Summary
人二尖瓣的蛋白质组成仍然是部分未知的,因为其分析由于细胞数量低,因此通过低蛋白质生物合成而复杂化。这项工作提供了有效提取蛋白质用于二尖瓣蛋白质组分析的方案。
Abstract
细胞蛋白质组学的分析可以帮助阐明基于疾病的分子机制,这是由于技术的发展,允许大规模鉴定和定量复制生物系统中存在的蛋白质。从蛋白质组学方法获得的知识有可能导致更好地了解基础疾病的致病机制,允许鉴定新的诊断和预后疾病标志物,以及希望的治疗靶点。然而,心脏二尖瓣代表蛋白质组学分析的非常具有挑战性的样品,因为蛋白多糖和富含胶原蛋白的细胞外基质的细胞数量较少。这使得挑选提取蛋白质进行全球蛋白质组学分析。该工作描述了与随后的蛋白质分析相容的方案,如定量蛋白质组学和免疫印迹。这可以允许数据关联的相关性g蛋白表达与定量mRNA表达和非定量免疫组化分析数据。实际上,这些方法在一起执行时,可以更全面地了解基因疾病的基因分子机制,从mRNA到翻译后蛋白质的修饰。因此,这种方法可以与对心脏瓣膜病理学研究感兴趣的研究者有关。
Introduction
最近的证据改变了对mRNA合成后发生的许多调节机制的作用的理解。实际上,翻译,转录后和蛋白水解过程可以调节蛋白丰度和功能。假设转录本水平是蛋白质丰度的主要决定因素,mRNA的浓度代表相应蛋白质的代谢 - 已被部分修订。目前,转录本水平仅部分预测蛋白质丰度,这表明转录后事件发生调节细胞内的蛋白质1,2 。
此外,蛋白质最终决定细胞的功能,因此决定其表型,其可以经受自分泌,旁分泌和内分泌因子的响应的动态变化;血液介体;温度;药物治疗和疾病发展换货。因此,以蛋白质水平为重点的表达分析有助于表征蛋白质组,并且揭示其作为疾病发病机理的一部分发生的关键变化3 。
因此,尽管现有的技术挑战,蛋白质组学所提出的澄清健康和疾病状况的机会也是艰巨的。蛋白质组学可以贡献的特别有希望的研究领域包括:在任何水平( 即全细胞或组织,亚细胞区室和生物液体)上鉴定改变的蛋白质表达;用于疾病诊断和预后的新型生物标志物的鉴定,验证和验证;并希望能够鉴定可用于治疗目的的新蛋白质靶标,以及药物功效和毒性的评估。
捕捉复杂性蛋白质组是技术挑战。目前的蛋白质组学工具提供了进行大规模,高通量分析来鉴定,定量和验证改变的蛋白质水平的机会。此外,引入分馏和富集技术,旨在避免由最丰富的蛋白质引起的干扰,还通过包括最少丰富的蛋白质来改善蛋白质鉴定。最后,蛋白质组学被补充了翻译后修饰的分析,其逐渐成为蛋白质功能的重要调节剂。
然而,分析中的生物标本中的样品制备和蛋白质回收仍然是蛋白质组学工作流程中的限制步骤,并增加可能陷阱的潜力5 。事实上,在大多数必须优化的分子生物学技术中,第一步是组织匀浆离子和细胞裂解,特别是在不存在扩增方法的低丰度蛋白质的分析过程中。此外,蛋白质的化学性质可以影响其自身的恢复。例如,高疏水性蛋白质的分析是非常具有挑战性的,因为它们在等电聚焦过程中容易沉淀,而跨膜蛋白几乎不溶(参见参考文献5)。此外,组织组成变异性为开发通用提取方法创造了显着的障碍。最后,由于几乎所有临床标本的数量都是有限的,所以必须以最小的样品量使蛋白质制备具有最大的恢复和重现性。
这项工作描述了从正常人心脏二尖瓣进行蛋白质提取的优化方案,这代表了蛋白质组学分析的非常具有挑战性的样品。正常二尖瓣是一种lex结构位于左心房和心脏左心室之间( 图1 )。它在控制从心房到脑室的血液流量方面起着重要的作用,防止回流,并确保适当的氧气供应给全身,从而保持足够的心输出量。然而,它通常被认为是一种“无活性”组织,细胞率低,组成少,主要是细胞外基质。这是因为在正常情况下,驻留的瓣膜间质细胞(VIC)具有低蛋白质生物合成速率7的静止表型。
然而,已经证明,在病理状态下,海绵体中的VIC的数量增加并且其蛋白质合成被激活,以及其他功能和表型变化8 。因此,最少的数据可用并不奇怪文献集中于病理性二尖瓣9,10的分析,其中活化的VIC的增加的数量可能解释相对较高数量的鉴定的蛋白质。
总之,本议定书可能通过研究二尖瓣蛋白组分来发展对负责二尖瓣疾病的致病机制的理解。事实上,更深入地了解潜在的病理过程可能有助于改善瓣膜疾病的临床管理,其目前的干预指标主要取决于血液动力学考虑因素。
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Protocol
在该方案中,尽管正常的超声心动图参数,在多器官移植(冷缺血时间4-12小时,平均6±2小时)内,从器官移植排除器官移植的技术或功能原因收集人心脏。他们被送到米兰的心血管组织银行Monzino心脏中心(意大利米兰),为主动脉瓣和肺动脉瓣的银行服务。二尖瓣后叶不用于临床目的,因此在从供体亲属获得知情同意后,在主动脉瓣和肺动脉瓣隔离期间收集二尖瓣后叶。移植和研究的组织仅在家长同意后收集;在同意书上,只有在不适合人类临床使用( 即微生物,功能和血清学问题)的情况下,他们授权(或不)使用心脏组织进行研究,遵循伦理委员会的指导方针蒙齐诺心脏中心。
二尖瓣制备
- 器官移植后尽早收集人体二尖瓣(冷缺血时间4-12 h)。
- 在洁净室内,从含有冷(4℃)溶液( 即盐水溶液或平衡介质Eurocollins或威斯康星州)的运输袋中取出心脏。将其放入桶中并放置在生物安全柜(生物危害垂直空气流,A级,良好生产规范(GMP)分类)中,以进行阀门准备。
- 将心脏放在柜内的无菌一次性悬垂物上。使用无菌的一次性手术刀,在距离顶点约4厘米处的左心室和右心室的水平上将心脏完全切开,与其主轴垂直。
- 移动升主动脉和肺动脉显示左心房顶。
- 用无菌高压灭菌镊子和捡拾,切割左耳廓上的左心房顶部,使二尖瓣可见,并允许确定大二尖瓣(前)和小二尖瓣(后)。
注意:前外侧和后内侧合缝定义前叶和后区的边界。 - 使用无菌高压灭菌剪刀和非创伤镊子,解剖左心房和围绕整个二尖瓣周围的心室壁厚度。
- 确定主动脉瓣主动脉瓣连续性。
注意:左心室包含整个二尖瓣和和弦。 - 将二尖瓣二尖瓣分离自二尖瓣后叶小叶,沿着插入与心室切开后叶(连合)。
- 在盐水溶液中洗后叶。将小叶切成小块(<1厘米2 ),并单独包裹在铝箔上。用液氮快速冻结。
注意:使用液氮时应遵循组织安全程序。- 在程序结束时,用70%异丙醇溶液和6%过氧化氢溶液对柜子进行消毒。
蛋白质提取
- 使用镊子拿起储存在液氮中的样品,并立即将其放在干冰上,同时仍然包裹在铝箔中。在转运期间不要让样品解冻。
- 在研磨之前,将研磨机系统( 例如, CryoGrinder)的瓷/锆砂浆和样品与样品一起放入含有液氮(〜500 mL)的杜瓦瓶中。
注意:使用液氮时应遵循组织安全程序。 - 将砂浆和杵放在含干冰的聚苯乙烯箱中。从铝箔上取出样品并放入砂浆中。
- 研磨他用大杵取样15-15次,用螺丝刀旋转杵。在研磨过程中将样品与预先冷却的铲刀的尖端混合。
- 用小杵重复。
- 将研磨的样品转移到先前称重的管( 例如 15mL离心管)上,通过倒置管,将其放置在研钵上,并将它们反转到一起以将样品移动到管中。使用预冷的铲子从砂浆中回收所有材料。
- 将样品保持在干冰上,以避免样品在转移过程中解冻。
- 计算样品的净重。
- 在每个样品后清洁砂浆和杵,并通过高压灭菌或在200℃加热2小时对其进行去污。
- 通过反转将粉末样品从离心管转移到均化器的玻璃管中。
- 加入过滤的尿素缓冲液将r(8M尿素,2M硫脲,4%w / v CHAPS,20mM Tris和55mM二硫苏糖醇)加入到玻璃管中,每10mg粉状组织200μL尿素缓冲液。
注意:离心管中残留的粉末样品可以使用部分计算的尿素缓冲液体积进行回收。 - 使用装有硼硅酸盐玻璃研钵和聚四氟乙烯(PTFE)杵的搅拌器均匀化样品。用搓动(1500转/分钟)将杵慢慢按压到样品上10次。
- 回收上清液并将其转移到干净的1.7 mL离心管中。再次用新鲜的尿素缓冲液提取剩余的样品,加入第一次提取过程中使用的体积的一半。
- 重复步骤2.10。
- 回收上清液并将其与步骤2.11的上清液组合。将合并的上清液放在管旋转器上30分钟。
- 在13,000 xg和4℃下离心管30分钟。
- 恢复上清液d根据制造商的说明书使用Bradford蛋白测定法测量蛋白质浓度。将样品储存在-80°C直到使用。
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Representative Results
蛋白质在尿素缓冲液中的提取和溶解与基于等电聚焦(二维电泳(2-DE) 11和液相等电聚焦(IEF) 12 )的蛋白质组学方法直接相容,并且在Laemmli缓冲液13中稀释后进行免疫印迹含有蛋白酶抑制剂混合物14 。
对于基于无凝胶质谱法( 即与数据无关质谱分析(LC / MS E )和二维LC / MS E (2D-LC / MS E ))相结合的液相色谱法15 ,样品提取在所述的尿素缓冲液中需要进一步处理以除去尿素和硫脲,这可能干扰随后的蛋白质消化和液相色谱分离。氏可以使用商业蛋白质沉淀试剂盒,按照制造商的说明来沉淀蛋白质来完成脱盐步骤。然后将样品溶解在含有0.1%可切割洗涤剂的25mM NH 4 HCO 3中用于蛋白质消化16 。蛋白质的沉淀可以消除缓冲液组分,最小限度影响蛋白质含量(蛋白质回收率> 85%),从而使样品适用于各种分析。
该方案在人二尖瓣的蛋白质提取中的应用允许鉴定总共422个蛋白质,结合先前详细描述的四种不同的蛋白质组学方法11,15。具体来说,通过2-DE鉴定了169个蛋白质,通过液相IEF鉴定了330个蛋白质,通过LC / MS E鉴定了96个蛋白质,以及148个蛋白质通过2D-LC / MS E (表1)。
为了根据亚细胞定位对422种鉴定的蛋白进行分类,使用软件进行基因本体(GO)分析( 例如, Cytoscape)。使用软件及其相应的插件创建的网络显示,除了局限在细胞外区域的预期蛋白质(参见图2的右上部分)外,蛋白质组学方法鉴定的蛋白质大部分来自细胞内区域( 即细胞质,细胞器,囊泡和细胞骨架)。还鉴定了细胞表面蛋白( 图2 )。
在三个独立的二尖瓣样本中进一步证实结果。使用免疫印迹法分析一组四种蛋白质( 即 septin-11,四个和半个LIM结构域蛋白1(FHL-1),dermatopontin和α-晶状体蛋白B(CryAB)),这在二尖瓣正常( 图3 )中从未被发现。
图1:二尖瓣结构。人的心脏的顶视图显示闭合( A )或开放( B )人体二尖瓣。人心脏左心室前视图( C )。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2:在细胞分布方面鉴定的二尖瓣蛋白质的分析。 Cytoscape和插件BiNGO被用来看待n来自细胞组分类别的基因本体(GO)术语的分布。圆尺寸与所选GO项相关联的蛋白质成分的数量成比例,并且报告了超值表示的p值的颜色标度。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3:来自三个人正常二尖瓣小叶的全部提取物中septin-11,FHL-1,皮肤素和CryAB的免疫印迹分析。使用针对CryAB的小鼠单克隆抗体和针对septin-11,FHL-1和皮肤接头抗体的兔多克隆抗体进行免疫印迹。 请点击这里查看此图的较大版本。
加入 | 描述 | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | 液相IEF |
A6NMZ7 | 胶原alpha VI | X | |||
O00151 | PDZ和LIM结构域蛋白1 | X | |||
O00299 | 氯化物细胞内通道蛋白1 | X | |||
O00764 | 吡哆醛激酶 | X | |||
O14558 | 热休克蛋白β6 | X | |||
O43399 | 肿瘤蛋白D54 | X | |||
O43488 | 黄曲霉毒素B1醛还原酶成员2 | X | |||
O43707 | 阿尔法肌动蛋白4 | X | X | ||
O43866 | CD5抗原如前体 | X | |||
O60493 | 排序nexin 3 | X | |||
O60701 | UDP葡萄糖6脱氢酶 | X | |||
O75223 | 未鉴定蛋白 | X | |||
O75368 | SH3结构域结合谷氨酸富含蛋白质 | X | |||
O75390 | 柠檬酸合酶线粒体前体 | X | |||
O75489 | NADH脱氢酶泛醌铁硫蛋白3线粒体前体 | X | X | ||
O75608 | 酰基蛋白硫酯酶1 | X | |||
O75828 | 羰基还原酶NADPH 3 | X | |||
O75874 | 异柠檬酸脱氢酶NADP细胞质 | X | |||
O75955 | 阀蛋白 | X | |||
O94760 | NG NG二甲基精氨酸二甲氨基水解酶1 | X | |||
O94788 | 视网膜脱氢酶2 | X | |||
O95865 | NG NG二甲基精氨酸二甲基氨基水解酶2 | X | X | ||
P00325 | 酒精脱氢酶1B | X | X | ||
P00338 | L乳酸脱氢酶A链 | X | |||
P00352 | 视网膜脱氢酶1 | X | |||
P00441 | 超氧化物歧化酶Cu Zn | X | X | ||
P00450 | 血浆铜蓝蛋白前体 | X | X | ||
P00488 | 凝血因子XIII A链前体 | X | |||
P00491 | 嘌呤核苷磷酸化酶 | X | |||
P00492 | 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 | X | |||
P00558 | 磷酸甘油酸激酶1 | <TD> XX | X | ||
P00568 | 腺苷酸激酶同工酶1 | X | |||
P00734 | 凝血酶原 | X | X | ||
P00738 | 结合珠蛋白 | X | X | X | X |
P00739 | 类胡萝卜素相关蛋白前体 | X | |||
P00751 | 补充因子B | X | X | X | |
P00915 | 碳酸酐酶1 | X | |||
P00918 | 碳酸酐酶2 | X | |||
P01008 | 抗凝血酶III前体 | X | X | X | |
P01009 | Alpha 1抗胰蛋白酶 | X | X | X | X |
P01011 | 阿尔法1抗胰凝乳蛋白酶 | X | X | X | X |
P01019 | 血管紧张素原前体 | X | X | ||
P01023 | 阿尔法2巨球蛋白 | X | X | ||
P01024 | 补体C3 | X | X | X | X |
P01033 | 金属蛋白酶抑制剂1前体 | X | |||
P01042 | 激肽原1前体 | X | |||
P01593 | Igκ链VI区AG | X | |||
P01598 | Ig卡巴链VI区欧盟 | X | |||
P01600 | Ig卡巴链VI区Hau | X | X | ||
P01611 | Ig卡巴链VI区Wes | X | |||
P01620 | Ig卡巴链V III区SIE | X | |||
P01625 | Ig卡巴链V IV区域Len | X | |||
P01766 | Ig重链V III区BRO | X | X | ||
P01781 | Ig重链V III区GAL | X | |||
P01834 | Igκ链C区 | X | X | X | X |
P01842 | Igλ链C区 | X | X | X | |
P01857 | Igγ1链C区 | X | X | X | X |
P01859 | Igγ2链C区 | X | X | X | X |
P01860 | Igγ3链C区 | X | X | X | |
P01861 | Igγ4链C区 | X | X | X | |
P01871 | Ig链C区 | X | X | X | |
P01876 | Igα1链C区 | X | X | X | X |
P01877 | Igα2链C区 | X | |||
P02144 | 肌红蛋白 | X | X | ||
P02452 | 胶原α1 I链 | X | X | X | X |
P02511 | α晶状体B链 | X | |||
P02545 | 层压AC 70kDa层压板 | X | X | X | X |
P02647 | 载脂蛋白AI | X | X | X | X |
P02649 | 载脂蛋白 | X | X | X | X |
P02671 | 纤维蛋白原α链 | X | X | X | X |
P02675 | 纤维蛋白原β链 | X | X | X | X |
P02679 | 纤维蛋白原γ链 | X | X | X | X |
P02689 | 髓磷脂P2蛋白 | X | |||
P02735 | 血清淀粉样蛋白A蛋白前体 | X | |||
P02741 | C反应蛋白前体 | X | |||
P02743 | 血清淀粉样蛋白P成分 | X | X | X | X |
P02746 | 补体C1q亚组分B | X | X | ||
P02747 | 补体C1q亚组分C前体 | X | |||
P02748 | 补充成分C9 | X | X | X | |
P02749 | β2糖蛋白1 | X | X | X | X |
P02750 | 富含亮氨酸的α2糖蛋白前体 | X | |||
P02751 | 纤维连接蛋白 | X | X | ||
P02760 | AMBP蛋白前体 | X | X | X | X |
P02763 | α1酸性糖蛋白1 | X | X | X | |
P02765 | Alpha 2 HS糖蛋白前体 | X | |||
P02766 | 曲氨酸蛋白前体 | X | X | X | |
P02768 | 血清白蛋白 | X | X | X | X |
P02774 | 维生素D结合蛋白前体 | X | |||
P02787 | Serotransferrin | X | X | X | X |
P02788 | 乳酸转铁蛋白前体 | X | |||
P02790 | 血液结合 | X | X | X | X |
P02792 | 铁蛋白轻链 | X | |||
P04004 | 玻 | X | X | X | X |
P04075 | 果糖二磷酸醛缩酶A | X | |||
P04083 | 膜联蛋白A1 | X | X | X | X |
P04179 | 超氧化物歧化酶Mn线粒体前体 | X | |||
P04196 | 组氨酸丰富的糖蛋白前体 | X | |||
P04217 | Alpha 1B糖蛋白前体 | X | X | ||
P04350 | 微管蛋白β4链 | X | |||
P04406 | 甘油醛3磷酸脱氢酶 | X | X | X | X |
P04792 | 热休克蛋白β1 | X | X | X | X |
P05091 | 醛脱氢酶线粒体前体 | X | X | ||
血浆蛋白酶C1抑制剂前体 | X | ||||
P05156 | 补体因子I前体 | X | |||
P05413 | 脂肪酸结合蛋白心脏 | X | |||
P05452 | 叶绿素前体TN | X | X | ||
P05787 | 角蛋白II型细胞骨架8 | X | |||
P06396 | 凝 | X | X | X | X |
P06576 | ATP合酶亚基β线粒体前体 | X | X | ||
P06732 | 肌酸激酶M型 | X | X | ||
P06733 | Alpha烯醇化酶 | X | X | X | X |
P06753 | 原肌球蛋白α3链 | X | X | ||
P07108 | 酰基辅酶A结合蛋白 | X | |||
P07195 | L乳酸脱氢酶B链 | X | X | X | |
P07196 | 神经丝光多肽 | X | |||
P07197 | 神经纤维培养基多肽 | X | X | ||
P07237 | 蛋白二硫键异构酶前体 | X | X | ||
P07339 | 组织蛋白酶D前体 | X | X | ||
P07355 | 膜联蛋白A2 | X | X | X | X |
P07360 | 补充组分C8γ链前体 | X | |||
P07437 | 微管蛋白β链 | X | X | X | X |
P07585 | 核心蛋白聚糖 | X | X | X | X |
P07737 | Profilin 1 | X | |||
P07858 | 组织蛋白酶B前体 | X | |||
P07900 | 热休克蛋白HSP90α | X | X | ||
P07951 | 原肌球蛋白β链 | X | |||
P07954 | 富马酸水合酶线粒体前体 | X | |||
P07996 | 血小板反应蛋白1 | X | X | X | |
P08107 | 热休克70 kDa蛋白1A 1B | X | X | X | X |
P08123 | 胶原α2I链 | X | X | X | X |
P08133 | 膜联蛋白A6 | X | X | ||
P08238 | 热休克蛋白HSP 90 beta | X | X | ||
P08253 | 72 kDa IV型胶原酶前体 | X | |||
P08294 | 细胞外超氧化物歧化酶Cu Znursor | X | X | X | |
P08590 | 肌球蛋白轻多肽3 | X | X | ||
P08603 | 补码因子H | X | X | X | X |
P08670 | 波形蛋白 | X | X | X | X |
P08729 | 角蛋白II型细胞骨架7 | X | |||
P08758 | 膜联蛋白A5 | X | X | X | X |
P09211 | 谷胱甘肽转移酶 | X | X | X | |
P09382 | 半乳凝素1 | X | X | X | |
P09417 | 二氢蝶啶还原酶 | <TD> | X | ||
P09493 | 原肌球蛋白1α链 | X | X | ||
P09525 | 膜联蛋白A4 | X | X | ||
P09651 | 异质核核糖核蛋白A1 | X | |||
P09871 | 补体C1s亚成分前体 | X | |||
P09936 | 泛素羧基末端水解酶同工酶L1 | X | |||
P09972 | 果糖二磷酸醛缩酶C | X | |||
P0C0L4 | 补体C4A前体 | X | |||
P0CG05 | 免疫球蛋白λ2链C区 | X | |||
P0CG38 | POTE ankyrin域家族成员I | X | |||
P10515 | 丙酮酸脱氢酶复合物的二氢硫辛酰赖氨酸残基乙酰转移酶组分 | X | |||
P10768 | 甲酰谷胱甘肽水解酶 | X | |||
P10809 | 60 kDa热休克蛋白线粒体前体 | X | |||
P10909 | 丛生 | X | X | X | X |
P10915 | 透明质酸和蛋白聚糖连接蛋白1前体 | X | X | ||
P11021 | 78 kDa g透明调节蛋白 | X | X | X | |
P11047 | 层粘连蛋白亚基γ1前体 | X | |||
P11142 | 热休克同源71 kDa蛋白 | X | X | X | X |
P11177 | 丙酮酸脱氢酶E1组分亚单位β线粒体前体 | X | |||
P11217 | 糖原磷酸化酶肌肉形态 | X | |||
P11310 | 中链特异性酰基辅酶A脱氢酶线粒体前体 | X | |||
P11413 | 葡萄糖6磷酸酯1脱氢酶 | X | |||
P11766 | 酒精脱氢酶3级链 | X | |||
P12036 | 神经丝重多肽 | X | |||
P12109 | 胶原alpha 1 VI链 | X | X | X | X |
P12110 | 胶原alpha 2 VI链 | X | X | X | X |
P12111 | 胶原alpha 3 VI链 | X | X | X | |
P12277 | 肌酸激酶B型 | X | |||
P12429 | 膜联蛋白A3 | X | X | ||
P12814 | 阿尔法肌动蛋白1 | X | X | ||
P12829 | 肌球蛋白轻多肽4 | X | |||
P12882 | 肌球蛋白1 | X | |||
P12883 | 肌球蛋白7 | X | X | ||
P12955 | Xaa Pro二肽酶 | X | |||
P13489 | 核糖核酸酶抑制剂 | X | |||
P13533 | 肌球蛋白6 | X | X | ||
P13611 | Versican核心蛋白前体 | X | X | ||
P13639 | 伸长因子2 | X | |||
P13716 | 三角洲氨基乙酰丙酸脱水酶 | X | |||
P13796 | Plastin 2 | X | |||
P13804 | 电子转移黄素蛋白亚基α线粒体前体 | X | |||
P13929 | β-烯醇化酶 | X | X | ||
P14136 | 胶质纤维酸性蛋白星形胶质细胞 | X | |||
P14314 | 葡萄糖苷酶2亚基β前体 | X | |||
P14550 | 酒精脱氢酶NADP | X | |||
P14618 | 丙酮酸激酶同功酶M1 M2 | X | X | X | |
P14625 </ TD> | 内啡肽前体 | X | X | ||
P15121 | 醛糖还原酶 | X | |||
P15259 | 磷酸甘油酸变位酶2 | X | |||
P16152 | 羰基还原酶NADPH 1 | X | |||
P17066 | 热休克70 kDa蛋白6 | X | X | X | |
P17174 | 天冬氨酸氨基转移酶细胞质 | X | |||
P17540 | 肌酸激酶肌节线粒体前体 | X | |||
P17661 | 结蛋白 | X | X | X | X |
P17980 | 26S蛋白酶调节亚基6A | X | |||
P17987 | T复合蛋白1亚基α | X | |||
P18206 | 纽蛋白 | X | X | ||
P18428 | 脂多糖结合蛋白前体 | X | |||
P18669 | 磷酸甘油酸变位酶1 | X | |||
P19105 | 肌球蛋白调节轻链2 | X | X | ||
P19623 | 亚精胺合酶 | X | |||
P19652 | α1酸性糖蛋白2前体 | X | X | ||
P19823 | α型胰蛋白酶抑制剂重链H2 | X | |||
P19827 | α型胰蛋白酶抑制剂重链H1 | X | X | ||
P20073 | 膜联蛋白A7 | X | |||
P20618 | 蛋白酶体亚型β1型前体 | X | |||
P20774 | Mimecan | X | X | X | X |
P21266 | 谷胱甘肽S转移酶3 | X | |||
P21333 | 菲拉明A | X | X | ||
P21796 | 电压依赖性阴离子选择通道蛋白1 | X | |||
P21810 | 二聚糖 | X | X | X | X |
P21980 | 蛋白谷氨酰胺γ谷氨酰转移酶2 | X | X | ||
P22105 | Tenascin X | X | X | ||
P22314 | 泛素活化酶E1 | X | |||
P22352 | 谷胱甘肽过氧化物酶3前体 | X | X | ||
P22626 | 异质核核糖核蛋白A2 B1 | X | |||
P22695 | Ubiquinol细胞色素c还原酶复合核心蛋白2线粒体前体 | X | |||
P23141 | 肝羧酸酯酶1前体 | X | |||
P23142 | 纤维蛋白1 | X | X | X | X |
P23284 | 肽基脯氨酰顺反异构酶B前体 | X | |||
P23381 | 色氨酰tRNA合成酶细胞质 | X | |||
P23526 | 腺苷高半胱氨酸酶 | X | X | ||
P23528 | 科菲林1 | X | |||
P24752 | 乙酰CoA乙酰转移酶线粒体前体 | X | |||
P25311 | 锌α2糖蛋白n前体 | X | |||
P25705 | ATP合酶亚基α线粒体 | X | |||
P25788 | 蛋白酶体亚型α3型 | X | X | ||
P25789 | 蛋白酶体亚型α4型 | X | |||
P26447 | 蛋白S100 A4 | X | |||
P27348 | 14 3 3蛋白质theta | X | X | ||
P27797 | 钙网蛋白前体 | X | |||
P28066 | 蛋白酶体亚型α5型 | X | |||
P28070 | <蛋白酶体亚型β4型前体X | X | |||
P28072 | 蛋白酶体亚型β型6型前体 | X | |||
P28074 | 蛋白酶体亚单位β5型前体 | X | |||
P28331 | NADH泛醌氧化还原酶75kDa亚单位线粒体前体 | X | |||
P28838 | 细胞溶素氨基肽酶 | X | |||
P29218 | 肌醇单磷酸酶 | X | |||
P29401 | 转酮醇 | X | |||
P29692 | 伸长系数1 delta | <TD> | X | ||
P29966 | 富含酪胺酰化丙氨酸的C激酶底物 | X | |||
P30040 | 内质网蛋白ERp29前体 | X | |||
P30041 | 过氧化还原酶6 | X | X | ||
P30043 | 黄素还原酶 | X | |||
P30044 | 过氧化还原毒素5线粒体前体 | X | |||
P30085 | UMP CMP激酶 | X | |||
P30086 | 磷脂酰乙醇胺结合蛋白1 | X | |||
P30101 | Protei二硫化物异构酶A3前体 | X | X | X | |
P30613 | 丙酮酸激酶同工酶RL | X | |||
P30740 | 白细胞弹性蛋白酶抑制剂 | X | |||
P31025 | Lipocalin 1前体 | X | |||
P31937 | 3羟基异丁酸脱氢酶线粒体前体 | X | |||
P31942 | 异质核核糖核酸蛋白H3 | X | |||
P31943 | 异质核核糖核蛋白H | X | |||
P31946 | 14 3 3蛋白βα | X | X | ||
P31948 | 应激诱导的磷蛋白1 | X | |||
P31949 | 蛋白S100A11 | X | |||
P32119 | 过氧氧化还原酶2 | X | X | ||
P34931 | 热休克70 kDa蛋白1 | X | X | ||
P34932 | 热休克70 kDa蛋白4 | X | |||
P35232 | 抑制素 | X | |||
P35237 | Serpin B6 | X | |||
P35443 | 血小板反应蛋白4 | X | </ TR> | ||
P35555 | 纤维蛋白1 | X | X | ||
P35579 | 肌球蛋白9 | X | X | X | |
P35580 | 肌球蛋白10 | X | X | ||
P35609 | 阿尔法肌动蛋白2 | X | |||
P35625 | 金属蛋白酶抑制剂3 | X | X | ||
P35998 | 26S蛋白酶调节亚基7 | X | |||
P36871 | 磷酸调解酶1 | X | X | ||
P36955 | 颜料上皮衍生因子 | X | X | ||
P37802 | <td> Transgelin 2X | X | |||
P37837 | 转醛 | X | |||
P38117 | 电子转移黄素蛋白亚基β | X | |||
P38646 | 应激70蛋白线粒体前体 | X | X | ||
P39687 | 酸性亮氨酸富含核蛋白32个家族成员A | X | |||
P40121 | 巨噬细胞封端蛋白 | X | |||
P40925 | 苹果酸脱氢酶细胞质 | X | |||
P40926 | 苹果酸脱氢酶线粒体前体 | <TD> | X | ||
P41219 | 外周 | X | |||
P42330 | Aldo酮还原酶家族1成员C3 | X | |||
P45880 | 电压依赖性阴离子选择通道蛋白2 | X | |||
P47755 | F肌动蛋白封端蛋白亚基α2 | X | X | ||
P47756 | F肌动蛋白封端蛋白亚基β | X | X | ||
P47985 | Ubiquinol细胞色素c还原酶铁硫亚单位线粒体前体 | X | |||
P48047 | ATP合酶O亚单位线粒体前体 | X | |||
P48637 | 谷胱甘肽合成酶 | X | |||
P48741 | 热休克70 kDa蛋白7 | X | X | ||
P49189 | 4三甲基氨基丁醛脱氢酶 | X | |||
P49368 | T复合蛋白1亚基γ | X | |||
P49747 | 软骨低聚基质蛋白 | X | X | X | X |
P49748 | 非常长链特异性酰基辅酶A脱氢酶线粒体前体 | X | |||
P50395 | Rab GDP解离抑制剂β | X | X </ TD> | ||
P50454 | Serpin H1前体 | X | |||
P50995 | 膜联蛋白A11 | X | |||
P51452 | 双重特异性蛋白磷酸酶3 | X | |||
P51884 | 基膜聚糖 | X | X | X | X |
P51888 | 前列腺素前体 | X | X | X | X |
P52565 | Rho GDP解离抑制剂1 | X | |||
P52566 | Rho GDP解离抑制剂2 | X | |||
P54652 | 热休克相关70 kDa蛋白2 | X | X | X | X |
P55072 | 过渡性内质网ATP酶 | X | |||
P55083 | 微纤维相关糖蛋白4前体 | X | X | ||
P57053 | 组蛋白H2B型F | X | |||
P60174 | 三磷酸异构酶 | X | X | X | |
P60660 | 肌球蛋白轻多肽6 | X | X | ||
P60709 | 肌动蛋白细胞质1 | X | X | X | X |
P60981 | Destrin | X | |||
P61086 | 泛素缀合酶E2 25 kDa | X | |||
P61088 | 泛素缀合酶E2 | X | |||
P61224 | Ras相关蛋白Rap 1b前体 | X | |||
P61978 | 异质核核糖核蛋白K | X | X | ||
P61981 | 14 3 3蛋白质γ | X | X | X | |
P62258 | 14 3 3蛋白质ε14 3 3E | X | |||
P62491 | Ras相关蛋白 | X | |||
P62714 | 丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶2A催化亚基β亚型 | X | |||
P62736 | 肌动蛋白主动脉平滑肌 | X | X | X | |
P62805 | 组蛋白H4 | X | |||
P62826 | GTP结合核蛋白Ran | X | |||
P62873 | 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白GIGSGT亚基β1 | X | |||
P62879 | 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白GIGSGT亚基β2 | X | |||
P62937 | 肽基脯氨酰顺反异构酶A | X | X | ||
P62987 | 泛素60S核糖体蛋白L40 | X | |||
P63104 | 14 3 3亲in eta三角洲 | X | X | X | X |
P63241 | 真核翻译起始因子5A 1 | X | |||
P63244 | 鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基β2如1 | X | |||
P63267 | 肌动蛋白γ肠平滑肌 | X | X | ||
P67936 | 原肌球蛋白α4链 | X | |||
P68032 | 肌动蛋白α心肌1 | X | |||
P68104 | 伸长因子1 alpha 1 | X | X | X | |
P68133 | 肌动蛋白α骨骼肌 | ||||
P68363 | 微管蛋白α1B链 | X | X | X | |
P68371 | 微管蛋白β2C链 | X | X | X | |
P68402 | 血小板活化因子乙酰水解酶IB亚单位β | X | |||
P68871 | 血红蛋白亚基β | X | X | X | |
P69905 | 血红蛋白亚基α | X | X | ||
P78371 | T复合蛋白1亚基β | X | |||
P78417 | 谷胱甘肽转移酶ω1 | X | X | ||
P80748 | Igλ链VI二区LOI | X | |||
P98095 | 纤维蛋白2 | X | X | ||
Q01082 | Spectrinβ链脑1 | X | |||
Q01449 | 肌球蛋白调节轻链2心房同种型 | X | |||
Q01518 | 腺苷酸环化酶相关蛋白1 | X | |||
Q01995 | Transgelin平滑肌蛋白22α | X | |||
Q03252 | Lamin B2 | X | X | ||
Q03591 | 补体因子H相关蛋白1前体 | X | Q04917 | 14 3 3蛋白质等 | X | X |
Q06323 | 蛋白酶体激活剂复合亚单位1 | X | |||
Q06828 | 纤 | X | X | X | X |
Q06830 | 过氧化还原酶1 | X | X | ||
Q07507 | 皮肤桥 | X | X | X | X |
Q07960 | Rho GTPase激活蛋白1 | X | |||
Q08257 | 喹诺酮氧化还原酶 | X | |||
Q08431 | 乳凝集素 | X | X | ||
Q12765 | 小号ecernin 1 | X | |||
Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4二烯酰辅酶A异构酶线粒体前体 | X | X | ||
Q13228 | 硒结合蛋白1 | X | X | ||
Q13404 | 泛素缀合酶E2变体1 | X | |||
Q13409 | 细胞质动力蛋白1中间链2 | X | |||
Q13509 | 微管蛋白β3链 | X | X | X | |
Q13642 | 四个半LIM域蛋白1 | X | |||
Q13765 | 激素多肽相关复合亚单位α | X | |||
Q13885 | N微管蛋白β2A链 | X | X | ||
Q14194 | 二氢嘧啶酶相关蛋白1 | X | |||
Q14195 | 二氢嘧啶酶相关蛋白3 | X | X | X | X |
Q14624 | α型胰蛋白酶抑制剂重链H4前体 | X | |||
Q14697 | 中性α葡糖苷酶AB前体 | X | |||
Q14764 | 主要蛋白质 | X | |||
Q14767 | 潜在的转化生长因子β结合蛋白2 | X | <TD>X | ||
Q14894 | Mu晶体蛋白同源物NADP调节甲状腺激素结合蛋白 | X | |||
Q15063 | 骨膜素前体 | X | X | X | X |
Q15084 | 蛋白二硫键异构酶A6前体 | X | |||
Q15113 | Procollagen C内肽酶增强子1前体 | X | |||
Q15181 | 无机焦磷酸酶 | X | |||
Q15365 | 聚rC结合蛋白1 | X | |||
Q15366 | Poly rC结合蛋白2 | X | |||
Q15582 | 转化生长因子β诱导蛋白 | X | X | X | |
Q15819 | 泛素缀合酶E2变体2 | X | |||
Q16352 | Alpha internexin | X | |||
Q16473 | 推定腱生蛋白XA | X | |||
Q16555 | 二氢嘧啶酶相关蛋白2 | X | X | X | |
Q16698 | 2 4二烯酰辅酶A还原酶线粒体前体 | X | |||
Q16891 | 线粒体内膜 | X | |||
Q562R1 | β肌动蛋白如蛋白2 | X | |||
Q6S8J3 | POTE ankyrin域家族成员E | X | |||
Q6UWY5 | 茉莉香素类似蛋白1前体 | X | X | ||
Q71U36 | 微管蛋白α1A链 | X | X | X | |
Q7Z7G0 | 目标Nesh SH3前体 | X | X | X | |
Q8WUM4 | 程序性细胞死亡6相互作用蛋白 | X | |||
Q8WWX9 | 硫氧还蛋白如硒蛋白M前体 | X | |||
Q92597 | 蛋白NDRG1 | X | |||
Q92945 | 远上游元件结合蛋白2X | ||||
Q96CN7 | 含有蛋白质的等位基因组域1 | X | |||
Q96CX2 | BTB POZ结构域含有蛋白质 | X | |||
Q96KK5 | 组蛋白H2A 1 H | X | X | ||
Q96KP4 | 细胞因子非特异性二肽酶 | X | |||
Q99426 | 微管蛋白特异性伴侣B | X | |||
Q99497 | 蛋白质DJ 1 | X | X | ||
Q99536 | 突触小泡膜蛋白 | X | X | X | |
Q99714 | 3羟酰基CoA脱氢酶2型 | X | |||
Q99715 | 胶原alpha 1 XII链 | X | X | ||
Q99798 | 乌头酸水合酶线粒体前体 | X | |||
Q9BQE3 | 微管蛋白α6链 | X | |||
Q9BUF5 | 微管蛋白β6链 | X | X | ||
Q9BUT1 | 3羟基丁酸脱氢酶2型 | X | |||
Q9BVA1 | 微管蛋白β2B链 | X | X | X | |
Q9BXN1 | Asporin | X | X </ TD> | X | X |
Q9H0W9 | 酯水解酶C11orf54 | X | |||
Q9H4B7 | 微管蛋白β1链 | X | |||
Q9NRN5 | 茉莉素类似蛋白3前体 | X | X | ||
Q9NRV9 | 血红蛋白结合蛋白1 | X | |||
Q9NSB2 | 角蛋白II型角质层Hb4 | X | X | ||
Q9NVA2 | Septin 11 | X | |||
Q9UBR2 | 组织蛋白酶Z前体 | X | |||
Q9UBX5 | 纤维蛋白5 | X | X | ||
Q9UK22 | F盒只蛋白2 | X | |||
Q9Y277 | 电压依赖性阴离子选择通道蛋白3 | X | |||
Q9Y281 | 科菲林2 | X | |||
Q9Y490 | 塔林1 | X | |||
Q9Y696 | 氯化物细胞内通道蛋白4 | X | |||
Q9Y6C2 | EMILIN 1 | X | X |
表1:应用四种不同蛋白质组学方法时在二尖瓣组织提取物中鉴定的蛋白质列表:二维电泳(2-DE),二维LC-MS E (2D-LC / MS E ),LC / MS E和液相IEF。报道了鉴定每种蛋白质的方法。
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Discussion
该方案的一个关键步骤是使用液氮冷冻样品并冷却研磨机系统。液氮的使用可防止生物降解并有效地进行粉末化,但需要对培训进行安全处理。
在该协议中,具有用于样品研磨的研磨机系统,因为小样品难以从标准的砂浆和杵中回收。在这种情况下,小样品作为细粉扩散到砂浆表面,使收集困难。另一个优点是研磨机是电动的,这允许以可再现的方式处理更多数量的样品并且没有增加的疲劳。对研磨机的使用的一个限制是,必须将杵的力量小(100mg或更少)的样品的尺寸有效地压在砂浆上。此外,研磨机组件必须在清洁用途之间加热至室温 G。因此,该过程是耗时的,并且如果每天处理许多样品,则需要许多组。
另外的关键步骤是提取缓冲液的制备。盐浓度,特别是尿素(8M)和硫脲(2M)的浓度相当高;因此,盐的体积几乎是溶液总体积的一半。此外,考虑到必须避免热量,溶解是不容易的,因为在大于37℃时,尿素可导致蛋白质/肽的N末端和赖氨酸和精氨酸残基17的侧链氨基处的蛋白质氨基甲酰化。一旦溶解,尿素缓冲液必须用0.22μm过滤器过滤,并且可以在-80℃下储存4周而不影响其提取效果,但是在使用之前必须将其温热至15℃以上才能完全溶解。
修改和故障排除
在本协议中,使用所述的尿素缓冲液进行蛋白质提取,因为它是用于蛋白质组研究的最常用的蛋白质提取溶液之一,因为其与等电聚焦的相容性及其在溶解微溶蛋白中的效率18已经被证明这种缓冲液可以非常有效地溶解微溶蛋白,例如整合膜蛋白19或高度易于聚集的蛋白质,如微管蛋白18 ,此外,该缓冲液与Bradford测定法完全相容以确定蛋白质浓度,它可以直接用于2-DE和液相IEF分析。然而,该缓冲液对于溶解样品中存在的所有蛋白质不是理想的。不同的提取缓冲液有可能揭示该方案不可检测的蛋白质。例如,它是很好的kno可以用酸提取或三氯乙酸/丙酮沉淀20更好地提取核糖体和核蛋白,而碱性pH水平更适合于膜蛋白21,22 。因此,使用替代缓冲液可能需要额外的蛋白质沉淀步骤来消除干扰2-DE或液相IEF的盐。
技术的局限性
通过该方案鉴定的蛋白质数量相对较少,但是通过使用更现代的仪器,可以进一步提高鉴定数量和蛋白质组学分析的覆盖范围,这些仪器的质量准确度和测序速度在过去几年中急剧增加23 ,可以通过采用长时间的液体梯度梯度来覆盖大部分蛋白质组,无需任何预分步骤与高分辨率MS仪器相结合,具有快速排序速度24 。
技术对现有/替代方法的重要意义
识别和量化人类心脏瓣膜中的蛋白质(如二尖瓣)的能力是一个重要且具有挑战性的任务,有助于阐明瓣膜疾病中生理/病理过程的机制。定义二尖瓣蛋白质组的变化将大大增加对与组织疾病状态相关的生物过程的性质的理解。
目前关于二尖瓣病理生理学的知识是有限的,通常通过分析涉及特定过程的个体蛋白质,如细胞外基质重塑,止血,炎症或氧化应激25 9,10的分析中。
缺乏综合的蛋白质组学研究可归因于细胞外基质蛋白( 即蛋白聚糖,胶原蛋白和弹性蛋白)高度富含的这种低细胞组织的复杂性。这些蛋白质占总量的约80%,妨碍了低丰度蛋白质26的分析。
因此,为了描述该组织的蛋白质组,需要建立一种有效的提取方案以使蛋白质溶解最大化。该方案允许从1mg组织中提取约50μg蛋白质。与“软”组织相比,这是相对较低的产量作为肝脏(从1mg组织中〜135μg),但对各个样品进行蛋白质分析就足够了。这在定义现象的个体内变异性时尤为重要。
此外,该方法具有与许多分析应用兼容的优点。溶解在所提出的提取缓冲液中的二尖瓣蛋白质可以直接用于基于二维电泳和液相电泳11,12的免疫印迹和蛋白质组学分析,或者在蛋白沉淀后,为了消除缓冲液成分的干扰,可用于其他测定,例如无凝胶质谱法15 。
随着该提取方案的应用,通过鉴定许多细胞内质粒获得正常二尖瓣组织的蛋白质组分的更详尽的表征细胞蛋白。这些蛋白质不仅在细胞外基质中位于胞质溶胶或细胞器中,而且具有不同的分子和生物功能。还鉴定了其他有趣的蛋白质( 即 CryAB,septin-11,FHL-1和皮肤粘蛋白)。这些蛋白质在二尖瓣中具有未知功能,但其生物学特性表明在瓣膜疾病中可能起作用。
掌握此技术后的未来应用或方向
使用该方案,可以将关于蛋白质表达的数据与定量mRNA表达和非定量免疫组织化学分析的数据相关联。事实上,当一起使用这些方法将导致更全面地了解从mRNA到翻译后蛋白质修饰的基础疾病的分子机制。因此,这种方法对于集中在心脏瓣膜病理生理学的研究人员而言是值得关注的。鳍该方案也可应用于与二次阀27非常相似的猪二尖瓣,并用作阀功能评估的实验模型。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
意大利卫生部支持这项研究(RC 2013-BIO 15)。我们非常感谢Barbara Micheli的优秀技术援助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
Stainless steel forceps | |||
Stainless steel spatula | |||
Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
Stainless steel picks | Autoclavable | ||
Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
Micropipette, 1 mL, with tips | |||
15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
Tube rotator | Pbi International | F205 | |
Liquid nitrogen | |||
Aluminum foil | |||
Ice | |||
Polystyrene box | |||
Dry ice | |||
Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
Freezer -80°C | |||
Precision balance | |||
Autoclave | For sterilization | ||
Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
Gloves | |||
Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
RapiGest | Waters | 186001861 | |
Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
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