren Alpha (ERα) und/oder Beta (ERβ) binden. Die Methode beinhaltet eines der beiden farbmetrischen Substrate (ortho- Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside (ONPG) oder Chlorphenol rot-β-D-Galactopyranoside (CPRG)), die durch β-Galaktosidase gespalten sind, treten Sie einer 6-tägigen gekühlten Inkubation erleichtern Sie Einsatz in undergraduate Laborübungen, eine automatisierte Anwendung für LacZ Berechnungen und R-Code für die damit verbundenen 4-Parameter logistische Regressionsanalyse. Das Protokoll wurde entwickelt, um Studenten zu entwickeln und führen Experimente, in denen sie Produkte ihrer Wahl für Östrogen imitiert Bildschirm, zu ermöglichen. Sie lernen dabei endokrine, Zellkultur, Rezeptorbindung, Enzymaktivität, Gentechnik, Statistik und Versuchsplanung. Gleichzeitig, sie auch üben Labor für grundlegende und breit anwendbar, wie z. B.: Berechnung der Konzentrationen; Herstellung von Lösungen; sterilen Technik demonstrieren; seriell verdünnen Normen; Bau und Interpolation Standardkurven; Ermittlung von Variablen und Kontrollen; sammeln, organisieren und analysieren von Daten; Aufbau und Interpretation der Graphen; und mit gemeinsamen Laborgeräte wie Mikroliterpipetten und Spektralphotometer. So fördert die Umsetzung dieser Assay Studenten in Inquiry-based Learning™ beim erkunden von neuen Themen in Umweltwissenschaften und Gesundheit engagieren.

Introduction

Die Hefe Östrogen Bildschirm (ja) ist weit verbreitet, Liganden zu quantifizieren, die Estradiol (E2 oder 17β-Estradiol) in einer Vielzahl von Matrizen, einschließlich Wasser, Pflanzengewebe, Konsumgüter und Lebensmittel^{1,2,3zu imitieren, 4}. Gemeinsam werden solche Liganden bezeichnet "Environmental Östrogene (EBS)." Die ja ursprünglich als eine niedrige Kosten, in-vitro- Alternative zu in-Vivo -Tests wie die Nager Uterotropher assay^5,6 und die Regenbogenforelle Fütterung Assay⁷entwickelt. Das Ziel dieser Tests ist es, festzustellen, ob ein Produkt enthält Chemikalien, die stimulieren oder blockieren Östrogen-abhängigen Mechanismen. Erkennung von EBS ist kritisch, weil sie die normale körpereigene Östrogen Signaltechnik, besonders während der fetalen Entwicklung beeinträchtigen können. Diese Störung beeinträchtigt Gesundheit erhöht Risiko für Fettleibigkeit, Unfruchtbarkeit, Krebs und kognitive Verlust⁸.

Trotz der Bedeutung der EBS und andere endokrine Disruptoren für die öffentliche Gesundheit endokrine Störung nicht allgemein Bachelor Curricula gehört. Dieser Mangel ist zum Teil auf einen Mangel an Aktivitäten, die die Grundsätze zu veranschaulichen beteiligt, aber auch für Studenten zugänglich. Darüber hinaus mehrere Varianten des Protokolls ja gibt es^{9,10,11,12,13}, und diese Vielfalt macht Assay Optimierung für zeitaufwendig Labor-Koordinatoren nicht speziell in den relevanten Techniken geschult. Schließlich sind ja Assays in der Regel über 1 langen Tag oder 2 aufeinander folgenden Tagen mit einer O/N Inkubation abgeschlossen. Dieses Timing ist nicht kompatibel mit dem Format der Bachelor Laborübungen, entsprechen in der Regel einmal / Woche für mehrere Stunden.

In Reaktion auf diese Bedürfnisse berichtet dieses Manuskript eine optimierte 96-Well-ja-Protokoll, die ethanolische Extraktionsmethoden für Körperpflegeprodukte (PCP)³ und eine 6-Tage-Kältetechnik Schritt, wöchentliche Labor treffen unterzubringen umfasst. Absoluter Ethanol ist eine vielseitige organischen Lösungsmittel, das eine Vielzahl von polaren und unpolaren solute auflösen kann. Darüber hinaus ist es geeignet für grundständige Studiengänge, weil es leicht verfügbar, relativ ungiftig, erschwinglich und mit Wasser mischbar ist; Es verdunstet auch leicht ohne spezielle Ausrüstung. Allerdings Ethanol eignet sich nicht für das Extrahieren von stark hydrophobe endokrine Disruptoren oder viele Öle und Wachse, die beiden letzteren werden häufige Zutaten in PCPs. schlechte Extraktionseffizienz erhöht das Risiko von falsch negativen Befund. Mit dieser Einschränkung im Auge sollte Ermittler wählen Sie Extraktionsverfahren (z.B., ethanolische Extraktion oder Festphasenextraktion), dass Adresse Probe Merkmale und Ziele der Studie (Forschung versus Bachelor Anleitung).

Das ja setzt auf rekombinante Saccharomyces Cerevisiae ursprünglich von Dr. Charles Miller an der Tulane University. Bitte siehe Miller Et al. (2010) für eine komplette Karte von veränderter Plasmid-¹⁴. Hefe verwandelt sich diese Plasmide konstitutiv Ausdruck menschlichen nukleare ERα und ERβ (auch genannt ESR1 und ESR2, beziehungsweise) Wenn Sie in Medien, die Galaktose (für ERα) oder Glukose oder Galaktose (für ERβ) angebaut. Wenn Östrogene Chemikalien in den Medien präsent sind, binden sie an die Rezeptoren, Erstellen von Ligand-Rezeptor-komplexe, die β-Galaktosidase (LacZ) Ausdruck auf eine Ebene proportional zur Konzentration von Östrogenen Chemikalien zu aktivieren. Hefezellen sind dann lysiert, um die angesammelten β-Galaktosidase zu lösen. Der Lyse Puffer enthält entweder ONPG oder CPRG, die durch β-Galaktosidase zu gelben oder roten Produkten, bzw. gespalten werden. Farbmetrische Produkte können durch Messung der Extinktion mit einer Microwell Platte Spektralphotometer quantifiziert werden. Der Grad der Farbwechsel ist proportional zur Konzentration der Östrogene Liganden, die die Hefe ausgesetzt war.

Die Wahl des Substrats (CPRG oder ONPG) hängt das Potenzial für Hintergrund-Absorption aus den Proben. Z. B. Pflanzenextrakte werden oft hinzufügen einen gelben Farbton auf die Medien, die künstlich Östrogenität Maßnahmen wenn bläst ONPG (quantifiziert bei 405 nm) dient als Substrat für β-Galaktosidase. Mit Pflanzenextrakte, CPRG (quantifiziert auf 574 nm) möglicherweise eine geeignetere farbmetrischen Substrat. CPRG ist teurer als ONPG sondern dient bei einem Zehntel der Molarity. Dieser Artikel stellt Estrogenicities von PCP Extrakte quantifiziert mit ONPG und CPRG.

Quantifizierung der Östrogenität von Umweltproben mit ERα und ERβ ist ein umfassender Ansatz als mit nur einer dieser Rezeptoren. Bei Tieren weisen diese Rezeptoren differential Gewebeverteilung, Regulierungstätigkeiten und verbindliche Affinitäten für Östrogene und Anti-Östrogene Liganden¹⁵. Zum Beispiel binden pflanzliche Phytoöstrogene in der Regel ERβ mehr stark², während synthetische Chemikalien Vorliebe für ERα und ERβ zeigen können oder beide Rezeptoren gleichermaßen gut¹⁵binden können. Daher Vorhersagen Bindung an einem Östrogen-Rezeptor nicht notwendigerweise, Bindung an das andere.

Obwohl die EBS in viele Consumer-Produkte (z.B., Pestizide, Waschmittel, Klebstoffe, Schmierstoffe, Kunststoffe, Nahrungsmittel und Pharma) sowie Pflanzen zu finden sind, stammen die dargestellten Daten mit einer Auswahl an PCP. PCPs sind überzeugend, leicht zur Verfügung, Budget-freundlichen und umweltrelevanten für Studierende. Studenten können eingeladen werden, bringen Sie ihre Lieblings PCPs von zu Hause, im Labor zu testen. Sie können auch suchen die Skin Deep Datenbank zu generieren Hypothese-driven Vergleiche von PCP mit hoher und geringer Toxizität Partituren von der Environmental Working Group¹⁶ entwickelt. Auf diese Weise können Schüler gleichzeitig erweiterte Labor Fähigkeiten entwickeln; Tätigung von selbstgesteuertes, Anfrage-basierten Lernens; und entdecken Sie neue Fragen in Umweltwissenschaften und Gesundheit.

Protocol

1. Herstellung Reagenzien

1. Bereiten Sie Glukose und Galaktose Medien durch das Mischen von 6,7 g Hefe Stickstoff base, 20 g Traubenzucker oder Galaktose, 20 mg Adenin Sulfat (hinzugefügt als 10 mL einer wässrigen Vorratslösung 200 mg/100 mL), 20 mg Uracil (hinzugefügt als 10 mL einer wässrigen Vorratslösung 200 mg/100 mL) , 60 mg Leucin (hinzugefügt als 6 mL einer wässrigen Stammlösung 1 g/100 mL) und 20 mg Histidin (hinzugefügt als 2 mL einer wässrigen Stammlösung 1 g/100 mL) in entionisiertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L. entkeimen durch Filtration (0,2 µm-Filter). Datenträger kann für mehrere Wochen bei 4 ° C aufbewahrt werden.
2. Bereiten Sie Estradiol (E2) Standards durch auflösende pulverisierte E2 in wasserfreiem Ethanol und mit den entsprechenden Arbeiten Konzentrationen verdünnt (227,5 nM & 9,75 nM) in 50 % igem Ethanol.
   Hinweis: Wenn als ein Fläschchen von 1 mg Estradiol gekauft wird, fügen Sie 1 mL Ethanol direkt an das Fläschchen Estradiol Pulver aufzulösen hinzu. Dies ergibt eine 3,67 mM Lager #1.  Verdünnen Sie 10 μL des Vorrates #1 in 990 μl Ethanol zu 1 mL 36.71 μM Lager #2 zu machen.  Verdünnen Sie dann 10 μL des Vorrates #2 in 990 μL 50 % Ethanol zu 1 mL 367.13 nM Lager #3 machen.  Um funktionierende Aktien machen, verdünnen Sie 619.7 μL Lager #3 in 380,3 μL 50 % Ethanol zu 1 mL 227,5 nM arbeiten Lager Standardkurven mit Hefe mit dem Ausdruck ERα erstellt.  Verdünnen Sie 26.56 μL Lager #3 in 973.44 μL 50 % Ethanol zu 1 mL 9,75 nM arbeiten Lager Standardkurven mit Hefe mit dem Ausdruck ERβ erstellt. Dichtung mit Parafilm und bei-20 oder-70 ° C.
   Achtung: E2 ist ein Verdacht Karzinogen und reproduktive Schlüpfzeit. Es ist gesundheitsschädlich beim Einatmen, verschlucken oder durch die Haut absorbiert. E2 kann zu stillen Kinder und Föten schädigen. E2 ist sehr giftig für Wasserorganismen. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Abzugshaube, Staubmaske) und vermeiden Sie während der Schwangerschaft und Stillzeit. E2 als Sondermüll zu entsorgen und nicht in die Umwelt loslassen.
3. Bereiten Sie LacZ Puffer durch Mischen von 8,52 g Na₂HPO₄, 5,52 g NaH₂PO₄•H₂O, 95,21 mg MgCl₂, 745,5 mg KCl, 2 g N-Lauroylsarcosine-Natriumsalz, und entweder ONPG (400 mg) oder CPRG (77,7 mg) in entionisiertem Wasser, um eine endgültige Volumen 1 L. Store LacZ-Puffers in 20 mL Aliquote bei-20 ° C.
   Hinweis: Eine aliquote 20 mL ist ausreichend für eine 96-Well-Platte.
4. Bereiten Sie Natriumkarbonat durch Mischen 105,9 g Natriumcarbonat in entionisiertem Wasser zu einem Endvolumen von 1 L. Store bei RT
5. Bereiten Sie 1 M Dithiothreitol (DTT) in Wasser. Einfrieren von 25 µL-Aliquots von DVB-t bei-20 ° C.
   Achtung: DVB-t ist eine akute Haut- und reizend. Verwenden Sie geeignete persönliche Schutzausrüstung (Handschuhe, Abzugshaube, Staubmaske), um Haut- und Augenkontakt, Inhalation und Verschlucken zu vermeiden.
   Hinweis: Jeder Aliquote ist ausreichend für eine 96-Well-Platte.

2. Vorbereitung der Proben und Kontrollen der Extraktion

1. Wählen Sie Proben zu testen.
   Hinweis: Dieser Artikel stellt Daten für fünfzehn PCPs, wie Seife, Haarcreme, Shampoo, Sonnencreme, Lippenbalsam, Stiftung, Rasierschaum, Nagellack und Lotion.
2. 1 g der Probe mit 10 mL wasserfreiem Ethanol in einem 15 mL konische Röhrchen zu kombinieren. Bereiten Sie eine negative Extraktionskontrolle, bestehend aus 11 mL Ethanol in einem 15 mL konische Röhrchen. Bereiten Sie Wiederholungen, je nach Bedarf.
   Hinweis: Für die vorgestellten experimentellen Design, wurden drei Aliquote aller 15 PCP und dreifacher Extraktion Steuerungslösungen vorbereitet nachgeben insgesamt 48 Proben, von der jede in dreifacher Ausfertigung unter Verwendung des Protokolls in Abschnitt 4 analysiert wurde. Eine einzelne Platte bietet Platz für bis zu 23 Proben in Triplicates. Wasserfreiem Ethanol wird in diesem Schritt verwendet, da es leicht verdampft. Verwenden Sie negative Extraktion Steuerelemente, um sicherzustellen, dass Östrogene in Proben aus den konischen Rohren nicht ausgewaschen sind.
3. Rohr-Inhalt für 30 min zu homogenisieren, durch eine Kombination von manueller schütteln und aufschütteln oder durch Schütteln Röhren auf einem Multi-Rohr Vortexer.
4. Zentrifugieren Sie konische Rohre bei der maximal zulässigen Geschwindigkeit in einer Zentrifuge Eimer für 10 min. Dekantieren des Überstands von jedes Rohr durch ein Sieb 40 µm Zelle in ein 50 mL konische Röhrchen. Leeren Inhalt jedes 50 mL-Röhrchen in eine Glasflasche funkeln.
5. Lassen Sie Fläschchen öffnen in einem gelüfteten Abzug für eine Woche, um Ethanol zu vollständig zu verdampfen lassen. Alternativ trockenen Sie Proben in einem gelüfteten Abzug unter Stickstoff oder mit einem Drehverdampfer. Zur Vermeidung von Abbau von Licht empfindliche Bestandteile schützen Sie trocknen Proben vor Licht (z.B.Ort undurchsichtigen Stoff über belüftete Haube Tür).
6. Bereiten Sie Proben in 1,0 mL 50 % Ethanol und Wirbel zu homogenisieren.

(3) kultiviert und Subkultivieren Hefe¹⁴

1. Pflegen Sie aktiv Hefekulturen (rekombinante W303a Stamm von S. Cerevisiae¹⁴) durch Inkubation Hefe im Filter sterilisiert Glukose Medien bei 30 ° C. Subkultur Hefe wöchentlich frische Filter sterilisiert Glukose Medien.
2. Zwei Nächte (ca. 42 h) vor der Vorbereitung der Platten ja Subkultur Hefe durch Zugabe von 0,1 mL aktive Hefekulturen bis 10 mL des Filter-sterilisiert Glukose Medien mit steriler Technik.  Zwei Nächte bei 30 ° C inkubieren.  Schütteln ist nicht erforderlich, wenn Hefe als flache Kulturen in sterilen 250 mL Erlenmeyer Kolben angebaut werden.
   Hinweis: Hefe kann auch auf gekühlte Agarplatten mehrere Monate aufbewahrt werden. Für längere Lagerung (Jahre), mit 15-50 % steriles Glyzerin, Wirbel und Einfrieren bei-70 ° c O/N Kulturen verbinden Um sterile Glycerin vorzubereiten, mithilfe einer Spritze um 300 µL Glycerin zu einem Cryoröhrchen und Autoklaven mit der Kappe gelockert zu übertragen. Fügen Sie dann 1.200 µL O/N Hefekultur mit steriler Technik.

4. Vorbereitung ja Platten (1. Tag des Tests)

1. In einem sterilen Becher und mit steriler Technik, verdünnen Hefe aus Schritt 3.2 zu einer optischen Dichte von 0,065 ±0.005 bei 610 nm (OD₆₁₀) in Filter-sterilisiert Galaktose Medien.
   1. Optische Dichte durch Pipettieren 120 μL jeder Hefe-Probe in dreifacher Ausfertigung zusammen mit dreifacher Galaktose-Rohlinge in eine klare Polystyrol Platte bestätigen (Platte muss nicht steril sein).  Verwenden Sie eine Platte Spektralphotometer um zu überprüfen, ob die verdünnte Hefekultur hat ein Netto OD₆₁₀ 0,065 ±0.005 subtrahieren OD610 Lesungen von Galaktose Rohlinge aus Hefe OD₆₁₀ Lesungen Netto OD₆₁₀ der Hefe zu bestimmen. Jede 96-Well-Platte ein Endvolumen von mindestens 30 mL verdünnt Hefe vorbereiten.
      Hinweis: Spektralphotometer Filter Messung der Absorption von 595 bis 610 nm können für diese Messung verwendet werden.

Eine ungefähre 1:6 V: V Verhältnis von Hefe: Medien in der Regel ergibt sich ein OD-₆₁₀ in der Nähe von 0,065, also zunächst 30 mL Medien 4,5 mL Hefe hinzu und füge mehr Hefe oder Medien als angebracht, ein NetOD₆₁₀ 0.060 bis 0,070 zu erreichen.

Fügen Sie diese verdünnte Hefesuspension mithilfe sterilen Technik zum Brunnen von einem sterilen, Polypropylen, 96-Well Mikrotestplatte gemäß der Platte Layout (Abbildung 1). Die Quelle zu halten während pipettieren, Hefe Wanderprediger kontinuierlich wirbeln die Container oder mischen mit der Pipette. Für diesen Schritt ist es hilfreich, eine sich wiederholende Pipette mit einer sterilen Spritze Spitze zu verwenden.
Hinweis: Polypropylen-Platten sind durch Autoklavieren zwei gestapelten Platten in Folie verpackt sterilisiert.  Die obere Platte dient als Deckel für Probenteller kann gewaschen, Re-autoklaviert werden und wiederverwendet.

3 weitere Brunnen (H10 - 12) nach der Platte Layout (Abbildung 1) 120 µL Filter sterilisiert Galaktose Medien hinzufügen. Diese Vertiefungen dienen als Media-Steuerelemente, um Absorption von den Medien allein beigetragen zu berücksichtigen.

Eine Standardkurve in jeder Platte durch Verdünnung seriell Triplicates E2 Arbeitsstandards zu konstruieren (227,5 nM für ERα, 9,75 nM für ERβ) in Brunnen mit Hefesuspension (A1 - G3) gemäß der Platte Layout (Abbildung 1).  Zunächst durch Zugabe von 5 µL E2 Standards zu Wells A1 bis A3. Mischen Sie Microwell Inhalt durch pipettieren, und dann seriell verdünnen Sie diese Aussetzung durch den Umstieg von 205 µL von Brunnen A1 - 3 in Vertiefungen B1 - 3. Wiederholen Sie die Vermischung und Übertragung von 205 µL durch Zeile G.
Hinweis: Nachdem die serielle Verdünnung abgeschlossen ist, verwerfen Sie 205 μL aus Brunnen G1 - 3. Am Ende dieses Schrittes sollte alle standard Wells 120 μL enthalten. Die serielle Verdünnung erbringt die Endkonzentrationen E2 in Tabelle 1aufgeführt. Für die serielle Verdünnung Schritte ist es hilfreich, eine Mehrkanal-Pipette mit sterilen Tipps zu verwenden.

Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen mit Hefesuspension (H1 - 3) nach der Platte Layout (Abbildung 1) fügen Sie 5 µL des Fahrzeugs (50 % Ethanol hinzu).
Hinweis: Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen dienen zum Hintergrund Extinktion Hefezellen und Medien zugeordnet zu quantifizieren. Zudem testen Zytotoxizität oder Wachstum fördern Effekte Test Proben nachgewiesen werden können, durch den Vergleich der OD-₆₁₀ -Werte der Brunnen mit der Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen.

Brunnen mit Hefesuspension gemäß der Platte Layout (Abbildung 1) fügen Sie 5 µL Triplicates von Proben und negative Extraktion Steuerelemente hinzu.
Hinweis: Notieren Sie sich die Proben oder negative Extraktion Steuerelemente hinzugefügt in jede Vertiefung.  Überblick zu behalten welche Brunnen Proben müssen und welche nicht, beginnen Sie mit einer frischen Box Tipps und Tipps aus den gleichen Positionen im Feld als die Standorte der entsprechenden Vertiefungen in der Platte. Eine 96-Well-Platte bietet Platz für bis zu 23 Proben in dreifacher Ausfertigung.

Mischen Sie den Inhalt der Probe, Extraktionskontrolle und Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen durch pipettieren. Einstellen Sie Mengen an diesen Brunnen zu 120 µL durch 205 µL voneinander entfernen, wie in der Legende für Abbildung 1beschrieben.

Versiegeln Sie Chicoréeblätter mit einer sterilen, Klebstoff, poröse Folie. Platten-Label und 17 h bei 30 ° c inkubieren Die Platte muss nicht geschüttelt werden, während der Inkubation

5. Verarbeitung ja Platten (Tag 2 des Tests)

1. Entfernen Sie nach der 17 h Inkubation bei 30 ° C Platten aus dem Inkubator. Wenn Platten sofort verarbeitet werden, fahren Sie mit Schritt 5.1.1. Wenn Platten zu einem späteren Zeitpunkt verarbeitet werden, fahren Sie mit Schritt 5.1.2.
   1. Verwenden Sie, eine Mehrkanal-Pipette, um den Inhalt jeder Zeile der Brunnen zu mischen, und dann übertragen Sie 50 µL Hefesuspension aus jedem Brunnen auf den entsprechenden gut von einer klaren, Polystyrol, 96-Well Mikrotestplatte.
      Hinweis: Polystyrol-Platten nicht steril sein müssen, sondern sollte einen Deckel haben. Verwenden Sie neue Pipettieren Tipps für jede Zeile von Brunnen, um Kreuz-Kontamination Brunnen zu vermeiden, obwohl wenn über Triplicates mit einem 8-Tip Mehrkanal-Pipette pipettieren, Tipps nur zwischen dreifacher Sätze geändert werden müssen.
      1. Beschriften Sie die neue Platte. Fahren Sie mit Schritt 5.2.
   2. Um Platten vor der Verarbeitung zu speichern, wickeln Sie sie in Folie eingeschweißt. Kühlen Sie verpackte Platten bei 4 ° C für 6 d. danach die Platten aus dem Kühlschrank nehmen, packen Sie sie und übertragen den Inhalt alle Vertiefungen Pipettieren wie in Schritt 5.1.1. Fahren Sie mit Schritt 5.2.
2. 20 mL aufgetaut, Raumtemperatur LacZ Puffer für eine Endkonzentration von 1 mM DTT 20 µL 1 m DTT hinzufügen. Mix LacZ Puffer gut. Wenn eine Multi-Kanal-Pipette verwenden, in ein Reagenz Reservoir zu verzichten.
   Achtung: Tragen Sie Handschuhe und arbeiten mit DVB-t in eine Haube, wenn möglich
3. Mit entweder einer Mehrkanal-Pipette oder Pipette zu wiederholen, fügen Sie 200 µL des LacZ-Puffer mit DVB-t und ONPG oder CPRG in alle Vertiefungen der Polystyrol Platte hinzu und sofort messen Sie und zeichnen Sie der OD-₆₁₀ von allen Brunnen mit einer Platte Spektralphotometer auf. Wiederholen Sie bei Bedarf für zusätzliche Platten.
   Hinweis: Die OD-₆₁₀ -Lesungen sind im Nenner des LacZ-Berechnung (Schritt 6.1) verwendet. Aus diesem Grund erhalten die Messwerte sofort nach dem Pipettieren und vor Zellen absetzen oder durch LacZ Puffer lysiert werden. Wenn OD-₆₁₀ -Werte für Probe-Brunnen merklich höher oder niedriger als OD-₆₁₀ -Werte für Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen sind, sind die Probe-Extrakte wachstumsfördernde oder zytotoxische, Hefe, beziehungsweise. LacZ, die Berechnung zu korrigieren wird für kleine Unterschiede in der Zelldichten über Brunnen, aber, wenn Unterschiede 30 % in beide Richtungen übersteigen, dann die rekonstituierte Probe (ab Schritt 2,6) in zusätzliche 50 % Ethanol verdünnen und erneut testen die Probe durch die Rückkehr zu Schritt 3.2 ¹².
4. Platten mit einem Deckel abdecken. Inkubieren Sie Platten, die Hefe, dass ausdrückliche ERα¹⁴ bei 30 ° C für 40 min (für ONPG) oder 3 h (für CPRG). Inkubieren Sie Platten, die Hefe, dass ausdrückliche ERβ¹⁴ bei 30 ° C für 70 min (für ONPG) bzw. 4 h (für CPRG).
   Hinweis: Wenn Sie mit CPRG arbeiten, sind Inkubationszeiten flexibel; für 2-4 h Inkubation Ergebnissen geeignet mit beide Rezeptoren mit längeren Inkubationen Assay Empfindlichkeit zu erhöhen.
5. Nach Inkubation Platten, mithilfe einer Mehrkanal-Pipette oder wiederholten Pipette 100 µL Natriumcarbonat in jede Vertiefung hinzufügen. Natriumcarbonat erhöht den pH-Wert und die β-Galaktosidase Reaktion anhält.
6. Messung und Aufzeichnung der OD₄₀₅ (für ONPG) oder OD₅₇₄ (für CPRG) von allen Brunnen mit einer Platte Spektralphotometer.

6.LacZ-Werte berechnen

Hinweis: LacZ Werte quantifizieren den Grad der Farbenänderung für jede Probe und bieten eine normalisierte Methode für den Vergleich der Werte unter separaten Assays Buchhaltung für mehrere Variablen (z.B., Hefe optische Dichte Medien optische Dichte und Inkubation Zeit wenn Dies unterscheidet sich unter den Brunnen auf der gleichen Platte)¹².

1. Mittel, dreifacher OD-₆₁₀ -Werte für Medien (Galaktose) Kontroll-Vertiefungen (H10-12) zu berechnen und Transportmittel dreifacher OD₄₀₅ oder OD-₅₇₄ -Werte für Fahrzeug (50 % Ethanol) Steuerelemente (H1-3) zu berechnen. Verwenden Sie diese Mittel und die Inkubationszeit (t) in Stunden für die Platte um zu verfärben (Schritt 5.5) zur Berechnung LacZ-Werte (entsprechend dem Grad der Farbänderung in jede Vertiefung) für alle Standard und Probe Brunnen mit den folgenden Gleichungen:
   
   
   1. Alternativ verwenden Sie die automatisierte Anwendung in Anhang 1 LacZ Werte für Standards und Proben zu berechnen.
      Hinweis: Mit der Anwendung verwendete Platte-Layout muss identisch mit der Platte Layout in Abbildung 1dargestellt. Wenn einige Probe-Brunnen nicht verwendet wurden, behalten Sie Extinktion Lesungen aus den leeren Brunnen als Platzhalter in der Extinktion Dataset wird in Anhang 1 LacZ Anwendung eingefügt.  Dadurch werden die räumliche Anordnung der die Platte in der Anwendung und sorgt dafür, dass Medien-Kontroll-Vertiefungen in ihrem gewünschten Ort.  Darüber hinaus wird die Anwendung nicht ausgeführt, wenn leere Zellen vorhanden sind.
2. Mittel, dreifacher LacZ-Werte für jede E2-Norm und jede Probe zu berechnen. Bericht LacZ-Mittelwerte als µL^-1h^-1. Log-Transformation die Konzentrationen der einzelnen E2 standard, und erzeugen ein Tabellenkalkulationsdokument formatiert wie in der template.csv-Datei (Anhang 2).

7. Beispiel Estradiol-Äquivalente (EEQs) 4-Parameter logistische Regression mit Interpolation

Hinweis: EEQs LacZ Beispielwerte (Farbwechsel) beziehen sich auf die LacZ-Werte der Standardkurve erstellt mit E2. EEQs bestimmen, also wieviel Probe erforderlich, um die gleiche Farbe Änderung Antwort als eine bekannte Konzentration von E2 zu entlocken.

1. Zum Berechnen der EEQs für Prüflinge zuerst plot der Standardkurve. Passen Sie LacZ-Mittelwerte für E2-Standards (y-Achse) und die entsprechenden Log-transformierten E2 Konzentrationen (x-Achse) auf ein vier-Parameter logistische Regressionsmodell.
2. Verwenden Sie das Modell zur EEQs für Test Probe LacZ Werte interpolieren. Führen Sie logistische Regressionsberechnungen von EEQs mit Statistiksoftware wie in Anhang 2dargestellt.

8. EEQs (ng/mL), PCP Probe Masse Standardisierung

1. EEQs beziehen sich auf die Menge der PCP Probe hinzugefügt, um jeweils gut im Schritt 4.5, das Gesamtvolumen in die Probe Vertiefungen (325 µL) plattiert EEQ (ng/mL) multiplizieren und dividieren durch das Volumen des extrahierten Probe hinzugefügt in jede Vertiefung (5 µL).
   Hinweis: Diese Werte repräsentieren EEQ pro mL der entnommenen Probe. Wenn Proben 1 g von PCP zubereitet wurden, repräsentieren diese Werte auch EEQ pro Gramm von PCP (ng/g). Auf diese Weise ausgedrückt, können EEQ Werte (ng/g) über verschiedene PCPs EEQ (ng/g) Werte verglichen werden für die Körperpflege-Produkten getestet in dieser Studie sind in Tabelle 2gezeigt, und Sample-Daten gesammelt, während das gesamte Protokoll sind im enthalten Anhang 3.

Representative Results

Die Estrogenicities von dreifacher Proben von 15 PCPs wurden unter Verwendung dieses Protokolls ja ausgewertet. Wie bereits von Miller Et Al. (2010), waren Assays mit Hefe mit dem Ausdruck ERβ mehr als eine Größenordnung empfindlicher als Assays mit Hefe mit dem Ausdruck ERα (Abbildung 2)¹⁴. Aus diesem Grund wurde östrogene Aktivität öfter mit ERβ exprimierenden Hefe (Tabelle 2) erkannt. Acht wurden ausgestellt östrogene Aktivität mit ERβ und 5 PCPs östrogene Aktivität mit ERα ausgestellt. Haarcreme, Sonnencreme, Lotion und Lip Balm Proben wurden Östrogene mit beide Rezeptoren, Stiftung, Rasierschaum und Nagellack nur Östrogene mit ERβ in den geprüften Konzentrationen waren. Sieben andere PCP (4 Shampoos, 2 Seifen und 1 Lippenbalsam) wurden nicht mit entweder Rezeptor in den geprüften Konzentrationen Östrogene.

Neben den Rezeptor Sensitivität Unterschieden unterschieden sich die EEQs für jede Probe je nach farbmetrischen Substrat (ONPG oder CPRG) verwendet in der Probe (Tabelle 2). Alles in allem aber eine Probe waren EEQs mit ONPG bestimmt höher als die durch CPRG bestimmt. Darüber hinaus Unterschiede zwischen verschiedenen Extraktion repliziert wurde bei EEQs mit ERβ und CPRG gemessen am geringsten und höchsten für EEQs bestimmt mit ERα und ONPG (Tabelle 2).

Neben der kolorimetrischen Substrate zu vergleichen, war 1 Ziel der vorliegenden Studie Inkubation Laufzeiten zu testen, die kompatibel mit dem Zeitplan von einem Bachelor Praktikum sind. Der typische ja Test erfordert eine 17 h Inkubation sofort Inkubation im LacZ Puffer für 40 min - 4 h, einen Zeitplan folgt, der nicht in eine Lehre Labor eingeschränkt durch einen einzigen wöchentlichen Sitzung umsetzbar ist. Zur Nutzung des Assays im Unterricht zu erleichtern, wurde der Test durch die Einführung einer 6D Kälte-Periode (Schritt 5.1.2) nach 17 h Inkubation geändert. Standardkurven von gekühlten Platten waren vergleichbar mit denen von Platten nicht gekühlt (Abbildungen 2 & 3), außer dass die Standardfehler der Parameter anhand der vier Parameter logistische Regressionsmodelle geschätzt alle waren kleinere für gekühlten Platten als für Thekemodule Platten (Tabelle 3). So kühl-Platten für 6D reduziert Fehler und verbessert die Genauigkeit der EEQ Schätzungen.

Abbildung 1: MicroWell Platte Layout und Standard Verdünnung Kurve Vorbereitung ja Assay. E2-Standards (graue Lichtschächte), Proben und negative Extraktion Steuerelemente (weiße Brunnen) und Fahrzeug (H1 - 3) und Galaktose Medien (H10 - 12) Steuerelemente (dunkel grau Brunnen) wurden in dreifacher Ausfertigung getestet. Eine Standardkurve E2 (graue Lichtschächte) errichtet durch Ausplattieren 320 µL der Hefe in Vertiefungen A1 bis A3 und 120 µL der Hefe in Vertiefungen B1 durch G3. Dann 5 µL E2 (227,5 nM für die Hefe, das express ERα; 9,75 nM für die Hefe, das express ERβ) wurden hinzugefügt, um die Hefe in Brunnen A1 bis A3. Die Hefe + E2 Fahrwerk wurde durch die Übertragung von 205 µL aus jedem Brunnen zum Brunnen darunter nachgeben der Endkonzentrationen E2 in Tabelle 1aufgeführten seriell verdünnt. Beachten Sie, dass am Ende des Prozesses serielle Verdünnung, 205 µL aus Brunnen G1 bis G3 zu einem Endvolumen von 120 µL in jede Vertiefung verworfen werden muss. Probe und negative Extraktion Kontroll-Vertiefungen waren 320 µL der Hefe durch Zugabe von 5 µL jeder Extrakt (in 50 % igem Ethanol gelöst) bereit. Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen (H1 - 3) wurden vorbereitet, indem man 5 µL 50 % Ethanol, 320 µL der Hefe. Alle Probe und Kontrolle Brunnen wurden durch Pipettieren gemischt, und 205 µL wurden entfernt und verworfen, um auch Bände über 120 µL anpassen. Zu guter Letzt wurden Mediensteuerungen vorbereitet durch Ausplattieren 120 µL Galaktose Medien in Vertiefungen H10 - 12.  Um die LacZ-Rechner in Anhang 1 und die R-basierte Anwendung, die in Anhang 2, E2 beschrieben verwenden müssen Standardkurve und Fahrzeug und Galaktose Mediensteuerungen überzogen werden, wie gezeigt.  Proben und Kontrollen negative Extraktion können in eines der weißen Brunnen überzogen werden, solange die Reihenfolge der Beschichtung vermerkt ist.  Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 2: Standard Kurven für die ja-Platten erzeugt über 4-Parameter logistische Regression. Zwei Substrate (ONPG & CPRG) wurden getestet, mit Hefe, die mit dem Ausdruck einer von zwei menschlichen Östrogen-Rezeptoren (ERα und ERβ) beide ohne (A) und (B) eine 6D Kältetechnik Zeit nach 17 h Inkubation mit 17β-Östradiol und Probe extrahiert. Alle E2 Standards und Medien und Fahrzeug Kontrollen wurden in dreifacher Ausfertigung getestet. Punkte stellen dreifacher LacZ-Werte, wo LacZ Werte den Grad der Farbänderung durch β-Galaktosidase induziert reflektieren. Logistische Regression Modellparameter sind in Tabelle 3aufgeführt. ONPG = ortho- Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside; CPRG = Chlorphenol rot-β-D-Galactopyranoside. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Abbildung 3. Beispiele für entwickelten ja Platten. Zwei Substrate (ONPG & CPRG) wurden getestet, mit Hefe, die mit dem Ausdruck menschlichen Östrogen-Rezeptoren (ERα und ERβ), entweder ohne (links) und mit (rechts) eine sechs-Tage-Kältetechnik Zeit nach 17 h Inkubation mit 17β-Estradiol oder Probe extrahiert. Alle E2-Standards, Medien und Fahrzeug Kontrollen wurden in Triplicates getestet. Platten wurden mit der höchsten Konzentration der E2 in der obersten Zeile der einzelnen Platte und Kontrollen (50 % Ethanol + Hefe auf der linken Seite und Galaktose Medien auf der rechten Seite) in der unteren Zeile jeder Platte gemäß Abbildung 1angeordnet. ONPG = ortho- Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside; CPRG = Chlorphenol rot-β-D-Galactopyranoside.Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur.

Standardnummer	[E2] für ERα Hefe (pM)	[E2] für ERβ Hefe (pM)
1	3500	150
2	2208	94,6
3	1393	59,7
4	878	37,6
5	554	23,7
6	349	15
7	220	9.45 Uhr

Tabelle 1. Endgültige Konzentrationen von E2 verwendeten Standards im ja.
Pulverisierte E2 wurde in wasserfreiem Ethanol gelöst und dann verdünnt, um arbeiten auf Konzentrationen von 227,5 nM (für die Hefe, das express ERα) und 9,75 nM (für die Hefe, das express ERβ) in 50 % igem Ethanol.Arbeiten Aktien wurden dann auf Mikrotestplatte Brunnen hefehaltigen in Galaktose Medien und seriell verdünnt, um die Konzentrationen, die in der Tabelle dargestellt.

Untersuchten Proben		Assay-Bedingungen		PCP-Östrogene Entsprechungen (EEQs)
PCP #	Probenart	Rezeptor	Substrat	EEQ 1 (ng/g)	EEQ 2 (ng/g)	EEQ 3 (ng/g)	Meine EEQ (ng/g)
1	Haarcreme	ERΑ	ONPG	ND	0.379	ND	< 0.379
1	Haarcreme	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
1	Haarcreme	ERΒ	ONPG	0.528	0.338	0.363	0.410
1	Haarcreme	ERΒ	CPRG	ND	0.215	ND	< 0.215
4	Sonnenschutz	ERΑ	ONPG	6.803	1.390	ND	< 4.097
4	Sonnenschutz	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
4	Sonnenschutz	ERΒ	ONPG	1.321	0.838	0.818	0.992
4	Sonnenschutz	ERΒ	CPRG	0.651	0.591	0.725	0.656
7	Stiftung	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
7	Stiftung	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
7	Stiftung	ERΒ	ONPG	ND	0.158	ND	< 0.158
7	Stiftung	ERΒ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Shave Creme	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
9	Shave Creme	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Shave Creme	ERΒ	ONPG	ND	0.256	0,295	< 0.276
9	Shave Creme	ERΒ	CPRG	0.507	0.392	0.560	0.486
10	Nagellack	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
10	Nagellack	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
10	Nagellack	ERΒ	ONPG	0.916	0.503	0.554	0,658
10	Nagellack	ERΒ	CPRG	0.532	0.628	0.594	0,585
11	Lotion	ERΑ	ONPG	ND	ND	2.327	< 2.327
11	Lotion	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
11	Lotion	ERΒ	ONPG	Überschreitet Bereich	2.599	1.845	> 2,222
11	Lotion	ERΒ	CPRG	--	1.986	1,236	1.611
13	Sonnenschutz	ERΑ	ONPG	14.069	11.494	10.189	11.917
13	Sonnenschutz	ERΑ	CPRG	4.773	5.790	5.850	5.471
13	Sonnenschutz	ERΒ	ONPG	Überschreitet Bereich	2.580	Überschreitet Bereich	> 2.580
13	Sonnenschutz	ERΒ	CPRG	0.292	0,240	ND	< 0,266
15	Lippenbalsam	ERΑ	ONPG	ND	ND	0.431	< 0.431
15	Lippenbalsam	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
15	Lippenbalsam	ERΒ	ONPG	1.202	1.060	0.887	1.050
15	Lippenbalsam	ERΒ	CPRG	0.820	0.871	0.851	0.847

Tabelle 2: EEQs von PCP mit Null-EEQs. Drei Aliquote 15 PCP und drei Extraktion Steuerelemente wurden homogenisiert in wasserfreiem Ethanol verdampft und in 50 % igem Ethanol für insgesamt 48 Proben, von denen jeder wurde analysiert, in dreifacher Ausfertigung mit den ja-Assay rekonstituiert. Acht PCPs hatte mindestens 1 ungleich Null EEQ während 7 PCPs Östrogene bei den getesteten Konzentrationen werden nicht gefunden wurden. EEQ 1, EEQ 2 und EEQ 3 beziehen sich auf die drei Aliquote von jeder PCP, jeweils in dreifacher Ausfertigung auf einer separaten Platte getestet. Werte für EEQ 1, EEQ 2 und EEQ 3 sind die Triplicates für jedes aliquoten. Hefe verwendet in der Probe ausgedrückt 1 2 Isoformen von menschlichen Östrogen-Rezeptoren (ERα und ERβ). Beiden farbmetrischen Substrate, ONPG und CPRG, wurden getestet unter Verwendung des Protokolls nicht gekühlt. EEQs wurden über vier Parameter logistische Regressionen (mit R² Werte ≥ 0,98) des LacZ Werte an jedem der 7 Konzentrationen von E2 ermittelt. ND = unterhalb der Nachweisgrenze des Tests.--= verloren replizieren.

Assay-Bedingungen			Modellparameter
Rezeptor	Substrat	Festnahme bei 4 ° C für 6 d	Modell R2	Wachstumsrate (LacZ Einheiten/ng/ml)	Wendepunkt (ng/mL)	Unteren Asymptote (LacZ Einheiten)	Obere Asymptote (LacZ Einheiten)
ERΑ	ONPG	Nein	> 0,99	8.548 ±1.633	-0.512 ±0.025	-1.623 ±4.408	128.11 ±6.31
ERΑ	ONPG	JA	> 0,99	7.618 ±0.758	-0.587 ±0.014	-8.378 ±2.223	99.53 ±2.528
ERΑ	CPRG	Nein	> 0,99	8.256 ±2.182	-0.610 ±0.033	0.853 ±3.333	62.52 ±3.473
ERΑ	CPRG	JA	> 0,99	5.068 ±0.616	-0.523 ±0.022	-3.147 ±1.946	68.06 ±3.069
ERΒ	ONPG	Nein	> 0,99	1.041 ±2.004	-0.898 ±4.410	-32.98 ±86.62	248.6 ±778.9
ERΒ	ONPG	JA	> 0,99	4.327 ±1.289	-1.736 ±0.087	4.654 ±3.087	66.37 ±10.75
ERΒ	CPRG	Nein	= 0,99	5.673 ±1.764	-1.914 ±0.052	3.925 ±1.679	28,05 ±2.334
ERΒ	CPRG	JA	> 0,99	4.412 ±1.142	-1.894 ±0.051	2.052 ±1.303	22.64 ±2.047

Tabelle 3. Modellparameter der 4-Parameter logistische Regressionen für die Standard Kurven in Abbildung 2. Zwei Substrate, ONPG und CPRG, wurden mit Hefe 1 von 2 menschlichen Östrogen-Rezeptoren (ERα und ERβ) auszudrücken, sowohl ohne als auch mit einer sechs-Tage-Kältetechnik nach 17 h Inkubation untersucht. Parameter werden als schätzt ±standard Fehler gemeldet.

Anhang 1. Anwendung für die Berechnung der Werte LacZ.  Um die Anwendung zu verwenden, zunächst herunterladen Sie kostenlose Java-Software (wie in Tabelle of Materials). Öffnen Sie dann die LacZ-Anwendung. Mit der Anwendung verwendete Platte-Layout muss identisch mit der Platte Layout in Abbildung 1dargestellt. Wenn einige Probe-Brunnen nicht verwendet wurden, behalten Sie Extinktion Lesungen aus den leeren Brunnen als Platzhalter in der Extinktion Dataset in die LacZ-Anwendung eingefügt werden.  Dadurch werden die räumliche Anordnung der die Platte in der Anwendung und sorgt dafür, dass Medien-Kontroll-Vertiefungen in ihrem gewünschten Ort.  Darüber hinaus wird die Anwendung nicht ausgeführt, wenn leere Zellen vorhanden sind. Einfügen in OD₄₀₅ Lesungen (ONPG) oder OD₅₇₄ Lesungen (für CPRG) von allen Brunnen mit Tastaturbefehl "Strg (Ctrl) + V" oder "Befehl + V," abhängig von der Computerplattform verwendet wird. Geben Sie den Betrag der Inkubationszeit in Stunden für den Assay, Farbe zu produzieren (ab Schritt 5.4; z. B. 0,66667 h 40 min). Klicken Sie auf weiter. Fügen Sie in OD₆₁₀ Lesungen aus Schritt 5.3. Klicken Sie auf Absenden. LacZ Ergebnisse werden angezeigt und können durch Drücken von "Strg (Ctrl) + c" oder "Befehl + C," je nach der verwendeten Rechnerplattform kopiert werden. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Anhang 2. Statistik-Software-Optionen für die Berechnung der EEQs. EEQs kann mit einer der drei vorgestellten Optionen berechnet werden.  Anweisungen für die Anwendung 1. JMP-Software oder 2. R-Code sind in der Anlage 2 zur Verfügung gestellt.  R-Code wurde auch auf 3 umgestellt. ein Anwendungsformat an https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/ erhältlich. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Anhang 3. Probieren Sie Daten mittels Hefe, dass Express ERα und CPRG als Substrat erhoben. Messungen von₆₁₀ OD OD₅₇₄ für jede der sieben E2-Standards, Fahrzeug und Medien-Steuerelemente und einer einzigen repräsentativen PCP zusammen mit berechneten LacZ-Werte enthalten. LacZ Werte Normen wurden verwendet, um ein vier-Parameter logistisches Regressionsmodell der Standardkurve zu konstruieren, wie beschrieben in Schritte 7A & B oben. Das Modell wurde zur dreifacher Schätzungen der EEQs der repräsentativen Stichprobe in ng/mL in die Mikrotestplatte Brunnen zu interpolieren. Diese Werte wurden dann in EEQs ausgedrückt in ng/g der Probe (Schritt 8.1) konvertiert. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterladen.

Discussion

Das ja ist eine kostengünstige Methode um Östrogene Liganden in Umweltproben, wie Wasser, Nahrung, Pflanzengewebe oder Körperpflege-Produkte zu erkennen. Daten hier vorgestellten vergleichen 2 Östrogen-Rezeptoren (ERα und ERβ), 2 Substrate (ONPG und CPRG) und 2 Fristen (2 d Protokoll ohne Kühlung) und sieben-Tage-Protokoll mit Kühlung für die Messung von Östrogenität in Körperpflegeprodukten über ja-Assay. Die 7D, gekühlte Protokoll mit CPRG und Hefe mit dem Ausdruck ERα und ERβ am besten quantifiziert EEQs, während auch kompatibel mit dem Zeitdruck durch Bachelor Laborkursen aufgezwungen, die nur einmal erfüllen / Woche für mehrere Stunden. In der Tat war im Vergleich zu den 2 d-Assay ohne Kühlung, die siebentägige gekühlte Assay verbunden mit geringeren Varianz über Platte repliziert. Darüber hinaus wurde der lineare Teil der Standardkurve für Daten, die mit der gekühlten Test leicht erweitert. Die lineare Teil der Standardkurve Assay Erfassungsbereich definiert und ist der einzige Teil der Standardkurve, die verwendet werden kann, zum Beispiel EEQs zu interpolieren.

Alles in allem aber eines der getesteten Proben waren EEQs CPRG anhand niedriger als die mit ONPG quantifiziert. Mit einem höheren Aussterben Koeffizienten und untere K_m und V_maxist CPRG zehnmal empfindlicher als ONPG¹⁷. So CPRG bei niedrigeren Konzentrationen eingesetzt werden und kann verwendet werden, um geringere Mengen an β-Galaktosidase zu erkennen. Aus diesen Gründen ist ONPG^18,19CPRG in der Regel vorzuziehen. Mehr Substrat Sensibilität erklärt jedoch nicht die niedrigeren EEQ-Werten mit CPRG erkannt. Die höheren EEQ Werte erkannt mit ONPG könnte aufgrund einer Störung der Matrix mit dem Assay, wie bereits von anderen Autoren^2,18. Gelbe Pigmente aus Körperpflege Produkt Extrakte konnte EEQ Werte erkannt mit ONPG aufzublasen. Andere haben dieses Problem umgangen, indem einschließlich der Pigment-Kontrollen in ihrer experimentellen Design², ein Ansatz, der die Anzahl der Platten in einem Experiment verdoppelt. Wenn Matrix Störungen problematisch sein kann, möglicherweise CPRG vorzuziehen Substrat für die ja-Assay, obwohl es teurer und längere Inkubationszeiten als ONPG erfordert. Darüber hinaus ist der Farbwechsel, induziert durch die Spaltung des Substrats durch β-Galaktosidase dramatischer mit CPRG, machen es einfacher für Studenten, Ergebnisse zu visualisieren.

Miller Et al. (2010), wer entwickelt, die in diesem Protokoll verwendeten Hefe, zur Kenntnis genommen, dass Hefe mit dem Ausdruck ERβ 30 X empfindlicher auf 17β-Estradiol als Hefe ERα, untermauert durch unsere Daten¹⁴Feststellung zum Ausdruck zu bringen waren. Abgesehen von möglichen Nuancen im Plasmid Bau, Miller Et al. (2010) konnte nicht erklären, dass dieser Unterschied in der Empfindlichkeit¹⁴. Ein Unterschied zwischen den beiden Plasmid-Konstrukte ist, dass Galaktose, ERα Ausdruck geregelt ist, ERβ Ausdruck von Glukose oder Galaktose geregelt ist. Die Hefe in den ja-Assay verwendet werden in Glukose Medien kultiviert und Galaktose nur gegeben, wenn sie zu Beginn des Tests verdünnt werden. Hefe mit dem Ausdruck ERβ könnte daher höhere Heftnummern der Rezeptor-Proteine vor Beginn des Tests, dadurch höhere Empfindlichkeit gegenüber Östrogenen Liganden konferieren ansammeln.

Die geringere Empfindlichkeit des ERα exprimierenden Hefe mag erklären, die höheren Preise der nicht-Erkennung von Östrogenität in Proben mit ERα im Vergleich zu ERβ. Um die Wahrscheinlichkeit zu erhöhen wird, die Probe EEQs erkannt, Benutzer beschäftigen verschiedene Extraktionslösungsmittel und Methoden oder die Hefe höhere Volumen der Probe hinzufügen könnte. Wenn höhere Probenvolumina verwendet werden, sollte die Konzentrationen von E2-Standards angepasst werden, so dass die gleiche Menge an Standards und Proben im Test verwendet werden kann. Eine Einschränkung der Zugabe mehr Probe ist, dass Hefe nur 6-10 % Ethanol, mit besseren Verträglichkeit bei Inkubation Temperaturen von 30 Vs. 35 ° C²⁰tolerieren kann. Um Effekte von Ethanol auf Hefe zu steuern, sollte Ermittler die Platte Layout dreifacher "Hefe nur" Quellen hinzufügen und bestätigen, dass der OD-₆₁₀ "Hefe nur" Brunnen vergleichbar mit der OD-₆₁₀ von Fahrzeug-Kontroll-Vertiefungen sofort nach der Zugabe des LacZ-Puffers. Alternativ können Proben in Ethanol gelöst hinzugefügt werden, zu den trockenen Microwell-Platten und das Ethanol verdampft ausschalten bevor Hefe hinzugefügt. Dimethylsulfoxide (DMSO) dient auch als Probe Lösungsmittel in ja Tests, aber die Endkonzentration Arbeiten von DMSO mit Hefe auf 1 %¹²beschränkt werden sollte.

Die ja-Assay ist ein leistungsfähiges Screening-Instrument zur Erfassung von Östrogenität in Umweltproben. Insbesondere erkennt das ja Liganden, die nukleare Östrogen-Rezeptoren binden, die mit Östrogen-Response-Elemente gen Ausdruck¹⁴direkt interagieren. Allerdings hat das ja auch wichtige Einschränkungen. Das ja erkennt keine EBS, die Arbeiten durch nicht-nuklearen Mechanismen wie Membran Östrogen-Rezeptoren oder Mechanismen, bei denen zusätzliche Elemente wie Transkriptionsfaktoren Activator Protein 1 (AP-1). Darüber hinaus da Hefe haben nicht die gleichen metabolische Kapazität als Säugerzellen, kann das ja Liganden nicht erkennen, die Stoffwechselaktivierung Östrogene zu erfordern.

Darüber hinaus kann nicht der Test ja Östrogene und Anti-Östrogene Liganden in komplexen Proben leicht unterscheiden. Stattdessen misst es net Östrogenität, die Summe der Östrogene und Anti-Östrogene Liganden bewirkt. Um die Konzentration von ER-Antagonisten zu quantifizieren oder bewerten der inhibitorischen Aktivität von Mischungen, kann der Test durch Inkubation Hefe mit der standard-Agonist (17β-Estradiol) und eine Reihe von Test Probe Konzentrationen¹²geändert werden. Dieser Prozess stellt fest, ob Antagonisten in den Proben Reporter Agonist-induzierte Aktivität vermindern können und bietet eine nützliche-Bildschirm für das Vorhandensein von ER-Antagonisten in Proben zu identifizieren.

Die hier vorgestellten Protokoll kann eine Vielzahl von Probenarten, unterbringen, obwohl einige Proben Änderungen an die Extraktion und Probe Vorbereitungsschritte erfordern. Beispielsweise EEQs sehr unterschiedlich zu der einige Körperpflegeprodukte repliziert. Variablen Proben tendenziell Öltröpfchen enthalten oder anderweitig nicht völlig homogen ist, darauf hinweist, dass mehr lipophilen Lösungsmittel wie Diethylether hilfreich wäre. Alternativ könnten Ölen und Wachs in Körperpflege-Produkten ausgeschlossen werden, durch die Gewinnung von Proben mit 50 % Ethanol anstelle von 100 % igem Ethanol.Eine 50 %-Ethanol-Extraktion wird auch mehr Wasser lösliche Östrogene Liganden (z.B. einige Pigmente) erfassen. Allerdings 50 % Ethanol langsamer als 100 % Ethanol verdampft und somit Extraktionszeit verlängern kann. Darüber hinaus wurden einige Proben (z. B. Seifen) zytotoxische, Hefe, was zu reduzierten Zelle Dichtemessungen (OD₆₁₀). Fox Et al. (2008) deuten darauf hin, dass solche Proben sollten verdünnt und erneut getestet, wenn Zelle Dichteunterschiede mehr 30 als % im Vergleich zum Fahrzeug Kontrolle Brunnen¹².

Wenn ja-Assay für analytische Zwecke verwendet wird, können Kurven Verdünnung der Probe Pools getestet werden soll präventiv entsprechende Mengen an Extrakt, Hefe im Schritt 4.5 hinzugefügt werden soll. Alternativ können Auszüge gleichzeitig auf mehrere Volumes (z.B., 5 µL und 20 µL Extrakt, Hefe im Schritt 4.5 hinzugefügt) getestet oder Verdünnungen, die Größenordnungen (z.B., 0,2 µL 2 µL und 20 µL) umfassen. "Angemessen" Bände des Extraktes sind diejenigen, die Östrogenität zu identifizieren, indem passende LacZ Werte entlang den linearen Teil der Standardkurve. Optimierung wird verhindert, dass Probleme, die durch Zugabe von zu viel oder zu wenig Probe auf der Hefe, wie Zytotoxizität, falsche negative oder Östrogenität, die die Standardkurve überschreitet. Wie oben erwähnt, sollte die Volumen der Proben und E2 Standards angepasst werden, wenn unterschiedliche Mengen an Liganden verwendet werden, so dass Hefe ausgesetzt sind eine einheitliche Lautstärke und Konzentration von Ethanol oder ein anderes Fahrzeug auf den Teller legen.

Trotz des Potenzials für falsche negative wurde ja Assay als einem Tier 3-Test-Tool für endokrine Disruptoren durch Schug Et Al. identifiziert (2013), entwickelt, die eine umfassende Tiered Protokoll für endokrine Störungen (TiPED)²¹. Für undergraduate-Ausbildung ist der Test für Unterrichtskonzepte im Zusammenhang mit endokrinen Störungen, Zellkultur, Rezeptorbindung, Enzymaktivität, Gentechnik, Statistik und Versuchsplanung. Studierende, die den Test verwenden üben auch grundlegende und breit anwendbar Labor wie seriell verdünnen Normen; Gewinnung von Proben; Herstellung von Lösungen; Bau und Interpolation Standardkurven; Berechnung der Konzentrationen; Herstellung von Lösungen; sterilen Technik demonstrieren; Kultivierung von Zellen; Ermittlung von Variablen und Kontrollen; sammeln, organisieren und analysieren von Daten; Aufbau und Interpretation der Graphen; und mit gemeinsamen Laborgeräte wie Mikroliterpipetten und Spektralphotometer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Vortex Mixer (for single or multiple tubes)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-215-365	Any mixer will suffice.
Bucket centrifuge	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	75-063-839	Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
Bunsen burner	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	17-012-823	Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
Incubator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	50125590H	Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
Microplate reader	BioTek (www.biotek.com)	EPOCH2	A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
Gen5 microplate reader and imager software	BioTek (www.biotek.com)	GEN5	Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
Refrigerator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05LREEFSA	Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-681-15E	Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
P10 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144562G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
P200 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144565G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
P300 multichannel pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FBE1200300	Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
Repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164001G	Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Sterile 15 mL conical tubes with caps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05-539-801
Glass scintillation vials	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	03-337-4
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12565501
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid	Cole-Parmer (www.coleparmer.com)	EW-01728-81
100 mL glass beakers	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-539H	Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
250 mL glass Erlenmeyer flasks	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB500250	Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
Sterile, adhesive, porous film	VWR (www.vwr.com)	60941-086
Metal forceps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12-000-157	Any metal forceps will suffice.
Reagent reservoir	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	07-200-127
Filtration units (0.2 µm)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	09-761-52
Squirt bottle (for ethanol)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-897-10	Any laboratory squirt bottles will suffice.
Autoclavable storage bottles	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	06-414-1D	Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
10 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27F	Any glass serological pipets will suffice.
1 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27C	Any glass serological pipets will suffice.
P10 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-3810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P200 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-8810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P300 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-9810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
Syringe tips for repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164150G	Only required if a repeating pipettor is used.
Sterile petri dishes	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB0875712	Any sterile petri dishes will suffice.
Parafilm	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	S37440
Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a)	American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)	MYA-151	Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
Receptor/reporter plasmid for ERα	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)
Receptor/reporter plasmid for ERβ	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Difco agar	BD (www.bd.com)	214530
Dithiothreitol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	D0632	CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	N1127
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	10884308001
Yeast nitrogen base	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	Y0626
Glucose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G8270
Galactose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G5388
Adenine sulfate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	A9126
Uracil	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	U0750
Leucine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L8000
Histidine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	H8000
17 β-Estradiol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals	E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg	CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
100% ethanol	Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)	111000200
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S9638
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S0876
Magnesium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	M8266
Potassium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	P9333
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L5125
Sodium carbonate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S7795
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Excel spreadsheet software	Microsoft		Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
Java software (required for Appendix 1 application)	Oracle Corporation		To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
JMP statistical software version 13.0.0	SAS Institute		Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
R statistical computing and graphics software	R Foundation		Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.