Opsporen van oestrogene liganden in verzorgingsproducten met behulp van een gist oestrogeen scherm geoptimaliseerd voor het Undergraduate Onderwijs laboratorium

Summary

Dit artikel presenteert een geoptimaliseerde gist oestrogeen scherm voor het kwantificeren van liganden in producten voor persoonlijke verzorging (PCP) die oestrogeen receptoren alpha (ERα) en/of bèta (ERβ binden). De methode omvat twee opties van de colorimetrische substraat, een zes-daagse gekoelde incubatie voor gebruik in undergraduate cursussen, en statistische hulpmiddelen voor gegevensanalyse.

Abstract

De gist oestrogeen scherm (Ja) wordt gebruikt voor het detecteren van oestrogene liganden in milieu monsters en is in grote lijnen toegepast in studies van endocriene verstoring. Oestrogene liganden omvatten zowel natuurlijke als door de mens veroorzaakte "milieu oestrogenen" (EWS) gevonden in vele consumptiegoederen, met inbegrip van producten voor persoonlijke verzorging (PCP), plastics, pesticiden en voedingsmiddelen. EWS verstoren hormoon signalering bij mensen en andere dieren, potentieel vermindering van de vruchtbaarheid en verhoging van ziekterisico. Ondanks het belang van de EWS en andere endocriene verstoren chemische stoffen (EDCs) voor de volksgezondheid, is hormoonontregeling niet typisch in undergraduate curriculum opgenomen. Deze tekortkoming is deels te wijten aan een gebrek aan relevante laboratoriumactiviteiten die de beginselen illustreren betrokken terwijl het ook voor studenten toegankelijk wordt. Dit artikel presenteert een geoptimaliseerde ja voor het kwantificeren van liganden in verzorgingsproducten die oestrogeen receptoren alpha (ERα) en/of bèta (ERβ binden). De methode omvat een van de twee colorimetrische substraten (ortho- nitrofenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) of chloorfenol rood-β-D-galactopyranoside (CPRG)) dat zijn gekloofd door β-galactosidase, een 6-daagse gekoelde incubatie stap naar gebruik in undergraduate laboratorium cursussen, een geautomatiseerde toepassing voor LacZ berekeningen en R-code voor de bijbehorende 4-parameter logistische regressieanalyse te vergemakkelijken. Het protocol is ontworpen om studenten te ontwikkelen en uit te voeren van de experimenten waarin ze producten van hun keuze voor oestrogeen nabootsers scherm. In het proces leren ze over hormoonontregeling, cultuur van de cel receptor bindende, enzymactiviteit, genetische manipulatie, statistieken en experimenteel design. Tegelijkertijd, zij ook praktijk fundamentele en breed toepasbare laboratorium vaardigheden, zoals: berekening van de concentraties; het maken van oplossingen; tonen steriele techniek; serieel verdunnen normen; bouw en interpoleren standaard curven; identificeren van variabelen en besturingselementen; verzamelen, ordenen en analyseren van gegevens; bouw en interpreteren van de grafieken; en het gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur zoals micropipettors en spectrofotometers. Zo, ter uitvoering van deze test moedigt studenten deelnemen aan onderzoek gebaseerde leren tijdens het verkennen van de opkomende problemen in milieuwetenschappen en gezondheid.

Introduction

De gist oestrogeen scherm (Ja) is gebruikte te kwantificeren liganden die na te bootsen van estradiol (E2 of 17β-estradiol) in een verscheidenheid van matrices, met inbegrip van water, plantaardige weefsels, consumentenproducten en levensmiddelen^{1,2,3, 4}. Collectief, dergelijke liganden worden hierna aangeduid als "Milieu oestrogenen (EWS)." Ja werd oorspronkelijk ontwikkeld als een lage kosten, in vitro -alternatief voor in vivo tests zoals de knaagdier uterotrophic assay^5,6 en de regenboogforel voederen assay⁷. Het doel van deze tests is om te bepalen of een product bevat chemische stoffen die stimuleren of blokkeren van oestrogeen-afhankelijke mechanismen. Detectie van de EWS is kritisch, omdat ze met de normale endogene oestrogeen signalering interfereren kunnen, met name tijdens de foetale ontwikkeling. Deze inmenging compromissen gezondheid door het risico van obesitas, onvruchtbaarheid, kanker en cognitieve verlies⁸vergroten.

Ondanks het belang van de EWS en andere EDCs voor de volksgezondheid, is hormoonontregeling niet vaak in undergraduate curriculum opgenomen. Deze tekortkoming is deels te wijten aan een gebrek aan activiteiten die de beginselen illustreren betrokken terwijl het ook voor studenten toegankelijk wordt. Bovendien verschillende varianten van de ja-protocol bestaat^{9,10,11,12,13}, en deze diversiteit maakt assay optimalisatie tijdrovend voor laboratorium coördinatoren niet specifiek opgeleid in de relevante technieken. Tot slot, ja testen zijn meestal afgerond meer dan 1 lange dag of 2 opeenvolgende dagen met een incubatie O/N. Deze timing is niet compatibel met de indeling van undergraduate laboratorium cursussen, die gewoonlijk eens ontmoeten / week voor enkele h.

In reactie op deze behoeften meldt dit manuscript een geoptimaliseerde 96-Wells ja protocol waarin ethanolbevattend extractiemethoden voor persoonlijke verzorgingsproducten (PCP)³ en een 6-daagse koeling stap voor de wekelijkse vergaderingen van het laboratorium. Absolute ethanol is een veelzijdige organische oplosmiddelen die een verscheidenheid van polaire en apolaire opgeloste stoffen kan ontbinden. Bovendien is het geschikt voor undergraduate cursussen, want het is gemakkelijk beschikbaar, relatief niet giftig, betaalbare en mengbaar zijn met water; ook is het gemakkelijk verdampt zonder speciale apparatuur. Echter, ethanol is niet ideaal voor het extraheren van sterk hydrofoob endocriene verstoorders of veel oliën en wassen, de laatste twee zijn gemeenschappelijke ingrediënten in eerstelijnszorg. slechte extractie-efficiëntie verhoogt het risico van valse negatieve resultaten. Met deze beperking in gedachten moeten onderzoekers Kies extractie procedures (b.v., ethanolbevattend extractie of vaste fase extractie) dat monster adreskenmerken en studie doelstellingen (onderzoek versus undergraduate instructie).

Ja, is afhankelijk van recombinant Saccharomyces cerevisiae Oorspronkelijk aangemaakt door Dr. Charles Miller aan de Tulane Universiteit. Gelieve te zien Miller et al. (2010) voor een volledige kaart van de gemodificeerde plasmide-¹⁴. Gist getransformeerd met deze plasmiden constitutively express menselijke nucleaire ERα of ERβ (ook ESR1 en ESR2, respectievelijk genoemd) wanneer gekweekt in medium met galactose (voor ERα) of glucose of galactose (voor ERβ). Als oestrogene stoffen aanwezig in de media zijn, binden ze aan de receptoren, ligand-receptor complexen die expressie van de β-galactosidase (lacZ) op een niveau dat evenredig is met de concentratie van oestrogene stoffen activeren maken. Gistcellen zijn vervolgens lysed om de geaccumuleerde β-galactosidase vrij te geven. De lysis-buffermengsel bevat ONPG of CPRG, die zijn gekloofd door β-galactosidase opleveren geel of rood producten, respectievelijk. Colorimetrische producten kunnen worden gekwantificeerd door het meten van de absorptie met behulp van een microwell plaat spectrofotometer. De mate van kleur te veranderen is evenredig aan de concentratie van oestrogene liganden waarnaar de gist werd blootgesteld.

De keuze van substraat (CPRG of ONPG), is afhankelijk van de mogelijkheden voor absorptie van de achtergrond die voortvloeien uit de monsters worden getest. Bijvoorbeeld, zal plantenextracten vaak een gele tint aan de media dat kunstmatig estrogenicity maatregelen opgeblazen als toevoegen ONPG (gekwantificeerd op 405 nm) wordt gebruikt als het substraat voor β-galactosidase. Met planten extracten, CPRG (gekwantificeerd op 574 nm) wellicht een geschiktere colorimetrische substraat. CPRG is duurder dan ONPG maar wordt gebruikt bij een tiende van de molarity. Dit artikel presenteert estrogenicities voor PCP extracten gekwantificeerd aan de hand van zowel ONPG als CPRG.

Kwantificeren van de estrogenicity van milieu monsters met behulp van zowel de ERα als de ERβ is een meer omvattende benadering dan het gebruik van slechts één van deze receptoren. In dieren vertonen deze receptoren differentiële weefsel distributie, regelgevende activiteiten en bindende affiniteiten voor oestrogene en Anti-oestrogene liganden¹⁵. Bijvoorbeeld binden op basis van planten fyto-oestrogenen meestal ERβ meer sterk², overwegende dat synthetische chemische producten prima overweg met voorkeur voor ERα of ERβ of beide receptoren even goed¹⁵kunnen binden. Daarom doet binding aan een oestrogeen receptor niet noodzakelijkerwijs voorspellen binding aan de andere.

Hoewel EWS te in vele consumentenproducten (b.v., pesticiden, wasmiddelen, lijmen, smeermiddelen, kunststoffen, levensmiddelen en farmaceutische producten) en planten vinden zijn, de gepresenteerde gegevens zijn verkregen met behulp van een selectie van eerstelijnszorg. eerstelijnszorg zijn overtuigend, gemakkelijk beschikbaar, budgetvriendelijk en vanuit milieuoogpunt relevant voor studenten. Studenten kunnen worden uitgenodigd om hun favoriete eerstelijnszorg vanuit huis om te testen in het laboratorium. Ze kunnen ook zoeken in de huid diep database ontwikkeld door de Environmental Working Group¹⁶ te genereren hypothese gestuurde vergelijkingen van eerstelijnszorg met hoge en lage toxiciteit scores. Op deze manier kunnen studenten gelijktijdig ontwikkelen geavanceerde laboratorium vaardigheden; deelnemen aan zelfstudie, op onderzoek gebaseerde leren; en verkennen van de opkomende problemen in milieuwetenschappen en gezondheid.

Protocol

1. van Dale reagentia

1. Bereiden van glucose en galactose media door het mengen van 6,7 g gist stikstof basis met 20 g dextrose of galactose, 20 mg adenine sulfaat (toegevoegd als 10 mL van een waterige stockoplossing van 200 mg/100 mL), 20 mg uracil (toegevoegd als 10 mL van een waterige stockoplossing van 200 mg/100 mL) , 60 mg leucine (toegevoegd als 6 mL van een waterige stockoplossing van 1 g/100 mL) en 20 mg histidine (toegevoegd als 2 mL van een waterige stockoplossing van 1 g/100 mL) met gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 1 L. Sterilize door filtratie (0,2 µm filter). Media kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor enkele weken.
2. Bereiden van estradiol (E2) normen door oplossen poedervorm E2 in watervrij ethanol en verdunnen naar de juiste werken concentraties (227.5 nM & 9,75 nM) in 50% ethanol.
   Opmerking: Als estradiol is gekocht als een flacon van 1 mg, 1 mL ethanol rechtstreeks aan de flacon te ontbinden estradiol poeder toevoegen. Dit levert een 3.67 mM voorraad #1.  Verdun 10 μL van voorraad #1 in 990 μL ethanol te maken van 1 mL 36.71 μM voorraad #2.  Dan Verdun 10 μL van voorraad #2 in 990 μL 50% ethanol te maken van 1 mL van 367.13 nM voorraad #3.  Om werken voorraden, Verdun 619.7 μL voorraad #3 in 380.3 μL 50% ethanol te maken van 1 mL van 227.5 nM werken materieel gebruikt voor het maken van standaard curven met gist uiting van ERα.  Verdun 26.56 μL voorraad #3 in 973.44 μL 50% ethanol te maken van 1 mL van 9,75 nM werken materieel gebruikt voor het maken van standaard curven met gist uiting van ERβ. Zegel van normen met parafilm en opslag bij -20 of 70 ° C.
   Let op: E2 is een verdachte carcinogeen en reproductieve veroorzaken. Het is schadelijk inademing, slikte of geabsorbeerd door de huid. E2 kan schade toebrengen aan de borstvoeding van kinderen en foetussen. E2 is zeer giftig voor aquatische leven. Gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, zuurkast Stofmasker) en Vermijd blootstelling tijdens zwangerschap en lactatie. Beschikken over E2 als gevaarlijk afval en niet vrijgeven in het milieu.
3. LacZ buffer bereid door het mengen van 8.52 g nb₂HPO₄, 5.52 g NaH₂PO₄•H₂O, 95.21 mg MgCl₂, 745.5 mg KCl, natriumzout van 2 g N-lauroylsarcosine, en ONPG (400 mg) of CPRG (77.7 mg) met gedeïoniseerd water tot een finale volume van 1 L. winkel LacZ buffer in 20 mL aliquots bij-20 ° C.
   Opmerking: Een aliquoot 20 mL is voldoende voor een 96-wells-plaat.
4. Bereid natriumcarbonaat door het mengen van 105.9 g natriumcarbonaat met gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 1 L. winkel op RT.
5. Bereiden 1 M dithiothreitol (DTT) in water. Bevriezen van 25 µL aliquots van DTT bij-20 ° C.
   Let op: DTT is een acute huid- en oogkleur irriterend. Het gebruik van passende persoonlijke beschermingsmiddelen (handschoenen, zuurkast Stofmasker) te voorkomen huid en oogcontact, inademing en inname.
   Opmerking: Elk aliquot is voldoende voor een 96-wells-plaat.

2. voorbereiding van de monsters en extractie besturingselementen

1. Selecteer monsters om te testen.
   Opmerking: Dit artikel presenteert gegevens voor vijftien eerstelijnszorg, met inbegrip van zeep, haar crème, shampoo, zonnebrand, lippenbalsem, foundation, scheerschuim, nagellak en lotion.
2. Combineer 1 g van het monster met 10 mL watervrij ethanol in een conische tube van 15 mL. Bereiden een controle van de negatieve extractie bestaande uit 11 mL ethanol in een conische tube van 15 mL. Bereiden wordt gerepliceerd als nodig.
   Opmerking: Voor de gepresenteerde proefopzet, drie aliquots van alle 15 eerstelijnszorg en drievoudige extractie besturingsoplossingen werden voorbereid, levert een totaal van 48 monsters, elk waarvan werd geanalyseerd in drievoud met behulp van het protocol in sectie 4. Een enkele plaat is geschikt voor maximaal 23 monsters in triplicates. Watervrij ethanol wordt gebruikt in deze stap, omdat het gemakkelijk verdampt. Negatieve extractie besturingselementen gebruiken om te verifiëren dat oestrogenen zijn niet uitspoeling in monsters van de conische buisjes.
3. Meng de inhoud van de tube voor 30 min door een combinatie van handmatige schudden en vortexing of door schudden van de buizen op een buis van de multi-vortexer.
4. Centrifugeer conische buizen met de maximale toegestane snelheid in een emmer centrifuge voor 10 min. Decant het supernatant van elke buis door een zeef van 40 µm cel in een conische buis van 50 mL. Lege inhoud van elke buis 50 mL in een flesje van glas scintillatie.
5. Verlof flesjes open in een geventileerde kap voor één week tot ethanol te volledig verdampen. U kunt ook droge monsters in een geventileerde kap onder stikstof of met een rotatieverdamper. Om te voorkomen dat de afbraak van lichte gevoelige bestanddelen, door drogen monsters te beschermen tegen licht (bijvoorbeeldplaats ondoorzichtig weefsel boven geventileerde kap deur).
6. Reconstrueren monsters in 1,0 mL 50% ethanol en vortex te homogeniseren.

3. het kweken en gist¹⁴ subcultivering

1. Actieve gist culturen (recombinant W303a stam van S. cerevisiae¹⁴) handhaven door het broeden van gist in de filter-gesteriliseerde glucose media bij 30 ° C. Subcultuur gist wekelijks in verse filter-gesteriliseerde glucose media.
2. Twee nachten (ongeveer 42 h) voorafgaand aan de voorbereiding van de ja-platen, subcultuur gist door toevoeging van 0,1 mL van actieve gist culturen tot 10 mL van de filter-gesteriliseerde glucose media met behulp van steriele techniek.  Incubeer bij 30 ° C gedurende twee nachten.  Schudden is niet vereist als gist worden geteeld als ondiepe culturen in steriele 250 mL conische kolven.
   Opmerking: Gist kan ook worden opgeslagen, op gekoelde agar platen voor enkele maanden. Voor de langere termijn opslag (jaar), O/N culturen combineren met 15-50% steriele glycerol, vortex, en bevriezing bij 70 ° C. Ter voorbereiding van steriele glycerol, kunt een injectiespuit 300 µL glycerol transfer in een cryovial en een autoclaaf met het GLB losgemaakt. Voeg vervolgens 1.200 µL O/N gist cultuur met behulp van steriele techniek.

4. voorbereiding ja platen (dag 1 van de test)

1. Verdund in een steriele bekerglas en met behulp van steriele techniek, gist uit stap 3.2 aan een optische dichtheid van 0.065 ±0.005 bij 610 nm (OD₆₁₀) in filter-gesteriliseerde galactose media.
   1. Optische dichtheid bevestigen door pipetting 120 μL van elk monster gist in drievoud samen met drievoudige galactose lege cellen in een duidelijk polystyreen plaat (plaat hoeft niet te worden steriel).  Gebruik een spectrofotometer plaat om te controleren dat de verdunde gist cultuur een netto OD₆₁₀ van 0.065 ±0.005 aftrekken OD610 lezingen van galactose vormstukken uit gist OD₆₁₀ lezingen heeft om netto OD₆₁₀ van de gist. Een eindvolume van ten minste 30 mL verdund gist voorbereiden op elke 96-wells-plaat.
      Opmerking: De filters van de spectrofotometer meten van de extinctie tussen 595 en 610 nm kunnen worden gebruikt voor deze meting.

Benaderend 1:6 v: v verhouding van gist: media levert meestal een OD-₆₁₀ dichtbij 0,065, dus starten door het toevoegen van 4.5 mL gist tot 30 mL media en meer gist of media toevoegen als nodig is om een netOD₆₁₀ tussen 0.060 en 0.070.

Met behulp van steriele techniek, wil deze verdunde gist schorsing de putjes van een steriele, polypropyleen, 96-Wells microplate volgens de plaat lay-out (Figuur 1). Tijdens pipetteren, houden de bron gist geschorst door voortdurend zwenken van de container of vermenging met de pipet. Voor deze stap is het handig een herhalende pipet met een steriele injectiespuit tip.
Opmerking: Polypropyleen platen zijn gesteriliseerd met autoclaaf twee gestapelde platen verpakt in folie.  De bovenste plaat dient als een deksel voor de steekproef plaat kan worden gewassen, re-gesteriliseerde met autoclaaf en hergebruikt.

120 µL filter-gesteriliseerde galactose media toevoegen aan 3 extra wells (H10 - 12) volgens de plaat lay-out (Figuur 1). Deze putjes dienen als de controles van media voor extinctie bijgedragen door de media alleen.

Bouwen van een standaard curve in elke plaat door serieel verdunning triplicates van E2-arbeidsnormen (227.5 nM voor ERα, 9,75 nM voor de ERβ) in putten met de schorsing van de gist (A1 - G3) volgens de plaat lay-out (Figuur 1).  Allereerst door 5 µL van E2 normen toe te voegen aan putjes A1 via de A3. Meng microwell inhoud door pipetteren, en vervolgens verdund serieel deze opschorting door het bewegen van 205 µL van putten A1 - 3 in putten B1 - 3. Herhaal de mengen en de overdracht van 205 µL tot en met rij G.
Opmerking: Nadat de seriële verdunning is voltooid, gooit u 205 μL van putten G1 - 3. Aan het eind van deze stap, moeten alle standaard putjes 120 μL bevatten. De seriële verdunning levert de eindconcentraties van de E2, vermeld in tabel 1. Voor de seriële verdunning stappen is het nuttig om het gebruik van een meerkanaals pipet met steriele tips.

Voeg toe 5 µL van voertuig (50% ethanol) aan voertuig-controleputjes met de schorsing van de gist (H1 - 3) volgens de plaat lay-out (Figuur 1).
Opmerking: Voertuig-controleputjes worden gebruikt om te kwantificeren achtergrond extinctie gistcellen en media is gekoppeld. Daarnaast testen cytotoxiciteit of groei bevorderen van effecten van test steekproeven kunnen worden gedetecteerd door het vergelijken van de OD₆₁₀ waarden van putjes met die van voertuig-controleputjes.

Breng 5 µL triplicates van monsters en negatieve extractie besturingselementen in putjes met de gist schorsing volgens de plaat lay-out (Figuur 1).
Opmerking: Noteer waarvan monsters of negatieve extractie besturingselementen worden toegevoegd aan elk putje.  Om bij te houden welke putten hebben monsters en die dat niet doen, met een verse doos van tips start tips te van dezelfde locaties in het vak als de locaties van de overeenkomstige putjes in de plaat gebruiken. Een 96-wells-plaat is geschikt voor maximaal 23 monsters in drievoud.

Meng de inhoud van de steekproef, controle van de winning en voertuig-controleputjes door pipetteren. Pas volumes van deze putten naar 120 µL doordat 205 µL van elk als beschreven in de legenda voor het cijfer 1.

Het zegel van de plate(s) met een poreuze, steriele, zelfklevende film. Label platen en incubeer gedurende 17 h bij 30 ° C. De plaat hoeft niet te worden geschud tijdens de incubatie

5. de verwerking ja platen (dag 2 van de Assay)

1. Na de incubatie 17 h bij 30 ° C platen uit de incubator te verwijderen. Als de platen worden onmiddellijk verwerkt, gaat u verder met stap 5.1.1. Als platen zullen worden verwerkt op een later tijdstip, gaat u verder met stap 5.1.2.
   1. Gebruik van een meerkanaals pipet te mengen van de inhoud van elke rij met putten, en breng 50 µL van gist ophanging van elk putje met de corre-goed voor een helder, polystyreen, 96-Wells microplate.
      Opmerking: Polystyreen platen hoeft niet te worden steriel, maar moeten een deksel. Gebruik nieuwe Pipetteer tips voor elke rij van putten te voorkomen van verontreiniging van het Kruis putten, hoewel als pipetteren over triplicates met een meerkanaalspipet 8-tip, tips alleen moeten worden gewijzigd tussen drievoudige sets.
      1. Label de nieuwe plaat. Ga verder met stap 5.2.
   2. Voor het opslaan van platen vóór de verwerking, wikkel ze in plasticfolie. Koelkast verpakt platen bij 4 ° C voor 6 d. daarna verwijderen van de platen uit de koelkast, ze uitpakken en overbrengen van de inhoud van alle putjes met pipetteren zoals in stap 5.1.1. Ga verder met stap 5.2.
2. Voeg 20 µL van 1 M DTT tot 20 mL van de ontdooide, kamertemperatuur LacZ buffer voor een eindconcentratie van 1 mM DTT. Mix LacZ buffer goed. Als met behulp van een pipet meerkanaals, afzien in een reagens reservoir.
   Let op: Draag handschoenen en werken met DTT in een kap, indien mogelijk
3. Met behulp van een meerkanaalspipet of herhalende Pipet, voeg 200 µL van LacZ buffer met DTT en ONPG of CPRG aan alle putjes van de polystyreen plaat, en onmiddellijk meten en registreren van de OD-₆₁₀ van alle putjes met behulp van een plaat spectrofotometer. Herhaal desgewenst voor extra platen.
   Opmerking: De OD₆₁₀ lezingen worden gebruikt in de noemer van de berekening van de LacZ (stap 6.1). Om deze reden, verkrijgen de lezingen meteen na pipetteren en vóór de cellen regelen of zijn lysed door buffer LacZ. Als OD₆₁₀ waarden voor monster putten merkbaar hoger of lager dan de OD-waarden van de₆₁₀ voor voertuig-controleputjes zijn, zijn de steekproef-extracten groeibevorderende of cytotoxisch zijn voor gist, respectievelijk. De berekening zal corrigeren voor kleine verschillen in cel dichtheden in putten, maar als de verschillen meer dan 30% in beide richtingen, LacZ dan Verdun het gereconstitueerde monster (uit stap 2.6) in extra 50% ethanol en het monster hertest door terug te keren naar stap 3.2 ¹².
4. Dekking van platen met een deksel. Incubeer de platen met gist dat uitdrukkelijke ERα¹⁴ bij 30 ° C gedurende 40 minuten (voor ONPG) of 3 h (voor CPRG). Incubeer de platen met gist dat uitdrukkelijke ERβ¹⁴ bij 30 ° C voor 70 min (voor ONPG) of 4 h (voor CPRG).
   Opmerking: Bij het werken met CPRG, incubatie tijden zijn flexibel; voor 2-4 h aan het broeden levert geschikte resultaten met beide receptoren, met langere incubations verhogen van de gevoeligheid van de test.
5. Na incubatie platen, een meerkanaalspipet of herhalende Pipet 100 µL van natriumcarbonaat toevoegen aan elk putje te gebruiken. Natriumcarbonaat verhoogt de pH en de β-galactosidase reactie stopt.
6. Meten en registreren de OD₄₀₅ (voor ONPG) of de OD₅₇₄ (voor CPRG) van alle putjes met behulp van een plaat spectrofotometer.

6.Berekening van de LacZ waarden

Opmerking: LacZ waarden kwantificeren van de mate van kleur te veranderen voor elk monster en bieden een genormaliseerde methode voor het vergelijken van waarden onder afzonderlijke testen door de administratieve verwerking van meerdere variabelen (bijvoorbeeld, gist optische dichtheid, media optische dichtheid en incubatie tijd als Dit verschilt tussen putten op de dezelfde plaat)¹².

1. Vervoermiddel drievoudige OD₆₁₀ waarden voor media (galactose)-controleputjes (H10-12) te berekenen en berekenen van vervoermiddel drievoudige OD₄₀₅ of OD₅₇₄ waarden voor besturingselementen van het voertuig (50% ethanol) (H1-3). Gebruik deze middelen en de incubatietijd (t) in uren voor de plaat en te wijzigen kleur (stap 5.5) om LacZ waarden (overeenkomend met de mate van kleur te veranderen in elk putje) te berekenen voor alle standaard monster putjes met behulp van de volgende vergelijkingen:
   
   
   1. Als alternatief, gebruiken de automatische toepassing in aanhangsel 1 om LacZ waarden voor normen en monsters te berekenen.
      Opmerking: De indeling van de plaat met de toepassing gebruikt moet identiek zijn aan de indeling van de plaat gepresenteerd in Figuur 1. Als sommige monster putten niet werden gebruikt, bewaren lezingen van de extinctie van de lege wells als houders van de plaats in de dataset van de absorptie in het aanhangsel 1 LacZ-toepassing wordt geplakt.  Deze bewaart de ruimtelijke indeling van de plaat in de toepassing en zorgt ervoor dat media-controleputjes hun vereiste locatie.  Bovendien kunnen de toepassing zal niet worden uitgevoerd als er lege cellen.
2. Middelen van de drievoudige LacZ waarden voor elke E2-standaard en elk monster berekenen. Verslag LacZ gemiddelden als µL^-1h^-1. Log-transformatie de concentraties van elke standaard E2 en genereren van een spreadsheet-documenten opgemaakt zoals in het template.csv bestand (aanhangsel 2).

7. interpoleren monster Estradiol equivalenten (EEQs) met 4-Parameter logistische regressie

Opmerking: EEQs hebben betrekking op LacZ voorbeeldwaarden (kleurverandering) de waarden van de LacZ van de standaard curve gemaakt met E2. EEQs bepalen dus hoeveel monster dient te ontlokken van de zelfde kleur verandering reactie als een bekende concentratie van E2.

1. Als u wilt berekenen EEQs voor gereduceerde monsters, uitzetten eerst de standaard curve. Fit LacZ gemiddelden voor E2 normen (y-as) en de bijbehorende log-getransformeerd E2 concentraties (x-as) met een vier-parameter logistische regressiemodel.
2. Gebruik het model om te interpoleren van EEQs voor testwaarden monster LacZ. Het gedrag van logistische regressie berekeningen van EEQs met behulp van statistische software zoals beschreven in aanhangsel 2.

8. standaardisatie van de EEQs (ng/mL) PCP monster massa

1. EEQs betrekking op het bedrag van PCP monster toegevoegd aan elk goed in stap 4.5, EEQ (ng/mL) te vermenigvuldigen met het totale volume verguld in de steekproef putten (325 µL) en vervolgens wordt gedeeld door het volume van het geëxtraheerde monster toegevoegd aan elk putje (5 µL).
   Opmerking: Deze waarden vertegenwoordigen EEQ per mL uitgepakte monster. Als monsters bereid het gebruik van 1 g van PCP zijn zouden, vertegenwoordigen deze waarden ook EEQ per gram PCP (ng/g). In deze manier uitgedrukt, kunnen EEQ waarden (ng/g) worden vergeleken over verschillende eerstelijnszorg. EEQ (ng/g)-waarden voor de verzorgingsproducten getest in deze studie worden weergegeven in tabel 2, en voorbeeldgegevens verzameld gedurende het gehele protocol zijn opgenomen in de Aanhangsel 3.

Representative Results

De estrogenicities van drievoudige monsters van 15 eerstelijnszorg werden geëvalueerd aan de hand van dit protocol Ja. Zoals opgemerkt door Miller et al. (2010), werden testen met gist uiting van ERβ meer dan een orde van grootte gevoeliger dan testen met gist ERα (Figuur 2)¹⁴uitdrukken. Oestrogene activiteit is daarom vaker aangetroffen met ERβ-uiten gist (tabel 2). Acht eerstelijnszorg tentoongesteld oestrogene activiteit met ERβ en 5 eerstelijnszorg tentoongesteld oestrogene activiteit met ERα. Haar room, zonnebrandcrème, lotion en lippenbalsem monsters waren oestrogene met beide receptoren, terwijl de Stichting, scheerschuim en nagellak alleen oestrogene met ERβ bij de geteste concentraties waren. Zeven andere eerstelijnszorg (4 shampoo, 2 zepen en 1 lippenbalsem) waren niet oestrogene met beide receptor bij de geteste concentraties.

Naast receptor gevoeligheid verschillen verschilde EEQs voor elk monster afhankelijk van de colorimetrische substraat (ONPG of CPRG) gebruikt in de assay (tabel 2). In totaal maar één monster waren EEQs bepaald met behulp van ONPG hoger dan die bepaald met behulp van CPRG. Bovendien variatie van extractie replicaat-organismen was voor EEQs met ERβ en CPRG gemeten laagste en hoogste voor EEQs met ERα en ONPG (tabel 2) vastgesteld.

Naast het vergelijken van colorimetrische substraten, wilden 1 van de huidige studie testen incubatie duur keer die compatibel met de planning van een undergraduate practicum zijn. De typische ja assay vereist dat een incubatie 17u onmiddellijk gevolgd door incubatie in LacZ buffer voor 40 min - 4 h, een schema dat is onmogelijk om te implementeren in een laboratorium van de onderwijs beperkt door één per sessie. Ter vergemakkelijking van het gebruik van deze bepaling in het onderwijs, is de bepaling bewerkt door de invoering van een 6 d koeling periode (stap 5.1.2) na de incubatie 17 h. Standaard curven van gekoelde platen waren vergelijkbaar zijn met die van niet-gekoelde platen (cijfers 2 & 3), behalve dat de standaardfouten van parameters die geschat aan de hand van vier-parameter logistische regressie-modellen alle werden kleinere voor gekoelde platen dan voor nonrefrigerated platen (tabel 3). Zo koel platen voor 6 d-vermindert fouten en verbetert de nauwkeurigheid van de schattingen van de EEQ.

Figuur 1. Microwell plaat lay-out en standaard verdunning kromme voorbereiding voor de ja-Assay. E2 normen (licht grijze wells), monsters en extractie besturingselementen (witte wells), en voertuig (H1 - 3) en galactose media (H10 - 12) negatieve controles (donkere grijze wells) waren allemaal getest in drievoud. Een E2 standaard curve (licht grijze wells) werd gebouwd door plating 320 µL van gist in putten A1 via de A3 en 120 µL van gist in putten B1 via G3. Vervolgens, 5 µL van E2 (227.5 nM voor gist die express ERα; 9,75 nM voor gist die express ERβ) werden toegevoegd aan de gist in putten A1 via de A3. De gist + E2 schorsing was serieel verdund door overdracht van 205 µL van elk putje naar de put eronder, opbrengst van de eindconcentraties van de E2, vermeld in tabel 1. Merk op dat aan het einde van het proces van seriële verdunning, 205 µL van putten G1 via G3 tot een eindvolume van 120 µL in elk putje moet worden verwijderd. Monster en negatieve extractie-controleputjes waren bereid door toevoeging van 5 µL van elk uittreksel (opgelost in 50% ethanol) 320 µL van gist. Voertuig-controleputjes (H1 - 3) werden voorbereid door 5 µL van 50% ethanol toe te voegen aan 320 µL van gist. Alle putjes van de steekproef en controle werden gemixt door pipetteren en 205 µL werden verwijderd en weggegooid om te passen goed volumes tot 120 µL elke. Tot slot, media controles werden voorbereid door plating 120 µL van galactose media in putten H10 - 12.  Als u wilt gebruiken de LacZ calculator in aanhangsel 1 en de R-gebaseerde toepassing beschreven in aanhangsel 2, de E2 moeten standaard curve en voertuig en galactose media controles worden verguld zoals.  Monsters en negatieve extractie besturingselementen kunnen in om het even welk van de witte putten worden verguld, zolang de volgorde van de beplating wordt opgemerkt.  Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2. Standaard buigt voor de ja-platen gegenereerd via 4-parameter logistische regressie. Twee substraten (ONPG & CPRG) werden getest met behulp van gist uiting geven aan een van de twee menselijk oestrogeen receptoren (ERα of ERβ) beide zonder (A) en (B) een 6 d koeling periode na de 17u incubatie met 17β-estradiol en monster wordt geëxtraheerd. Alle normen van de E2 en media en voertuig controles werden getest in drievoud. Punten vertegenwoordigen drievoudige LacZ waarden, waar LacZ waarden de mate van kleurverandering geïnduceerd door β-galactosidase weerspiegelt vervoermiddel. Logistische regressie model parameters worden weergegeven in tabel 3. ONPG = ortho- nitrofenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chloorfenol rood-β-D-galactopyranoside. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3. Voorbeelden van ontwikkelde ja platen. Twee substraten (ONPG & CPRG) werden getest met behulp van gist uiting van menselijk oestrogeen receptoren (ERα of ERβ), ofwel zonder (links) of met (rechts) de koeling van een zes-daagse periode na de 17u incubatie met 17β-estradiol of monster uittreksels. Alle normen van de E2, media en voertuig besturingselementen werden getest in triplicates. Platen werden georganiseerd met de hoogste concentratie van de E2 in de bovenste rij van elke plaat en besturingselementen (50% ethanol + gist op de linker- en galactose media aan de rechterkant) in de onderste rij van elke plaat volgens Figuur 1. ONPG = ortho- nitrofenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = chloorfenol rood-β-D-galactopyranoside.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Standard Number	[E2] voor ERα gist (pM)	[E2] voor ERβ gist (pM)
1	3500	150
2	2208	94,6
3	1393	59,7
4	878	37,6
5	554	23.7
6	349	15
7	220	9,45

Tabel 1. Uiteindelijke concentraties van E2 gehanteerde in Ja.
Gepoederde E2 was opgelost in watervrij ethanol en vervolgens verdund tot werken voorraad concentraties van 227.5 nM (voor gist die ERα express) en 9,75 nM (voor gist die ERβ express) in 50% ethanol.Werkende voorraden werden vervolgens toegevoegd aan microplate putjes met gist in galactose media en serieel verdund tot de concentratie in de tabel weergegeven.

Geteste monsters		Assay-voorwaarden		Oestrogene equivalenten (EEQs) van de eerstelijnszorg
PCP #	Voorbeeld Type	Receptor	Substraat	EEQ 1 (ng/g)	EEQ 2 (ng/g)	EEQ 3 (ng/g)	Bedoel EEQ (ng/g)
1	Haar room	ERΑ	ONPG	ND	0.379	ND	< 0.379
1	Haar room	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
1	Haar room	ERΒ	ONPG	0.528	0.338	0.363	0.410
1	Haar room	ERΒ	CPRG	ND	0.215	ND	< 0.215
4	Zonnebrandcrème	ERΑ	ONPG	6.803	1.390	ND	< 4.097
4	Zonnebrandcrème	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
4	Zonnebrandcrème	ERΒ	ONPG	1.321	0.838	0.818	0.992
4	Zonnebrandcrème	ERΒ	CPRG	0.651	0.591	0.725	0.656
7	Stichting	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
7	Stichting	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
7	Stichting	ERΒ	ONPG	ND	0.158	ND	< 0.158
7	Stichting	ERΒ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Shave crème	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
9	Shave crème	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Shave crème	ERΒ	ONPG	ND	0.256	0.295	< 0.276
9	Shave crème	ERΒ	CPRG	0.507	0.392	0.560	0.486
10	Nagellak	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
10	Nagellak	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
10	Nagellak	ERΒ	ONPG	0.916	0.503	0.554	0.658
10	Nagellak	ERΒ	CPRG	0.532	0.628	0.594	0.585
11	Lotion	ERΑ	ONPG	ND	ND	2.327	< 2.327
11	Lotion	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
11	Lotion	ERΒ	ONPG	Bereik overschrijden	2.599	1.845	> 2,222
11	Lotion	ERΒ	CPRG	--	1.986	1.236	1.611
13	Zonnebrandcrème	ERΑ	ONPG	14.069	11.494	10.189	11.917
13	Zonnebrandcrème	ERΑ	CPRG	4.773	5.790	5.850	5.471
13	Zonnebrandcrème	ERΒ	ONPG	Bereik overschrijden	2.580	Bereik overschrijden	> 2.580
13	Zonnebrandcrème	ERΒ	CPRG	0.292	0.240	ND	< 0.266
15	Lippenbalsem	ERΑ	ONPG	ND	ND	0.431	< 0.431
15	Lippenbalsem	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
15	Lippenbalsem	ERΒ	ONPG	1.202	1.060	0.887	1.050
15	Lippenbalsem	ERΒ	CPRG	0.820	0,871	0.851	0.847

Tabel 2. EEQs van eerstelijnszorg met niet-nulzijnde EEQs. Waren drie aliquots van 15 eerstelijnszorg en drie extractie besturingselementen gereconstitueerd in 50% ethanol voor een totaal van 48 monsters, elk waarvan werd geanalyseerd in drievoud met behulp van de ja-assay, gehomogeniseerd in watervrij ethanol en verdampt. Acht eerstelijnszorg had ten minste 1 niet-nulzijnde EEQ, terwijl 7 eerstelijnszorg niet bleken te zijn bij de geteste concentraties oestrogene. EEQ 1, EEQ 2 en 3 van de EEQ verwijzen naar de drie aliquots voor elke PCP, elk getest in drievoud op een afzonderlijke plaat. Waarden voor EEQ 1, EEQ 2 en 3 van de EEQ zijn de middelen van de triplicates voor elk aliquot. Gist in de test gebruikte uitgedrukt 1 van 2 isoforms van menselijk oestrogeen receptoren (ERα of ERβ). Twee colorimetrische substraten, ONPG en CPRG, werden getest met behulp van het protocol niet-gekoeld. EEQs werden bepaald met behulp van vier-parameter logistieke regressie (met R² waarden ≥ 0.98) van LacZ-waarden op elk van de 7 concentraties van E2. ND = onder de detectiegrens van de bepaling.--= verloren repliceren.

Assay-voorwaarden			Model Parameters
Receptor	Substraat	Arrestatie bij 4 ° C voor 6 d	Model R2	Groeitempo op jaarbasis (LacZ eenheden/ng/ml)	Omslagpunt (ng/mL)	Lagere Asymptote (LacZ eenheden)	Bovenste Asymptote (LacZ eenheden)
ERΑ	ONPG	NO	> 0.99	8.548 ±1.633	-0.512 ±0.025	-1.623 ±4.408	128.11 ±6.31
ERΑ	ONPG	JA	> 0.99	7.618 ±0.758	-0.587 ±0.014	-8.378 ±2.223	99.53 ±2.528
ERΑ	CPRG	NO	> 0.99	8.256 ±2.182	-0.610 ±0.033	0.853 ±3.333	62.52 ±3.473
ERΑ	CPRG	JA	> 0.99	5.068 ±0.616	-0.523 ±0.022	-3.147 ±1.946	68.06 ±3.069
ERΒ	ONPG	NO	> 0.99	1.041 ±2.004	-0.898 ±4.410	-32.98 ±86.62	248.6 ±778.9
ERΒ	ONPG	JA	> 0.99	4.327 ±1.289	-1.736 ±0.087	4.654 ±3.087	66.37 ±10.75
ERΒ	CPRG	NO	= 0.99	5.673 ±1.764	-1.914 ±0.052	3.925 ±1.679	28.05 ±2.334
ERΒ	CPRG	JA	> 0.99	4.412 ±1.142	-1.894 ±0.051	2.052 ±1.303	22.64 ±2.047

Tabel 3. Model van de Parameters van de logistieke regressies 4-parameter voor de standaard curven in Figuur 2. Twee substraten, ONPG en CPRG, werden getest met behulp van gist uiting van 1 van de 2 menselijk oestrogeen receptoren (ERα of ERβ) zowel zonder als met een zes-daagse koeling periode na de incubatie 17 h. Parameters worden gemeld als schattingen van ±standard fouten.

Aanhangsel 1. Toepassing voor de berekening van de LacZ waarden.  Voor het gebruik van de toepassing, moet u eerst gratis Java software (als aangegeven in Tabel van materialen) downloaden. Open vervolgens de toepassing LacZ. De indeling van de plaat met de toepassing gebruikt moet identiek zijn aan de indeling van de plaat gepresenteerd in Figuur 1. Als sommige monster putten niet werden gebruikt, bewaren lezingen van de extinctie van de lege wells als houders van de plaats in de dataset van de absorptie in de LacZ-toepassing wordt geplakt.  Deze bewaart de ruimtelijke indeling van de plaat in de toepassing en zorgt ervoor dat media-controleputjes hun vereiste locatie.  Bovendien kunnen de toepassing zal niet worden uitgevoerd als er lege cellen. Plakken in OD₄₀₅ lezingen (voor ONPG) of OD₅₇₄ lezingen (voor CPRG) van alle putjes met behulp van toetsenbord command "control (ctrl) + v" of "command + v," afhankelijk van het computerplatform wordt gebruikt. Voer de hoeveelheid incubatietijd in uren voor de assay om kleur te produceren (vanaf stap 5.4; bijvoorbeeld 0.66667 h voor 40 min). Klik op volgende. Plak in OD₆₁₀ lezingen uit stap 5.3. Klik op verzenden. LacZ resultaten worden getoond en kunnen worden gekopieerd door het indrukken van de "control (ctrl) + c" of "command + c," afhankelijk van het computerplatform wordt gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanhangsel 2. Statistische softwareopties voor de berekening van EEQs. EEQs kan worden berekend met behulp van een van de drie getoonde opties.  Aanwijzingen voor het gebruik van 1. JMP software of 2. R-code zijn opgenomen in aanhangsel 2.  De R-code heeft ook omgebouwd tot 3. een toepassing-formaat beschikbaar op https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanhangsel 3. Voorbeeld van gegevens verzameld met behulp van gist die Express-ERα en CPRG als het substraat. Metingen van OD_{610 574} OD voor elk van de zeven E2-normen, motorvoertuigen en media-besturingselementen en een één representatieve steekproef van PCP zijn opgenomen, samen met de berekende waarden van de LacZ. LacZ waarden van normen waren gebruikt voor de bouw van een vier-parameter logistische regressiemodel van de standaard curve zoals beschreven in stappen 7A & B hierboven. Het model werd gebruikt voor het interpoleren van de drievoudige raming van de EEQs van het representatieve monster in ng/mL in de microplate-putten. Deze waarden werden vervolgens geconverteerd naar EEQs uitgedruct in ng/g monster (stap 8.1). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Ja is een low-cost methode gebruikt voor het opsporen van oestrogene liganden in milieu monsters, zoals water, eten, plantaardige weefsels of producten voor persoonlijke verzorging. Gegevens gepresenteerd hier Vergelijk 2 oestrogeen receptoren (ERα en ERβ), 2 substraten (ONPG en CPRG) en 2 tijdlijnen (2 d zonder koeling) en zeven dagen protocol met koeling voor het meten van estrogenicity in producten voor persoonlijke verzorging via de ja-bepaling. De 7 d, gekoelde protocol gebruikt CPRG en gist uiting van ERα en/of ERβ beste kwantificeert EEQs terwijl undergraduate laboratorium cursussen die voldoen aan slechts eenmaal wordt ook compatibel met de tijdsdruk oplegt / week voor enkele h. In feite, werd in vergelijking met de bepaling van de 2 d zonder koeling, de zevendaagse gekoelde assay geassocieerd met verminderde variantie over plaat wordt gerepliceerd. Bovendien werd het lineaire deel van de standaard curve enigszins uitgebreid voor gegevens die zijn verzameld met behulp van de gekoelde assay. Het lineaire gebied van de standaard curve definieert het registratiebereik assay en is het enige gedeelte van de standaard curve die kan worden gebruikt voor het interpoleren van monster EEQs.

In alle, maar een van de geteste monsters waren gemeten met behulp van de CPRG EEQs lager dan die gekwantificeerd met ONPG. Met een hogere coëfficiënt van uitsterven en lagere K_m en V_max, CPRG tien keer gevoeliger is dan ONPG¹⁷. Dus, CPRG kan worden gebruikt bij lagere concentraties en kan worden gebruikt voor het detecteren van lagere bedragen van β-galactosidase. Om deze redenen heeft de CPRG in het algemeen voorkeur over ONPG^18,19. Grotere substraat gevoeligheid verklaart echter niet de lagere waarden van de EEQ met CPRG ontdekt. De hogere waarden van de EEQ met ONPG ontdekt kon te wijten zijn aan interferentie van de matrix met de assay, zoals opgemerkt door andere auteurs^2,18. Gele pigmenten uit persoonlijke verzorging product extracten kunnen opblazen EEQ waarden met ONPG ontdekt. Anderen hebben dit probleem omzeild door met inbegrip pigment controles in hun proefopzet², een aanpak die het aantal platen in een experiment verdubbelt. Als matrix interferentie problematisch zijn kan, mogelijk CPRG een beter substraat voor de ja-assay, hoewel het is duurder en langere incubatietijd tijden dan ONPG vereist. Bovendien is de kleurverandering geïnduceerd door het splijten van substraat door β-galactosidase dramatischer met CPRG, waardoor het makkelijker voor studenten om te visualiseren van de resultaten.

Miller et al. (2010), die de gist gebruikt in dit protocol ontworpen, dat gist uitdrukken ERβ 30 x gevoeliger voor 17β-estradiol dan gist uiting van ERα, een bevinding gemotiveerd door onze gegevens¹⁴werden genoteerd. Afgezien van potentiële nuances in de plasmide bouw, Miller et al. (2010) dit verschil in gevoeligheid¹⁴niet kon verklaren. Een verschil tussen de twee plasmide constructies is dat ERα expressie wordt gereguleerd door galactose, terwijl ERβ expressie wordt gereguleerd door glucose of galactose. De gist gebruikt in de ja-assay zijn gekweekt in de media van de glucose en galactose alleen gegeven wanneer ze aan het begin van de test worden verdund. Gist uiting van ERβ kan daarom hogere moleculen van receptor eiwitten vóór de aanvang van de test, waardoor de overdracht van hogere gevoeligheid voor oestrogene liganden accumuleren.

De lagere gevoeligheid van ERα-uiten gist kan verklaren de hogere tarieven van niet-detectie van estrogenicity in monsters gemeten met ERα in vergelijking met ERβ. Om te vergroten de kans wordt dat monster EEQs gedetecteerd, gebruikers kunnen verschillende extractiemiddelen en methoden in dienst of hogere volumes van monster toe te voegen aan de gist. Als hogere volumes van het monster worden gebruikt, moeten de concentraties van E2 normen worden aangepast zodat hetzelfde volume van normen en monsters kan worden gebruikt in de test. Een beperking van het toevoegen van meer monster is dat gist slechts 6-10% ethanol, met betere tolerantie bij incubatie temperaturen van 30 Vs. 35 ° C²⁰kan tolereren. Om te bepalen voor de effecten van ethanol op gist, moeten onderzoekers drievoudige "gist alleen" putten aan de plaat-indeling toevoegt en bevestigen dat de OD₆₁₀ van deze "gist alleen" putten vergelijkbaar met de OD₆₁₀ van voertuig-controleputjes onmiddellijk is na de toevoeging van LacZ buffer. Als alternatief, monsters, opgelost in ethanol kunnen worden toegevoegd aan droge microwell platen en de ethanol verdampt uit voordat gist worden toegevoegd. Dimethylsulfoxide (DMSO) wordt ook gebruikt als een monster oplosmiddel in Ja testen, maar de uiteindelijke concentratie van de werken van DMSO met gist beperkt tot 1%^{12 worden moet}.

De ja-bepaling is een krachtige screening tool voor het opsporen van estrogenicity in milieu monsters. Specifiek, detecteert de ja liganden die nucleaire oestrogeen receptoren die samenwerken met oestrogeen response-elementen om te leiden van gen expressie¹⁴binden. De waarde Ja heeft echter ook belangrijke beperkingen. Ja detecteert geen EWS die werken door middel van niet-nucleaire mechanismen zoals membraan oestrogeen receptoren of mechanismen die betrekking hebben op aanvullende elementen zoals transcriptiefactoren Activator eiwit 1 (AP-1). Bovendien, omdat gist hebben niet dezelfde metabole capaciteit als cellen van zoogdieren, ja niet wordt gedetecteerd door liganden waarvoor metabole activering als oestrogene.

Bovendien, de ja-bepaling kan niet gemakkelijk onderscheid maken tussen oestrogene en Anti-oestrogene liganden in complexe monsters. In plaats daarvan meet net estrogenicity, die het effect van de som van de oestrogene en Anti-oestrogene liganden. Voor het kwantificeren van de concentratie van ER-antagonisten of evalueren van de inhiberende activiteit van mengsels, kan de bepaling worden gewijzigd door het gist met zowel de standaard agonist (17β-estradiol) en een aantal test sample concentraties¹²aan het broeden. Dit proces wordt bepaald of antagonisten in de monsters agonist-geïnduceerde verslaggever activiteit kunnen verminderen en biedt een handig scherm voor de identificatie van de aanwezigheid van ER antagonisten in monsters.

Het hier gepresenteerde protocol is geschikt voor diverse soorten monster, hoewel sommige monsters moet u mogelijk wijzigingen aan de extractie en sample voorbereiding stappen. Bijvoorbeeld, EEQs sterk uiteen tussen repliceert van sommige producten voor persoonlijke verzorging. De meer variabele monsters neiging om bevatten olie druppels of waren anders niet volledig homogeen, die aangeeft dat een meer lipofiele oplosmiddel zoals diethylether nuttig zou zijn. Als alternatief, olie en wax in producten voor persoonlijke verzorging kunnen worden uitgesloten door de winning van monsters met 50% ethanol in plaats van 100% ethanol.Een 50% ethanol extractie zal ook meer water oplosbare oestrogene liganden (bijvoorbeeld, sommige pigmenten) vangen. Echter 50% ethanol verdampt langzamer dan 100% ethanol en dus kan verlengen extractie tijd. Daarnaast werden enkele monsters (zoals zeep) cytotoxisch zijn voor gist, wat resulteert in verminderde cel dichtheid metingen (OD₆₁₀). Fox et al. (2008) suggereren dat dergelijke monsters moeten worden verdund en Nacontrole verricht als cel dichtheid verschillen groter is dan 30% ten opzichte van voertuig controle putten¹².

Als de ja-assay voor analytische onderzoeksdoeleinden wordt gebruikt, kunnen preventief bepalen juiste hoeveelheid extract worden toegevoegd aan gist in stap 4.5 verdunning curven van monster zwembaden worden beproefd. Als alternatief, extracten tegelijk kunnen worden getest op meerdere volumes (b.v., 5 µL en 20 µL extract toegevoegd aan gist in stap 4.5) of verdunningen, die zich uitstrekken van de ordes van grootte (b.v., 0.2 µL, 2 µL en 20 µL). "Juiste" hoeveelheid extract zijn die het identificeren van estrogenicity door LacZ waarden langs de lineaire deel van de standaard curve te vergelijken. Optimalisatie voorkomt problemen veroorzaakt door te veel of te weinig monster toe te voegen aan de gist, zoals cytotoxiciteit, valse negatieven of estrogenicity die hoger is dan de standaard curve. Zoals hierboven vermeld, moeten de omvang van de monsters en E2 normen worden aangepast wanneer verschillende hoeveelheden ligand worden gebruikt zodat de gist worden blootgesteld aan een consistent volume en de concentratie van ethanol of ander voertuig over de plaat.

Ondanks het potentieel voor valse negatieven, is de ja-bepaling geïdentificeerd als een Tier 3 testing tool voor endocriene verstoorders door Schug et al. (2013), die ontwikkelde een uitgebreide gelaagde Protocol voor endocriene verstoring (TiPED)²¹. Voor undergraduate onderwijs is de test waardevol voor het onderwijzen van begrippen met betrekking tot de hormoonontregeling, cultuur van de cel receptor bindende, enzymactiviteit, genetische manipulatie, statistieken en experimenteel design. Studenten die gebruik maken van de test ook praktijk fundamentele en breed toepasbare laboratorium vaardigheden zoals serieel verdunnen normen; winning van monsters; het maken van oplossingen; bouw en interpoleren standaard curven; berekening van de concentraties; het maken van oplossingen; tonen steriele techniek; kweken van cellen; identificeren van variabelen en besturingselementen; verzamelen, ordenen en analyseren van gegevens; bouw en interpreteren van de grafieken; en het gebruik van gemeenschappelijke laboratoriumapparatuur zoals micropipettors en spectrofotometers.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Vortex Mixer (for single or multiple tubes)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-215-365	Any mixer will suffice.
Bucket centrifuge	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	75-063-839	Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
Bunsen burner	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	17-012-823	Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
Incubator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	50125590H	Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
Microplate reader	BioTek (www.biotek.com)	EPOCH2	A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
Gen5 microplate reader and imager software	BioTek (www.biotek.com)	GEN5	Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
Refrigerator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05LREEFSA	Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-681-15E	Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
P10 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144562G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
P200 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144565G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
P300 multichannel pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FBE1200300	Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
Repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164001G	Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Sterile 15 mL conical tubes with caps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05-539-801
Glass scintillation vials	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	03-337-4
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12565501
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid	Cole-Parmer (www.coleparmer.com)	EW-01728-81
100 mL glass beakers	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-539H	Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
250 mL glass Erlenmeyer flasks	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB500250	Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
Sterile, adhesive, porous film	VWR (www.vwr.com)	60941-086
Metal forceps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12-000-157	Any metal forceps will suffice.
Reagent reservoir	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	07-200-127
Filtration units (0.2 µm)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	09-761-52
Squirt bottle (for ethanol)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-897-10	Any laboratory squirt bottles will suffice.
Autoclavable storage bottles	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	06-414-1D	Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
10 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27F	Any glass serological pipets will suffice.
1 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27C	Any glass serological pipets will suffice.
P10 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-3810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P200 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-8810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P300 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-9810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
Syringe tips for repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164150G	Only required if a repeating pipettor is used.
Sterile petri dishes	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB0875712	Any sterile petri dishes will suffice.
Parafilm	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	S37440
Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a)	American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)	MYA-151	Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
Receptor/reporter plasmid for ERα	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)
Receptor/reporter plasmid for ERβ	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Difco agar	BD (www.bd.com)	214530
Dithiothreitol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	D0632	CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	N1127
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	10884308001
Yeast nitrogen base	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	Y0626
Glucose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G8270
Galactose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G5388
Adenine sulfate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	A9126
Uracil	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	U0750
Leucine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L8000
Histidine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	H8000
17 β-Estradiol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals	E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg	CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
100% ethanol	Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)	111000200
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S9638
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S0876
Magnesium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	M8266
Potassium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	P9333
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L5125
Sodium carbonate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S7795
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Excel spreadsheet software	Microsoft		Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
Java software (required for Appendix 1 application)	Oracle Corporation		To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
JMP statistical software version 13.0.0	SAS Institute		Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
R statistical computing and graphics software	R Foundation		Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.