Summary
La composition protéique de la valvule mitrale humaine est encore partiellement inconnue, car son analyse est compliquée par une faible cellularité et donc par une faible biosynthèse des protéines. Ce travail fournit un protocole pour extraire efficacement les protéines pour l'analyse du protéome de la valvule mitrale.
Abstract
L'analyse du protéome cellulaire peut aider à élucider les mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies dues au développement de technologies qui permettent l'identification et la quantification à grande échelle des protéines présentes dans les systèmes biologiques complexes. Les connaissances acquises à partir d'une approche protéomique peuvent conduire à une Une meilleure compréhension des mécanismes pathogènes sous-jacents aux maladies, permettant d'identifier de nouveaux marqueurs de diagnostic et de pronostic et, espérons-le, des cibles thérapeutiques. Cependant, la valvule mitrale cardiaque représente un échantillon très difficile pour l'analyse protéomique en raison de la faible cellularité dans le protéoglycane et la matrice extracellulaire enrichie en collagène. Cela rend difficile l'extraction de protéines pour une analyse protéomique globale. Ce travail décrit un protocole qui est compatible avec l'analyse subséquente des protéines, telles que la protéomique quantitative et l'immunoblot. Cela peut permettre la corrélation des données concernantG expression de protéines avec des données sur l'expression quantitative de l'ARNm et l'analyse immunohistochimique non quantitative. En effet, ces approches, lorsqu'elles sont réalisées ensemble, conduiront à une compréhension plus complète des mécanismes moléculaires sous-jacents aux maladies, de l'ARNm à la modification de la protéine post-traductionnelle. Ainsi, cette méthode peut être pertinente pour les chercheurs intéressés par l'étude de la physiopathologie valvulaire cardiaque.
Introduction
Des preuves récentes ont modifié la compréhension des rôles des nombreux mécanismes de régulation qui se produisent après la synthèse de l'ARNm. En effet, les processus translationnels, post-transcriptionnels et protéolytiques peuvent réguler l'abondance et la fonction des protéines. Le dogme - qui indique que les concentrations d'ARNm sont des proxies de celles des protéines correspondantes, en supposant que les niveaux de transcription sont le principal déterminant de l'abondance des protéines - ont été partiellement révisés. En effet, les niveaux de transcription ne prédisent partiellement que l'abondance des protéines, ce qui suggère que les événements post-transcriptionnels Se produisent pour réguler les protéines dans les cellules 1 , 2 .
En outre, les protéines déterminent finalement la fonction de la cellule et dictent donc son phénotype, qui peut subir des changements dynamiques en réponse aux facteurs autocrins, paracrins et endocriniens; Médiateurs transmis par le sang; température; traitement médical; Et la maladie se développeMent. Ainsi, une analyse d'expression axée sur le niveau de protéine est utile pour caractériser le protéome et pour démêler les changements critiques qui lui apparaissent dans le cadre de la pathogenèse de la maladie 3 .
Par conséquent, les opportunités que la protéomique présente pour clarifier la santé et les maladies sont formidables, malgré les défis technologiques existants. Les domaines de recherche particulièrement prometteurs auxquels la protéomique peut contribuer: l'identification de l'expression protéique altérée à n'importe quel niveau ( c.-à-d. Cellules entières ou tissus, compartiments subcellulaires et fluides biologiques); L'identification, la vérification et la validation de nouveaux biomarqueurs utiles pour le diagnostic et le pronostic de la maladie; Et, espérons-le, l'identification de nouvelles cibles protéiques qui peuvent être utilisées à des fins thérapeutiques, ainsi que pour l'évaluation de l'efficacité et de la toxicité du médicament 4 .
Capture de la complexité deLe protéome représente un défi technologique. Les outils protéomiques actuels offrent l'opportunité d'effectuer une analyse à grande échelle et à haut débit pour l'identification, la quantification et la validation des niveaux de protéines altérés. En outre, l'introduction de techniques de fractionnement et d'enrichissement, visant à éviter les interférences causées par les protéines les plus abondantes, a également amélioré l'identification des protéines en incluant les protéines les moins abondantes. Enfin, la protéomique a été complétée par l'analyse des modifications post-traductionnelles, qui apparaissent progressivement comme des modulateurs importants de la fonction protéique.
Cependant, la préparation des échantillons et la récupération des protéines dans les échantillons biologiques en cours d'analyse restent les étapes limitantes du flux de travail protéomique et augmentent le potentiel d'écueils possibles 5 . En effet, dans la plupart des techniques de biologie moléculaire qui doivent être optimisées, les premières étapes sont des tissus homogénéisésLa lyse ionique et cellulaire, en particulier lors de l'analyse de protéines à faible abondance pour lesquelles des méthodes d'amplification n'existent pas. En outre, la nature chimique des protéines peut influencer leur propre récupération. Par exemple, l'analyse des protéines hautement hydrophobes est très difficile car elles se précipitent facilement pendant la focalisation isoélectrique, tandis que les protéines trans-membranaires sont presque insolubles (revues dans la référence 5). En outre, la variabilité de la composition tissulaire crée un obstacle important au développement d'une méthode d'extraction universelle. Enfin, étant donné que la quasi-totalité des spécimens cliniques ont une quantité limitée, il est essentiel de permettre la préparation des protéines avec une récupération maximale et une reproductibilité à partir de quantités minimales d'échantillon 6 .
Ce travail décrit un protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la valvule mitrale cardiaque humaine normale, ce qui représente un échantillon très difficile pour l'analyse protéomique. La valvule mitrale normale est une compStructure lex située entre l'oreillette gauche et le ventricule gauche du cœur ( figure 1 ). Il joue un rôle important dans le contrôle du flux sanguin de l'oreillette au ventricule, en évitant le reflux et en assurant le bon niveau d'apport en oxygène à l'ensemble du corps, en maintenant un débit cardiaque adéquat. Cependant, il est souvent considéré comme un tissu «inactif», avec une faible cellularité et peu de composants, principalement dans la matrice extracellulaire. C'est parce que, dans des conditions normales, les cellules interstitielles valvulaires résidentes (VIC) présentent un phénotype quiescent avec un taux de biosynthèse faible en protéines 7 .
Cependant, il a été démontré que, dans un état pathologique, le nombre de VIC dans le spongiosa augmente et que leur synthèse protéique est activée, ainsi que d'autres changements fonctionnels et phénotypiques 8 . Par conséquent, il n'est pas surprenant que les données minimales disponibles dansLa littérature se concentre sur l'analyse des valves mitrales pathologiques 9 , 10 , dans lesquelles le nombre accru de VIC activés pourrait expliquer le nombre relativement élevé de protéines identifiées.
En conclusion, le présent protocole peut servir à développer la compréhension des mécanismes pathogènes responsables des maladies de la valvule mitrale par l'étude des composants des protéines valvulaires mitrales. En effet, une meilleure compréhension des processus pathologiques sous-jacents pourrait aider à améliorer la gestion clinique des maladies des valvules, dont les indications actuelles d'intervention sont principalement fondées sur des considérations hémodynamiques.
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Protocol
Dans ce protocole, les cœurs humains sont recueillis lors d'une explication multiorganique (temps d'ischémie froide de 4-12 h, moyen 6 ± 2 h) provenant de donneurs multi-organes exclus de la transplantation d'organe pour des raisons techniques ou fonctionnelles, malgré des paramètres échocardiographiques normaux. Ils sont envoyés à la Banque de tissus cardiovasculaires de Milan, au Centre cardiologique Monzino (Milan, Italie) pour la banque des valves aortiques et pulmonaires. Les tracts postérieurs mitral ne sont pas utilisés à des fins cliniques, de sorte qu'ils sont recueillis lors de l'isolement valvulaire aortique et pulmonaire après obtention du consentement éclairé des proches des donneurs. Le tissu pour la transplantation et la recherche ne sont recueillis qu'après le consentement des parents; Sur la fiche de consentement, ils autorisent (ou non) l'utilisation du tissu cardiaque pour la recherche uniquement si elle n'est pas adaptée à une utilisation clinique humaine ( c'est-à-dire des problèmes microbiologiques, fonctionnels et sérologiques), conformément aux directives du comité d'éthique deMonzino Cardiologic Center.
1. Préparation de la soupape mitrale
- Récolter la valvule mitrale humaine dès que possible après l'explication de l'organe (temps d'ischémie froide de 4-12 h).
- Dans une pièce propre, retirez le cœur du sac de transport contenant une solution froide (4 ° C) (solution saline ou milieu équilibré, Eurocollins ou Wisconsin). Mettez-le dans un seau et placez-le dans un coffret de sécurité biologique (flux d'air vertical à risque biologique, classe A, classification des bonnes pratiques de fabrication (BPF)) pour procéder à la préparation de la soupape.
- Placez le cœur sur un drap stérile jetable dans le coffret. À l'aide d'un scalpel jetable stérile, couper complètement le cœur, perpendiculairement à son axe principal, au niveau des ventricules gauche et droit, à environ 4 cm de l'apex.
- Déplacez l'aorte ascendante et l'artère pulmonaire pour afficher le toit de l'oreille gauche.
- Avec des pince et des piquets stériles autoclavables, couper autour de l'oreillette gauche sur leToit auriculaire gauche, rendant la valvule mitrale visible et permettant d'identifier la grande feuillette mitrale (antérieure) et la petite notice mitrale (postérieure).
NOTE: Les commissures antéro-latérales et postérieures du médium définissent la bordure de la notice antérieure et la zone postérieure. - En utilisant des ciseaux stériles autoclavables et des pinces non traumatiques, disséquer l'oreillette gauche et l'épaisseur de la paroi du ventricule autour de la circonférence de toute la valvule mitrale .
- Identifiez la continuité de la valve mitro-aortique.
NOTE: Le ventricule gauche contient toute la valvule mitrale et les cordes. - Séparez la valvule de la valvule mitrale antérieure de la valvule de la valvule mitrale postérieure, en coupant la notice postérieure le long de l'insertion avec le ventricule (commissure).
- Laver la notice postérieure dans la solution saline. Couper la notice en petits morceaux (<1 cm 2 ) et les enrouler individuellement dans du papier d'aluminium. Branchez-les à l'aide d'azote liquide.
Attention: Suivez les procédures de sécurité organisationnelles lors de l'utilisation d'azote liquide.- Sanitier la table de l'armoire avec une solution d'alcool isopropylique à 70% et une solution à 6% de peroxyde d'hydrogène à la fin de la procédure.
2. Extraction de protéines
- Utilisez une pince pour retirer l'échantillon stocké dans de l'azote liquide et placez-le immédiatement sur de la glace carbonique tout en étant encore enroulé dans la feuille d'aluminium. Ne laissez pas l'échantillon décongeler pendant les transferts.
- Avant le broyage, refroidissez le mortier de porcelaine / zirconium et les pilons d'un système de broyage ( par exemple, CryoGrinder), ainsi que l'échantillon, en les mettant dans un flacon Dewar contenant de l'azote liquide (~ 500 mL).
Attention: Suivez les procédures de sécurité organisationnelles lors de l'utilisation d'azote liquide. - Mettez le mortier et les pilons dans une boîte en polystyrène contenant de la glace carbonique. Retirez l'échantillon du papier d'aluminium et placez-le dans le mortier.
- Grind tIl échantillonne avec le gros pilon contre le mortier 15 à 20 fois, en utilisant le tournevis pour faire tourner le pilon. Mélanger l'échantillon avec la pointe d'une spatule pré-refroidie pendant le processus de broyage.
- Répétez avec le petit pilon.
- Transférer l'échantillon de terre à un tube préalablement pesé ( p. Ex., Tube de centrifugation de 15 ml) en inversant le tube, en le plaçant sur le mortier et en les inverse pour déplacer l'échantillon vers le tube. Utilisez une spatule pré-refroidie pour récupérer tout le matériau du mortier.
- Gardez le tube avec l'échantillon sur de la glace sèche pour éviter la décongélation de l'échantillon pendant le transfert.
- Calculer le poids net de l'échantillon.
- Nettoyez le mortier et les pilons après chaque échantillon et décontaminez-les en autoclavant ou en les chauffant à 200 ° C pendant 2 h.
- Transférer l'échantillon en poudre du tube centrifuge au tube de verre d'un homogénéisateur par inversion.
- Ajouter un buffe d'urée filtréR (8 M d'urée, 2 M de thiourée, 4% p / v CHAPS, 20 mM de Tris et 55 mM de dithiotréitol) au tube de verre, 200 μL de tampon d'urée pour chaque 10 mg de tissu en poudre.
REMARQUE: L'échantillon de poudre résiduelle laissé dans le tube de centrifugation peut être récupéré en utilisant une partie du volume calculé de tampon d'urée. - Homogénéiser l'échantillon à l'aide d'un agitateur équipé d'un mortier de verre à base de borosilicate et d'un pilon de polytétrafluoroéthylène (PTFE). Appuyez lentement sur le pilon sur l'échantillon avec un mouvement de torsion (1.500 tr / min) 10 fois.
- Récupérer le surnageant et le transférer dans un tube de centrifugation propre de 1,7 ml. Encore extraire l'échantillon restant avec du tampon d'urée frais, en ajoutant la moitié du volume utilisé lors de la première extraction.
- Répétez l'étape 2.10.
- Récupérer le surnageant et le combiner avec le surnageant à partir de l'étape 2.11. Placez le surnageant combiné sur un rotator de tube pendant 30 min.
- Centrifuger le tube pendant 30 min à 13 000 xg et 4 ° C.
- Récupérer le surnageant etD mesure la concentration de protéines en utilisant le dosage de protéines de Bradford, selon les instructions du fabricant. Conservez l'échantillon à -80 ° C jusqu'à l'utilisation.
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Representative Results
L'extraction et la dissolution des protéines dans le tampon d'urée sont directement compatibles avec les méthodes protéomiques basées sur l'isoélectro-focalisation (électrophorèse bidimensionnelle (2-DE) 11 et la focalisation isoélectrique en phase liquide (IEF) 12 ) et avec immunoblot après dilution dans le tampon Laemmli 13 Contenant un cocktail inhibiteur de protéase 14 .
Pour les méthodes à base de spectrométrie de masse sans gel ( c.-à-d., La chromatographie liquide couplée à une analyse de spectrométrie de masse indépendante de la donnée (LC / MS E ) et LC / MS E bidimensionnelle (2D-LC / MS E )) 15 , les échantillons sont extraits Dans le tampon d'urée décrit, doivent être encore traités pour éliminer l'urée et la thiourée, ce qui pourrait interférer avec la digestion ultérieure des protéines et la séparation par chromatographie liquide. ThiL'étape de dessalage de S peut être réalisée en utilisant les kits commerciaux de précipitation des protéines, en suivant les instructions du fabricant pour précipiter les protéines. L'échantillon peut ensuite être dissous dans du NH 4 HCO 3 25 mM contenant 0,1% de détergents clivables pour la digestion des protéines 16 . La précipitation des protéines peut éliminer les composants tampons, ce qui affecte de manière minimale la teneur en protéines (récupération de protéines:> 85%), ce qui rend l'échantillon approprié pour chaque type d'analyse.
L'application de ce protocole pour l'extraction de protéines à partir de valves mitrales humaines a permis d'identifier un total de 422 protéines, combinant quatre approches protéomiques différentes décrites précédemment en détail 11 , 15 . Plus précisément, 169 protéines ont été identifiées par 2-DE, 330 protéines par phase liquide IEF, 96 protéines par LC / MS E et 148 protéinesPar 2D-LC / MS E (tableau 1).
Pour classer les 422 protéines identifiées en termes de localisation subcellulaire, un logiciel a été utilisé pour l'analyse de l'ontologie du gène (GO) ( p. Ex., Cytoscape). Le réseau créé avec le logiciel et son plug-in correspondant a montré que, outre les protéines attendues localisées dans la région extracellulaire (voir la partie supérieure droite de la figure 2 ), la plupart des protéines identifiées par les approches protéomiques proviennent de la région intracellulaire (C. -à-d. Le cytoplasme, les organites, les vésicules et le cytosquelette). Les protéines de surface cellulaire ont également été identifiées ( figure 2 ).
Les résultats ont encore été confirmés dans trois échantillons mitraux indépendants. L'immunoblot a été utilisé pour analyser un groupe de quatre protéines ( c.-à-d. Septin-11, quatre et demi protéines de domaine LIM 1 (FHL-1), derLa matopontin et l'alpha-cristalline B (CryAB)) qui n'ont jamais été identifiées dans la valvule mitrale normale ( figure 3 ).
Figure 1: structure de la valve mitrale. Vue de dessus du coeur humain montrant la valve mitrale humaine fermée ( A ) ou ouverte ( B ). Vue de face du ventricule gauche d'un coeur humain ( C ). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2: Analyse des protéines de valvule mitrale identifiées en terme de distribution cellulaire. Cytoscape et le plugin BiNGO ont été utilisés pour obtaiN la répartition des termes de l'ontologie du gène (GO) à partir des catégories de composants cellulaires. La taille du cercle est proportionnelle au nombre de composants protéiques associés aux termes GO sélectionnés, et l'échelle de couleur pour la valeur p de la surreprésentation est signalée. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3: Analyse par immunoblot de septin-11, FHL-1, dermatopontine et CryAB dans l'extrait entier de trois valvules valvulaires mitrovales normales. L'immunoblot a été réalisé en utilisant un anticorps monoclonal de souris contre CryAB et des anticorps polyclonaux de lapin contre les anticorps septin-11, FHL-1 et dermatopontin. S'il vous plaîtCliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Accession | La description | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Phase liquide IEF |
| A6NMZ7 | Colagène alpha VI | X | |||
| O00151 | PDZ et LIM domain protéine 1 | X | |||
| O00299 | Protéine de canal intracellulaire de chlorure 1 | X | |||
| O00764 | Pyridoxal kinase | X | |||
| O14558 | Protéine de choc thermique beta 6 | X | |||
| O43399 | Protéine tumorale D54 | X | |||
| O43488 | Aflatoxine B1 aldéhyde réductase membre 2 | X | |||
| O43707 | Alpha actinine 4 | X | X | ||
| O43866 | Anti-antigène CD5 comme précurseur | X | |||
| O60493 | Tri de nexin 3 | X | |||
| O60701 | UDP glycémie 6 déshydrogénase | X | |||
| O75223 | Protéine non caractéristique | X | |||
| O75368 | Le protéine protéinée par l'acide glutamique du domaine SH3 | X | |||
| O75390 | Citrate synthase mitochondrial precursor | X | |||
| O75489 | NADH déshydrogénase ubiquinone protéine de soufre de fer 3 précurseur mitochondrial | X | X | ||
| O75608 | Acyl protein thioesterase 1 | X | |||
| O75828 | Carbonyl réductase NADPH 3 | X | |||
| O75874 | Isocitrate déshydrogénase NADP cytoplasmique | X | |||
| O75955 | Flotillin | X | |||
| O94760 | NG NG diméthylarginine diméthylaminohydrolase 1 | X | |||
| O94788 | Retinal déshydrogénase 2 | X | |||
| O95865 | NG NG diméthylarginine diméthylaminohydrolase 2 | X | X | ||
| P00325 | Alcool déshydrogénase 1B | X | X | ||
| P00338 | L chaîne de lactate déshydrogénase A | X | |||
| P00352 | Retinal déshydrogénase 1 | X | |||
| P00441 | Superoxyde dismutase Cu Zn | X | X | ||
| P00450 | Précurseur de la céruloplasmine | X | X | ||
| P00488 | Le précurseur de chaîne du facteur de coagulation XIII A | X | |||
| P00491 | Purine nucleoside phosphorylase | X | |||
| P00492 | Hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase | X | |||
| P00558 | Phosphoglycératine kinase 1 | <Td> xX | X | ||
| P00568 | Isoenzyme 1 d'adénylate kinase | X | |||
| P00734 | Prothrombine | X | X | ||
| P00738 | Haptoglobine | X | X | X | X |
| P00739 | Précurseur de protéines liées à l'haptoglobine | X | |||
| P00751 | Facteur de complément B | X | X | X | |
| P00915 | Anhydrase carbonique 1 | X | |||
| P00918 | Anhydrase carbonique 2 | X | |||
| P01008 | Précurseur antithrombine III | X | X | X | |
| P01009 | Alpha 1 antitrypsine | X | X | X | X |
| P01011 | Alpha 1 antichymotrypsine | X | X | X | X |
| P01019 | Précurseur d'angiotensinogène | X | X | ||
| P01023 | Alpha 2 macroglobuline | X | X | ||
| P01024 | Complément C3 | X | X | X | X |
| P01033 | Le précurseur de l'inhibiteur 1 de la métalloprotéinase | X | |||
| P01042 | Kininogène 1 précurseur | X | |||
| P01593 | Ig kappa chain VI region AG | X | |||
| P01598 | Ig kappa chain VI region EU | X | |||
| P01600 | Ig kappa chaîne VI région Hau | X | X | ||
| P01611 | Ig kappa chain VI region Wes | X | |||
| P01620 | Ig kappa chaîne V III région SIE | X | |||
| P01625 | Ig kappa chain V IV region Len | X | |||
| P01766 | Ig de la chaîne lourde Ig III BRO | X | X | ||
| P01781 | Ig de la chaîne lourde Ig III GAL | X | |||
| P01834 | Région de la chaîne C kappa d'Ig | X | X | X | X |
| P01842 | Régions de la chaîne C de Ig lambda | X | X | X | |
| P01857 | Ig Gamma 1 chaîne C région | X | X | X | X |
| P01859 | Région Ig de gamma 2 chaîne C | X | X | X | X |
| P01860 | Région Ig de gamma 3 chaîne C | X | X | X | |
| P01861 | Ig gamma 4 chaîne C région | X | X | X | |
| P01871 | Ig mu chaîne C région | X | X | X | |
| P01876 | Ig alpha 1 chaîne C région | X | X | X | X |
| P01877 | Ig alpha 2 chaîne C région | X | |||
| P02144 | Myoglobine | X | X | ||
| P02452 | Chaîne de collagène alpha 1 I | X | X | X | X |
| P02511 | Chaîne alpha-cristalline B | X | |||
| P02545 | Lamin AC 70 kDa lamin | X | X | X | X |
| P02647 | Apolipoprotéine AI | X | X | X | X |
| P02649 | Apolipoprotéine E | X | X | X | X |
| P02671 | Chaîne alpha fibrinogène | X | X | X | X |
| P02675 | Chaîne bêta fibrinogène | X | X | X | X |
| P02679 | Chaîne gamma fibrinogène | X | X | X | X |
| P02689 | Protéine Myelin P2 | X | |||
| P02735 | Amyloïde au sérum Un précurseur de protéines | X | |||
| P02741 | Précurseur de protéines réactives C | X | |||
| P02743 | Composant P amyloïde au sérum | X | X | X | X |
| P02746 | Sous-unité B de sous-composant C1q Complément | X | X | ||
| P02747 | Complément C1q sous-composant sous-unité C précurseur | X | |||
| P02748 | Composante Complément C9 | X | X | X | |
| P02749 | Beta 2 glycoprotéine 1 | X | X | X | X |
| P02750 | Le précurseur de glycoprotéines alpha 2 riches en leucine | X | |||
| P02751 | Fibronectine | X | X | ||
| P02760 | Précurseur de protéine AMBP | X | X | X | X |
| P02763 | Alpha 1 glycoprotéine acide 1 | X | X | X | |
| P02765 | Alpha 2 HS précurseur de glycoprotéines | X | |||
| P02766 | Précurseur de transthyretin | X | X | X | |
| P02768 | Albumine de sérum | X | X | X | X |
| P02774 | Précurseur de protéines liant la vitamine D | X | |||
| P02787 | Serotransferrine | X | X | X | X |
| P02788 | Précurseur de la lactotransferrine | X | |||
| P02790 | Hemopexine | X | X | X | X |
| P02792 | Chaîne légère de ferritine | X | |||
| P04004 | Vitronectine | X | X | X | X |
| P04075 | Fructose bisphosphate aldolase A | X | |||
| P04083 | Annexe A1 | X | X | X | X |
| P04179 | Super-oxide dismutase Mn précurseur mitochondrial | X | |||
| P04196 | Précurseur de glycoprotéines riches en histidine | X | |||
| P04217 | Alpha 1B précurseur de glycoprotéines | X | X | ||
| P04350 | Tubuline bêta 4 chaîne | X | |||
| P04406 | Glyceraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase | X | X | X | X |
| P04792 | Protéine de choc thermique beta 1 | X | X | X | X |
| P05091 | Le précurseur mitochondrial d'Aldehyde Deshydrogenase | X | X | ||
| Le précurseur d'inhibiteur de la protéase C1 de plasma | X | ||||
| P05156 | Précurseur de complément de facteur I | X | |||
| P05413 | Coeur de protéine liant les acides gras | X | |||
| P05452 | TNT précurseur de Tetranectine | X | X | ||
| P05787 | Cytoskeletal de la kératine de type II 8 | X | |||
| P06396 | Gelsolin | X | X | X | X |
| P06576 | ATP synthase sous-unité beta mitochondrial precursor | X | X | ||
| P06732 | Type de créatine kinase M | X | X | ||
| P06733 | Alpha enolase | X | X | X | X |
| P06753 | Chaîne alpha 3 de Tropomyosine | X | X | ||
| P07108 | Protéine de liaison Acyl CoA | X | |||
| P07195 | L chaîne de lactase déshydrogénase B | X | X | X | |
| P07196 | Polypeptide léger de neurofilament | X | |||
| P07197 | Polypeptide moyen de neurofilament | X | X | ||
| P07237 | Protéines disulfure isomérase précurseur | X | X | ||
| P07339 | Le précurseur de la cathepsine D | X | X | ||
| P07355 | Annexe A2 | X | X | X | X |
| P07360 | Complément composant C8 précurseur de chaîne gamma | X | |||
| P07437 | Chaîne bêta de tubuline | X | X | X | X |
| P07585 | Decorin | X | X | X | X |
| P07737 | Profilin 1 | X | |||
| P07858 | Précurseur de la cathepsine B | X | |||
| P07900 | Protéine de choc thermique HSP 90 alpha | X | X | ||
| P07951 | Chaîne bêta de Tropomyosine | X | |||
| P07954 | Le précurseur mitochondrial de l'hydratase de fumarate | X | |||
| P07996 | Thrombospondin 1 | X | X | X | |
| P08107 | Choc thermique 70 kDa protéine 1A 1B | X | X | X | X |
| P08123 | Chaîne de collagène alpha 2 I | X | X | X | X |
| P08133 | Annexe A6 | X | X | ||
| P08238 | Protéine de choc thermique HSP 90 beta | X | X | ||
| P08253 | Précurseur de collagénase de type 72 kDa type IV | X | |||
| P08294 | Superoxide dismutase extracellulaire Cu Zn précUrsor | X | X | X | |
| P08590 | Polypeptide léger à la myosine 3 | X | X | ||
| P08603 | Facteur de complément H | X | X | X | X |
| P08670 | Vimentin | X | X | X | X |
| P08729 | Kertoste type II cytosquelette 7 | X | |||
| P08758 | Annexe A5 | X | X | X | X |
| P09211 | Glutathione S transferase P | X | X | X | |
| P09382 | Galectine 1 | X | X | X | |
| P09417 | Dihydropteridine réductase | <Td> | X | ||
| P09493 | Tropomyosine 1 chaîne alpha | X | X | ||
| P09525 | Annexin A4 | X | X | ||
| P09651 | Ribonucléoprotéine nucléaire A1 hyperthermique | X | |||
| P09871 | Complément C1s sous-composant précurseur | X | |||
| P09936 | L'isozyme L1 de l'hydrolase terminal carboxyle d'ubiquitine | X | |||
| P09972 | Fructose bisphosphate aldolase C | X | |||
| P0C0L4 | Complément C4 Un précurseur | X | |||
| P0CG05 | IgLambda 2 chaînes C | X | |||
| P0CG38 | POTE membre de la famille de domaine Ankyrin I | X | |||
| P10515 | Composé d'acétyltransférase de résidu de dihydrolipoyllysine du complexe pyruvate déshydrogénase | X | |||
| P10768 | S formylglutathione hydrolase | X | |||
| P10809 | Protéine mitochondrial de protéines de choc thermique de 60 kDa | X | |||
| P10909 | Clusterin | X | X | X | X |
| P10915 | Hyaluronan et proteoglycan link protein 1 precursor | X | X | ||
| P11021 | 78 kDa gProtéine régulée par lucose | X | X | X | |
| P11047 | Sous-unité Laminin gamma 1 précurseur | X | |||
| P11142 | La protéine 71 kDa cognée par choc thermique | X | X | X | X |
| P11177 | Le précurseur mitochondrial de la sous-unité des composants de la pyruvate déshydrogénase E1 | X | |||
| P11217 | Forme du muscle glycogène phosphorylase | X | |||
| P11310 | Précédente mitochondrial d'acyl CoA déshydrogénase spécifique de chaîne moyenne | X | |||
| P11413 | Glucose 6 phosphate 1 déshydrogénase | X | |||
| P11766 | Chaîne de chi de la classe 3 de l'alcool déshydrogénase | X | |||
| P12036 | Polypeptide lourd de neurofilament | X | |||
| P12109 | Collagène alpha 1 chaîne VI | X | X | X | X |
| P12110 | Chaîne de collagène alpha 2 VI | X | X | X | X |
| P12111 | Chaîne de collagène alpha 3 VI | X | X | X | |
| P12277 | Type de créatine kinase B | X | |||
| P12429 | Annexe A3 | X | X | ||
| P12814 | Alpha actinine 1 | X | X | ||
| P12829 | Polypeptide léger à la myosine 4 | X | |||
| P12882 | Myosine 1 | X | |||
| P12883 | Myosine 7 | X | X | ||
| P12955 | Xaa Pro dipeptidase | X | |||
| P13489 | Inhibiteur de ribonucléase | X | |||
| P13533 | Myosine 6 | X | X | ||
| P13611 | Précurseur de protéines de base de Versican | X | X | ||
| P13639 | Facteur d'allongement 2 | X | |||
| P13716 | Delta aminolevulinic acid déshydratase | X | |||
| P13796 | Plastin 2 | X | |||
| P13804 | Le précurseur mitochondrial de la sous-unité alpha de flavoprotéine de transfert d'électrons | X | |||
| P13929 | Beta enolase | X | X | ||
| P14136 | Astrocyte de protéines acides fibrillaires gliaires | X | |||
| P14314 | Le précurseur bêta de la sous-unité Glucosidase 2 | X | |||
| P14550 | Alcool déshydrogénase NADP | X | |||
| P14618 | Les isozymes de pyruvate kinase M1 M2 | X | X | X | |
| P14625 </ Td> | Précurseur d'endoplasmine | X | X | ||
| P15121 | Aldose réductase | X | |||
| P15259 | Phosphoglycerate mutase 2 | X | |||
| P16152 | Carbonyl réductase NADPH 1 | X | |||
| P17066 | Choc thermique 70 kDa protéine 6 | X | X | X | |
| P17174 | Aspartate aminotransférase cytoplasmique | X | |||
| P17540 | Le précurseur mitochondrial sarcomérique de la créatine kinase | X | |||
| P17661 | Desmin | X | X | X | X |
| P17980 | Sous-unité de régulation de protéase 26S 6A | X | |||
| P17987 | Sous-unité de protéine 1 complexe complexe alpha | X | |||
| P18206 | Vinculin | X | X | ||
| P18428 | Le précurseur de protéines liant les lipopolysaccharides | X | |||
| P18669 | Phosphoglycérate mutase 1 | X | |||
| P19105 | Chaîne légère de régulation de la myosine 2 | X | X | ||
| P19623 | Spermidine synthase | X | |||
| P19652 | Alpha 1 précurseur de glycoprotéine acide 2 | X | X | ||
| P19823 | Inter-alpha trypsine inhibiteur chaîne lourde H2 | X | |||
| P19827 | Inter-alpha trypsine inhibiteur chaîne lourde H1 | X | X | ||
| P20073 | Annexin A7 | X | |||
| P20618 | Protéasome subunité beta type 1 précurseur | X | |||
| P20774 | Mimecan | X | X | X | X |
| P21266 | Glutathione S transferase Mu 3 | X | |||
| P21333 | Filamine A | X | X | ||
| P21796 | Protéine de canal sélectif anion dépendant de la tension1 | X | |||
| P21810 | Biglycan | X | X | X | X |
| P21980 | Proteine glutamine gamma glutamyltransferase 2 | X | X | ||
| P22105 | Tenascin X | X | X | ||
| P22314 | L'enzyme activant l'ubiquitine E1 | X | |||
| P22352 | Le précurseur de glutathion peroxydase 3 | X | X | ||
| P22626 | Ribonucléoprotéines nucléaires A2 A2 | X | |||
| P22695 | Le précurseur mitochondrial de la protéine core 2 de la protéine nucléaire 2 de l'ubiquinol cytochrome c réductase | X | |||
| P23141 | Précurseur de la carboxylésterase 1 du foie | X | |||
| P23142 | Fibulin 1 | X | X | X | X |
| P23284 | Peptidyl prolyl cis trans isomérase B précurseur | X | |||
| P23381 | Tryptophanyl tRNA synthetase cytoplasmique | X | |||
| P23526 | Adénosylhomocysteinase | X | X | ||
| P23528 | Cofilin 1 | X | |||
| P24752 | Acetyl CoA acétyltransférase mitochondrial precursor | X | |||
| P25311 | Zinc alpha 2 glycoproteiN précurseur | X | |||
| P25705 | ATP synthase sous-unité alpha mitochondrial | X | |||
| P25788 | Substance protéasome alpha type 3 | X | X | ||
| P25789 | Substance protéasome alpha type 4 | X | |||
| P26447 | Protéine S100 A4 | X | |||
| P27348 | 14 3 3 protéine theta | X | X | ||
| P27797 | Précurseur de calréticuline | X | |||
| P28066 | Sous-unité Proteasome alpha type 5 | X | |||
| P28070 | <Td> Protéasome subunité beta type 4 précurseurX | X | |||
| P28072 | Protéasome subunité bêta type 6 précurseur | X | |||
| P28074 | Protéasome subunité bêta type 5 précurseur | X | |||
| P28331 | NADH ubiquinone oxydoréductase 75 kDa sous-unité précurseur mitochondrial | X | |||
| P28838 | Cytosol aminopeptidase | X | |||
| P29218 | Inositol monophosphatase | X | |||
| P29401 | Transketolase | X | |||
| P29692 | Elta du facteur 1 delta | <Td> | X | ||
| P29966 | Substrat de C kinase riche en alanine myristoylée | X | |||
| P30040 | Protéine de réticulum endoplasmique Protéine ERp29 | X | |||
| P30041 | Peroxiredoxine 6 | X | X | ||
| P30043 | Flavine réductase | X | |||
| P30044 | Peroxiredoxine 5 précurseur mitochondrial | X | |||
| P30085 | UMP CMP kinase | X | |||
| P30086 | Protéine de liaison à la phosphatidyléthanolamine 1 | X | |||
| P30101 | ProteiN précurseur de disulfure isomérase A3 | X | X | X | |
| P30613 | Isozymes de pyruvate kinase RL | X | |||
| P30740 | Inhibiteur d'élastase leucocytaire | X | |||
| P31025 | Lipocalin 1 précurseur | X | |||
| P31937 | 3 précurseur mitochondrial de l'hydroxyisobutyrate déshydrogénase | X | |||
| P31942 | Honeogène nucléaire ribonucléoprotéine H3 | X | |||
| P31943 | La ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène H | X | |||
| P31946 | 14 3 3 protéine alpha bêta | X | X | ||
| P31948 | Phosphoprotéine induite par le stress 1 | X | |||
| P31949 | Protéines S100 A11 | X | |||
| P32119 | Peroxiredoxine 2 | X | X | ||
| P34931 | Choc thermique 70 kDa protéine 1 comme | X | X | ||
| P34932 | Choc thermique 70 kDa protéine 4 | X | |||
| P35232 | Prohibition | X | |||
| P35237 | Serpin B6 | X | |||
| P35443 | Thrombospondin 4 | X | </ Tr> | ||
| P35555 | Fibrilline 1 | X | X | ||
| P35579 | Myosine 9 | X | X | X | |
| P35580 | Myosine 10 | X | X | ||
| P35609 | Alpha actinine 2 | X | |||
| P35625 | Inhibiteur de la métalloprotéinase 3 | X | X | ||
| P35998 | Sous-unité 7S de protection de la protéase | X | |||
| P36871 | Phosphoglucomutase 1 | X | X | ||
| P36955 | Facteur dérivé de l'épithélium pigmenté | X | X | ||
| P37802 | <Td> Transgelin 2X | X | |||
| P37837 | Transaldolase | X | |||
| P38117 | Sous-unité de flavoprotéines de transfert d'électrons bêta | X | |||
| P38646 | Stress 70 protéines mitochondrial précurseur | X | X | ||
| P39687 | Fiduoproteine nucléaire riche en leucine acidifiée 32 membre de la famille A | X | |||
| P40121 | Protéine de capsule de macropore | X | |||
| P40925 | Malate déshydrogénase cytoplasmique | X | |||
| P40926 | Précurseur mitochondrial malate déshydrogénase | <Td> | X | ||
| P41219 | Périphérique | X | |||
| P42330 | Aldo keto réductase famille 1 membre C3 | X | |||
| P45880 | La protéine de canal sélectif anion dépendante de la tension 2 | X | |||
| P47755 | Sous-unité de protéines de capsulation de l'actine alpha 2 | X | X | ||
| P47756 | Sous-unité de protéines de protection de l'actine beta | X | X | ||
| P47985 | Ubiquinol cytochrome c réductase soufre de fer subunité mitochondrial précurseur | X | |||
| P48047 | ATP synthase O subunit mitochondrial precursor | X | |||
| P48637 | Glutathion synthetase | X | |||
| P48741 | Choc thermique 70 kDa protéine 7 | X | X | ||
| P49189 | 4 triméthylaminobutyraldéhyde déshydrogénase | X | |||
| P49368 | T complexe sous-unité 1 gamma | X | |||
| P49747 | Protéine matricielle oligomérique du cartilage | X | X | X | X |
| P49748 | Précurateur mitochondrial spécifique d'acyl CoA déshydrogénase à chaîne très longue | X | |||
| P50395 | Rab inhibiteur de dissociation du PIB bêta | X | X </ Td> | ||
| P50454 | Précurseur de Serpin H1 | X | |||
| P50995 | Annexe A11 | X | |||
| P51452 | Spécificité double protéines phosphatase 3 | X | |||
| P51884 | Lumican | X | X | X | X |
| P51888 | Prolargin précurseur | X | X | X | X |
| P52565 | Rho Inhibiteur de dissociation du PIB 1 | X | |||
| P52566 | Rho Inhibiteur de dissociation du PIB 2 | X | |||
| P54652 | Protéine de 70 kDa associée aux chocs thermiques | X | X | X | X |
| P55072 | Réticulum endoplasmique transitoire ATPase | X | |||
| P55083 | Le précurseur associé à la glycoprotéine 4 associé à la microfibril | X | X | ||
| P57053 | Histone H2B type F | X | |||
| P60174 | Triosephosphate isomérase | X | X | X | |
| P60660 | Polypeptide léger à la myosine 6 | X | X | ||
| P60709 | Actine cytoplasmique 1 | X | X | X | X |
| P60981 | Destrin | X | |||
| P61086 | L'enzyme de conjugaison d'ubiquitine E2 25 kDa | X | |||
| P61088 | L'enzyme de conjugaison d'ubiquitine E2 | X | |||
| P61224 | Protéine Ras protégée Rap 1b précurseur | X | |||
| P61978 | La ribonucléoprotéine nucléaire nucléaire Heterogène | X | X | ||
| P61981 | 14 3 3 gamme de protéines | X | X | X | |
| P62258 | 14 3 3 protéine epsilon 14 3 3E | X | |||
| P62491 | Protéine apparentée à Ras | X | |||
| P62714 | Serine threonine protein phosphatase 2A sous-unité catalytique isoforme bêta | X | |||
| P62736 | Actine aortic smooth muscle | X | X | X | |
| P62805 | Histone H4 | X | |||
| P62826 | GTP reliant la protéine nucléaire Ran | X | |||
| P62873 | Substance GIGSGT de liaison de nucléotide de Guanine beta 1 | X | |||
| P62879 | Substance GIGSGT de liaison de nucléotide de guanine bêta 2 | X | |||
| P62937 | Peptidyl prolyl cis trans isomérase A | X | X | ||
| P62987 | Proteine ribosomale ubiquitine 60S L40 | X | |||
| P63104 | 14 3 3 proTein zeta delta | X | X | X | X |
| P63241 | Facteur d'initiation de la traduction eukaryote 5A 1 | X | |||
| P63244 | Sous-unité de protéine de liaison de nucléotide de guanine bêta 2 comme 1 | X | |||
| P63267 | Actine gamma entérique muscle lisse | X | X | ||
| P67936 | Chaîne alpha de Tropomyosine 4 | X | |||
| P68032 | Acte alpha muscle cardiaque 1 | X | |||
| P68104 | Facteur d'élongation 1 alpha 1 | X | X | X | |
| P68133 | Actine alpha squelettique | ||||
| P68363 | Chaîne de tubuline alpha 1B | X | X | X | |
| P68371 | Chaîne de tubuline bêta 2C | X | X | X | |
| P68402 | Facteur d'activation des plaquettes sous-unité IB de l'acétylhydrolase IB | X | |||
| P68871 | Sous-unité de l'hémoglobine bêta | X | X | X | |
| P69905 | Sous-unité d'hémoglobine alpha | X | X | ||
| P78371 | Sous-unité de protéine 1 complexe T bêta | X | |||
| P78417 | Glutathione transferase omega 1 | X | X | ||
| P80748 | Chaîne Ig lambda VIII Région LOI | X | |||
| P98095 | Fibulin 2 | X | X | ||
| Q01082 | Cerveau de chaîne beta de Spectrin 1 | X | |||
| Q01449 | Chaîne légère de régulation de la myosine 2 isoforme auriculaire | X | |||
| Q01518 | Protéine 1 associée à l'adénylyl cyclase | X | |||
| Q01995 | Transgeline Protéine de muscle lisse 22 alpha | X | |||
| Q03252 | Lamin B2 | X | X | ||
| Q03591 | Facteur de compléments H précurseur de protéine 1 apparenté | X | Q04917 | 14 3 3 protéine eta | X | X |
| Q06323 | Activateur protéasome complexe sous-unité 1 | X | |||
| Q06828 | Fibromoduline | X | X | X | X |
| Q06830 | Peroxiredoxine 1 | X | X | ||
| Q07507 | Dermatopontin | X | X | X | X |
| Q07960 | Rho GTPase activant la protéine 1 | X | |||
| Q08257 | Quinone oxydoréductase | X | |||
| Q08431 | Lactadherin | X | X | ||
| Q12765 | SEcernin 1 | X | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 dienoyl CoA isomérase mitochondrial précurseur | X | X | ||
| Q13228 | Protéine de liaison au sélénium 1 | X | X | ||
| Q13404 | L'enzyme de conjugaison de ubiquitine E2 variante 1 | X | |||
| Q13409 | Chaîne intermédiaire 2 de la dyneine cytoplasmique | X | |||
| Q13509 | Tubuline bêta 3 chaîne | X | X | X | |
| Q13642 | Quatre protéines 1 de domaine LIM et demi | X | |||
| Q13765 | Sous-unité complexe alpha associée aux polypeptides naissants | X | |||
| Q13885 | N Tubulin chaîne beta 2A | X | X | ||
| Q14194 | Protéine liée à la dihydropyrimidinase 1 | X | |||
| Q14195 | Protéine 3 protégée par la dihydropyrimidinase | X | X | X | X |
| Q14624 | Inter-alpha trypsine inhibiteur de chaîne lourde H4 précurseur | X | |||
| Q14697 | Neutral alpha glucosidase AB precursor | X | |||
| Q14764 | Protéine de la voûte principale | X | |||
| Q14767 | Protéine de liaison bêta du facteur de croissance transformant latente 2 | X | <Td>X | ||
| Q14894 | Protéine de fixation de l'hormone thyroïdienne réglementée par NADP | X | |||
| Q15063 | Précurseur Periostin | X | X | X | X |
| Q15084 | Protéines disulfure isomérase A6 précurseur | X | |||
| Q15113 | Procédure de Procollagen C endopeptidase enhancer 1 précurseur | X | |||
| Q15181 | Pyrophosphatase inorganique | X | |||
| Q15365 | Poly RC binding protein 1 | X | |||
| Q15366 | Poly RC binding protein 2 | X | |||
| Q15582 | Transformer la protéine induite par le facteur de croissance beta | X | X | X | |
| Q15819 | L'enzyme de conjugaison d'ubiquitine E2 variante 2 | X | |||
| Q16352 | Internexin alpha | X | |||
| Q16473 | Ténascine XA putative | X | |||
| Q16555 | Protéine 2 protégée par la dihydropyrimidinase | X | X | X | |
| Q16698 | 2 4 précurseur mitochondrial de dienoyl CoA réductase | X | |||
| Q16891 | Membrane interne mitochondriale | X | |||
| Q562R1 | La bêta-actine, comme la protéine 2 | X | |||
| Q6S8J3 | POTE ankyrin domaine membre de la famille E | X | |||
| Q6UWY5 | Olfactomedine comme précurseur de protéine 1 | X | X | ||
| Q71U36 | Chaîne de tubuline alpha 1A | X | X | X | |
| Q7Z7G0 | Target of Nesh SH3 precursor | X | X | X | |
| Q8WUM4 | Mortule cellulaire programmée 6 protéine interagissante | X | |||
| Q8WWX9 | Thioredoxine comme précurseur de sélénoprotéine M | X | |||
| Q92597 | Protéines NDRG1 | X | |||
| Q92945 L'agent amont en amont qui lient la protéine 2 | X | ||||
| Q96CN7 | Domaine de l'isochorismatase contenant la protéine 1 | X | |||
| Q96CX2 | BTB POZ domaine contenant des protéines | X | |||
| Q96KK5 | Histone H2A type 1 H | X | X | ||
| Q96KP4 | Dipeptidase non spécifique cytosolique | X | |||
| Q99426 | Tubacul spécifique chaperon B | X | |||
| Q99497 | Protein DJ 1 | X | X | ||
| Q99536 | Synaptic vesicle membrane protein | X | X | X | |
| Q99714 | 3 hydroxyacyl CoA déshydrogénase de type 2 | X | |||
| Q99715 | Collagène alpha 1 chaîne XII | X | X | ||
| Q99798 | Aconitate hydratase mitochondrial precursor | X | |||
| Q9BQE3 | Tubuline chaîne alpha 6 | X | |||
| Q9BUF5 | Chaîne bêta 6 de tubuline | X | X | ||
| Q9BUT1 | 3 hydroxybutyrate déshydrogénase de type 2 | X | |||
| Q9BVA1 | Tubuline bêta 2B chaîne | X | X | X | |
| Q9BXN1 | Asporin | X | X </ Td> | X | X |
| Q9H0W9 | Ester hydrolase C11orf54 | X | |||
| Q9H4B7 | Tubuline bêta 1 chaîne | X | |||
| Q9NRN5 | Olfactomedin comme précurseur de protéine 3 | X | X | ||
| Q9NRV9 | Heme binding protein 1 | X | |||
| Q9NSB2 | Queratin type II cuticulaire Hb4 | X | X | ||
| Q9NVA2 | Septin 11 | X | |||
| Q9UBR2 | Précurseur de la Cathepsine Z | X | |||
| Q9UBX5 | Fibulin 5 | X | X | ||
| Q9UK22 | F case seulement protéine 2 | X | |||
| Q9y277 | La protéine de canal sélectif anion dépendant de la tension 3 | X | |||
| Q9Y281 | Cofilin 2 | X | |||
| Q9Y490 | Talin 1 | X | |||
| Q9Y696 | Protéine de canal intracellulaire de chlorure 4 | X | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | X | X |
Tableau 1: Liste des protéines identifiées dans l'extrait de tissu de valvule mitrale lorsque quatre approches protéomiques différentes ont été appliquées: électrophorèse bidimensionnelle (2-DE), LC-MS E bidimensionnel (2D-LC / MS E ), LC / MS E et IEF en phase liquide. La méthode par laquelle chaque protéine a été identifiée est signalée.
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Discussion
Une étape cruciale de ce protocole est l'utilisation d'azote liquide pour congeler l'échantillon et refroidir le système de broyage. L'utilisation d'azote liquide empêche la dégradation biologique et permet une pulvérisation efficace, mais elle nécessite une formation spécifique pour une manipulation sûre.
Dans ce protocole, il existe un système de broyage pour le meulage des échantillons car les petits échantillons sont difficiles à récupérer à partir du mortier et des pilons standard. Dans ce cas, de petits échantillons se répandent sous forme de poudre fine sur la surface du mortier, rendant la collecte difficile. Un autre avantage est que le broyeur est motorisé, ce qui permet de traiter un plus grand nombre d'échantillons de manière reproductible et sans fatigue supplémentaire. Une limitation à l'utilisation d'un broyeur est que la taille de l'échantillon qui doit être faible (100 mg ou moins) pour que le pilon soit pressé efficacement contre le mortier. En outre, les composants du broyeur doivent être réchauffés à température ambiante entre les utilisations pour le nettoyage g. Par conséquent, la procédure prend beaucoup de temps et, si de nombreux échantillons sont traités quotidiennement, plusieurs ensembles sont nécessaires.
Une étape critique supplémentaire est la préparation du tampon d'extraction. Les concentrations de sel, en particulier pour l'urée (8 M) et la thiourée (2 M), sont assez élevées; Ainsi, le volume de sel représente près de la moitié du volume total de la solution. En outre, la dissolution n'est pas facile, compte tenu du fait que la chaleur doit être évitée car, à plus de 37 ° C, l'urée peut conduire à une carbamylation des protéines aux extrémités N de protéines / peptides et aux groupes amino à chaîne latérale des résidus lysine et arginine 17 . Une fois dissous, le tampon d'urée doit être filtré avec des filtres de 0,22 μm et peut être conservé à -80 ° C pendant 4 semaines sans affecter son efficacité d'extraction, mais il doit être réchauffé à plus de 15 ° C avant utilisation pour permettre une dissolution complète .
Modifications et dépannage
Dans ce protocole, l'extraction de protéines est effectuée à l'aide du tampon d'urée décrit, car c'est l'une des solutions d'extraction de protéines les plus couramment utilisées pour les études protéomiques en raison de sa compatibilité avec l'isolectrofocus et son efficacité dans la solubilisation de protéines peu solubles 18 . A démontré que ce tampon peut solubiliser de manière très efficace des protéines peu solubles, telles que des protéines membranaires intégrales 19 , ou des protéines fortement propices à l'agrégation, telles que la tubuline 18. En outre, ce tampon est entièrement compatible avec le dosage de Bradford pour déterminer la concentration de protéines et Il peut être utilisé directement dans des analyses de 2-DE et de phase liquide en phase liquide.Cependant, ce tampon n'est pas idéal pour la solubilisation de toutes les protéines présentes dans un échantillon. Il est possible que différents tampons d'extraction puissent révéler des protéines indétectables par ce protocole. Par exemple, il est bien comprisLorsque les protéines ribosomales et nucléaires pourraient être mieux extraites avec une extraction acide ou une précipitation d'acide trichloroacétique / acétone 20 , alors que les niveaux de pH alcalins sont plus adaptés aux protéines membranaires 21 , 22 . Par conséquent, l'utilisation de tampons alternatifs pourrait nécessiter des étapes supplémentaires pour la précipitation des protéines afin d'éliminer les sels qui interfèrent avec l'IEF à 2-DE ou en phase liquide.
Limitations de la technique
Le nombre de protéines identifiées par ce protocole est relativement faible, mais le nombre d'identifications et la couverture de l'analyse protéomique peuvent être encore accrus grâce à l'utilisation d'instruments plus modernes, dont la précision de masse et la vitesse de séquençage ont considérablement augmenté au cours des dernières années 23. Il est possible de couvrir une grande partie du protéome, sans étapes de prétraction, en utilisant un gradient long pour le liquide chSéparations romatographiques couplées à un instrument MS haute résolution qui a une vitesse de séquençage rapide 24 .
Importance de la technique par rapport aux méthodes existantes / alternatives
La capacité d'identifier et de quantifier les protéines dans les valves cardiaques humaines, telles que la valvule mitrale, est une tâche importante et stimulante qui aidera à élucider les mécanismes des processus physiologiques / pathologiques dans les maladies valvulaires. La définition des changements du protéome de la valvule mitrale augmentera grandement la compréhension de la nature des processus biologiques qui sont associés à l'état pathologique du tissu.
Les connaissances actuelles sur la physiopathologie de la valvule mitrale sont limitées et généralement obtenues grâce à l'analyse de protéines individuelles impliquées dans des processus spécifiques, tels que le remodelage de la matrice extracellulaire, l'hémostase, l'inflammation ou le stress oxydatif 25 9 , 10 .
Le manque d'études protéomiques globales peut être attribué à la complexité de ce tissu à faible cellularité qui est très riche en protéines de la matrice extracellulaire (protéoglycanes, collagène et élastine). Ces protéines représentent environ 80% de la quantité totale, entravant l'analyse des protéines à faible abondance 26 .
Ainsi, il était nécessaire d'établir un protocole d'extraction efficace pour maximiser la solubilisation des protéines afin de décrire le protéome de ce tissu. Ce protocole a permis l'extraction de ~ 50 μg de protéines à partir de 1 mg de tissu. Il s'agit d'un rendement relativement faible par rapport au tissu "doux", telComme foie (~ 135 μg à partir de 1 mg de tissu), mais il suffit d'effectuer une analyse de protéines sur des échantillons individuels. Ceci est particulièrement pertinent lorsque l'on définit la variabilité intra-individuelle d'un phénomène.
En outre, cette méthode présente l'avantage d'être compatible avec de nombreuses applications analytiques. Les protéines de valvule mitrale dissoutes dans le tampon d'extraction proposé peuvent être directement utilisées pour l'immunoblot et l'analyse protéomique basée sur l'électrophorèse bidimensionnelle et l'isoélectrophorèse en phase liquide 11 , 12 ou, après précipitation de la protéine pour éliminer l'interférence des composants tampons, pour d'autres analyses, telles que Spectrométrie de masse sans gel 15 .
Avec l'application de ce protocole d'extraction, une caractérisation plus exhaustive des composants protéiques du tissu de valvule mitrale normale a été obtenue grâce à l'identification de nombreux intracellulesProtéines lombaires. Ces protéines sont localisées dans le cytosol ou dans les organites, non seulement dans la matrice extracellulaire, et ont différentes fonctions moléculaires et biologiques. D'autres protéines intéressantes (CryAB, septin-11, FHL-1 et dermatopontin) ont également été identifiées. Ces protéines ont des fonctions inconnues dans la valvule mitrale, mais leurs propriétés biologiques suggèrent un rôle possible dans les maladies des valvules.
Applications ou directions futures après maîtriser cette technique
Avec ce protocole, il est possible de corréler les données concernant l'expression de la protéine avec des données sur l'expression quantitative d'un ARNm et des analyses immunohistochimiques non quantitatives. En effet, lorsqu'ils sont utilisés ensemble, ces approches conduiront à une compréhension plus complète des mécanismes moléculaires sous-jacents à la maladie, de l'ARNm à la modification de la protéine post-traductionnelle. Ainsi, cette méthode peut intéresser les chercheurs axés sur la physiopathologie valvulaire cardiaque. AiletteCe protocole peut également être appliqué à la valve mitrale porcine, qui ressemble étroitement à la valve 27 humaine et est utilisée comme modèle expérimental pour l'évaluation de la fonction de soupape.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Le ministère italien de la Santé a appuyé cette étude (RC 2013-BIO 15). Nous remercions Barbara Micheli pour son excellente assistance technique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
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