Att upptäcka östrogena ligander i personliga hygienprodukter använder en jäst östrogen skärmen optimerad för grundutbildning undervisning laboratoriet

Summary

Denna artikel presenterar en optimerad jäst östrogen skärm för att kvantifiera ligander i personliga hygienprodukter (PCP) som binder östrogen receptorer alpha (ERα) och/eller beta (ERβ). Metoden innehåller två kolorimetriska substrat alternativ, en sex-dagars kylda inkubation för användning i grundutbildningen och statistiska verktyg för dataanalys.

Abstract

Den jäst östrogen skärmen (Ja) används för att upptäcka östrogena ligander i miljöprover och har tillämpats i stort sett i studier av endokrina störningar. Östrogena ligander inkluderar både naturliga och konstgjorda ”Environmental östrogener” (EEs) Funna i många konsumentvaror inklusive personliga hygienprodukter (PCP), plast, bekämpningsmedel och livsmedel. Europeiska sysselsättningsstrategin störa hormon signalering i människor och andra djur, potentiellt minskad fertilitet och ökad sjukdomsrisk. Trots betydelsen av europeiska sysselsättningsstrategin och andra endokrina störningar kemikalier (hormonstörande ämnen) för folkhälsan ingår endokrina störningar inte normalt i grundutbildningen läroplaner. Denna brist är delvis på grund av relevanta laboratorieverksamhet som illustrerar principerna involverad samtidigt vara tillgänglig för studenter. Denna artikel presenterar en optimerad Ja för att kvantifiera ligander i kroppsvårdsprodukter som binder östrogen receptorer alpha (ERα) och/eller beta (ERβ). Metoden innehåller en av de två kolorimetriska substratesna (ortho- nitrofenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) eller klorfenol röd-β-D-galactopyranoside (CPRG)) som klyvs av β-galaktosidas, en 6-dagars kylda inkubation steg till underlätta användning i grundutbildningsprogram laboratorium kurser, ett automatiserat program för Lindholm beräkningar och R-kod för den associera 4-parameter logistisk regressionsanalysen. Protokollet har utformats för att tillåta studenter att utveckla och genomföra experiment där skärmen de produkter de själva väljer för östrogen härmar. I processen, de lär sig om endokrina störningar, cellodling, receptorbindning, enzymaktivitet, genteknik, statistik och försöksplanering. Samtidigt, de också öva grundläggande och allmänt tillämpliga laboratorium färdigheter, såsom: beräkna koncentrationer; göra-lösningar; visar steril teknik; seriellt späda normer. att konstruera och interpolera standard kurvor; att identifiera variabler och kontroller. samla, ordna och analysera data. konstruera och tolka grafer; och använder vanlig laboratorieutrustning såsom Mikropipetter och spektrofotometrar. Således, genomföra denna analys uppmuntrar eleverna att engagera i undersökande lärande samtidigt undersöka framväxande frågor i miljövetenskap och hälsa.

Introduction

Den jäst östrogen skärmen (Ja) används ofta för att kvantifiera ligander som efterliknar estradiol (E2 eller 17β-Östradiol) i en mängd olika matriser, inklusive vatten, växt vävnader, konsumtionsvaror och livsmedel^{1,2,3, 4}. Sammantaget som dessa ligander kallas ”Environmental östrogener (EEs)”. Ja utvecklades ursprungligen som en låg kostnad, in vitro- alternativ till i vivo tester som den gnagare uterotrophic assay^5,6 och regnbåge utfodring assay⁷. Syftet med dessa tester är att avgöra om en produkt innehåller kemikalier som stimulerar eller blockera östrogen-beroende mekanismer. Påvisande av EEs är kritisk, eftersom de kan störa normal endogena östrogen signalering, särskilt under fosterutvecklingen. Denna störning äventyrar hälsa genom att öka risken för fetma, infertilitet, cancer och kognitiva förlust⁸.

Trots betydelsen av europeiska sysselsättningsstrategin och andra hormonstörande ämnen för folkhälsan ingår endokrina störningar inte vanligen i grundutbildningen läroplaner. Denna brist är delvis på grund av en brist på aktiviteter som illustrerar principerna involverad samtidigt vara tillgänglig för studenter. Dessutom flera varianter av protokollet Ja finns^{9,10,11,12,13}, och denna mångfald gör assay optimering tidskrävande för laboratoriet samordnare inte särskilt utbildade i de relevanta teknikerna. Slutligen, ja analyser är vanligtvis avslutad över 1 lång dag eller 2 dagar med en O/N inkubation. Denna tidpunkt är inte kompatibel med formatet för grundutbildning laboratorium jagar, som normalt träffas en gång / vecka för flera h.

Svar på dessa behov rapporterar detta manuskript en optimerad 96 brunnar Ja protokoll som innehåller enprocentig extraktionsmetoder för personliga hygienprodukter (PCP)³ och ett 6-dagars kyl steg att rymma laboratorium veckomöten. Absolut etanol är en mångsidig organiskt lösningsmedel som kan lösa upp en mängd polära och opolära koncentrationsfördelningen. Dessutom är det lämpligt för grundutbildningen eftersom det är lätt tillgängliga, relativt giftfritt, prisvärd och blandbar med vatten. Det avdunstar också enkelt utan speciell utrustning. Men etanol är inte idealiskt för att utvinna starkt hydrofoba hormonstörande eller många oljor och vaxer, de senare två är vanliga ingredienser i PCP. dålig utvinning effektivitet ökar risken för falskt negativa fynd. Med denna begränsning i åtanke, bör utredare välja extraktionsprocessen (t.ex., enprocentig utvinning eller fasta fasen extraktion) denna adress provets karaktär och målen för studien (forskning kontra grundutbildningsprogram instruktion).

Ja är beroende av rekombinant Saccharomyces cerevisiae ursprungligen skapad av Dr. Charles Miller vid Tulane University. Vänligen se Miller et al. (2010) för en komplett karta av bakåtkompilerade plasmid¹⁴. Jästen omvandlas med dessa plasmider konstitutivt express mänskliga nukleära ERα eller ERβ (även kallad ESR1 och ESR2, respektive) när den odlas i media som innehåller galaktos (för ERα) eller antingen glukos eller galaktos (för ERβ). Om det förekommer östrogena kemikalier i media, binder de till receptorer, skapa ligand-receptor komplex som aktiverar β-galaktosidas (Lindholm) uttryck på en nivå som är proportionell mot koncentrationen av östrogena kemikalier. Jästceller är sedan lyserat för att släppa den ackumulerade β-galaktosidas. Lyseringsbuffert innehåller antingen ONPG eller CPRG, som klyvs av β-galaktosidas ge gula eller röda produkter, respektive. Kolorimetriska produkter kan kvantifieras genom mätning av absorbans med en mikrobrunn plattan spektrofotometer. Graden av färgförändring är proportionell mot koncentrationen av östrogena ligander som jästen var utsatt.

Valet av substrat (CPRG eller ONPG) beror på potentialen för bakgrundsabsorbansen som härrör från de prover som ska testas. Till exempel växtextrakt kommer ofta lägga en gul nyans till media som artificiellt blåses östrogeniciteten åtgärder om ONPG (kvantifieras vid 405 nm) används som substrat för β-galaktosidas. Med växtextrakt, CPRG (kvantifieras på 574 nm) kan vara en lämpligare kolorimetriska substrat. CPRG är dyrare än ONPG men används på en tiondel av molariteten. Denna artikel presenterar estrogenicities av PCP extrakt kvantifieras med hjälp av både ONPG och CPRG.

Kvantifiera östrogeniciteten av miljöprov med både ERα och ERβ är en mer omfattande metod än att använda endast en av dessa receptorer. Djur uppvisar dessa receptorer differentiell vävnadsdistribution, tillsynsverksamhet och bindande tillhörighet för östrogena och Anti-östrogena ligander¹⁵. Till exempel, bind växtbaserad fytoöstrogener vanligtvis ERβ mer starkt², medan syntetiska kemikalier kan visa preferens för antingen ERα eller ERβ eller kan binda båda receptorer lika väl¹⁵. Bindning till en östrogenreceptor därför inte nödvändigtvis förutsäga bindning till den andra.

Även om EEs finns i många konsumentprodukter (t.ex., bekämpningsmedel, rengöringsmedel, lim, smörjmedel, plast, livsmedel och läkemedel) liksom växter, presenterade uppgifter erhölls med ett urval av PCP. PCP är övertygande, lätt tillgängliga, budgetvänligt och miljömässigt relevanta för studenter. Studenter kan inbjudas att ta deras favorit PCP hemifrån att testa i laboratoriet. De kan också söka i huden djup databasen som utvecklats av Environmental Working Group¹⁶ för att generera hypotes-driven jämförelser av PCP med hög och låg toxicitet noter. På detta sätt kan studenter samtidigt utveckla avancerade laboratorium färdigheter; självstyrd, undersökande lärande; och utforska nya problem i miljövetenskap och hälsa.

Protocol

1. att göra reagenser

1. Förbered glukos och galaktos media genom att blanda 20 g dextros, 20 mg adenin sulfat (Tillagd som 10 mL av en 200 mg/100 mL vattenlösning av lager) eller galaktos, 6,7 g jäst kväve bas, 20 mg uracil (Tillagd som 10 mL av en 200 mg/100 mL vattenlösning av lager) , 60 mg leucin (Tillagd som 6 mL av en 1 g/100 mL vattenlösning av lager), och 20 mg histidin (Tillagd som 2 mL av en 1 g/100 mL vattenlösning av lager) i avjoniserat vatten till en slutlig volym av 1 L. Sterilize genom filtrering (0,2 µm filter). Media kan lagras vid 4 ° C i flera veckor.
2. Förbereda estradiol (E2) standarder av Proteinupplösande pulveriserad E2 i vattenfri etanol och späda till de lämpliga koncentrationerna som arbetar (227,5 nM & 9,75 nM) i 50% etanol.
   Obs: Om estradiol är köpt som en injektionsflaska med 1 mg, tillsätt 1 mL etanol direkt till injektionsflaskan att upplösa estradiol pulver. Detta ger en 3.67 mM lager #1.  Späd 10 μL av lager #1 i 990 μL etanol att göra 1 mL 36.71 μM lager #2.  Späd sedan, 10 μL av lager #2 i 990 μL 50% etanol att göra 1 mL 367.13 nM lager #3.  För att göra arbetande bestånd, späd 619.7 μL lager #3 i 380,3 μL 50% etanol att göra 1 mL 227,5 nM fungerande lager används för att skapa standard kurvor med jäst som uttrycker ERα.  Späd 26.56 μL lager #3 i 973.44 μL 50% etanol att göra 1 mL 9,75 nM fungerande lager används för att skapa standard kurvor med jäst som uttrycker ERβ. Försegla standarder med parafilm och förvaras vid -20 eller -70 ° C.
   FÖRSIKTIGHET: E2 är en misstänkt cancerframkallande och reproduktiv för människor. Det är skadligt vid inandning, förtäring eller absorberas genom huden. E2 kan orsaka skada på amning barn och foster. E2 är mycket giftigt för vattenlevande organismer. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, spiskåpa, damm mask) och undvika exponering under graviditet och amning. Kassera E2 som farligt avfall och får inte släppas ut i miljön.
3. Förbered Lindholm buffert genom att blanda 8.52 g Na₂HPO₄, 5.52 g NaH₂PO₄•H₂O, 95.21 mg MgCl₂, 745.5 mg KCl, 2 g N-lauroylsarcosine natriumsalt, och antingen ONPG (400 mg) eller CPRG (77,7 mg) i avjoniserat vatten till en slutlig volym 1 L. Store Lindholm buffert i 20 mL alikvoter vid-20 ° C.
   Obs: En 20 mL alikvotens räcker för en plattan med 96 brunnar.
4. Förbered natriumkarbonat genom att blanda 105.9 g natriumkarbonat i avjoniserat vatten till en slutlig volym av 1 L. Store på RT.
5. Laga 1 M Ditiotreitol (DTT) i vatten. Frysa 25 µL portioner av DTT vid-20 ° C.
   Varning: DTT är en akuta hud- och ögonirritation. Använd lämplig personlig skyddsutrustning (handskar, spiskåpa, andningsmask) för att undvika hud och ögonkontakt, inandning och förtäring.
   Obs: Varje alikvot räcker för en plattan med 96 brunnar.

2. förbereda prover och utvinning kontroller

1. Välj prover att testa.
   Obs: Denna artikel innehåller uppgifter för femton PCP, inklusive tvål, hårkräm, schampo, solskydd, läppbalsam, foundation, rakkräm, nagellack och lotion.
2. Kombinera 1 g av provet med 10 mL vattenfri etanol i en 15 mL koniska rör. Förbereda en negativ kontrollextraktion bestående av 11 mL etanol i en 15 mL koniska rör. Förbereda replikat som behövs.
   Obs: För presenterade experimentell design, tre portioner av alla 15 PCP och tre exemplar utvinning styrlösningar var beredda, vilket ger sammanlagt 48 prover, som analyserades i tre exemplar med protokollet i avsnitt 4. En enda plåt rymmer upp till 23 prover i exemplar. Vattenfri etanol används i det här steget eftersom det avdunstar snabbt. Använda negativa utvinning kontroller för att verifiera att östrogener inte urlakning i prover från de koniska rör.
3. Homogenisera tube innehåll för 30 min av en kombination av manuell skakning och vortexa eller skakar rör på en flera rör vortexer.
4. Centrifugera koniska rör vid den maximala tillåtna hastigheten i en hink Centrifugera i 10 min. Dekantera supernatanten från varje rör genom en sil med 40 µm i cellen till en 50 mL konisk tub. Töm innehållet i varje 50 mL tub i en injektionsflaska av glas scintillation.
5. Lämna injektionsflaskor öppna i en ventilerad huva för en vecka att tillåta etanol avdunsta helt. Alternativt torka prover i en ventilerad huva under kväve eller med en roterande indunstare. För att undvika nedbrytning av ljus känsliga beståndsdelar, ljuskänsligt snabbtorkande prover (t.ex., plats ogenomskinligt tyg över ventilerad huva dörren).
6. Beredes prover i 1,0 mL 50% etanol och vortex att homogenisera.

3. odling och Subculturing jäst¹⁴

1. Upprätthålla aktiv jäst kulturer (rekombinant W303a stam S. cerevisiae¹⁴) genom ruvning jäst i filter-steriliseras glukos media vid 30 ° C. Subkultur jäst veckovis i färska filter-steriliseras glukos media.
2. Två nätter (ca 42 h) före förbereda Ja plattorna, subkultur jäst genom att tillsätta 0,1 mL aktiv jäst kulturer 10 ml av filter-steriliseras glukos media med steril teknik.  Inkubera vid 30 ° C i två nätter.  Det krävs inte att skaka om jäst odlas som grunt kulturer i sterila 250 mL Erlenmeyer kolvar.
   Obs: Jäst kan också lagras på kylda agarplattor i flera månader. För längre sikt lagring (år), kombinera O/N kulturer med 15-50% steril glycerol, vortex och frysa vid-70 ° C. För att förbereda steril glycerol, Använd en spruta för att överföra 300 µL glycerol i en cryovial och autoklav med locket lossade. Lägg sedan till 1 200 µL O/N jästkultur med steril teknik.

4. förbereda Ja plattor (dag 1 analysens)

1. I en steril bägare och med steril teknik, späd jäst från steg 3,2 till en optisk densitet på 0,065 ±0.005 på 610 nm (OD₆₁₀) i filter-steriliseras galaktos media.
   1. Bekräfta optisk densitet genom pipettering 120 μL av varje jäst prov i tre exemplar tillsammans med tre exemplar galaktos tomrummen i en klar polystyren plattan (plattan behöver inte vara steril).  Använd en tallrik spektrofotometer verifiera att den utspädda jäst kulturen har en netto OD₆₁₀ 0,065 ±0.005 subtrahera OD610 avläsningar av galaktos råämnen från jäst OD₆₁₀ avläsningar att avgöra net OD₆₁₀ av jäst. Förbereda en slutlig volym av minst 30 mL utspädd jäst för varje plattan med 96 brunnar.
      Obs: Spektrofotometer filter mäta absorbansen mellan 595 och 610 nm kan användas för denna mätning.

En ungefärlig 1:6 v: v förhållandet av jäst: media vanligtvis ger en OD₆₁₀ nära 0,065, så börja med att lägga till 4,5 mL jäst till 30 mL media och Lägg till mer jäst eller media som lämpliga för att uppnå en netOD₆₁₀ mellan 0.060 och 0,070.

Med steril teknik, lägga till denna utspädda jästsuspension till brunnar i en steril, polypropylen, 96 brunnar mikroplattan enligt layouten plattan (figur 1). Under pipettering, hålla källan jäst stängts av kontinuerligt virvlande behållaren eller blanda med pipetten. För detta steg är det bra att använda en upprepande vi rekommenderar med en steril spruta spets.
Obs: Polypropylen plattor är steriliserade med autoklavering två staplade plattor insvept i folie.  Den övre plattan fungerar som ett lock för provet plattan kan vara tvättat, re-autoklaveras och återanvändas.

Lägga till 120 µL filter-steriliseras galaktos media till 3 ytterligare brunnar (H10 - 12) enligt layouten plattan (figur 1). Dessa brunnar fungera som mediekontroller för absorbans bidragit genom media ensam.

Konstruera en standardkurva i varje platta av seriellt späda exemplar av E2 arbetsstandarder (227,5 nM för ERα, 9,75 nM för ERβ) i brunnar med jästsuspension (A1 - G3) enligt layouten plattan (figur 1).  Börja med genom att lägga till 5 µL E2 standarder brunnar A1 genom A3. Blanda mikrobrunn innehållet genom pipettering, och späd sedan seriellt denna suspension genom att flytta 205 µL från brunnar A1 - 3 i brunnar B1 - 3. Upprepa blandning och överföring av 205 µL igenom rad G.
Obs: Efter den seriella utspädningen är klar, kassera 205 μL från wells G1 - 3. I slutet av detta steg, bör alla standard brunnar innehåller 120 μL. Den seriella utspädningen kommer att ge de slutliga E2 koncentrationer anges i tabell 1. För seriella utspädning steg är det bra att använda en multikanalpipett med steril tips.

Tillsätt 5 µL av fordon (50% etanol) till fordonets kontrollbrunnarna med jästsuspension (H1 - 3) enligt layouten plattan (figur 1).
Obs: Fordon kontrollbrunnar används för att kvantifiera bakgrundsabsorbansen är associerad med jästceller och media. Cytotoxicitet eller tillväxt främjande effekter av test prover kan upptäckas genom att jämföra OD₆₁₀ värden testa brunnar med fordonet kontrollbrunnarna.

Tillsätt 5 µL exemplar av prover och negativa utvinning kontroller brunnar innehållande jästsuspensionen enligt layouten plattan (figur 1).
Obs: Anteckna vilka prover eller negativa utvinning kontroller läggs till varje brunn.  Att hålla reda på vilka brunnar har prover och som inte, börja med en ny låda med tips och använda tips från samma platser i rutan som platserna för motsvarande brunnar i plattan. Ena plattan med 96 brunnar kan rymma upp till 23 prover i tre exemplar.

Blanda innehållet i de prov och kontrollextraktion fordonet kontrollbrunnar genom pipettering. Justera volymerna av dessa brunnar till 120 µL genom att ta bort 205 µL från var enligt legenden för figur 1.

Försegla skylt(ar) med en steril, självhäftande, porös film. Etikettera plattor och inkubera i 17 h vid 30 ° C. Plattan behöver inte skakas under inkuberingen

5. bearbetning Ja plattor (dag 2 analysens)

1. Efter 17 h inkubering vid 30 ° C, ta bort plattor från inkubatorn. Om plattorna kommer att behandlas omedelbart, gå till steg 5.1.1. Om plattorna kommer att behandlas vid ett senare datum, gå till steg 5.1.2.
   1. Använda en multikanalpipett för att blanda innehållet i varje rad av brunnar, och sedan överföra 50 µL jästsuspension från varje brunn till motsvarande väl av en tydlig, polystyren, 96 brunnar mikroplattan.
      Obs: Polystyren plattor behöver inte vara steril men bör ha lock. Använd nya Pipettera tips för varje rad i brunnar för att undvika cross-förorena brunnar, även om pipettering över exemplar med en 8-tip flerkanalspipett, behöver tips bara ändras mellan tre exemplar uppsättningar.
      1. Etikett på nya plattan. Fortsätt till steg 5.2.
   2. För att lagra plattor före bearbetning, Linda in dem i plastfolie. Kylskåp inslagna plattor vid 4 ° C för 6 d. efteråt, ta bort plattorna från kylskåpet, packa upp dem och överföra innehållet i alla brunnar genom pipettering som i steg 5.1.1. Fortsätt till steg 5.2.
2. Tillsätt 20 µL av 1 M DTT 20 ml av tinade, rumstemperatur Lindholm buffert för en slutlig koncentration på 1 mM DTT. Blanda Lindholm buffert väl. Om du använder en flerkanalig pipett, fördela i en reagens reservoir.
   FÖRSIKTIGHET: Använd skyddshandskar och arbeta med DTT i en huva, om möjligt
3. Med hjälp av antingen en flerkanalspipett eller upprepande vi rekommenderar, tillsätt 200 µL av Lindholm buffert innehållande DTT och antingen ONPG eller CPRG till alla brunnar i polystyren plattan, och omedelbart mät och anteckna den OD₆₁₀ av alla brunnar med en tallrik spektrofotometer. Upprepa vid behov för ytterligare plåtar.
   Obs: OD₆₁₀ avläsningarna används som nämnare i beräkningen Lindholm (steg 6.1). Därför erhålla avläsningar omedelbart efter pipettering och före celler kvitta eller är lyserat av Lindholm buffert. Om OD₆₁₀ -värdena för prov brunnar är märkbart högre eller lägre än OD₆₁₀ -värdena för fordon kontrollbrunnar, är provextrakt antingen tillväxtbefrämjande eller cytotoxiska för jäst, respektive. Den Lindholm beräkning kommer att korrigera för små skillnader i cell densiteter över brunnar, men om skillnader överstiger 30% i endera riktningen, sedan späd beredda provet (från steg 2,6) i ytterligare 50% etanol och testa provet genom att återgå till steg 3,2 ¹².
4. Täck plattorna med lock. Inkubera plattorna som innehåller jäst det uttryckliga ERα¹⁴ vid 30 ° C i 40 min (för ONPG) eller 3 h (för CPRG). Inkubera plattorna som innehåller jäst det uttryckliga ERβ¹⁴ vid 30 ° C för 70 min (för ONPG) eller 4 h (för CPRG).
   Obs: När du arbetar med CPRG, inkubationstider är flexibla; ruvning för 2-4 h ger lämpliga resultat med båda receptorer, med längre inkubationer öka analysens känslighet.
5. Efter inkubation tallrikar, Använd en multikanalpipett eller upprepande vi rekommenderar för att tillsätt 100 µL av natriumkarbonat till varje brunn. Natriumkarbonat höjer pH och stoppar β-galaktosidas reaktionen.
6. Mät och anteckna den OD₄₀₅ (för ONPG) eller OD₅₇₄ (för CPRG) av alla brunnar med en tallrik spektrofotometer.

6.Beräkning av Lindholm värden

Obs: Lindholm värden kvantifiera graden av färgförändring för varje prov och erbjuda en normaliserad metod för att jämföra värden bland separata analyser av redovisning för flera variabler (t.ex.jäst optisk densitet, media optisk densitet och inkubation tid om Detta skiljer sig bland brunnar på samma platta)¹².

1. Beräkna medel för tre exemplar OD₆₁₀ värden för media (galaktos) kontrollbrunnar (H10-12), och beräkna tre exemplar OD₄₀₅ eller OD₅₇₄ värden för fordon (50% etanol) kontroller (H1-3). Använda dessa medel och inkubationstiden (t) i timmar för plattan för att ändra färg (steg 5,5) för att beräkna Lindholm värden (motsvarande graden av färgförändring i varje brunn) för alla standard och prov brunnar med hjälp av följande ekvationer:
   
   
   1. Alternativt använda en automatiserad tillämpning i tillägg 1 för att beräkna Lindholm värden för standarder och prover.
      Obs: Plattan layouten används med programmet måste vara identiska med layouten tallrik presenteras i figur 1. Om några prov brunnar inte användes, behålla absorbansen avläsningar från tomma brunnarna som plats innehavare i absorbans datamängden klistras in i tillägg 1 Lindholm ansökan.  Detta bevarar den rumsliga layouten av plattan i programmet och ser till att media kontrollbrunnar i deras önskad plats.  Dessutom kommer programmet inte att köra om det finns tomma celler.
2. Beräkna medel av tre exemplar Lindholm värden för varje E2 standard och varje prov. Rapportera Lindholm medelvärden som µL^-1h^-1. Log-transform koncentrationerna av varje E2 standard och generera en kalkylbladsdokument formaterade som i filen template.csv (tillägg 2).

7. interpolera prov Estradiol medel (EEQs) med 4-Parameter logistisk Regression

Obs: EEQs gäller exempelvärden Lindholm (färgförändring) Lindholm värdena av standardkurvan skapade med E2. EEQs avgör alltså hur mycket prov krävs för att framkalla samma färg förändring svar som en känd koncentration av E2.

1. För att beräkna EEQs för prover, först Rita standardkurvan. Passar Lindholm medelvärden för E2 standarder (y-axeln) och motsvarande logg-omvandlad E2 koncentrationer (x-axeln) att en fyra-parametern logistisk regressionsmodell.
2. Använda modellen för att interpolera EEQs för test exempelvärden Lindholm. Genomföra Logistisk regression beräkningar av EEQs använda statistisk programvara som beskrivs i tillägg 2.

8. standardisera EEQs (ng/mL) till PCP provmassan

1. För att relatera EEQs till mängden PCP prov tillsätts varje brunn i steg 4,5, multiplicera EEQ (ng/mL) av den totala volymen pläterade i provet brunnar (325 µL) och sedan dividera med extraherade provmängden lagt till varje brunn (5 µL).
   Obs: Dessa värden representerar EEQ per mL av extraherade provet. Om prover var beredd att använda 1 g av PCP representerar dessa värden också EEQ per gram PCP (ng/g). Uttryckt på detta sätt, kan EEQ värdena (ng/g) jämföras över olika PCP. EEQ (ng/g) värden för personvård produkterna testas i denna studie visas i tabell 2, och prov insamlade i hela hela protokollet ingår i Bilaga 3.

Representative Results

Estrogenicities av tre exemplar prover av 15 PCP utvärderades med denna Ja-protokollet. Som påpekas av Miller et al. (2010), var analyser med jäst som uttrycker ERβ mer än en storleksordning som är mer känsliga än analyser med jäst som uttrycker ERα (figur 2)¹⁴. Östrogena aktiviteten upptäcktes därför oftare med ERβ-uttryckande jäst (tabell 2). Åtta PCP ställde ut östrogena aktivitet med ERβ och 5 PCP uppvisade östrogena aktivitet med ERα. Hårsalva, solskydd, lotion och lip balm prover var östrogena med båda receptorer, medan foundation, rakkräm och nagellack var endast östrogena med ERβ på de testa koncentrationerna. Sju andra PCP (4 schampo, 2 tvålar och 1 läppbalsam) var inte östrogena med antingen receptorn på de testa koncentrationerna.

Förutom receptor känslighet skillnader, EEQs för varje prov skilde sig åt beroende på den kolorimetriska substrat (ONPG eller CPRG) som används i analysen (tabell 2). I alla utom ett prov var EEQs fastställs med hjälp av ONPG högre än de fastställs med hjälp av CPRG. Dessutom variationen mellan utvinning replikat var lägst för EEQs mätt med ERβ och CPRG och högsta för EEQs bestäms med ERα och ONPG (tabell 2).

Förutom att jämföra kolorimetriska substrat, var 1 Syftet med föreliggande studie att testa inkubation varaktighet tider som är kompatibla med schemat för en grundutbildningsprogram laborationskurs. Den typiska Ja assay kräver en 17 h inkubation som omedelbart följt av inkubation i Lindholm buffert för 40 min - 4 h, ett schema som är omöjligt att genomföra i undervisningen laboratorium begränsas av en enda handelsvecka. För att underlätta användningen av denna analys i undervisning, ändrades analysen genom att införa en 6 d kyl period (steg 5.1.2) efter 17 h ruvning. Standard kurvor från kylda plåtar var jämförbara med de från icke-kylda plåtar (figurerna 2 & 3), förutom att de standard fel parametrar beräknas med hjälp av fyra-parametern logistiska regressionsmodeller var alla mindre för kylda plåtar än för nonrefrigerated plåtar (tabell 3). Således, kylar plattor för 6 d minskar fel och förbättrar noggrannheten för EEQ uppskattningar.

Figur 1. Mikrobrunn plattan Layout och Standard utspädning kurva förberedelse för Ja analysens. E2 standarder (ljus grå brunnar), prover och negativa utvinning kontroller (vit brunnar), och fordonet (H1 - 3) och galaktos media (H10 - 12) kontroller (mörk grå brunnar) testades alla i tre exemplar. En E2 standardkurvan (ljus grå brunnar) byggdes av plätering 320 µL av jäst i brunnar A1 genom A3 och 120 µL av jäst i brunnar B1 genom G3. Sedan, 5 µL E2 (227,5 nM för jäst som uttrycker ERα; 9,75 nM för jäst som uttrycker ERβ) lades till jästen i brunnar A1 genom A3. Den jäst + E2 suspension var seriellt spädas genom att överföra 205 μl från varje brunn till brunnen under den, ger de slutliga E2 koncentrationer anges i tabell 1. Observera att i slutet av den seriella utspädningen, 205 µL kasseras från wells G1 genom G3 att uppnå en slutlig volym av 120 µL i varje brunn. Prov och negativa utvinning kontrollbrunnar var förberedda genom att lägga till 5 µL av varje utdrag (upplöst i 50% etanol) till 320 µL av jäst. Fordon-kontrollbrunnarna (H1 - 3) var förberedda genom att lägga 5 µL av 50% etanol till 320 µL av jäst. Alla prov och kontrollbrunnar blandades av pipettering och 205 µL avlägsnades och kasseras för att justera väl volymer till 120 µL varje. Slutligen, mediekontroller utarbetades av plätering 120 µL av galaktos media i brunnar H10 - 12.  För att använda Lindholm Kalkylatorn i bilaga 1 och det R-baserade program som beskrivs i tillägg 2, E2 måste standardkurva och fordon och galaktos mediekontroller vara klädd som visas.  Prover och negativa utvinning kontroller kan beläggas i någon av de vita brunnarna så länge ordningen för plätering noteras.  Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2. Standard kurvor för Ja plattorna genereras via 4-parameter Logistic Regression. Två substrat (ONPG & CPRG) testades med jäst som uttrycker en av två mänskligt östrogenreceptorer (ERα eller ERβ) båda utan (A) och (B), en 6 d kyl period efter 17 h inkubering med 17β-Östradiol och prov extrakt. Alla E2 standarder och media och fordonets reglage prövades i tre exemplar. Punkter utgör tre exemplar Lindholm värden, där Lindholm värdena återspeglar graden av färgförändring som induceras av β-galaktosidas. Logistisk regression modellparametrar listas i tabell 3. ONPG = ortho- nitrofenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = klorfenol röd-β-D-galactopyranoside. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3. Exempel på utvecklade Ja plattor. Två substrat (ONPG & CPRG) testades med hjälp av jäst att uttrycka mänskliga östrogenreceptorer (ERα eller ERβ), antingen utan (vänster) eller med (höger) en sex-dagars kyl period efter 17 h inkubering med 17β-Östradiol eller prov utdrag. Alla E2 standarder, media och fordonet kontroller prövades i exemplar. Plattorna var ordnade med den högsta E2-koncentrationen i den översta raden i varje tallrik och kontroller (50% etanol + jäst på vänster och galaktos media till höger) i den nedersta raden av varje platta enligt figur 1. ONPG = ortho- nitrofenyl-β-D-galactopyranoside; CPRG = klorfenol röd-β-D-galactopyranoside.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Standardnummer	[E2] för ERα jäst (pM)	[E2] för ERβ jäst (pM)
1	3500	150
2	2208	94,6
3	1393	59,7
4	878	37,6
5	554	23,7
6	349	15
7	220	9,45

Tabell 1. Slutliga koncentrationer av E2 standarder används i Ja.
Pulveriserad E2 upplöstes i vattenfri etanol och sedan spädas till arbetande lager koncentrationer av 227,5 nM (för jäst som uttrycker ERα) och 9,75 nM (för jäst som uttrycker ERβ) i 50% etanol.Arbeta bestånd var sedan läggas till mikroplattan brunnar som innehåller jäst i galaktos media och seriellt spädas till koncentrationer visas i tabellen.

Prov		Assay villkor		Östrogena medel (EEQs) av PCP
PCP #	Provtyp	Receptor	Substrat	EEQ 1 ng/g	EEQ 2 ng/g	EEQ 3 (ng/g)	Menar EEQ (ng/g)
1	Hårkräm	ERΑ	ONPG	ND	0.379	ND	< 0.379
1	Hårkräm	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
1	Hårkräm	ERΒ	ONPG	0.528	0.338	0,363	0,410
1	Hårkräm	ERΒ	CPRG	ND	0,215	ND	< 0,215
4	Solskydd	ERΑ	ONPG	6.803	1.390	ND	< 4.097
4	Solskydd	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
4	Solskydd	ERΒ	ONPG	1.321	0,838	0.818	0.992
4	Solskydd	ERΒ	CPRG	0.651	0.591	0.725	0.656
7	Stiftelse	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
7	Stiftelse	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
7	Stiftelse	ERΒ	ONPG	ND	0.158	ND	< 0.158
7	Stiftelse	ERΒ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Shave cream	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
9	Shave cream	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
9	Shave cream	ERΒ	ONPG	ND	0.256	0,295	< 0,276
9	Shave cream	ERΒ	CPRG	0,507	0.392	0,560	0,486
10	Nail Polish	ERΑ	ONPG	ND	ND	ND	ND
10	Nail Polish	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
10	Nail Polish	ERΒ	ONPG	0.916	0.503	0.554	0,658
10	Nail Polish	ERΒ	CPRG	0.532	0.628	0.594	0,585
11	Lotion	ERΑ	ONPG	ND	ND	2.327	< 2.327
11	Lotion	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
11	Lotion	ERΒ	ONPG	Överskrider intervallet	2.599	1.845	> 2,222
11	Lotion	ERΒ	CPRG	--	1.986	1,236	1.611
13	Solskydd	ERΑ	ONPG	14.069	11.494	10.189	11,917
13	Solskydd	ERΑ	CPRG	4.773	5.790	5.850	5.471
13	Solskydd	ERΒ	ONPG	Överskrider intervallet	2.580	Överskrider intervallet	> 2.580
13	Solskydd	ERΒ	CPRG	0,292	0,240	ND	< 0,266
15	Läppbalsam	ERΑ	ONPG	ND	ND	0.431	< 0.431
15	Läppbalsam	ERΑ	CPRG	ND	ND	ND	ND
15	Läppbalsam	ERΒ	ONPG	1.202	1.060	0,887	1.050
15	Läppbalsam	ERΒ	CPRG	0.820	0.871	0.851	0.847

Tabell 2. EEQs av PCP med noll EEQs. Tre portioner av 15 PCP och tre utvinning kontroller var homogeniserad i vattenfri etanol, avdunstat och beredas i 50% etanol för sammanlagt 48 prover, som analyserades i tre exemplar med ja-analys. Åtta PCP hade minst 1 noll EEQ, medan 7 PCP inte befanns vara östrogena vid de testa koncentrationerna. EEQ 1, EEQ 2 och EEQ 3 avser de tre portioner av varje PCP, alla testade i tre exemplar på en separat plåt. Värden för EEQ 1, EEQ 2 och EEQ 3 är hjälpmedlet av exemplar för varje delprov. Jästen används i analysen uttryckt 1 av 2 isoformer av mänskligt östrogenreceptorer (ERα eller ERβ). Två kolorimetriska substrat, ONPG och CPRG, testades med hjälp av icke-kylda protokollet. EEQs bestämdes med hjälp av fyra-parametern logistiska regressioner (med R² värden ≥ 0,98) av Lindholm värden vid varje 7 koncentrationer av E2. ND = nedanför detektionsgränsen för analysen.--= förlorade replikera.

Assay villkor			Modellparametrar
Receptor	Substrat	Gripande vid 4 ° C för 6 d	Modell R2	Tillväxttakt (Lindholm enheter/ng/ml)	Brytpunkt (ng/mL)	Lägre Asymptote (Lindholm enheter)	Övre Asymptote (Lindholm enheter)
ERΑ	ONPG	Nej	> 0,99	8.548 ±1.633	-0.512 ±0.025	-1.623 ±4.408	128.11 ±6.31
ERΑ	ONPG	Ja	> 0,99	7.618 ±0.758	-0.587 0.014	-8.378 ±2.223	99.53 ±2.528
ERΑ	CPRG	Nej	> 0,99	8.256 ±2.182	-0.610 ±0.033	0,853 ±3.333	62,52 ±3.473
ERΑ	CPRG	Ja	> 0,99	5.068 ±0.616	-0.523 ±0.022	-3.147 ±1.946	68.06 ±3.069
ERΒ	ONPG	Nej	> 0,99	1.041 ±2.004	-0.898 ±4.410	-32.98 ±86.62	248.6 ±778.9
ERΒ	ONPG	Ja	> 0,99	4.327 ±1.289	-1.736 ±0.087	4.654 ±3.087	66.37 ±10.75
ERΒ	CPRG	Nej	= 0,99	5.673 ±1.764	-1.914 ±0.052	3.925 ±1.679	28,05 ±2.334
ERΒ	CPRG	Ja	> 0,99	4.412 ±1.142	-1.894 ±0.051	2.052 ±1.303	22.64 ±2.047

Tabell 3. Modellera parametrar 4-parameter logistiska regressioner för Standard kurvorna i figur 2. Två substrat, ONPG och CPRG, testades med hjälp av jäst att uttrycka 1 av 2 mänskligt östrogenreceptorer (ERα eller ERβ) både utan och med en sex-dagars kyl period efter 17 h ruvning. Parametrar redovisas som uppskattar ±standard fel.

Bilaga 1. Program för beräkning av Lindholm värden.  För att använda programmet först hämta gratis Java-programvara (som anges i Tabellen för material). Öppna sedan programmet Lindholm. Layouten plåt som används med programmet måste vara identiskt med layouten tallrik presenteras i figur 1. Om några prov brunnar inte användes, behålla absorbansen avläsningar från tomma brunnarna som plats innehavare i absorbans datamängden klistras in i programmet Lindholm.  Detta bevarar den rumsliga layouten av plattan i programmet och ser till att media kontrollbrunnar i deras önskad plats.  Dessutom kommer programmet inte att köra om det finns tomma celler. Klistra in OD₄₀₅ avläsningar (för ONPG) eller OD₅₇₄ läsningar (för CPRG) av alla brunnar med tangentbordskommando ”control (ctrl) + v” eller ”command + v”, beroende på vilket operativsystem som används. Ange beloppet av inkubationstiden i timmar för analysen att producera färg (från steg 5,4; exempelvis 0.66667 h för 40 min). Klicka på Nästa. Klistra in i OD₆₁₀ avläsningar från steg 5.3. Klicka på Skicka. Lindholm resultat visas och kan kopieras genom att trycka på ”control (ctrl) + c” eller ”command + c”, beroende på vilket operativsystem som används. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Bilaga 2. Statistisk programvarualternativ för beräkning av EEQs. EEQs kan beräknas med hjälp av en av tre presenterade alternativen.  Riktningar för att använda 1. JMP programvara eller 2. R-kod finns i tillägg 2.  R koden har också konverterats till 3. en ansökningsformat finns på https://furmanbiology.shinyapps.io/YESapp/. Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Bilaga 3. Prova Data samlas in med jäst att uttrycka ERα och CPRG som substrat. Mätningar av OD₆₁₀ och OD₅₇₄ för varje sju E2 standarder, fordon och media kontroller, och en enda representativt PCP ingår, liksom beräknade Lindholm värden. Lindholm värden av standarder användes för att konstruera en fyra-parametern logistisk regressionsmodell av standardkurvan enligt beskrivningen i steg 7A & B ovan. Modellen användes för att interpolera tre exemplar uppskattningar av EEQs av det representativa urvalet i ng/mL i mikroplattan brunnarna. Dessa värden konverterades sedan till EEQs uttryckt i ng/g av provet (steg 8,1). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Discussion

Ja är en låg kostnad metod som används för att upptäcka östrogena ligander i miljöprov, såsom vatten, mat, växt vävnader eller personliga hygienprodukter. Data presenteras här jämför 2 östrogenreceptorer (ERα och ERβ), 2 substrat (ONPG och CPRG) och 2 tidslinjer (2 d utan kylning) och sju dagars protokollet med kyl för att mäta östrogeniciteten i personlig vårdprodukter via Ja analysen. 7 d, kylda protokoll använder CPRG och jäst att uttrycka ERα och/eller ERβ bäst kvantifierar EEQs medan också kompatibel med tidsbrist beslutas av grundutbildning laboratorium-kurser som uppfyller endast en gång / vecka för flera h. I själva verket var jämfört med 2 d analysen utan kylning, sju dagar kyld analysen associerade med minskad varians över plattan replikat. Dessutom utökades något den linjära delen av standardkurvan för data som samlas in med kylda analys. Den linjära delen av standardkurvan definierar assay detektionsområdet och är den enda delen av standardkurvan som kan användas för att interpolera provet EEQs.

I alla utom en av de testa proverna var EEQs mätt med CPRG lägre än de kvantifierade med ONPG. Med en högre extinktionskoefficient och lägre K_m och V_maxär CPRG tio gånger känsligare än ONPG¹⁷. Således, CPRG kan användas vid lägre koncentrationer och kan användas för att detektera lägre mängder β-galaktosidas. Av dessa skäl är CPRG generellt att föredra över ONPG^18,19. Större substrat känslighet förklarar dock inte de lägre EEQ värdena upptäcks med CPRG. Högre EEQ värden upptäcks med ONPG kan bero på matrix störningar med analys, som påpekas av andra författare^2,18. Gula pigment från personlig vård produkt extrakt kunde blåsa EEQ värden upptäcks med ONPG. Andra har kringgått problemet genom pigment kontroller i deras experimentell design², ett synsätt som fördubblar antalet plattor i ett experiment. När matrix störningar kan vara problematiskt, kan CPRG vara att föredra substrat för Ja analysen, även om det är dyrare och kräver längre inkubationstider än ONPG. Dessutom är den färgförändring som induceras genom klyvning av substrat av β-galaktosidas mer dramatisk med CPRG, vilket gör det lättare för eleverna att visualisera resultat.

Miller et al. (2010), som konstruerade den jäst som används i detta protokoll, noterade att jäst som uttrycker ERβ var 30 x mer känsliga för 17β-Östradiol än jäst uttrycker ERα, ett konstaterande som styrks av våra data¹⁴. Bortsett från eventuella nyanser i plasmiden konstruktion, Miller et al. (2010) kunde inte förklara denna skillnad i känslighet¹⁴. En skillnad mellan de två plasmid konstruktioner är att ERα uttryck är reglerat av galaktos, ERβ uttryck regleras av antingen glukos eller galaktos. Jästen används i Ja analysen är odlade i glukos media och endast ges galaktos när de späds ut i början av analysen. Jäst som uttrycker ERβ kan därför ackumuleras högre kopia antalet receptor protein före starten av analysen, vilket ger högre ljuskänslighet östrogena ligander.

Lägre känslighet för ERα-uttryckande jäst kan förklara den högsta andelen icke-påvisande av östrogeniciteten i prover mätt med ERα jämfört med ERβ. För att öka sannolikheten kommer att provet EEQs att upptäckas, användare kunde anställa olika extraktionsmedel och metoder eller lägga till högre volymer av provet i jästen. Om högre provvolymer används bör koncentrationerna av E2 standarder justeras så att samma volym av standarder och prover kan användas i analysen. En begränsning av att lägga till fler prov är att jäst kan tolerera endast 6-10% etanol, med bättre tolerans vid inkubation temperaturer på 30 vs 35 ° C²⁰. För att styra för effekter av etanol på jäst, bör utredare lägga till tre exemplar ”svampinfektion bara” brunnar i plattan layouten och bekräfta att den OD₆₁₀ av dessa ”svampinfektion bara” brunnar är jämförbar med den OD₆₁₀ av fordonet kontrollbrunnar omedelbart efter tillsats av Lindholm buffert. Alternativt kan prover löst i etanol läggas till torr mikrobrunn tallrikar och etanolen avdunstat innan jästen tillsätts. Dimetylsulfoxid (DMSO) används också som ett prov lösningsmedel i Ja-analyser, men slutliga arbetande koncentration DMSO med jäst bör begränsas till 1%¹².

Ja analysen är ett kraftfullt screeningverktyg för att identifiera östrogeniciteten i miljöprover. Specifikt, upptäcker Ja ligander som binder nukleära östrogenreceptorer som samverkar med östrogen svar element direkt gen uttryck¹⁴. Ja har dock också viktiga begränsningar. Ja identifierar inte EEs som arbetar genom icke-nukleära mekanismer såsom membran östrogenreceptorer eller mekanismer som innebär ytterligare inslag såsom Activator Protein 1 (AP-1) transkriptionsfaktorer. Dessutom eftersom jäst inte har samma metaboliska kapacitet som däggdjursceller, kan inte Ja upptäcka ligander som kräver metabolisk aktivering vara östrogena.

Ja analysen inte kan dessutom lätt skilja mellan östrogena och Anti-östrogena ligander i komplexa prover. Istället mäter det netto östrogeniciteten, vilket är summan effekten av östrogena och Anti-östrogena ligander. För att kvantifiera koncentration av ER antagonister eller utvärdera den hämmande effekten av blandningar, kan analysen ändras genom ruvning jäst med både den standard agonist (17β-estradiol) och ett utbud av prov prov koncentrationer¹². Denna process bestämmer om antagonister i proverna kan minska agonist-inducerad reporter aktivitet och ger en användbar skärm för att identifiera närvaron av ER antagonister i prover.

Det protokoll som presenteras här rymmer en mängd olika typer av prov, även om vissa prover kan kräva ändringar av utvinning och prov förberedelsestegen. Exempelvis EEQs varierade kraftigt bland replikerar av vissa personliga hygienprodukter. Mer rörlig proverna tenderade att innehålla oljedroppar eller var annars inte helt homogen, vilket indikerar att ett mer lipofila lösningsmedel såsom dietyleter skulle vara till hjälp. Alternativt, oljor och vax i kroppsvårdsprodukter kunde uteslutas genom att extrahera prover med 50% etanol i stället för 100% etanol.En 50% etanol utvinning kommer också fånga mer vattenlösliga östrogena ligander (t.ex., vissa pigment). Men 50% etanol förångas långsammare än 100% etanol och därmed förlänga utvinning tid. Dessutom var några prover (såsom tvålar) cytotoxiska för jäst, vilket resulterar i minskad cell densiteten mätningar (OD₆₁₀). Fox et al. (2008) föreslår att sådana prover bör spädas ut och testas om cell densiteten skillnader överstiger 30% jämfört med fordon kontroll brunnar¹².

Om ja analysen används för analytiska forskningsändamål, kan utspädning kurvor av provet pooler testas för att preemptively fastställa lämpliga volymer av extraktet läggas till jäst i steg 4,5. Alternativt, extrakt kan provas samtidigt på flera volymer (t.ex., 5 µL och 20 µL extract tillsätts jäst i steg 4,5) eller utspädningar som spänner över flera storleksordningar (t.ex., 0.2 µL, 2 µL och 20 µL). ”Lämpligt” volymer av extrakt är de som identifierar östrogeniciteten genom att matcha Lindholm värden längs den linjära delen av standardkurvan. Optimering förhindrar problem som orsakas av att lägga för mycket eller för lite prov till jästen, såsom cytotoxicitet, falska negativa eller östrogeniciteten som överskrider standardkurvan. Som nämnts ovan, bör volymerna av prover och E2 standarder justeras när olika mängder ligand används sådana att jäst är utsatta för en konsekvent volym och koncentration av etanol eller andra fordon över plattan.

Trots risken för falskt negativ, har ja analysen identifierats som en Tier 3 testverktyg för hormonstörande ämnen av Schug m.fl. (2013), som utvecklade en omfattande nivåindelade protokoll för endokrina störningar (TiPED)²¹. För grundutbildningen är analysen värdefulla för undervisning begrepp relaterade till endokrina störningar, cellodling, receptorbindning, enzymaktivitet, genteknik, statistik och försöksplanering. Studenter som använder analysen också öva grundläggande och allmänt tillämpliga laboratorium färdigheter såsom seriellt späda normer. utvinna prover; göra-lösningar; att konstruera och interpolera standard kurvor; beräkning av koncentrationer. göra-lösningar; visar steril teknik; odling av celler; att identifiera variabler och kontroller. samla, ordna och analysera data. konstruera och tolka grafer; och använder vanlig laboratorieutrustning såsom Mikropipetter och spektrofotometrar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Vortex Mixer (for single or multiple tubes)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-215-365	Any mixer will suffice.
Bucket centrifuge	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	75-063-839	Any bucket centrifuge will suffice if it is capable of centrifuging conical tubes at 4000 rpm.
Bunsen burner	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	17-012-823	Any Bunsen burner will suffice, or an alcohol burner (Fisher Scientific 04-245-1) can be used instead.
Incubator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	50125590H	Any incubator will suffice if it is capable of maintaining 30 °C.
Microplate reader	BioTek (www.biotek.com)	EPOCH2	A different brand of plate reader will suffice if it can measure absorbance at wavelengths of 405, 574, and 610 nm.
Gen5 microplate reader and imager software	BioTek (www.biotek.com)	GEN5	Software required depends on make and model of plate reader; GEN5 software is intended for use with BioTek plate reader.
Refrigerator	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05LREEFSA	Any refrigerator will suffice if it is capable of maintaining 4 °C.
Pipettor or PipetAid compatible with 1 - 10 mL serological pipets	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-681-15E	Any pipettors will suffice if they are compatible with 1 & 10 mL serological pipets.
P10 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144562G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing 5 µl.
P200 micropipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F144565G	Any micropipettor will suffice if it is capable of dispensing up to 200 µl.
P300 multichannel pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FBE1200300	Any multichannel pipettor will suffice if it is capable of dispensing 50 - 205 µl.
Repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164001G	Must be able to deliver 100 - 320 µl; this pipettor is optional because a multichannel pipettor can be used instead.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Sterile 15 mL conical tubes with caps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	05-539-801
Glass scintillation vials	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	03-337-4
Polystyrene 96-well, flat-bottom microplates with lid (nonsterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12565501
Polypropylene 96-well, flat-bottom microplates without lid	Cole-Parmer (www.coleparmer.com)	EW-01728-81
100 mL glass beakers	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-539H	Any glass beakers will suffice if they are autoclavable.
250 mL glass Erlenmeyer flasks	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB500250	Any glass Erlenmeyer flasks will suffice if they are autoclavable.
Sterile, adhesive, porous film	VWR (www.vwr.com)	60941-086
Metal forceps	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	12-000-157	Any metal forceps will suffice.
Reagent reservoir	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	07-200-127
Filtration units (0.2 µm)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	09-761-52
Squirt bottle (for ethanol)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	02-897-10	Any laboratory squirt bottles will suffice.
Autoclavable storage bottles	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	06-414-1D	Any autoclavable glass storage bottles will suffice.
10 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27F	Any glass serological pipets will suffice.
1 mL glass serological pipets (sterile)	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	13-678-27C	Any glass serological pipets will suffice.
P10 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-3810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P200 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-8810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
P300 micropipettor tips	USA Scientific (www.usascientific.com)	1120-9810	Any tips will suffice if they are compatible with the micropipettor above.
Syringe tips for repeating pipettor	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	F164150G	Only required if a repeating pipettor is used.
Sterile petri dishes	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	FB0875712	Any sterile petri dishes will suffice.
Parafilm	Fisher Scientific (www.fishersci.com)	S37440
Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast
Saccharomyces cerevisiae strains that lack the TRP1 gene product (e.g., W303a)	American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)	MYA-151	Recombinant yeast are also available upon request from the authors.
Receptor/reporter plasmid for ERα	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERalpha-5Z (Plasmid #23061)
Receptor/reporter plasmid for ERβ	Addgene (www.addgene.org)	pRR-ERbeta-5Z (Plasmid #23062)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Difco agar	BD (www.bd.com)	214530
Dithiothreitol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	D0632	CAUTION:  Dithiothreitol is an acute skin and eye irritant.  Use appropriate personal protection equipment (gloves, fume hood, dust mask) to avoid skin and eye contact, inhalation and ingestion.
Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	N1127
Chlorophenol red-β-D-galactopyranoside	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	10884308001
Yeast nitrogen base	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	Y0626
Glucose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G8270
Galactose	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	G5388
Adenine sulfate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	A9126
Uracil	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	U0750
Leucine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L8000
Histidine	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	H8000
17 β-Estradiol	Sigma (www.sigmaaldrich.com)                     MP Biomedicals	E8875-250 mg     0219456401 - 1 mg	CAUTION:  Estradiol is a suspected carcinogen and reproductive toxicant.  It is harmful if inhaled, swallowed, or absorbed through skin.  Estradiol may cause harm to breast-fed children and fetuses.  Estradiol is very toxic to aquatic life.  Use appropriate personal protection (gloves, fume hood, dust mask) and avoid exposure during pregnancy and lactation.  Estradiol should be disposed of as hazardous waste and not released to the environment.
100% ethanol	Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)	111000200
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S9638
Sodium phosphate dibasic (anhydrous)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S0876
Magnesium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	M8266
Potassium chloride	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	P9333
Sarkosyl (N-lauroylsarcosine sodium salt)	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	L5125
Sodium carbonate	Sigma (www.sigmaaldrich.com)	S7795
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Excel spreadsheet software	Microsoft		Excel is convenient spreadsheet software for managing data outputs and generating .csv files for R analysis.
Java software (required for Appendix 1 application)	Oracle Corporation		To calculate LacZ values using the application in Appendix 1, first download free Java software (https://www.java.com/en/download/), then open the LacZ application in Appendix 1.  LacZ results created by the application can be copied by pressing "control (ctrl) + c" on PC keyboards, or "command + c" on Mac keyboards.
JMP statistical software version 13.0.0	SAS Institute		Appendix 2 includes directions on using JMP to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve.  The curve is used to interpolate test sample estradiol equivalents (EEQs), relative to the estradiol standard curve.
R statistical computing and graphics software	R Foundation		Free R software can be downloaded from https://www.r-project.org/.  Directions and code for using R to fit LacZ data to a four-parameter logistic regression curve are given in Appendix 2.