Summary
ヒト僧帽弁のタンパク質組成は、未分化であり、その分析は細胞密度が低く、したがって低タンパク質生合成によって複雑であるため、まだ未知である。この研究は、僧帽弁プロテオームの分析のためにタンパク質を効率的に抽出するためのプロトコールを提供する。
Abstract
細胞のプロテオームの解析は、複雑な生物システムに存在するタンパク質の大規模な同定と定量を可能にする技術の開発による疾患の根底にある分子メカニズムを解明するのに役立ちます。プロテオームアプローチから得られた知識は、疾病の根底にある病原性メカニズムをより良く理解し、新規の診断および予後の疾患マーカーの同定を可能にする。しかし、心臓僧帽弁は、プロテオグリカンおよびコラーゲン富化細胞外マトリックスの細胞性が低いため、プロテオーム分析のための非常に困難なサンプルである。これは、全体的なプロテオーム分析のためにタンパク質を抽出することを困難にする。この研究は、定量的プロテオミクスおよびイムノブロッティングのような後続のタンパク質分析と互換性のあるプロトコールを記載する。これにより、データの関連性を考慮することができますgタンパク質の発現を、定量的mRNA発現および非定量的免疫組織化学的分析に関するデータと比較した。実際、これらのアプローチは、一緒に実施されると、mRNAから翻訳後タンパク質改変まで、疾患の根底にある分子メカニズムのより包括的な理解につながるであろう。したがって、この方法は、心臓弁の生理病理学の研究に関心のある研究者に関連する可能性がある。
Introduction
最近の証拠は、mRNA合成後に生じる多くの調節機構の役割の理解を変化させている。実際、翻訳、転写後およびタンパク質分解プロセスは、タンパク質の存在量および機能を調節することができる。転写産物レベルがタンパク質存在量の主な決定因子であると仮定して、mRNA濃度が対応するタンパク質のプロキシであると言うドグマは部分的に改訂されている。細胞1,2内のタンパク質を調節するために起こる。
さらに、タンパク質は最終的に細胞の機能を決定し、したがって自己分泌、傍分泌および内分泌因子に応答して動的変化を起こすことができるその表現型を指示する。血液媒介メディエーター;温度;薬物治療;病気が発症する。このように、タンパク質レベルに焦点を当てた発現解析は、プロテオームの特徴を明らかにするとともに、疾患病因の一部として起こる重大な変化を解明するのに有用である3 。
したがって、既存の技術的課題にもかかわらず、プロテオミクスが健康状態や病状を明らかにする機会が大いにあります。プロテオミクスが貢献できる研究の特に有望な分野には、以下のものが含まれる：任意のレベル（ すなわち、細胞全体または組織、細胞内コンパートメントおよび生物学的液体）におけるタンパク質発現の変化の同定;疾患の診断および予後に有用な新規なバイオマーカーの同定、検証および検証;薬効と毒性の評価だけでなく、治療目的でも使用できる新しいタンパク質標的の同定4 。
複雑さを捉えるプロテオームは技術的な課題である。現在のプロテオミクスツールは、変化したタンパク質レベルの同定、定量化、および検証のための大規模で高スループットの分析を行う機会を提供する。さらに、最も豊富なタンパク質によって引き起こされる干渉を回避することを目的とする分画および濃縮技術の導入は、最も豊富でないタンパク質を含むことによってタンパク質同定を改善した。最後に、プロテオミクスは、タンパク質機能の重要なモジュレーターとして徐々に出現する翻訳後修飾の分析によって補完されてきた。
しかし、分析中の生物標本における試料調製およびタンパク質回収は、プロテオミクスのワークフローにおける制限的なステップのままであり、潜在的な落とし穴の可能性を高めます5 。実際、最適化されなければならない分子生物学技術の大部分において、最初のステップは、組織ホモジナイズイオンおよび細胞溶解、特に増幅方法が存在しない低濃度のタンパク質の分析中に起こる。さらに、タンパク質の化学的性質は、それら自身の回復に影響を及ぼす可能性がある。例えば、高度に疎水性のタンパク質の分析は、等電点電気泳動の間に容易に沈殿するため、膜貫通タンパク質はほとんど不溶性であるため、非常に難しい（参考文献5で検討されている）。さらに、組織組成の変動性は、普遍的な抽出方法を開発する上で重要な障壁となる。最後に、臨床検体のほとんどすべてが限られているため、最小限の検体量で最大の回収率と再現性でタンパク質を調製することが不可欠です。
この研究は、プロテオーム分析のための非常に困難なサンプルである、正常ヒト心臓僧帽弁からのタンパク質抽出のための最適化されたプロトコールを記載する。正常な僧帽弁は、心臓の左心房と左心室との間に横たわるレックス構造（ 図1 ）。心房から心室への血流を制御し、逆流を防止し、全身への適正な酸素供給を保証し、それによって十分な心拍出量を維持するのに重要な役割を果たす。しかし、それはしばしば細胞性が低く、主に細胞外マトリックス中の成分が少ない「不活性」組織であると考えられている。これは、正常な状態では、常在性の弁間質細胞（VIC）が低いタンパク質生合成速度で静止表現型を示すためである7 。
しかしながら、病理学的状態では、海綿体におけるVICの数が増加し、それらのタンパク質合成が他の機能的および表現型の変化と共に活性化されることが実証されている8 。したがって、驚くべきことではない文献は、増加した数の活性化VICが同定されたタンパク質の比較的高い数を説明し得る病理学的僧帽弁9,10の分析に焦点を当てている。
結論として、本プロトコールは、僧帽弁タンパク質成分の研究を通して、僧帽弁疾患に関与する病原機構の理解を発展させるのに役立つ可能性がある。事実、根底にある病理学的プロセスのより深い理解は、現在の介入適応症が血行力学的考察に主に基づいている弁疾患の臨床管理を改善するのに役立つ可能性がある。
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Protocol
このプロトコルでは、正常な心エコー検査のパラメーターにかかわらず、技術的または機能的理由のために、臓器移植から除外された多臓器ドナーからの多臓器外植片（4〜12時間の冷虚血時間、平均6±2時間）の間にヒト心臓を収集する。彼らは、大動脈弁および肺動脈弁の銀行業務のために、ミラノの心血管組織バンクMonzino Cardiologic Centre（ミラノ、イタリア）に送られる。僧帽弁後小葉は臨床目的では使用されないので、ドナーの親族からインフォームドコンセントが得られた後、大動脈弁および肺動脈弁の隔離中に収集される。移植および研究のための組織は、親の同意の後にのみ収集される。倫理委員会のガイドラインに従い、人間の臨床使用（ すなわち、微生物学的、機能的および血清学的問題）に適していない場合にのみ、同意書上で心臓組織の使用を認可する（またはしない）モンティーノ心臓病センター。
1.僧帽弁の準備
- 臓器の外植後（冷虚血時間は4〜12時間）、できるだけ早くヒト僧帽弁を採取する。
- クリーンルームでは、冷たい（4℃）溶液（ すなわち、生理食塩水または平衡培地EurocollinsまたはWisconsin）を含む輸送用バッグから心臓を取り除く。それをバケツに入れて、バルブの準備を進めるために、バイオセーフティキャビネット（バイオハザード気流、クラスA、グッドマニュファクチャリングプラクティス（GMP）分類）に入れてください。
- キャビネット内の滅菌使い捨てドレープに心臓を置きます。滅菌使い捨てメスを使用して、心臓をその主軸に対して垂直に、心尖部から約4cm離れた左右の心室のレベルで完全に切断する。
- 左心房の屋根を表示するために、上行大動脈と肺動脈を動かす。
- 滅菌オートクレーブ可能な鉗子とピックを使用して、左耳の周りを僧帽弁を目に見えるようにし、大きな僧帽弁尖（前側）と小さい僧帽弁葉（後側）を識別することを可能にする。
注：前側および後側の交連は、前尖および後部の境界を画定する。 - 滅菌オートクレーブ可能なはさみおよび非外傷性の鉗子を使用して、左心房および僧帽弁全体の周囲の心室壁の厚さを切開する。
- 大動脈弁の連続性を確認する。
注：左心室には、僧帽弁全体と腱索が含まれています。 - 前僧帽弁小葉を後僧帽弁小葉から分離し、後尖を脳室の挿入に沿って切断する（交連）。
- 生理食塩水中の後弁膜を洗浄する。リーフレットを小片（<1 cm 2 ）に切断し、個々にアルミホイルで包んでください。液体窒素でそれらをスナップフリーズする。
注意：液体窒素を使用する場合は、組織の安全手順に従ってください。- 手順の最後に、70％イソプロピルアルコール溶液と6％過酸化水素水でキャビネットのテーブルを衛生化してください。
2.タンパク質抽出
- 鉗子を使用して、液体窒素に保存されたサンプルをピックアップし、直ちにアルミ箔に包みながらドライアイス上に置きます。移送中にサンプルを融解させないでください。
- 粉砕する前に、液体窒素（約500mL）を入れたDewarフラスコに入れることによって、粉砕システム（ 例えば、 CryoGrinder）の磁器/ジルコニウムモルタルおよび乳棒を試料とともに冷やす。
注意：液体窒素を使用するときは、組織の安全手順に従ってください。 - ドライアイスを入れたポリスチレンボックスに乳鉢と乳棒を入れます。サンプルをアルミホイルから取り出し、モルタルに入れます。
- グラインドt彼は乳棒を回転させるためにドライバーを使用して、モルタルに対して大きな乳棒で15-20回サンプリングします。粉砕プロセスの間、予め冷却したスパチュラの先端と試料を混合する。
- 小さな乳棒で繰り返します。
- チューブを反転させ、モルタルの上に置き、それらを一緒に反転させてサンプルをチューブに移動させることによって、前に計量したチューブ（ 例えば、 15mL遠心チューブ）に地上サンプルを移す。予備冷却されたスパチュラを使用して、モルタルからすべての材料を回収する。
- 移送中のサンプル解凍を避けるために、サンプルをドライアイス上に置いてください。
- サンプルの正味重量を計算する。
- 各サンプルの後に乳鉢と乳棒をきれいにし、オートクレーブまたは200°Cで2時間加熱することによってそれらを除染する。
- 粉末サンプルを遠心分離管からホモジナイザーのガラス管に転倒させて移す。
- ろ過された尿素バフを加える10mgの粉末組織につき200μLの尿素緩衝液をガラス管に添加した（8M尿素、2Mチオ尿素、4％w / v CHAPS、20mMトリス、および55mMジチオトレイトール）。
注記：遠心チューブに残っている残留粉末サンプルは、計算された量の尿素バッファーの一部を使用して回収することができます。 - ホウケイ酸ガラス乳鉢およびポリテトラフルオロエチレン（PTFE）乳棒を備えた撹拌機を用いて試料を均質化する。サンプルをゆっくりと捻るような動き（1,500 rpm）で10回押します。
- 上清を回収し、それを清潔な1.7mL遠心管に移す。新たな尿素緩衝液で残りの試料を再度抽出し、最初の抽出の間に使用した容量の半分を加える。
- 手順2.10を繰り返します。
- 上清を回収し、それをステップ2.11の上清と合わせる。合わせた上清をチューブローテーター上に30分間置く。
- 13,000 xgおよび4℃で30分間チューブを遠心分離する。
- 上清を回収するBradfordタンパク質アッセイを用いて、製造業者の指示に従ってタンパク質濃度を測定する。サンプルを使用するまで-80℃で保存します。
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Representative Results
ウレア緩衝液中のタンパク質の抽出および溶解は、等電点電気泳動（2次元電気泳動（2-DE） 11および液相等電点電気泳動（IEF） 12 ）に基づくプロテオーム法およびLaemmli緩衝液13での希釈後のイムノブロッティングプロテアーゼ阻害剤カクテル14を含有する。
ゲルフリー質量分析法（ すなわち、データ非依存性質量分析（LC / MS E ）および2次元LC / MS E （2D-LC / MS E ）に結合された液体クロマトグラフィー）尿素およびチオ尿素を除去するためにさらに処理される必要があり、これはその後のタンパク質消化および液体クロマトグラフィー分離を妨害する可能性がある。ティ市販のタンパク質沈殿キットを使用して、タンパク質を沈殿させるための製造者の指示に従って達成することができる。次いで、タンパク質消化のために0.1％切断可能な界面活性剤を含む25mM NH 4 HCO 3にサンプルを溶解することができる16 。タンパク質の沈殿は、タンパク質成分（タンパク質回収率> 85％）に最小限の影響を及ぼす緩衝成分を排除することができ、試料をあらゆる種類の分析に適したものにする。
ヒト僧帽弁からのタンパク質抽出のためのこのプロトコールの適用は、先に詳細11,15に記載された4つの異なるプロテオミクスアプローチを組み合わせて、合計422個のタンパク質の同定を可能にした。具体的には、2-DEにより169個のタンパク質、液相IEFにより330個のタンパク質、LC / MS Eにより96個のタンパク質、148個のタンパク質2D-LC / MS Eにより分析した（表1）。
細胞内局在に関して422個の同定されたタンパク質を分類するために、遺伝子オントロジー（GO）分析（ 例えば、 Cytoscape）のためにソフトウェアを使用した。ソフトウェアおよび対応するプラグインを用いて作製したネットワークは、細胞外領域に局在する予想されるタンパク質（ 図2の右上の部分を参照 ）以外にも、プロテオミクスアプローチによって同定されたタンパク質のほとんどが細胞内領域（ すなわち、細胞質、細胞小器官、小胞、および細胞骨格）。細胞表面タンパク質も同定された（ 図2 ）。
3つの独立した僧帽弁サンプルで結果をさらに確認した。免疫ブロッティングを用いて、4つのタンパク質（ すなわち、セプチン-11,4半分のLIMドメインタンパク質1（FHL-1）、derマトポンチン、およびアルファ - クリスタリンB（CryAB））が含まれる（ 図3 ）。
図1：僧帽弁構造。閉じた（ A ）または開いた（ B ）ヒト僧帽弁を示す人間の心臓の上面図。人間の心臓の左心室の正面図（ C ）。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図2：同定された僧帽弁タンパク質の細胞分布の分析。 CytoscapeとプラグインBiNGOを使用してobtain細胞成分カテゴリーからの遺伝子オントロジ（GO）の分布。円の大きさは、選択されたGO項に関連するタンパク質成分の数に比例し、過剰表現のp値のカラースケールが報告される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3：3つのヒト正常僧帽弁尖からの全抽出物中のセプチン-11、FHL-1、デルマトポンチンおよびCryABのイムノブロッティング分析。免疫ブロッティングは、CryABに対するマウスモノクローナル抗体およびセプチン11、FHL-1およびデルマトポンチン抗体に対するウサギポリクローナル抗体を用いて行った。 お願いしますこの図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
| 受託 | 説明 | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | 液相IEF |
| A6NMZ7 | コラーゲンアルファVI | バツ | |||
| O00151 | PDZおよびLIMドメインタンパク質1 | バツ | |||
| O00299 | 塩化物細胞内チャネルタンパク質1 | バツ | |||
| O00764 | ピリドキサールキナーゼ | バツ | |||
| O14558 | 熱ショックタンパク質β6 | バツ | |||
| O43399 | 腫瘍タンパク質D54 | バツ | |||
| O43488 | アフラトキシンB1アルデヒドリダクターゼメンバー2 | バツ | |||
| O43707 | アルファアクチニン4 | バツ | バツ | ||
| O43866 | 前駆体のようなCD5抗原 | バツ | |||
| O60493 | Nexin 3の並べ替え | バツ | |||
| O60701 | UDPグルコース6デヒドロゲナーゼ | バツ | |||
| O75223 | 特徴付けられていないタンパク質 | バツ | |||
| O75368 | グルタミン酸に富むSH3ドメイン結合タンパク質 | バツ | |||
| O75390 | クエン酸シンターゼミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| O75489 | NADH脱水素酵素ユビキノン鉄硫黄タンパク質3ミトコンドリア前駆体 | バツ | バツ | ||
| O75608 | アシルタンパク質チオエステラーゼ1 | バツ | |||
| O75828 | カルボニルレダクターゼNADPH 3 | バツ | |||
| O75874 | イソクエン酸脱水素酵素NADP細胞質 | バツ | |||
| O75955 | フロチリン | バツ | |||
| O94760 | NG NGジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ1 | バツ | |||
| O94788 | 網膜デヒドロゲナーゼ2 | バツ | |||
| O95865 | NG NGジメチルアルギニンジメチルアミノヒドロラーゼ2 | バツ | バツ | ||
| P00325 | アルコールデヒドロゲナーゼ1B | バツ | バツ | ||
| P00338 | L乳酸デヒドロゲナーゼA鎖 | バツ | |||
| P00351 | 網膜デヒドロゲナーゼ1 | バツ | |||
| P00441 | スーパーオキシドジスムターゼCu Zn | バツ | バツ | ||
| P00450 | セルロプラスミン前駆体 | バツ | バツ | ||
| P00488 | 凝固因子XIII鎖前駆体 | バツ | |||
| P00491 | プリンヌクレオシドホスホリラーゼ | バツ | |||
| P00492 | ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ | バツ | |||
| P00558 | ホスホグリセリン酸キナーゼ1 | <td> xバツ | バツ | ||
| P00568 | アデニル酸キナーゼアイソザイム1 | バツ | |||
| P00734 | プロトロンビン | バツ | バツ | ||
| P00738 | ハプトグロビン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P00739 | ハプトグロビン関連タンパク質前駆体 | バツ | |||
| P00751 | 補因子B | バツ | バツ | バツ | |
| P00915 | 炭酸脱水酵素1 | バツ | |||
| P00918 | 炭酸脱水酵素2 | バツ | |||
| P01008 | アンチトロンビンIII前駆体 | バツ | バツ | バツ | |
| p01009 | アルファ1アンチトリプシン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P01011 | アルファ1アンチキモトリプシン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P01019 | アンギオテンシノーゲン前駆体 | バツ | バツ | ||
| P01023 | アルファ2マクログロブリン | バツ | バツ | ||
| P01024 | 補体C3 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P01033 | メタロプロテイナーゼ阻害剤1前駆体 | バツ | |||
| P01042 | キニノーゲン1前駆体 | バツ | |||
| P01593 | Igカッパ鎖VI領域AG | バツ | |||
| p01598 | Igカッパ鎖VI領域EU | バツ | |||
| P01600 | Igカッパ鎖VI領域Hau | バツ | バツ | ||
| P01611 | Igカッパ鎖VI領域Wes | バツ | |||
| P01620 | Igカッパ鎖V III領域SIE | バツ | |||
| P01625 | Igカッパ鎖V IV領域Len | バツ | |||
| P01766 | Ig重鎖V III領域BRO | バツ | バツ | ||
| P01781 | Ig重鎖V III領域GAL | バツ | |||
| P01834 | Igカッパ鎖C領域 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P01842 | Igラムダ鎖C領域 | バツ | バツ | バツ | |
| P01857 | Igガンマ1鎖C領域 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P01859 | Igガンマ2鎖C領域 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P01860 | Igガンマ3鎖C領域 | バツ | バツ | バツ | |
| P01861 | Igガンマ4鎖C領域 | バツ | バツ | バツ | |
| P01871 | Igミュー鎖C領域 | バツ | バツ | バツ | |
| P01876 | Igα1鎖C領域 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P01877 | Igアルファ2鎖C領域 | バツ | |||
| P02144 | ミオグロビン | バツ | バツ | ||
| P02452 | コラーゲンアルファ1鎖 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02511 | アルファクリスタリンB鎖 | バツ | |||
| P02545 | ラミンAC 70kDaラミネート | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02647 | アポリポタンパク質AI | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02649 | アポリポタンパク質E | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02671 | フィブリノーゲンα鎖 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02675 | フィブリノゲンベータ鎖 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02679 | フィブリノーゲンγ鎖 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02689 | ミエリンP2タンパク質 | バツ | |||
| P02735 | 血清アミロイドAタンパク質前駆体 | バツ | |||
| P02741 | C反応性タンパク質前駆体 | バツ | |||
| P02743 | 血清アミロイドP成分 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02746 | 補体C1qサブ成分サブユニットB | バツ | バツ | ||
| P02747 | 補体C1qサブ成分サブユニットC前駆体 | バツ | |||
| P02748 | 補体成分C9 | バツ | バツ | バツ | |
| P02749 | ベータ2糖タンパク質1 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02750 | ロイシンリッチアルファ2糖タンパク質前駆体 | バツ | |||
| P02751 | フィブロネクチン | バツ | バツ | ||
| P02760 | AMBPタンパク質前駆体 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02763 | アルファ1酸性糖タンパク質1 | バツ | バツ | バツ | |
| P02765 | アルファ2 HS糖タンパク質前駆体 | バツ | |||
| P02766 | トランスサイレチン前駆体 | バツ | バツ | バツ | |
| P02768 | 血清アルブミン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02774 | ビタミンD結合タンパク質前駆体 | バツ | |||
| P02787 | セロトランスフェリン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02788 | ラクトトランスフェリン前駆体 | バツ | |||
| P02790 | ヘモペキシン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P02792 | フェリチン軽鎖 | バツ | |||
| P04004 | ビトロネクチン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P04075 | フルクトースビスホスフェートアルドラーゼA | バツ | |||
| P04083 | アネキシンA1 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P04179 | スーパーオキシドジスムターゼMnミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P04196 | ヒスチジンに富む糖タンパク質前駆体 | バツ | |||
| P04217 | アルファ1B糖タンパク質前駆体 | バツ | バツ | ||
| P04350 | チューブリンベータ4鎖 | バツ | |||
| P04406 | グリセロアルデヒド3リン酸デヒドロゲナーゼ | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P04792 | 熱ショックタンパク質β1 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P05091 | アルデヒドデヒドロゲナーゼミトコンドリア前駆体 | バツ | バツ | ||
| 血漿プロテアーゼC1インヒビター前駆体 | バツ | ||||
| P05156 | 補体因子I前駆体 | バツ | |||
| P05413 | 脂肪酸結合タンパク質心臓 | バツ | |||
| P05452 | テトラネクチン前駆体TN | バツ | バツ | ||
| P05787 | ケラチンII型細胞骨格8 | バツ | |||
| P06396 | ゲルソリン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P06576 | ATP合成酵素サブユニットベータミトコンドリア前駆体 | バツ | バツ | ||
| P06732 | クレアチンキナーゼM型 | バツ | バツ | ||
| P06733 | アルファエノラーゼ | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P06753 | トロポミオシンα3鎖 | バツ | バツ | ||
| P07108 | アシルCoA結合タンパク質 | バツ | |||
| P07195 | L乳酸デヒドロゲナーゼB鎖 | バツ | バツ | バツ | |
| P07196 | 神経フィラメント軽ポリペプチド | バツ | |||
| P07197 | 神経フィラメント培地ポリペプチド | バツ | バツ | ||
| P07237 | タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ前駆体 | バツ | バツ | ||
| P07339 | カテプシンD前駆体 | バツ | バツ | ||
| P07355 | アネキシンA2 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P07360 | 補体成分C8ガンマ鎖前駆体 | バツ | |||
| P07437 | チューブリンベータ鎖 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P07585 | デコリン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P07737 | Profilin 1 | バツ | |||
| P07858 | カテプシンB前駆体 | バツ | |||
| P07900 | 熱ショックタンパク質HSP90α | バツ | バツ | ||
| P07951 | トロポミオシンベータ鎖 | バツ | |||
| P07954 | フマル酸ヒドラターゼミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P07996 | トロンボスポンジン1 | バツ | バツ | バツ | |
| P08107 | 熱ショック70kDaタンパク質1A 1B | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P08123 | コラーゲンアルファ2 I鎖 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P08133 | アネキシンA6 | バツ | バツ | ||
| P08238 | 熱ショックタンパク質HSP90ベータ | バツ | バツ | ||
| P08253 | 72kDaのIV型コラゲナーゼ前駆体 | バツ | |||
| P08294 | 細胞外スーパーオキシドジスムターゼCu Zn precウルソル | バツ | バツ | バツ | |
| P08590 | ミオシン軽ポリペプチド3 | バツ | バツ | ||
| P08603 | 補数因子H | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P08670 | ビメンチン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P08729 | ケラチンII型細胞骨格7 | バツ | |||
| P08758 | アネキシンA5 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P09211 | グルタチオンSトランスフェラーゼP | バツ | バツ | バツ | |
| P09382 | ガレクチン1 | バツ | バツ | バツ | |
| P09417 | ジヒドロプテリジンレダクターゼ | <td> | バツ | ||
| P09493 | トロポミオシン1アルファ鎖 | バツ | バツ | ||
| P09525 | アネキシンA4 | バツ | バツ | ||
| P09651 | 異種核リボ核タンパク質A1 | バツ | |||
| P09871 | 補体C1s副成分前駆体 | バツ | |||
| P09936 | ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素アイソザイムL1 | バツ | |||
| P09972 | フルクトースビスホスフェートアルドラーゼC | バツ | |||
| P0C0L4 | 補体C4前駆体 | バツ | |||
| P0CG05 | Igラムダ2鎖C領域 | バツ | |||
| P0CG38 | POTEアンキリンドメインファミリーメンバーI | バツ | |||
| P10515 | ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体のジヒドロリポイルリジン残基アセチルトランスフェラーゼ成分 | バツ | |||
| P10768 | Sホルミルグルタチオン加水分解酵素 | バツ | |||
| P10809 | 60kDa熱ショックタンパク質ミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P10909 | クラステリン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P10915 | ヒアルロナンとプロテオグリカンはプロテイン1前駆体を連結する | バツ | バツ | ||
| P11021 | 78kDa gルコース調節タンパク質 | バツ | バツ | バツ | |
| P11047 | ラミニンサブユニットガンマ1前駆体 | バツ | |||
| P11142 | 熱ショックコグネイト71kDaタンパク質 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P11177 | ピルビン酸デヒドロゲナーゼE1成分サブユニットベータミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P11217 | グリコーゲンホスホリラーゼ筋肉形態 | バツ | |||
| P11310 | 中鎖特異的アシルCoAデヒドロゲナーゼミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P11413 | グルコース6リン酸1デヒドロゲナーゼ | バツ | |||
| P11766 | アルコールデヒドロゲナーゼクラス3カイ鎖 | バツ | |||
| P12036 | 神経フィラメント重ポリペプチド | バツ | |||
| P12109 | コラーゲンアルファ1鎖 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P12110 | コラーゲンα2 VI鎖 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P12111 | コラーゲンアルファ3鎖 | バツ | バツ | バツ | |
| P12277 | クレアチンキナーゼB型 | バツ | |||
| P12429 | アネキシンA3 | バツ | バツ | ||
| P12814 | アルファアクチニン1 | バツ | バツ | ||
| P12829 | ミオシン軽ポリペプチド4 | バツ | |||
| P12882 | ミオシン1 | バツ | |||
| P12883 | ミオシン7 | バツ | バツ | ||
| P12955 | Xaa Proジペプチダーゼ | バツ | |||
| P13489 | リボヌクレアーゼ阻害剤 | バツ | |||
| P13533 | ミオシン6 | バツ | バツ | ||
| P13611 | バーシカンコアタンパク質前駆体 | バツ | バツ | ||
| P13639 | 伸長率2 | バツ | |||
| P13716 | デルタアミノレブリン酸デヒドラターゼ | バツ | |||
| P13796 | プラスティン2 | バツ | |||
| P13804 | 電子伝達フラボタンパク質サブユニットαミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P13929 | ベータエノラーゼ | バツ | バツ | ||
| P14136 | グリア線維性酸性タンパク質星状膠細胞 | バツ | |||
| P14314 | グルコシダーゼ2サブユニットβ前駆体 | バツ | |||
| P14550 | アルコールデヒドロゲナーゼNADP | バツ | |||
| P14618 | ピルビン酸キナーゼアイソザイムM1 M2 | バツ | バツ | バツ | |
| P14625 </ td> | エンドプラスミン前駆体 | バツ | バツ | ||
| P15121 | アルドース還元酵素 | バツ | |||
| P15259 | ホスホグリセリン酸ムターゼ2 | バツ | |||
| P16152 | カルボニルレダクターゼNADPH 1 | バツ | |||
| P17066 | 熱ショック70kDaタンパク質6 | バツ | バツ | バツ | |
| P17174 | アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ細胞質 | バツ | |||
| P17540 | クレアチンキナーゼサルコメアミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P17661 | デスミン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P17980 | 26Sプロテアーゼ調節サブユニット6A | バツ | |||
| P17987 | T複合体タンパク質1サブユニットα | バツ | |||
| P18206 | ビンキュリン | バツ | バツ | ||
| P18428 | リポ多糖結合タンパク質前駆体 | バツ | |||
| P18669 | ホスホグリセリン酸ムターゼ1 | バツ | |||
| P19105 | ミオシン制御軽鎖2 | バツ | バツ | ||
| P19623 | スペルミジン合成酵素 | バツ | |||
| P19652 | アルファ1酸性糖タンパク質2前駆体 | バツ | バツ | ||
| P19823 | インターアルファトリプシンインヒビター重鎖H2 | バツ | |||
| P19827 | インターアルファトリプシンインヒビター重鎖H1 | バツ | バツ | ||
| P20073 | アネキシンA7 | バツ | |||
| P20618 | プロテアソームサブユニットベータ1型前駆体 | バツ | |||
| P20774 | ミメカン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P21266 | グルタチオンSトランスフェラーゼMu 3 | バツ | |||
| P21333 | フィラミンA | バツ | バツ | ||
| P21796 | 電圧依存性陰イオン選択的チャネルタンパク質1 | バツ | |||
| P21810 | ビグリカン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P21980 | プロテイングルタミンガンマグルタミルトランスフェラーゼ2 | バツ | バツ | ||
| P22105 | テネイシンX | バツ | バツ | ||
| P22314 | ユビキチン活性化酵素E1 | バツ | |||
| P22352 | グルタチオンペルオキシダーゼ3前駆体 | バツ | バツ | ||
| P22626 | 異種核リボ核タンパク質A2 B1 | バツ | |||
| P22695 | ユビキノールシトクロムcレダクターゼ複合体コアタンパク質2ミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P23141 | 肝臓カルボキシルエステラーゼ1前駆体 | バツ | |||
| P23142 | フィブリン1 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P23284 | ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼB前駆体 | バツ | |||
| P23381 | トリプトファニルtRNA合成酵素細胞質 | バツ | |||
| P23526 | アデノシルホモシステナーゼ | バツ | バツ | ||
| P23528 | コフィリン1 | バツ | |||
| P24752 | アセチルCoAアセチルトランスフェラーゼミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P25311 | 亜鉛アルファ2糖タンパク質n前駆体 | バツ | |||
| P25705 | アルファミトコンドリアATPシンターゼサブユニット | バツ | |||
| P25788 | プロテアソームサブユニットα型3 | バツ | バツ | ||
| P25789 | プロテアソームサブユニットα型4 | バツ | |||
| P26447 | プロテインS100 A4 | バツ | |||
| P27348 | 14 3 3タンパク質シータ | バツ | バツ | ||
| P27797 | カルレティキュリン前駆体 | バツ | |||
| P28066 | プロテアソームサブユニットアルファタイプ5 | バツ | |||
| P28070 | <td>プロテアソームサブユニットベータ4型前駆体バツ | バツ | |||
| P28072 | プロテアソームサブユニットβ型6前駆体 | バツ | |||
| P28074 | プロテアソームサブユニットβ型5前駆体 | バツ | |||
| P28331 | NADHユビキノンオキシドレダクターゼ75kDaサブユニットミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P28838 | サイトゾルアミノペプチダーゼ | バツ | |||
| P29218 | イノシトールモノホスファターゼ | バツ | |||
| P29401 | トランスケトラーゼ | バツ | |||
| P29692 | 伸長率1デルタ | <td> | バツ | ||
| P29966 | ミリストイル化アラニンリッチCキナーゼ基質 | バツ | |||
| P30040 | 小胞体タンパク質ERp29前駆体 | バツ | |||
| P30041 | ペルオキシレドキシン6 | バツ | バツ | ||
| P30043 | フラビンレダクターゼ | バツ | |||
| P30044 | ペルオキシレドキシン5ミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P30085 | UMP CMPキナーゼ | バツ | |||
| P30086 | ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質1 | バツ | |||
| P30101 | プロテウスnジスルフィドイソメラーゼA3前駆体 | バツ | バツ | バツ | |
| P30613 | ピルビン酸キナーゼアイソザイムRL | バツ | |||
| P30740 | 白血球エラスターゼ阻害剤 | バツ | |||
| P31025 | リポカリン1前駆体 | バツ | |||
| P31937 | 3ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P31942 | 異種核リボ核タンパク質H3 | バツ | |||
| P31943 | 異種核リボ核タンパク質H | バツ | |||
| P31946 | 14 3 3タンパク質ベータアルファ | バツ | バツ | ||
| P31948 | ストレス誘発リンタンパク質1 | バツ | |||
| P31949 | プロテインS100 A11 | バツ | |||
| P32119 | ペルオキシレドキシン2 | バツ | バツ | ||
| P34931 | 熱ショック70kDaタンパク質1様 | バツ | バツ | ||
| P34932 | 熱ショック70kDaタンパク質4 | バツ | |||
| P35232 | 禁止 | バツ | |||
| P35237 | セルピンB6 | バツ | |||
| P35443 | トロンボスポンジン4 | バツ | </ tr> | ||
| P35555 | フィブリリン1 | バツ | バツ | ||
| P35579 | ミオシン9 | バツ | バツ | バツ | |
| P35580 | ミオシン10 | バツ | バツ | ||
| P35609 | アルファアクチニン2 | バツ | |||
| P35625 | メタロプロテイナーゼ阻害剤3 | バツ | バツ | ||
| P35998 | 26Sプロテアーゼ調節サブユニット7 | バツ | |||
| P36871 | ホスホグルコムターゼ1 | バツ | バツ | ||
| P36955 | 色素上皮由来因子 | バツ | バツ | ||
| P37802 | <td>トランスゲリン2バツ | バツ | |||
| P37837 | トランスアルドラーゼ | バツ | |||
| P38117 | 電子伝達フラボタンパク質サブユニットベータ | バツ | |||
| P38646 | ストレス70タンパク質ミトコンドリア前駆体 | バツ | バツ | ||
| P39687 | 酸性ロイシン富化核リンタンパク質32ファミリーメンバーA | バツ | |||
| P40121 | マクロファージキャッピングタンパク質 | バツ | |||
| P40925 | マレートデヒドロゲナーゼ細胞質 | バツ | |||
| P40926 | マレイン酸脱水素酵素ミトコンドリア前駆体 | <td> | バツ | ||
| P41219 | ペリフェリン | バツ | |||
| P42330 | アルドケトレダクターゼファミリー1メンバーC3 | バツ | |||
| P45880 | 電圧依存性陰イオン選択的チャネルタンパク質2 | バツ | |||
| P47755 | Fアクチンキャッピングタンパク質サブユニットα2 | バツ | バツ | ||
| P47756 | Fアクチンキャッピングタンパク質サブユニットβ | バツ | バツ | ||
| P47985 | ユビキノールシトクロムcレダクターゼ鉄硫黄サブユニットミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P48047 | ATP合成酵素Oサブユニットミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P48637 | グルタチオン合成酵素 | バツ | |||
| P48741 | 熱ショック70kDaタンパク質7 | バツ | バツ | ||
| P49189 | 4トリメチルアミノブチルアルデヒドデヒドロゲナーゼ | バツ | |||
| p49368 | T複合タンパク質1サブユニットγ | バツ | |||
| P49747 | 軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P49748 | 非常に長い鎖特異的アシルCoAデヒドロゲナーゼミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| P50395 | Rab GDP解離阻害剤ベータ | バツ | x </ td> | ||
| P50454 | セルピンH1前駆体 | バツ | |||
| P50995 | アネキシンA11 | バツ | |||
| P51452 | 二重特異性タンパク質ホスファターゼ3 | バツ | |||
| P51884 | ルミカン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P51888 | プロラギン前駆体 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P52565 | Rho GDP解離阻害剤1 | バツ | |||
| P52566 | Rho GDP解離阻害剤2 | バツ | |||
| P54652 | 熱ショック関連70kDaタンパク質2 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P55072 | 移行小胞体ATPアーゼ | バツ | |||
| P55083 | マイクロフィブリル関連糖タンパク質4前駆体 | バツ | バツ | ||
| P57053 | ヒストンH2BタイプF | バツ | |||
| P60174 | トリオースリン酸イソメラーゼ | バツ | バツ | バツ | |
| P60660 | ミオシン軽ポリペプチド6 | バツ | バツ | ||
| P60709 | アクチン細胞質1 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P60981 | デストリン | バツ | |||
| P61086 | ユビキチン結合酵素E2 25kDa | バツ | |||
| P61088 | ユビキチン結合酵素E2 | バツ | |||
| P61224 | Ras関連タンパク質Rap 1b前駆体 | バツ | |||
| P61978 | 異種核リボ核タンパク質K | バツ | バツ | ||
| P61981 | 14 3 3タンパク質γ | バツ | バツ | バツ | |
| P62258 | 14 3 3タンパク質イプシロン14 3 3E | バツ | |||
| P6249 | Ras関連タンパク質 | バツ | |||
| P62714 | セリントレオニンタンパク質ホスファターゼ2A触媒サブユニットβアイソフォーム | バツ | |||
| P62736 | アクチン大動脈平滑筋 | バツ | バツ | バツ | |
| P62805 | ヒステロンH4 | バツ | |||
| P62826 | GTP結合核タンパク質ラン | バツ | |||
| P62873 | グアニンヌクレオチド結合タンパク質GIGSGTサブユニットベータ1 | バツ | |||
| P62879 | グアニンヌクレオチド結合タンパク質GIGSGTサブユニットベータ2 | バツ | |||
| P62937 | ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼA | バツ | バツ | ||
| P62987 | ユビキチン60Sリボソームタンパク質L40 | バツ | |||
| P63104 | 14 3 3 proテインゼータデルタ | バツ | バツ | バツ | バツ |
| P63241 | 真核生物翻訳開始因子5A 1 | バツ | |||
| P63244 | 1のようなグアニンヌクレオチド結合タンパク質サブユニットベータ2 | バツ | |||
| P63267 | アクチンガンマ腸平滑筋 | バツ | バツ | ||
| P67936 | トロポミオシンα4鎖 | バツ | |||
| P68032 | アクチンα心筋1 | バツ | |||
| P68104 | 伸長率1アルファ1 | バツ | バツ | バツ | |
| P68133 | アクチンα骨格筋 | ||||
| P68363 | チューブリンα1B鎖 | バツ | バツ | バツ | |
| P68371 | チューブリンベータ2C鎖 | バツ | バツ | バツ | |
| P68402 | 血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼIBサブユニットβ | バツ | |||
| P68871 | ヘモグロビンサブユニットベータ | バツ | バツ | バツ | |
| P69905 | ヘモグロビンサブユニットアルファ | バツ | バツ | ||
| P78371 | T複合体タンパク質1サブユニットベータ | バツ | |||
| P78417 | グルタチオントランスフェラーゼオメガ1 | バツ | バツ | ||
| P80748 | Igラムダ鎖VIII領域LOI | バツ | |||
| P98095 | フィブリン2 | バツ | バツ | ||
| Q01082 | スペクトリンβ鎖脳1 | バツ | |||
| Q01449 | ミオシン制御軽鎖2心房アイソフォーム | バツ | |||
| Q01518 | アデニリルシクラーゼ関連タンパク質1 | バツ | |||
| Q01995 | トランスジェリン平滑筋タンパク質22α | バツ | |||
| Q03252 | ラミンB2 | バツ | バツ | ||
| Q03591 | 補体因子H関連タンパク質1前駆体 | バツ | Q04917 | 14 3 3タンパク質η | バツ | バツ |
| Q06323 | プロテアソームアクチベーター複合体サブユニット1 | バツ | |||
| Q06828 | フィブロモジュリン | バツ | バツ | バツ | バツ |
| Q06830 | ペルオキシレドキシン1 | バツ | バツ | ||
| Q07507 | Dermatopontin | バツ | バツ | バツ | バツ |
| Q07960 | Rho GTPase活性化タンパク質1 | バツ | |||
| Q08257 | キノンオキシドレダクターゼ | バツ | |||
| Q08431 | ラクタドヘリン | バツ | バツ | ||
| Q12765 | Sエーセレン1 | バツ | |||
| Q13011 | デルタ3デルタ2 4ジエノイルCoAイソメラーゼミトコンドリア前駆体 | バツ | バツ | ||
| Q13228 | セレン結合タンパク質1 | バツ | バツ | ||
| Q13404 | ユビキチン結合酵素E2変異体1 | バツ | |||
| Q13409 | 細胞質ダイニン1中間鎖2 | バツ | |||
| Q13509 | チューブリンベータ3鎖 | バツ | バツ | バツ | |
| Q13642 | 4および半分のLIMドメインタンパク質1 | バツ | |||
| Q13765 | 新生ポリペプチド関連複合体サブユニットα | バツ | |||
| Q13885 | Nチューブリンベータ2A鎖 | バツ | バツ | ||
| Q14194 | ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質1 | バツ | |||
| Q14195 | ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質3 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| Q14624 | インターアルファトリプシン阻害剤重鎖H4前駆体 | バツ | |||
| Q14697 | ニュートラルアルファグルコシダーゼAB前駆体 | バツ | |||
| Q14764 | 主要なボールトタンパク質 | バツ | |||
| Q14767 | 潜在的形質転換成長因子β結合タンパク質2 | バツ | <td>バツ | ||
| Q14894 | MuクリスタリンホモログNADPは甲状腺ホルモン結合タンパク質を調節する | バツ | |||
| Q15063 | ペリオスチン前駆体 | バツ | バツ | バツ | バツ |
| Q15084 | プロテインジスルフィドイソメラーゼA6前駆体 | バツ | |||
| Q15113 | プロコラーゲンCエンドペプチダーゼエンハンサー1前駆体 | バツ | |||
| Q15181 | 無機ピロホスファターゼ | バツ | |||
| Q15365 | ポリrC結合タンパク質1 | バツ | |||
| Q15366 | ポリrC結合タンパク質2 | バツ | |||
| Q15582 | トランスフォーミング増殖因子ベータ誘導タンパク質 | バツ | バツ | バツ | |
| Q15819 | ユビキチン結合酵素E2変異体2 | バツ | |||
| Q16352 | アルファインターエクスチェンジ | バツ | |||
| Q16473 | 推定テネイシンXA | バツ | |||
| Q16555 | ジヒドロピリミジナーゼ関連タンパク質2 | バツ | バツ | バツ | |
| Q16698 | 2 4ジエノイルCoAレダクターゼミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| Q16891 | ミトコンドリア内膜 | バツ | |||
| Q562R1 | タンパク質2のようなβアクチン | バツ | |||
| Q6S8J3 | POTEアンキリンドメインファミリーメンバーE | バツ | |||
| Q6UWY5 | プロテイン1前駆体のようなオルフファトメジン | バツ | バツ | ||
| Q71U36 | チューブリンアルファ1A鎖 | バツ | バツ | バツ | |
| Q7Z7G0 | Nesh SH3前駆体のターゲット | バツ | バツ | バツ | |
| Q8WUM4 | プログラムされた細胞死6相互作用タンパク質 | バツ | |||
| Q8WWX9 | セレノプロテインM前駆体のようなチオレドキシン | バツ | |||
| Q92597 | プロテインNDRG1 | バツ | |||
| Q92945 遠い上流の要素結合タンパク質2 | バツ | ||||
| Q96CN7 | イソコリシス酵素ドメイン含有タンパク質1 | バツ | |||
| Q96CX2 | BTB POZドメイン含有タンパク質 | バツ | |||
| Q96KK5 | ヒストンH2Aタイプ1H | バツ | バツ | ||
| Q96KP4 | サイトゾル非特異的ジペプチダーゼ | バツ | |||
| Q99426 | チューブリン特異的シャペロンB | バツ | |||
| Q99497 | プロテインDJ 1 | バツ | バツ | ||
| Q99536 | シナプス小胞膜タンパク質 | バツ | バツ | バツ | |
| Q99714 | 3ヒドロキシアシルCoAデヒドロゲナーゼ2型 | バツ | |||
| Q99715 | コラーゲンα1XII鎖 | バツ | バツ | ||
| Q99798 | ヒドラターゼミトコンドリア前駆体 | バツ | |||
| Q9BQE3 | チューブリンアルファ6鎖 | バツ | |||
| Q9BUF5 | チューブリンベータ6鎖 | バツ | バツ | ||
| Q9BUT1 | 3ヒドロキシブチレートデヒドロゲナーゼタイプ2 | バツ | |||
| Q9BVA1 | チューブリンベータ2B鎖 | バツ | バツ | バツ | |
| Q9BXN1 | アスポリン | バツ | x </ td> | バツ | バツ |
| Q9H0W9 | エステル加水分解酵素C11orf54 | バツ | |||
| Q9H4B7 | チューブリンベータ1鎖 | バツ | |||
| Q9NRN5 | プロテオミクス | バツ | バツ | ||
| Q9NRV9 | ヘム結合タンパク質1 | バツ | |||
| Q9NSB2 | ケラチンII型クチクラHb4 | バツ | バツ | ||
| Q9NVA2 | セプチン11 | バツ | |||
| Q9UBR2 | カテプシンZ前駆体 | バツ | |||
| Q9UBX5 | フィブリン5 | バツ | バツ | ||
| Q9UK22 | Fボックスのみのタンパク質2 | バツ | |||
| Q9Y277 | 電圧依存性陰イオン選択的チャネルタンパク質3 | バツ | |||
| Q9Y281 | コフィリン2 | バツ | |||
| Q9Y490 | タリン1 | バツ | |||
| Q9Y696 | 塩化物細胞内チャネルタンパク質4 | バツ | |||
| Q9Y6C2 | エミリン1 | バツ | バツ |
表1：4つの異なるプロテオームアプローチを適用した場合の僧帽弁組織抽出物で同定されたタンパク質のリスト：2次元電気泳動（2-DE）、二次元LC-MS E （2D-LC / MS E ）、LC / MS E 、および液相IEFが挙げられる。各タンパク質が同定された方法が報告されている。
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Discussion
このプロトコールの1つの重要なステップは、試料を凍結させ、粉砕システムを冷却するために液体窒素を使用することである。液体窒素の使用は生物分解を防ぎ、パウダー化を効率的に行うことができますが、安全な取り扱いのためには特別な訓練が必要です。
このプロトコールでは、標準的なモルタルおよび乳棒から小さなサンプルを回収することが困難であるため、サンプル粉砕用の粉砕システムが特徴です。この場合、小さな試料はモルタル表面上に微細な粉末として広がり、収集が困難になる。別の利点は、グラインダが電動化され、再現可能な方法でより多くのサンプルを処理することができ、疲労を増やさないことである。粉砕機の使用に関する1つの制限は、乳棒がモルタルに対して効果的に押されるためには小さくなければならない試料のサイズ（100mg以下）であることである。さらに、粉砕機の構成要素は、洗浄のための使用の間に室温に温めなければならない g。結果として、手順は時間がかかり、多くのサンプルが毎日処理される場合、多くのセットが必要となる。
さらなる重要なステップは抽出緩衝液の調製である。特に尿素（8M）およびチオ尿素（2M）の塩濃度はかなり高い。従って、塩の量は、溶液の総量のほぼ半分である。さらに、37℃を超えると尿素はタンパク質/ペプチドのN末端およびリシンおよびアルギニン残基の側鎖アミノ基にタンパク質カルバミル化を引き起こす可能性があるので、熱を避けなければならないことを考慮すると溶解は容易ではない。一度溶解すると、尿素バッファーは0.22μmのフィルターでろ過しなければならず、抽出効率に影響を与えずに-80℃で4週間保存することができますが、完全に溶解させるためには使用前に15℃以上に加温する必要があります。
変更とトラブルシューティング
このプロトコールでは、タンパク質抽出は、等電点電気泳動との適合性および難溶性タンパク質の可溶化効率のために、プロテオーム研究のための最も一般的に使用されるタンパク質抽出溶液の1つであるため、記載された尿素緩衝液を用いて行われる。この緩衝液は、内蔵膜タンパク質19またはチューブリン18のような凝集の傾向が非常に高いタンパク質のような難溶性タンパク質を非常に効率的に可溶化することができることを実証した。それは2-DEおよび液相IEF分析に直接使用することができる。しかしながら、この緩衝液は、試料中に存在する全てのタンパク質の可溶化には理想的ではない。異なる抽出バッファーがこのプロトコルによって検出されないタンパク質を明らかにすることが可能である可能性がある。例えば、それはよく知られているリボソームおよび核タンパク質は、酸抽出またはトリクロロ酢酸/アセトン沈殿20により良好に抽出することができるが、アルカリ性pHレベルは、膜タンパク質21,22により適している。したがって、代替緩衝液の使用は、2-DEまたは液相IEFを妨げる塩を排除するために、タンパク質沈殿のためのさらなる工程を必要とし得る。
技術の限界
このプロトコールで同定されたタンパク質の数は比較的少ないが、数年後に質量精度とシーケンシング速度が劇的に向上したより現代的な機器を使用することにより、同定数とプロテオーム分析の適用範囲をさらに拡大することができる23。液体クロマトグラフィーのための長い勾配を用いることにより、プロテオームの大部分を予備分画工程なしでカバーすることが可能であるロマトグラフの分離と、高速シーケンシング速度24を備えた高分解能MS装置を組み合わせたものです。
既存/代替法に関する技術の意義
僧帽弁のようなヒトの心臓弁におけるタンパク質を同定および定量する能力は、弁疾患における生理学的/病理学的過程のメカニズムを解明するのに役立つ重要かつ挑戦的な課題である。僧帽弁プロテオームの変化を定義することは、組織の疾患状態に関連する生物学的プロセスの性質の理解を大きく増加させる。
僧帽弁の生理病理学に関する現在の知識は限られており、一般に、細胞外マトリクスのリモデリング、止血、炎症または酸化ストレスなどの特定のプロセスに関与する個々のタンパク質の分析によって得られる9,10 。
包括的なプロテオーム研究の欠如は、細胞外マトリックスタンパク質（ すなわち、プロテオグリカン、コラーゲンおよびエラスチン）が非常に豊富なこの低細胞性組織の複雑さに帰することができる。これらのタンパク質は全量の約80％を構成し、低濃度のタンパク質の分析を妨げます。
したがって、この組織のプロテオームを記述するために、タンパク質可溶化を最大にする効率的な抽出プロトコールを確立することが必要であった。このプロトコールは、1mgの組織から約50μgのタンパク質を抽出することを可能にした。これは、「柔らかい」組織と比較して比較的低い収率である。肝臓（1mgの組織から約135μg）であるが、個々の試料についてタンパク質分析を行うことで十分である。これは、現象の個人内変動性を定義する場合に特に重要です。
さらに、この方法は、多くの分析用途に適合するという利点を有する。提案された抽出緩衝液に溶解された僧帽弁タンパク質は、2次元電気泳動および液相等電点電気泳動11,12または緩衝液成分干渉を排除するためのタンパク質沈殿後のイムノブロッティングおよびプロテオーム解析に直接使用することができ、ゲルフリー質量分析15 。
この抽出プロトコールの適用により、正常な僧帽弁組織のタンパク質成分のより網羅的な特徴付けが、多くのイントラセルの同定によって得られているラウルタンパク質。これらのタンパク質は、細胞外マトリックス中だけでなく、細胞質ゾルまたは細胞小器官に局在し、異なる分子および生物学的機能を有する。他の興味深いタンパク質（ すなわち、 CryAB、septin-11、FHL-1、およびdermatopontin）も同定された。これらのタンパク質は、僧帽弁において未知の機能を有するが、それらの生物学的特性は、弁疾患において可能な役割を示唆する。
この技術を習得した後のアプリケーションまたは方向
このプロトコールにより、タンパク質発現に関するデータを、定量的mRNA発現および非定量的免疫組織化学的分析に関するデータと相関させることが可能である。実際、一緒に使用する場合、これらのアプローチは、mRNAから翻訳後タンパク質改変まで、疾患の根底にある分子メカニズムのより包括的な理解につながるであろう。したがって、この方法は、心臓弁の生理病理学に焦点を当てた研究者にとって興味深いものであり得る。フィンこのプロトコルは、人間の弁27に非常に類似しているブタの僧帽弁にも適用することができ、弁機能評価の実験モデルとして使用される。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
イタリアの保健省はこの研究を支持した（RC 2013-BIO 15）。彼女の優れた技術的支援のためにBarbara Micheliに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
