Summary
Proteinsammensætningen af den humane mitralventil er stadig delvis ukendt, fordi dens analyse er kompliceret ved lav cellulæritet og derfor ved lav proteinbiosyntese. Dette arbejde tilvejebringer en protokol til effektivt at ekstrahere protein til analyse af mitralventilproteomet.
Abstract
Analyse af det cellulære proteom kan bidrage til at belyse de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdomme som følge af udviklingen af teknologier, som muliggør storskala identifikation og kvantificering af de proteiner, der er til stede i komplekse biologiske systemer. Den viden, der opnås ved en proteomisk tilgang, kan potentielt føre til en Bedre forståelse af de patogene mekanismer, der ligger til grund for sygdomme, hvilket muliggør identifikation af nye diagnostiske og prognostiske sygdomsmarkører og forhåbentlig af terapeutiske mål. Imidlertid repræsenterer den kardiale mitralventil en meget udfordrende prøve til proteomanalyse på grund af den lave cellularitet i proteoglycan og kollagen beriget ekstracellulær matrix. Dette gør det udfordrende at udvinde proteiner til en global proteomanalyse. Dette værk beskriver en protokol, der er kompatibel med efterfølgende proteinanalyse, såsom kvantitativ proteomik og immunoblotting. Dette kan muliggøre korrelation af data vedrG-proteinekspression med data om kvantitativ mRNA-ekspression og ikke-kvantitativ immunhistokemisk analyse. Faktisk vil disse tilgange, når de udføres sammen, føre til en mere omfattende forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdomme, fra mRNA til posttranslationel protein modifikation. Denne metode kan således være relevant for forskere, der er interesseret i undersøgelsen af hjerteventil-fysiopatologi.
Introduction
Nylige beviser har ændret forståelsen af rollerne i de mange reguleringsmekanismer, der opstår efter mRNA-syntese. Faktisk kan translationelle, post-transkriptionelle og proteolytiske processer regulere protein overflod og funktion. Dogmen - som siger, at mRNA-koncentrationer er proxier til de tilsvarende proteiner, forudsat at transkriptionsniveauerne er den vigtigste determinant for protein overflod - er blevet delvist revideret. Indeholdt transkriptniveauer kun delvist forudsige proteinabundance, hvilket tyder på, at posttranskriptionelle hændelser Forekomme for at regulere proteinerne i cellerne 1 , 2 .
Desuden dikterer proteiner i sidste ende cellens funktion og dicterer derfor dens fænotype, som kan undergå dynamiske ændringer som reaktion på autokrine, parakrine og endokrine faktorer; Blodbårne mediatorer; temperatur; Lægemiddelbehandling; Og sygdomsudviklingenling. Således er en ekspressionsanalyse, der er fokuseret på proteinniveauet, nyttig til at karakterisere proteomet og for at løse de kritiske forandringer, der forekommer for det som en del af sygdomspatogenese 3 .
Derfor er mulighederne for proteomics til at klarlægge helbredstilstand og sygdomsbetingelser formidabel, på trods af de eksisterende teknologiske udfordringer. De særligt lovende forskningsområder, som proteomics kan bidrage med, omfatter: Identifikation af ændret proteinekspression på ethvert niveau ( dvs. hele celler eller væv, subcellulære rum og biologiske væsker); Identifikation, verifikation og validering af nye biomarkører, der er nyttige til diagnose og prognose for sygdom Og forhåbentlig identifikation af nye proteinmål, der kan anvendes til terapeutiske formål, samt til vurdering af lægemiddelvirkningsevne og toksicitet 4 .
Fange kompleksiteten afProteomet repræsenterer en teknologisk udfordring. De nuværende proteomiske værktøjer giver mulighed for at udføre storskala, høj gennemstrømningsanalyse til identifikation, kvantificering og validering af ændrede proteinniveauer. Derudover har indførelsen af fraktionerings- og berigelsesmetoder, der har til formål at undgå interferens forårsaget af de mest rigelige proteiner, også forbedret proteinidentifikation ved at inkludere de mindst rigelige proteiner. Endelig er proteomics blevet suppleret med analysen af posttranslationelle modifikationer, som progressivt fremkommer som vigtige modulatorer af proteinfunktion.
Prøveforberedelsen og proteingendannelsen i de biologiske prøver under analyse forbliver imidlertid de begrænsende trin i den proteomiske arbejdsgang og øger potentialet for mulige faldgruber 5 . Faktisk skal de første trin i vævshomogenizat i de fleste molekylærbiologiske teknikker, der skal optimeresIon og celle lysis, især under analysen af proteiner med lavt indhold, for hvilke amplifikationsmetoder ikke eksisterer. Derudover kan proteinernes kemiske natur påvirke deres egen genopretning. Eksempelvis er analysen af stærkt hydrofobe proteiner meget udfordrende, fordi de let fælder under isoelektrisk fokusering, mens trans-membranproteiner er næsten uopløselige (gennemgået i Reference 5). Endvidere skaber vævsammensætningens variabilitet en betydelig barriere for udvikling af en universel ekstraktionsmetode. Endelig, fordi næsten alle de kliniske prøver er af begrænset mængde, er det essentielt at muliggøre proteinpræparation med maksimal genvinding og reproducerbarhed fra minimale prøve mængder 6 .
Dette værk beskriver en optimeret protokol til proteinudvinding fra den normale mitralventil, som er en meget udfordrende prøve til proteomanalyse. Den normale mitralventil er en kompLex struktur liggende mellem venstre atrium og venstre ventrikel i hjertet ( figur 1 ). Det spiller en vigtig rolle i kontrollen af blodgennemstrømning fra atriumet til ventriklen, forhindrer tilbagestrømning og sikrer det korrekte niveau af iltforsyning til hele kroppen og derved opretholder en passende hjerteudgang. Imidlertid anses det ofte for at være et "inaktivt" væv med lav cellulæritet og få komponenter, hovedsagelig i den ekstracellulære matrix. Dette skyldes, at de residente valvulære interstitiale celler (VIC'er) under normale betingelser frembyder en hvilende fænotype med en lav proteinbiosyntesehastighed 7 .
Imidlertid er det blevet påvist, at i en patologisk tilstand øges antallet af VIC'er i spongiosa og deres proteinsyntese aktiveres sammen med andre funktionelle og fænotypiske ændringer 8 . Det er derfor ikke overraskende, at de minimale data, der er tilgængelige iLitteraturen fokuserer på analysen af patologiske mitralventiler 9 , 10 , hvor det øgede antal aktiverede VIC'er kan forklare det forholdsvis høje antal identificerede proteiner.
Som konklusion kan den foreliggende protokol tjene til at udvikle forståelsen af de patogene mekanismer, der er ansvarlige for mitralventil sygdomme gennem undersøgelsen af mitralventilproteinkomponenter. En større forståelse af de underliggende patologiske processer kunne faktisk bidrage til at forbedre den kliniske styring af ventilsygdomme, hvis nuværende indikationer for intervention i høj grad er baseret på hæmodynamiske overvejelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
I denne protokol indsamles de menneskelige hjerter under multiorgan explantation (kold iskæmitid på 4-12 timer, gennemsnit 6 ± 2 timer) fra multorgendonorer ekskluderet fra organtransplantation af tekniske eller funktionelle årsager til trods for normale ekkokardiografiske parametre. De sendes til Cardiovascular Tissue Bank i Milano, Monzino Cardiologic Center (Milano, Italien) til banklægning af aorta og lungeventiler. Mitral posterior folderne anvendes ikke til kliniske formål, så de samles under aorta- og lungeventilisolering efter informeret samtykke fra donorernes slægtninge. Vävet til transplantation og forskning indsamles først efter forældres samtykke; På godkendelsesarket tillader de (kun) at bruge hjertevævet til forskning, hvis det ikke er egnet til human klinisk brug ( dvs. mikrobiologiske, funktionelle og serologiske problemer) i overensstemmelse med retningslinjerne i etiske udvalgsMonzino Cardiologic Center.
1. Mitral ventil forberedelse
- Høst den humane mitralventil hurtigst muligt efter organteksplantering (kold iskæmistid på 4-12 timer).
- I et rent rum skal du fjerne hjertet fra transportposen, der indeholder en kold (4 ° C) opløsning ( dvs. saltopløsning eller afbalanceret medium Eurocollins eller Wisconsin). Sæt den i en spand og læg den i et biosikkerhedsskabe (biohazard vertikal luftstrøm, klasse A, god fremstillingspraksis (GMP)) for at fortsætte med ventilpræparatet.
- Placer hjertet på en steril engangsdug i kabinettet. Ved hjælp af en steril engangs scalpel skal du klippe hjertet helt, vinkelret på dets hovedakse, på niveauet af venstre og højre ventrikel, ca. 4 cm væk fra toppen.
- Flyt den stigende aorta og lungearterien for at vise det venstre atrielle tag.
- Med sterile autoklaverbare pincett og plukker skæres den venstre auricle påVenstre atrieltak, der gør mitralventilen synlig og giver mulighed for at identificere den store mitralbrochure (anterior) og den lille mitralbrochure (bageste).
BEMÆRK: Antero-lateral og de bakre mediale kommissar definerer grænsen på den forreste folder og det bageste område. - Ved hjælp af sterile autoklaverbare saks og ikke-traumatiske tænger, dissekere venstre atrium og ventrikelvægtykkelse rundt om hele mitralventilens omkreds .
- Identificer mitro-aorta ventil kontinuitet.
BEMÆRK: Venstre ventrikel indeholder hele mitralventilen og akkorderne. - Separér den fremre mitralventilfolie fra den bageste mitralventilblade, og skær den bageste folder langs indsættelsen med ventriklen (kommissur).
- Vask den bageste folder i saltvandsløsningen. Skær folderen i små stykker (<1 cm 2 ) og pakk dem individuelt i aluminiumfolie. Snapfrys dem med flydende nitrogen.
Forsigtig: Følg organisatoriske sikkerhedsprocedurer, når du bruger flydende nitrogen.- Sanitér bordet af kabinettet med en 70% isopropylalkoholopløsning og en 6% hydrogenperoxidopløsning ved afslutningen af proceduren.
2. Proteinekstraktion
- Brug pincet til at samle prøven opbevaret i flydende kvælstof og straks placere det på tøris, mens det stadig er indpakket i aluminiumsfolien. Forlad ikke prøven til optøning under overførsler.
- Før slipning afkøles porcelæn / zirconiummørtel og pistler i et slibesystem ( f.eks. CryoGrinder) sammen med prøven ved at sætte dem i en Dewar kolbe indeholdende flydende nitrogen (~ 500 ml).
Forsigtig: Følg organisatoriske sikkerhedsprocedurer, når du bruger flydende nitrogen. - Sæt mørtel og pestles i en polystyren kasse indeholdende tøris. Fjern prøven fra aluminiumsfolien og læg den i mørtel.
- Grind tHan prøver med den store støvler mod mørtelen 15-20 gange ved at bruge skruetrækker til at dreje pistlen. Bland prøven med spidsen af en forkølet spatel under slibeprocessen.
- Gentag med den lille stamme.
- Overfør grundprøven til et tidligere vejet rør ( f.eks. 15 ml centrifugerør) ved at dreje røret, placere det over mørtelen og vende dem sammen for at flytte prøven til røret. Brug en forkølet spatel til at genvinde alt materiale fra mørtel.
- Hold røret med prøven på tøris for at undgå prøveoptøning under overførslen.
- Beregn nettovægten af prøven.
- Rengør mørtel og pestles efter hver prøve og dekontaminere dem ved autoklavering eller opvarmning dem ved 200 ° C i 2 timer.
- Overfør den pulveriserede prøve fra centrifugerøret til glasrøret i en homogenisator ved inversion.
- Tilsæt filtreret urea buffeR (8 M urea, 2 M thiourinstof, 4% w / v CHAPS, 20 mM Tris og 55 mM dithiotreitol) til glasrøret, 200 μl urinstofpuffer for hver 10 mg pulveriseret væv.
BEMÆRK: Resterende pulveriseret prøve tilbage i centrifugerøret kan udvindes under anvendelse af en del af det beregnede volumen urinstofpuffer. - Homogeniser prøven ved hjælp af en omrører udstyret med en borosilicatglasmørtel og en polytetrafluorethylen (PTFE) -pestle. Tryk langsomt pestlen på prøven med en vridningsbevægelse (1500 rpm) 10 gange.
- Genindvind supernatanten og overfør den til et rent 1,7 ml centrifugerør. Genindvind igen den resterende prøve med frisk urinstofbuffer, og tilsæt halvdelen af det volumen, der blev brugt under den første ekstraktion.
- Gentag trin 2.10.
- Genindvind supernatanten og kombiner den med supernatanten fra trin 2.11. Anbring den kombinerede supernatant på en rørrotator i 30 minutter.
- Centrifuger røret i 30 minutter ved 13.000 xg og 4 ° C.
- Gendan supernatanten anD måle proteinkoncentrationen ved hjælp af Bradford-proteinassayet, ifølge producentens anvisninger. Opbevar prøven ved -80 ° C indtil brug.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ekstraktionen og opløsningen af proteiner i urinstofpufferen er direkte kompatibel med proteomiske metoder baseret på isoelektrofokusering (todimensionel elektroforese (2-DE) 11 og flydende fase isoelektrisk fokusering (IEF) 12 ) og med immunoblottning efter fortynding i Laemmli-buffer 13 Indeholdende en proteaseinhibitor cocktail 14 .
For gel-fri massespektrometri-baserede metoder ( dvs. væskekromatografi koblet til datauafhængig massespektrometrianalyse (LC / MS E ) og todimensionel LC / MS E (2D-LC / MSE)) 15 blev prøverne ekstraheret I den beskrevne urinstofpuffer skal yderligere behandles for at eliminere urinstof og thiourinstof, som kunne interferere med efterfølgende proteinfordøjelse og væskekromatografiseparation. ThiS afsaltningstrin kan udføres under anvendelse af de kommercielle proteinudfældningssæt efter fabrikantens instruktioner til udfældning af proteinerne. Prøven kan derefter opløses i 25 mM NH4HCO3 indeholdende 0,1% spaltbare detergenter til proteinfordøjelse 16 . Udfældningen af proteinerne kan eliminere bufferkomponenter, der minimerer proteinindholdet (proteingendannelse:> 85%), hvilket gør prøven egnet til enhver form for analyse.
Anvendelsen af denne protokol til proteinekstraktion fra humane mitralventiler tilladt til identifikation af i alt 422 proteiner, der kombinerer fire forskellige proteomiske fremgangsmåder, som tidligere er beskrevet i detaljer 11 , 15 . Specifikt blev 169 proteiner identificeret ved 2-DE, 330 proteiner ved hjælp af flydende fase IEF, 96 proteiner af LC / MS E og 148 proteinerVed 2D-LC / MS E (tabel 1).
For at klassificere de 422 identificerede proteiner med hensyn til subcellulær lokalisering blev der anvendt en software til gen ontologi (GO) analyse ( f.eks. Cytoscape). Netværket oprettet med softwaren og dets tilsvarende plugin viste, at foruden de forventede proteiner lokaliseret i den ekstracellulære region (se den øverste højre del af figur 2 ) var de fleste proteiner identificeret ved de proteomiske fremgangsmåder fra det intracellulære område ( Dvs. cytoplasma, organeller, vesikler og cytoskelet). Cell-overfladeproteiner blev også identificeret ( figur 2 ).
Resultaterne blev yderligere bekræftet i tre uafhængige mitralventilprøver. Immunoblotting blev brugt til at analysere en gruppe af fire proteiner ( dvs. septin-11, fire og en halv LIM-domæner protein 1 (FHL-1), derMatopontin og alfa-krystallin B (CryAB)), som aldrig er blevet identificeret i den normale mitralventil ( figur 3 ).
Figur 1: Mitralventilstruktur. Øverste billede af det menneskelige hjerte, der viser den lukkede ( A ) eller åbne ( B ) menneskelige mitralventil. Forfra af venstre hjertekammer af et menneskeligt hjerte ( C ). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Analyse af de identificerede mitralventilproteiner i løbet af cellulær fordeling. Cytoscape og plugin BiNGO var vant til at obtaiN fordelingen af gen ontologi (GO) udtryk fra de cellulære komponent kategorier. Cirkelstørrelsen er proportional med antallet af proteinkomponenter associeret med de valgte GO-betingelser, og farveskalaen for p-værdien af overrepræsentation er rapporteret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Immunoblottingsanalyse af septin-11, FHL-1, dermatopontin og CryAB i hel ekstrakt fra tre humane normale mitralventilfolier. Immunoblotting blev udført under anvendelse af monoklonalt mus-antistof mod CryAB og kaninpolyklonale antistoffer mod septin-11, FHL-1 og dermatopontinantistoffer. Vær venligKlik her for at se en større version af denne figur.
| tiltrædelse | Beskrivelse | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Flydende fase IEF |
| A6NMZ7 | Kollagen alfa VI | x | |||
| O00151 | PDZ- og LIM-domæneprotein 1 | x | |||
| O00299 | Chlorid-intracellulært kanalprotein 1 | x | |||
| O00764 | Pyridoxalkinase | x | |||
| O14558 | Varmechokprotein beta 6 | x | |||
| O43399 | Tumorprotein D54 | x | |||
| O43488 | Aflatoxin B1-aldehydreduktaseelement 2 | x | |||
| O43707 | Alpha actinin 4 | x | x | ||
| O43866 | CD5 antigen-lignende precursor | x | |||
| O60493 | Sortering af nexin 3 | x | |||
| O60701 | UDP glucose 6 dehydrogenase | x | |||
| O75223 | Ukarakteriseret protein | x | |||
| O75368 | SH3 domænebindende glutaminsyre, som er rig på protein | x | |||
| O75390 | Citrat syntase mitochondriale forstadie | x | |||
| O75489 | NADH dehydrogenase ubiquinon jern svovlprotein 3 mitochondriale forstadie | x | x | ||
| O75608 | Acylproteintioesterase 1 | x | |||
| O75828 | Carbonylreduktase NADPH 3 | x | |||
| O75874 | Isocitrat dehydrogenase NADP cytoplasmatisk | x | |||
| O75955 | Flotillin | x | |||
| O94760 | NG NG dimethylarginindimethylaminohydrolase 1 | x | |||
| O94788 | Retinal dehydrogenase 2 | x | |||
| O95865 | NG NG dimethylarginindimethylaminohydrolase 2 | x | x | ||
| P00325 | Alkohol dehydrogenase 1B | x | x | ||
| P00338 | L lactat dehydrogenase A kæde | x | |||
| P00352 | Retinal dehydrogenase 1 | x | |||
| P00441 | Superoxiddismutase Cu Zn | x | x | ||
| P00450 | Ceruloplasmin forløber | x | x | ||
| P00488 | Koagulationsfaktor XIII En kædeprecursor | x | |||
| P00491 | Purin-nukleosidphosphorylase | x | |||
| P00492 | Hypoxanthin guanin phosphoribosyltransferase | x | |||
| P00558 | Phosphoglyceratkinase 1 | <td> xx | x | ||
| P00568 | Adenylatkinaseisoenzym 1 | x | |||
| P00734 | prothrombin | x | x | ||
| P00738 | haptoglobin | x | x | x | x |
| P00739 | Haptoglobin-relateret proteinprecursor | x | |||
| P00751 | Komplementfaktor B | x | x | x | |
| P00915 | Carbonanhydrase 1 | x | |||
| P00918 | Carbonanhydrase 2 | x | |||
| P01008 | Antitrombin III precursor | x | x | x | |
| P01009 | Alfa 1 antitrypsin | x | x | x | x |
| P01011 | Alfa 1 antichymotrypsin | x | x | x | x |
| P01019 | Angiotensinogen forløber | x | x | ||
| P01023 | Alpha 2-makroglobulin | x | x | ||
| P01024 | Komplement C3 | x | x | x | x |
| P01033 | Metalloproteinaseinhibitor 1 precursor | x | |||
| P01042 | Kininogen 1 precursor | x | |||
| P01593 | Ig kappa kæde VI region AG | x | |||
| P01598 | Ig kappa kæde VI region EU | x | |||
| P01600 | Ig kappa kæde VI region Hau | x | x | ||
| P01611 | Ig kappa kæde VI region Wes | x | |||
| P01620 | Ig kappa kæde V III region SIE | x | |||
| P01625 | Ig kappa kæde V IV region Len | x | |||
| P01766 | Ig tung kæde V III region BRO | x | x | ||
| P01781 | Ig tungkæde V III region GAL | x | |||
| P01834 | Ig kappa kæde C region | x | x | x | x |
| P01842 | Ig lambda kæde C regioner | x | x | x | |
| P01857 | Ig gamma 1-kæde C-region | x | x | x | x |
| P01859 | Ig gamma 2-kæde C-region | x | x | x | x |
| P01860 | Ig gamma 3-kæde C-region | x | x | x | |
| P01861 | Ig gamma 4-kæde C-region | x | x | x | |
| P01871 | Ig mu kæde C region | x | x | x | |
| P01876 | Ig alfa 1-kæde C-region | x | x | x | x |
| P01877 | Ig alfa 2-kæde C-region | x | |||
| P02144 | myoglobin | x | x | ||
| P02452 | Kollagen alfa 1 I kæde | x | x | x | x |
| P02511 | Alfa-krystallinske B-kæde | x | |||
| P02545 | Lamin AC 70 kDa lamin | x | x | x | x |
| P02647 | Apolipoprotein Al | x | x | x | x |
| P02649 | Apolipoprotein E | x | x | x | x |
| P02671 | Fibrinogen alfa-kæde | x | x | x | x |
| P02675 | Fibrinogen beta-kæde | x | x | x | x |
| P02679 | Fibrinogen gamma kæde | x | x | x | x |
| P02689 | Myelin P2 protein | x | |||
| P02735 | Serumamyloid En proteinprecursor | x | |||
| P02741 | C-reaktivproteinprecursor | x | |||
| P02743 | Serumamyloid P-komponent | x | x | x | x |
| P02746 | Komplement C1q underkomponent subenhed B | x | x | ||
| P02747 | Komplement C1q subkomponent subenhed C precursor | x | |||
| P02748 | Komplementkomponent C9 | x | x | x | |
| P02749 | Beta 2 glycoprotein 1 | x | x | x | x |
| P02750 | Leucin Rich Alfa 2-glycoproteinprecursor | x | |||
| P02751 | Fibronectin | x | x | ||
| P02760 | AMBP proteinprecursor | x | x | x | x |
| P02763 | Alfa 1 syre glycoprotein 1 | x | x | x | |
| P02765 | Alpha 2 HS glycoproteinprecursor | x | |||
| P02766 | Transthyretinprecursor | x | x | x | |
| P02768 | Serumalbumin | x | x | x | x |
| P02774 | Vitamin D-bindende proteinprecursor | x | |||
| P02787 | Serotransferrin | x | x | x | x |
| P02788 | Lactotransferrinprecursor | x | |||
| P02790 | hæmopexin | x | x | x | x |
| P02792 | Ferritin let kæde | x | |||
| P04004 | vitronectin | x | x | x | x |
| P04075 | Fructose bisfosfat aldolase A | x | |||
| P04083 | Bilag A1 | x | x | x | x |
| P04179 | Superoxid dismutase Mn mitokondriale forstadie | x | |||
| P04196 | Histidin-rich glycoproteinprecursor | x | |||
| P04217 | Alpha 1B glycoproteinprecursor | x | x | ||
| P04350 | Tubulin beta 4 kæde | x | |||
| P04406 | Glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase | x | x | x | x |
| P04792 | Varmechokprotein beta 1 | x | x | x | x |
| P05091 | Aldehyddehydrogenase mitochondriale forstadie | x | x | ||
| Plasmaprotease C1-inhibitorprecursor | x | ||||
| P05156 | Komplement faktor I precursor | x | |||
| P05413 | Fedtsyrebindende proteinhjerte | x | |||
| P05452 | Tetranectinprecursor TN | x | x | ||
| P05787 | Keratin type II cytoskeletal 8 | x | |||
| P06396 | gelsolin | x | x | x | x |
| P06576 | ATP syntase subunit beta mitokondriale precursor | x | x | ||
| P06732 | Kreatin kinase M type | x | x | ||
| P06733 | Alfa enolase | x | x | x | x |
| P06753 | Tropomyosin alfa 3-kæde | x | x | ||
| P07108 | Acyl CoA bindende protein | x | |||
| P07195 | L lactat dehydrogenase B kæde | x | x | x | |
| P07196 | Neurofilament lyspolypeptid | x | |||
| P07197 | Neurofilament medium polypeptid | x | x | ||
| P07237 | Proteindisulfid-isomeraseprecursor | x | x | ||
| P07339 | Cathepsin D forløber | x | x | ||
| P07355 | Bilag A2 | x | x | x | x |
| P07360 | Komplementkomponent C8 gamma kædeprecursor | x | |||
| P07437 | Tubulin beta-kæde | x | x | x | x |
| P07585 | decorin | x | x | x | x |
| P07737 | Profilin 1 | x | |||
| P07858 | Cathepsin B precursor | x | |||
| P07900 | Varmechokprotein HSP 90 alpha | x | x | ||
| P07951 | Tropomyosin beta kæde | x | |||
| P07954 | Fumarathydratase mitokondriale forstadie | x | |||
| P07996 | Trombospondin 1 | x | x | x | |
| P08107 | Varmechok 70 kDa protein 1A 1B | x | x | x | x |
| P08123 | Kollagen alfa 2 I kæde | x | x | x | x |
| P08133 | Bilag A6 | x | x | ||
| P08238 | Varmechokprotein HSP 90 beta | x | x | ||
| P08253 | 72 kDa type IV collagenase forstadie | x | |||
| P08294 | Ekstracellulær superoxiddismutase Cu Zn precursor | x | x | x | |
| P08590 | Myosin-lyspolypeptid 3 | x | x | ||
| P08603 | Komplementfaktor H | x | x | x | x |
| P08670 | vimentin | x | x | x | x |
| P08729 | Keratin type II cytoskeletal 7 | x | |||
| P08758 | Annexin A5 | x | x | x | x |
| P09211 | Glutathion S transferase P | x | x | x | |
| P09382 | Galectin 1 | x | x | x | |
| P09417 | Dihydropteridinreduktase | <td> | x | ||
| P09493 | Tropomyosin 1-alfa-kæde | x | x | ||
| P09525 | Bilag A4 | x | x | ||
| P09651 | Heterogent nukleært ribonukleoprotein A1 | x | |||
| P09871 | Komplement C1s subkomponentforløber | x | |||
| P09936 | Ubiquitin carboxyl-terminalt hydrolase-isozym L1 | x | |||
| P09972 | Fructose bisfosfat aldolase C | x | |||
| P0C0L4 | Komplement C4 En precursor | x | |||
| P0CG05 | igLambda 2 kæde C regioner | x | |||
| P0CG38 | POTE ankyrin domæne familiemedlem I | x | |||
| P10515 | Dihydrolipoyllysinrest-acetyltransferasekomponent af pyruvat-dehydrogenase-kompleks | x | |||
| P10768 | S-formylglutathionhydrolase | x | |||
| P10809 | 60 kDa varmchokprotein mitokondriale precursor | x | |||
| P10909 | clusterin | x | x | x | x |
| P10915 | Hyaluronan og proteoglycan link protein 1 forstadie | x | x | ||
| P11021 | 78 kDa gLucose reguleret protein | x | x | x | |
| P11047 | Laminin subunit gamma 1 precursor | x | |||
| P11142 | Varmestød medregnet 71 kDa protein | x | x | x | x |
| P11177 | Pyruvat dehydrogenase E1 komponent subunit beta mitochondriale forstadie | x | |||
| P11217 | Glycogen phosphorylase muskelform | x | |||
| P11310 | Medium kæde specifik acyl CoA dehydrogenase mitokondriale forstadie | x | |||
| P11413 | Glucose 6 phosphat 1 dehydrogenase | x | |||
| P11766 | Alkohol dehydrogenase klasse 3 chi kæde | x | |||
| P12036 | Neurofilament tungt polypeptid | x | |||
| P12109 | Kollagen alfa 1 VI kæde | x | x | x | x |
| P12110 | Kollagen alfa 2 VI kæde | x | x | x | x |
| P12111 | Kollagen alfa 3 VI kæde | x | x | x | |
| P12277 | Kreatin kinase B type | x | |||
| P12429 | Annexin A3 | x | x | ||
| P12814 | Alpha actinin 1 | x | x | ||
| P12829 | Myosin-lyspolypeptid 4 | x | |||
| P12882 | Myosin 1 | x | |||
| P12883 | Myosin 7 | x | x | ||
| P12955 | Xaa Pro dipeptidase | x | |||
| P13489 | Ribonucleaseinhibitor | x | |||
| P13533 | Myosin 6 | x | x | ||
| P13611 | Versican kerneproteinforløber | x | x | ||
| P13639 | Forlængelsesfaktor 2 | x | |||
| P13716 | Delta-aminolevulinsyre dehydratase | x | |||
| P13796 | Plastin 2 | x | |||
| P13804 | Elektron overførsel af flavoprotein subunit alfa mitochondriale precursor | x | |||
| P13929 | Beta-enolase | x | x | ||
| P14136 | Glialfibrillær sur proteinastrocyt | x | |||
| P14314 | Glucosidase 2 subunit beta precursor | x | |||
| P14550 | Alkohol dehydrogenase NADP | x | |||
| P14618 | Pyruvat kinaseisozymer M1 M2 | x | x | x | |
| P14625 </ Td> | Endoplasminprecursor | x | x | ||
| P15121 | Aldose reduktase | x | |||
| P15259 | Phosphoglyceratmutase 2 | x | |||
| P16152 | Carbonylreduktase NADPH 1 | x | |||
| P17066 | Varmechok 70 kDa protein 6 | x | x | x | |
| P17174 | Aspartat aminotransferase cytoplasmatisk | x | |||
| P17540 | Kreatinsinkomarisk mitokondriel forstadie | x | |||
| P17661 | desmin | x | x | x | x |
| P17980 | 26S protease regulatorisk underenhed 6A | x | |||
| P17987 | T kompleks protein 1 subenhed alfa | x | |||
| P18206 | vinculin | x | x | ||
| P18428 | Lipopolysaccharidbindende proteinprecursor | x | |||
| P18669 | Phosphoglyceratmutase 1 | x | |||
| P19105 | Myosin regulatorisk let kæde 2 | x | x | ||
| P19623 | Spermidin syntase | x | |||
| P19652 | Alpha 1 syre glycoprotein 2 precursor | x | x | ||
| P19823 | Inter alfa trypsininhibitor tung kæde H2 | x | |||
| P19827 | Inter alfa trypsininhibitor tung kæde H1 | x | x | ||
| P20073 | Annexin A7 | x | |||
| P20618 | Proteasome subunit beta type 1 precursor | x | |||
| P20774 | mimecan | x | x | x | x |
| P21266 | Glutathion S transferase Mu 3 | x | |||
| P21333 | Filamin A | x | x | ||
| P21796 | Spændingsafhængigt anionselektivt kanalprotein1 | x | |||
| P21810 | biglycan | x | x | x | x |
| P21980 | Proteinglutamin gamma glutamyltransferase 2 | x | x | ||
| P22105 | Tenascin X | x | x | ||
| P22314 | Ubiquitin-aktiverende enzym E1 | x | |||
| P22352 | Glutathionperoxidase 3 precursor | x | x | ||
| P22626 | Heterogene nukleare ribonukleoproteiner A2 B1 | x | |||
| P22695 | Ubiquinol cytochrom c-reduktase-komplekskerneprotein 2 mitokondriale forstadie | x | |||
| P23141 | Levercarboxylesterase 1 forstadie | x | |||
| P23142 | Fibulin 1 | x | x | x | x |
| P23284 | Peptidyl prolyl cis trans isomerase B precursor | x | |||
| P23381 | Cytoplasmatisk tryptophanyl-tRNA syntetase | x | |||
| P23526 | Adenosylhomocysteinase | x | x | ||
| P23528 | Cofilin 1 | x | |||
| P24752 | Acetyl CoA acetyltransferase mitokondriale precursor | x | |||
| P25311 | Zink alfa 2 glycoproteiN forløber | x | |||
| P25705 | ATP syntase subunit alpha mitochondrial | x | |||
| P25788 | Proteasom subunit alfa type 3 | x | x | ||
| P25789 | Proteasom subunit alfa type 4 | x | |||
| P26447 | Protein S100 A4 | x | |||
| P27348 | 14 3 3 protein theta | x | x | ||
| P27797 | Calreticulin forstadie | x | |||
| P28066 | Proteasom subunit alfa type 5 | x | |||
| P28070 | <Td> Proteasome subunit beta type 4 precursorx | x | |||
| P28072 | Proteasome subunit beta type 6 precursor | x | |||
| P28074 | Proteasome subunit beta type 5 precursor | x | |||
| P28331 | NADH ubiquinonoxidoreduktase 75 kDa subunit mitokondriale forstadie | x | |||
| P28838 | Cytosol aminopeptidase | x | |||
| P29218 | Inositolmonophosphatase | x | |||
| P29401 | transketolase | x | |||
| P29692 | Forlængelsesfaktor 1 delta | <td> | x | ||
| P29966 | Myristoylerede alaninrige C-kinasesubstrat | x | |||
| P30040 | Endoplasmatisk reticulumprotein ERp29-forstadie | x | |||
| P30041 | Peroxiredoxin 6 | x | x | ||
| P30043 | Flavinreduktase | x | |||
| P30044 | Peroxiredoxin 5 mitochondriale forstadie | x | |||
| P30085 | UMP CMP kinase | x | |||
| P30086 | Phosphatidylethanolaminbindende protein 1 | x | |||
| P30101 | ProteiN disulfid isomerase A3 precursor | x | x | x | |
| P30613 | Pyruvat kinase isozymer RL | x | |||
| P30740 | Leukocyt elastase inhibitor | x | |||
| P31025 | Lipocalin 1 forløber | x | |||
| P31937 | 3 hydroxyisobutyrat dehydrogenase mitochondriale precursor | x | |||
| P31942 | Heterogent nukleært ribonukleoprotein H3 | x | |||
| P31943 | Heterogent nukleært ribonukleoprotein H | x | |||
| P31946 | 14 3 3 protein beta alfa | x | x | ||
| P31948 | Stressinduceret phosphoprotein 1 | x | |||
| P31949 | Protein S100 A11 | x | |||
| P32119 | Peroxiredoxin 2 | x | x | ||
| P34931 | Varmechok 70 kDa protein 1 som | x | x | ||
| P34932 | Varmechok 70 kDa protein 4 | x | |||
| P35232 | prohibitin | x | |||
| P35237 | Serpin B6 | x | |||
| P35443 | Trombospondin 4 | x | </ Tr> | ||
| P35555 | Fibrillin 1 | x | x | ||
| P35579 | Myosin 9 | x | x | x | |
| P35580 | Myosin 10 | x | x | ||
| P35609 | Alpha actinin 2 | x | |||
| P35625 | Metalloproteinaseinhibitor 3 | x | x | ||
| P35998 | 26S protease regulatorisk underenhed 7 | x | |||
| P36871 | Phosphoglucomutase 1 | x | x | ||
| P36955 | Pigmentepitel-afledt faktor | x | x | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2x | x | |||
| P37837 | transaldolase | x | |||
| P38117 | Elektron overførsel flavoprotein subunit beta | x | |||
| P38646 | Stress 70 protein mitokondriale forstadie | x | x | ||
| P39687 | Syre-leucin-rige nukleare phosphoprotein 32-familiemedlem A | x | |||
| P40121 | Makrofag-capping protein | x | |||
| P40925 | Malat dehydrogenase cytoplasmatisk | x | |||
| P40926 | Malat dehydrogenase mitochondriale forstadie | <td> | x | ||
| P41219 | peripherin | x | |||
| P42330 | Aldo keto reductase familie 1 medlem C3 | x | |||
| P45880 | Spændingsafhængigt anionsselektivt kanalprotein 2 | x | |||
| P47755 | F actin capping protein subunit alfa 2 | x | x | ||
| P47756 | F actin capping protein subunit beta | x | x | ||
| P47985 | Ubiquinol cytochrom c reductase jern svovl subunit mitokondriale forstadie | x | |||
| P48047 | ATP syntase O subunit mitokondriale precursor | x | |||
| P48637 | Glutathionsyntetase | x | |||
| P48741 | Varmechok 70 kDa protein 7 | x | x | ||
| P49189 | 4 trimethylaminobutyraldehyddehydrogenase | x | |||
| P49368 | T kompleks protein 1 subenhed gamma | x | |||
| P49747 | Brusk-oligomert matrixprotein | x | x | x | x |
| P49748 | Meget lang kædespecifik acyl CoA dehydrogenase mitokondriale precursor | x | |||
| P50395 | Rab GDP dissociation inhibitor beta | x | x </ Td> | ||
| P50454 | Serpin H1 precursor | x | |||
| P50995 | Annexin A11 | x | |||
| P51452 | Dual specificity protein phosphatase 3 | x | |||
| P51884 | Lumican | x | x | x | x |
| P51888 | Prolargin precursor | x | x | x | x |
| P52565 | Rho GDP dissociation inhibitor 1 | x | |||
| P52566 | Rho GDP dissociation inhibitor 2 | x | |||
| P54652 | Varmechokrelateret 70 kDa protein 2 | x | x | x | x |
| P55072 | Transitional endoplasmatisk reticulum ATPase | x | |||
| P55083 | Microfibril associeret glycoprotein 4 precursor | x | x | ||
| P57053 | Histon H2B type F | x | |||
| P60174 | Triosephosphatisomerase | x | x | x | |
| P60660 | Myosin-lyspolypeptid 6 | x | x | ||
| P60709 | Actin cytoplasmatisk 1 | x | x | x | x |
| P60981 | Destrin | x | |||
| P61086 | Ubiquitin-konjugerende enzym E2 25 kDa | x | |||
| P61088 | Ubiquitin-konjugerende enzym E2 | x | |||
| P61224 | Rasrelateret protein Rap 1b precursor | x | |||
| P61978 | Heterogent nukleært ribonukleoprotein K | x | x | ||
| P61981 | 14 3 3 protein gamma | x | x | x | |
| P62258 | 14 3 3 protein epsilon 14 3 3E | x | |||
| P62491 | Rasrelateret protein | x | |||
| P62714 | Serin threoninprotein phosphatase 2A katalytisk subunit beta isoform | x | |||
| P62736 | Actin aorta glat muskel | x | x | x | |
| P62805 | Histon H4 | x | |||
| P62826 | GTP-bindende nukleært protein Ran | x | |||
| P62873 | Guaninukleotidbindende protein GIGSGT subunit beta 1 | x | |||
| P62879 | Guaninukleotidbindende protein GIGSGT subunit beta 2 | x | |||
| P62937 | Peptidyl prolyl cis trans isomerase A | x | x | ||
| P62987 | Ubiquitin 60S ribosomalt protein L40 | x | |||
| P63104 | 14 3 3 proTein zeta delta | x | x | x | x |
| P63241 | Eukaryotisk translationsinitieringsfaktor 5A1 | x | |||
| P63244 | Guanin-nukleotidbindende proteinunderenhed beta 2 som 1 | x | |||
| P63267 | Actin gamma enterisk glat muskel | x | x | ||
| P67936 | Tropomyosin alfa 4-kæde | x | |||
| P68032 | Actin alfa-hjertemuskel 1 | x | |||
| P68104 | Forlængelsesfaktor 1 alfa 1 | x | x | x | |
| P68133 | Actin alfa skeletmuskel | ||||
| P68363 | Tubulin alfa 1B kæde | x | x | x | |
| P68371 | Tubulin beta 2C kæde | x | x | x | |
| P68402 | Blodpladeaktiverende faktor acetylhydrolase IB subunit beta | x | |||
| P68871 | Hemoglobin subunit beta | x | x | x | |
| P69905 | Hemoglobin subunit alfa | x | x | ||
| P78371 | T-kompleks protein 1 subenhed beta | x | |||
| P78417 | Glutathion transferase omega 1 | x | x | ||
| P80748 | Ig lambda kæde VIII region LOI | x | |||
| P98095 | Fibulin 2 | x | x | ||
| Q01082 | Spectrin beta kæde hjerne 1 | x | |||
| Q01449 | Myosin regulatorisk let kæde 2 atriel isoform | x | |||
| Q01518 | Adenylylcyclaseassocieret protein 1 | x | |||
| Q01995 | Transgelin Glat muskelprotein 22 alpha | x | |||
| Q03252 | Lamin B2 | x | x | ||
| Q03591 | Komplement faktor H beslægtet protein 1 precursor | x | Q04917 | 14 3 3 protein eta | x | x |
| Q06323 | Proteasomaktivator kompleks subenhed 1 | x | |||
| Q06828 | Fibromodulin | x | x | x | x |
| Q06830 | Peroxiredoxin 1 | x | x | ||
| Q07507 | Dermatopontin | x | x | x | x |
| Q07960 | Rho GTPase-aktiverende protein 1 | x | |||
| Q08257 | Quinonoxidoreduktase | x | |||
| Q08431 | Lactadherin | x | x | ||
| Q12765 | SEcernin 1 | x | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA-isomerase mitochondriale precursor | x | x | ||
| Q13228 | Selenbindende protein 1 | x | x | ||
| Q13404 | Ubiquitin-konjugerende enzym E2-variant 1 | x | |||
| Q13409 | Cytoplasmisk dynein 1 mellemkæde 2 | x | |||
| Q13509 | Tubulin beta 3 kæde | x | x | x | |
| Q13642 | Fire og en halv LIM-domæner protein 1 | x | |||
| Q13765 | Nascent polypeptidassocieret kompleks subunit alpha | x | |||
| Q13885 | N-tubulin beta 2A-kæde | x | x | ||
| Q14194 | Dihydropyrimidinase-relateret protein 1 | x | |||
| Q14195 | Dihydropyrimidinase-relateret protein 3 | x | x | x | x |
| Q14624 | Inter alpha trypsininhibitor tungkæde H4 precursor | x | |||
| Q14697 | Neutral alfa glucosidase AB precursor | x | |||
| Q14764 | Stort hvælveprotein | x | |||
| Q14767 | Latent transformerende vækstfaktor beta bindende protein 2 | x | <td>x | ||
| Q14894 | Mu-krystallinsk homolog-NADP-reguleret thyroidhormonbindende protein | x | |||
| Q15063 | Periostinprecursor | x | x | x | x |
| Q15084 | Proteindisulfid-isomerase A6-precursor | x | |||
| Q15113 | Procollagen C endopeptidaseforstærker 1 precursor | x | |||
| Q15181 | Uorganisk pyrophosphatase | x | |||
| Q15365 | Poly rC bindingsprotein 1 | x | |||
| Q15366 | Poly rC bindingsprotein 2 | x | |||
| Q15582 | Omdannelse af vækstfaktor beta-induceret protein | x | x | x | |
| Q15819 | Ubiquitin-konjugerende enzym E2-variant 2 | x | |||
| Q16352 | Alpha internexin | x | |||
| Q16473 | Putative tenascin XA | x | |||
| Q16555 | Dihydropyrimidinase-relateret protein 2 | x | x | x | |
| Q16698 | 2 4 dienoyl CoA reduktase mitochondriale precursor | x | |||
| Q16891 | Mitokondriel indre membran | x | |||
| Q562R1 | Beta aktin som protein 2 | x | |||
| Q6S8J3 | POTE ankyrin domæne familiemedlem E | x | |||
| Q6UWY5 | Olfactomedin som protein 1 precursor | x | x | ||
| Q71U36 | Tubulin alfa 1A kæde | x | x | x | |
| Q7Z7G0 | Mål for Nesh SH3 precursor | x | x | x | |
| Q8WUM4 | Programmeret celledød 6 interaktionsprotein | x | |||
| Q8WWX9 | Thioredoxin som selenoprotein M precursor | x | |||
| Q92597 | Protein NDRG1 | x | |||
| Q92945 Langt opstrøms elementbindende protein 2 | x | ||||
| Q96CN7 | Isochorismatase-domæne indeholdende protein 1 | x | |||
| Q96CX2 | BTB POZ-domæne indeholdende protein | x | |||
| Q96KK5 | Histon H2A type 1 H | x | x | ||
| Q96KP4 | Cytosolisk uspecifik dipeptidase | x | |||
| Q99426 | Tubulin-specifik chaperon B | x | |||
| Q99497 | Protein DJ 1 | x | x | ||
| Q99536 | Synaptisk vesikel membranprotein | x | x | x | |
| Q99714 | 3 hydroxyacyl CoA dehydrogenase type 2 | x | |||
| Q99715 | Kollagen alfa 1 XII kæde | x | x | ||
| Q99798 | Aconiter hydratase mitochondriale precursor | x | |||
| Q9BQE3 | Tubulin alfa 6 kæde | x | |||
| Q9BUF5 | Tubulin beta 6 kæde | x | x | ||
| Q9BUT1 | 3 hydroxybutyrat dehydrogenase type 2 | x | |||
| Q9BVA1 | Tubulin beta 2B kæde | x | x | x | |
| Q9BXN1 | Asporin | x | x </ Td> | x | x |
| Q9H0W9 | Esterhydrolase C11orf54 | x | |||
| Q9H4B7 | Tubulin beta 1 kæde | x | |||
| Q9NRN5 | Olfactomedin som protein 3 precursor | x | x | ||
| Q9NRV9 | Heme bindende protein 1 | x | |||
| Q9NSB2 | Keratin type II cutikulær Hb4 | x | x | ||
| Q9NVA2 | Septin 11 | x | |||
| Q9UBR2 | Cathepsin Z forløber | x | |||
| Q9UBX5 | Fibulin 5 | x | x | ||
| Q9UK22 | F boks kun protein 2 | x | |||
| Q9Y277 | Spændingsafhængigt anionsselektivt kanalprotein 3 | x | |||
| Q9Y281 | Cofilin 2 | x | |||
| Q9Y490 | Talin 1 | x | |||
| Q9Y696 | Chlorid-intracellulært kanalprotein 4 | x | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | x | x |
Tabel 1: Liste over proteinerne identificeret i mitralventilvævsekstraktet, når der blev anvendt fire forskellige proteomiske fremgangsmåder: todimensionel elektroforese (2-DE), todimensionel LC-MS E (2D-LC / MSE), LC / MS E og flydende fase IEF. Fremgangsmåden ved hvilken hvert protein blev identificeret er rapporteret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Et kritisk trin i denne protokol er brugen af flydende nitrogen til at fryse prøven og afkøle grindersystemet. Brug af flydende nitrogen forhindrer biologisk nedbrydning og giver mulighed for effektiv pulverisering, men det kræver specifik træning for sikker håndtering.
I denne protokol er der et slibesystem til prøveslibning, fordi små prøver er vanskelige at genvinde fra standard mørtel og pistler. I dette tilfælde spredte små prøver som et fint pulver over mørteloverfladen, hvilket gør indsamling vanskeligt. En anden fordel er, at kværnen er motoriseret, hvilket gør det muligt for et større antal prøver at blive behandlet på en reproducerbar måde og uden ekstra træthed. En begrænsning ved brugen af en slibemaskine er, at prøven skal være lille (100 mg eller mindre) for at pestlen skal presses effektivt mod mørtel. Endvidere skal kværnkomponenterne opvarmes til stuetemperatur mellem anvendelser til rengøring g. Derfor er proceduren tidskrævende, og hvis mange prøver behandles dagligt, er der brug for mange sæt.
Et yderligere kritisk trin er fremstillingen af ekstraktionsbufferen. Saltkoncentrationerne, især for urea (8 M) og thiourinstof (2 M), er ret høje; Således er saltmængden næsten halvdelen af opløsningens totale volumen. Desuden er opløsningen ikke let i betragtning af, at varme skal undgås, fordi urinstof ved mere end 37 ° C kan føre til proteincarbamylering ved N-terminalerne af proteiner / peptider og ved sidekædeaminogrupperne af lysin- og argininrester 17 . Når opløsningen er opløst, skal urinstofpufferen filtreres med 0,22 μm filtre og kan opbevares ved -80 ° C i 4 uger uden at påvirke dets ekstraktionseffektivitet, men den skal opvarmes til mere end 15 ° C før brug for at muliggøre fuldstændig opløsning .
Ændringer og fejlfinding
I denne protokol udføres proteinekstraktion ved anvendelse af den beskrevne urinstofpuffer, fordi den er en af de mest anvendte proteinekstraktionsløsninger til proteomiske undersøgelser på grund af dets kompatibilitet med isoelektrofokusering og dens effektivitet ved opløsning af sparsomt opløselige proteiner 18. Det har været Demonstreret, at denne buffer meget effektivt kan opløse de sparsomt opløselige proteiner, såsom integrerede membranproteiner 19 eller proteiner, der er meget tilbøjelige til aggregering, såsom tubulin 18. Endvidere er denne buffer fuldstændig kompatibel med Bradford-analysen for at bestemme proteinkoncentrationen, og Det kan anvendes direkte i 2-DE og flydende fase IEF analyser.Imidlertid er denne buffer ikke ideel til opløsning af alle proteiner, der er til stede i en prøve. Det er muligt, at forskellige ekstraktionsbuffere kunne afsløre proteiner, der ikke kan påvises ved denne protokol. For eksempel er det godt knoDa ribosomale og nukleare proteiner bedre kunne ekstraheres med syreekstraktion eller trichloreddikesyre / acetoneudfældning 20 , mens alkaliske pH-niveauer er mere egnede til membranproteiner 21 , 22 . Anvendelsen af alternative buffere kan derfor kræve yderligere trin til proteinudfældning for at eliminere salte der interfererer med 2-DE eller flydende fase IEF.
Begrænsninger af teknikken
Antallet af proteiner identificeret ved denne protokol er forholdsvis lavt, men antallet af identifikationer og dækningen af proteomanalysen kan yderligere forøges ved brug af mere moderne instrumenter, hvis massens nøjagtighed og sekvenseringshastighed er steget dramatisk i de sidste par år 23. Det er muligt at dække en stor del af proteomet uden nogen forfractioneringstrin ved at anvende en lang gradient for flydende chRomatografiseparationer kombineret med et MS-instrument med høj opløsning, der har en hurtig sekvenseringshastighed 24 .
Betydningen af teknikken med hensyn til eksisterende / alternative metoder
Evnen til at identificere og kvantificere proteiner i de menneskelige hjerteventiler, såsom mitralventilen, er en vigtig og udfordrende opgave, som vil bidrage til at belyse mekanismerne for fysiologiske / patologiske processer i ventilsygdomme. Definering af ændringerne af mitralventilproteomet vil i høj grad øge forståelsen af arten af de biologiske processer, som er forbundet med sygdoms tilstand af vævet.
Den nuværende viden om mitralventilens fysiopatologi er begrænset og opnås generelt ved analyse af individuelle proteiner involveret i specifikke processer, såsom ekstracellulær matrix-remodeling, hæmostase, inflammation eller oxidativ stress 25 9 , 10 .
Manglen på omfattende proteomiske undersøgelser kan tilskrives kompleksiteten af dette lavcellulært væv, der er stærkt rigt på ekstracellulære matrixproteiner ( dvs. proteoglycaner, collagen og elastin). Disse proteiner udgør ca. 80% af det totale antal, hvilket hæmmer analysen af lavmængdeproteiner 26 .
Det var således nødvendigt at etablere en effektiv ekstraktionsprotokol for at maksimere proteinopløseliggørelse for at beskrive proteomet af dette væv. Denne protokol tillod ekstraktionen af ~ 50 μg protein fra 1 mg væv. Dette er et relativt lavt udbytte i sammenligning med "blødt" væv, sådanSom lever (~ 135 μg fra 1 mg væv), men det er tilstrækkeligt at udføre en proteinanalyse på individuelle prøver. Dette er særlig relevant, når man definerer en fænomenes intra-individuelle variabilitet.
Desuden har denne metode den fordel at være kompatibel med mange analytiske applikationer. Mitralventilproteinerne opløst i den foreslåede ekstraktionsbuffer kan anvendes direkte til immunblotting og proteomanalyse baseret på tvådimensionel elektroforese og væskefaseisoelektroforese 11 , 12 eller efter proteinpræcipitation for at eliminere bufferkomponentinterferens for andre analyser, såsom Gel-fri massespektrometri 15 .
Ved anvendelse af denne ekstraktionsprotokol er der opnået en mere udtømmende karakterisering af proteinkomponenterne i det normale mitralventilvæv ved identifikation af mange intracelLulære proteiner. Disse proteiner er lokaliseret i cytosol eller i organeller, ikke kun i den ekstracellulære matrix, og har forskellige molekylære og biologiske funktioner. Andre interessante proteiner ( dvs. CryAB, septin-11, FHL-1 og dermatopontin) blev også identificeret. Disse proteiner har ukendte funktioner i mitralventilen, men deres biologiske egenskaber indikerer en mulig rolle i ventilsygdomme.
Fremtidige applikationer eller retninger efter mastering af denne teknik
Med denne protokol er det muligt at korrelere data vedrørende proteinekspression med data om kvantitativ mRNA-ekspression og ikke-kvantitative immunhistokemiske analyser. Faktisk vil disse tilgange, når de bruges sammen, føre til en mere omfattende forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for sygdom, fra mRNA til posttranslationel proteinmodifikation. Således kan denne metode være af interesse for forskere fokuseret på hjerteventil-fysiopatologi. finAllieret kan denne protokol også anvendes på porcin mitralventilen, som har en tæt lighed med den humane ventil 27 og anvendes som en eksperimentel model til evaluering af ventilfunktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Det italienske sundhedsministerium støttede denne undersøgelse (RC 2013-BIO 15). Vi takker Barbara Micheli for sin fremragende tekniske assistance.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
