Summary
Белковый состав митрального клапана человека все еще частично неизвестен, поскольку его анализ осложняется низкой клеточностью и, следовательно, низким биосинтезом белка. Эта работа обеспечивает протокол для эффективного извлечения белка для анализа протеома митрального клапана.
Abstract
Анализ клеточного протеома может помочь выявить молекулярные механизмы, лежащие в основе болезней, из-за развития технологий, которые позволяют широкомасштабную идентификацию и количественную оценку белков, присутствующих в сложных биологических системах. Знания, полученные из протеомического подхода, могут потенциально привести к Лучшее понимание патогенных механизмов, лежащих в основе болезней, позволяющих идентифицировать новые диагностические и прогностические маркеры болезни и, надеюсь, терапевтических целей. Однако сердечный митральный клапан представляет собой очень сложный образец для протеомического анализа из-за низкой клеточности в протеогликане и обогащенном коллагеном внеклеточном матриксе. Это затрудняет извлечение белков для глобального протеомического анализа. Эта работа описывает протокол, который совместим с последующим анализом белка, таким как количественная протеомика и иммуноблоттинг. Это может обеспечить корреляцию данных вГ белка с данными о количественной экспрессии мРНК и не количественном иммуногистохимическом анализе. Действительно, эти подходы, когда они выполняются вместе, приведут к более полному пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе болезней, от мРНК до посттрансляционной модификации белка. Таким образом, этот метод может иметь отношение к исследователям, заинтересованным в изучении физиопатологии сердечного клапана.
Introduction
Недавние данные изменили понимание роли многих регуляторных механизмов, которые возникают после синтеза мРНК. Действительно, трансляционные, посттранскрипционные и протеолитические процессы могут регулировать количество и функцию белка. Догма - в которой говорится, что концентрации мРНК являются проксимидами, соответствующими концентрациям соответствующих белков, предполагая, что уровни транскрипции являются основным фактором, определяющим количество белков, - были частично пересмотрены. В результате уровни транскрипции лишь частично предсказывают обилие белка, предполагая, что посттранскрипционные события Происходят для регулирования белков в клетках 1 , 2 .
Кроме того, белки в конечном счете диктуют функцию клетки и, следовательно, диктуют ее фенотип, который может подвергаться динамическим изменениям в ответ на аутокринную, паракринную и эндокринную факторы; Кровные посредники; температура; Лечение наркозависимости; И болезни развиваютсяМент. Таким образом, анализ экспрессии, сфокусированный на уровне белка, полезен для характеристики протеома и разгадать критические изменения, которые происходят с ним как часть патогенеза болезни 3 .
Таким образом, возможности, которые протеомика представляет для выяснения состояния здоровья и болезней, являются грозными, несмотря на существующие технологические проблемы. Особенно перспективные области исследований, к которым могут вносить протеомики: идентификация измененной экспрессии белка на любом уровне ( т . Е. Целые клетки или ткань, субклеточные клетки и биологические жидкости); Идентификация, верификация и валидация новых биомаркеров, полезных для диагностики и прогнозирования болезни; И, мы надеемся, идентификация новых белковых мишеней, которые могут быть использованы в терапевтических целях, а также для оценки эффективности и токсичности препарата 4 .
Захват сложностиПротеом представляет собой технологическую проблему. Существующие протеомические инструменты дают возможность проводить крупномасштабный высокопроизводительный анализ для идентификации, количественной оценки и проверки измененных уровней белка. Кроме того, внедрение методов фракционирования и обогащения, направленных на предотвращение интерференции, вызванной наиболее распространенными белками, также улучшило идентификацию белка путем включения наименее распространенных белков. Наконец, протеомика дополнена анализом посттрансляционных модификаций, которые постепенно появляются как важные модуляторы функции белка.
Однако подготовка проб и восстановление белка в анализируемых биологических образцах по-прежнему остаются предельными стадиями протеомического рабочего процесса и увеличивают потенциал возможных ловушек 5 . Действительно, в большинстве методов молекулярной биологии, которые необходимо оптимизировать, первыми шагами являются гомогенизация тканиИон и клеточный лизис, особенно при анализе белков с низким уровнем обилия, для которых методов амплификации не существует. Кроме того, химическая природа белков может влиять на их собственное выздоровление. Например, анализ высокогидрофобных белков очень сложный, поскольку они легко осаждаются во время изоэлектрической фокусировки, тогда как транс-мембранные белки почти нерастворимы (см. Ссылку 5). Кроме того, изменчивость состава ткани создает значительный барьер для разработки универсального метода экстракции. Наконец, поскольку почти все клинические образцы имеют ограниченное количество, необходимо обеспечить подготовку белка с максимальным восстановлением и воспроизводимостью из минимальных количеств проб 6 .
В этой работе описывается оптимизированный протокол экстракции белка из нормального митрального клапана сердца человека, который представляет собой очень сложный образец для протеомического анализа. Нормальный митральный клапан представляет собой компLex, лежащей между левым предсердием и левым желудочком сердца ( рис. 1 ). Он играет важную роль в контроле кровотока из атриума в желудочек, предотвращении обратного потока и обеспечении надлежащего уровня подачи кислорода всему телу, что обеспечивает адекватный сердечный выброс. Однако он часто считается «неактивной» тканью с низкой клеточностью и несколькими компонентами, главным образом в внеклеточной матрице. Это связано с тем, что в нормальных условиях резидентные клапанные интерстициальные клетки (VIC) представляют собой покоящийся фенотип с низкой скоростью биосинтеза белка 7 .
Однако было продемонстрировано, что в патологическом состоянии количество VIC в спонгиозе увеличивается, а их синтез белка активируется вместе с другими функциональными и фенотипическими изменениями 8 . Поэтому неудивительно, что минимальные данные, имеющиеся вВ литературе основное внимание уделяется анализу патологических митральных клапанов 9 , 10 , в которых увеличение числа активированных ВИП может объяснить относительно большое количество идентифицированных белков.
В заключение, настоящий протокол может служить для развития понимания патогенных механизмов, ответственных за болезни митрального клапана, путем изучения компонентов белка митрального клапана. Действительно, более глубокое понимание лежащих в основе патологических процессов могло бы помочь улучшить клиническое лечение клапанных заболеваний, чьи текущие показания к вмешательству в основном основаны на гемодинамических соображениях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
В этом протоколе человеческие сердца собираются во время мультиорганной эксплантации (время холодной ишемии 4-12 ч, в среднем 6 ± 2 ч) от доноров многих органов, исключенных из трансплантации органов по техническим или функциональным причинам, несмотря на нормальные эхокардиографические параметры. Они отправляются в сердечно-сосудистый тканевый банк Милана, Кардиологический центр Монзино (Милан, Италия) для лечения аортальных и легочных клапанов. Митральные задние листочки не используются в клинических целях, поэтому они собираются во время выделения аорты и легочного клапана после получения информированного согласия от родственников доноров. Ткань для трансплантации и исследований собирается только после согласия родителей; На листе согласия они разрешают (или не) использование сердечной ткани для исследования только в том случае, если оно не подходит для клинического применения ( т.е. микробиологических, функциональных и серологических проблем), следуя руководящим принципам комитета по этикеМонзино-кардиологический центр.
1. Подготовка митрального клапана
- Убирайте человеческий митральный клапан как можно скорее после эксплантации органа (время холодной ишемии 4-12 часов).
- В чистой комнате удалите сердце из транспортной сумки, содержащей холодный (4 ° C) раствор ( т. Е. Солевой раствор или сбалансированную среду Eurocollins или Wisconsin). Поместите его в ведро и поместите его в шкаф для биобезопасности (биологическая защита от вертикального воздушного потока, класс A, классификация надлежащей производственной практики (GMP)), чтобы продолжить подготовку клапана.
- Поместите сердце на стерильную одноразовую драпировку в шкафу. Используя стерильный одноразовый скальпель, полностью отрежьте сердце, перпендикулярно его главной оси, на уровне левого и правого желудочков, примерно на расстоянии 4 см от вершины.
- Переместите восходящую аорту и легочную артерию, чтобы отобразить левую предсердную крышу.
- С помощью стерильных автоклавируемых щипцов и кирков обрезать левое предсердие наЛевая предсердная крыша, делая видимым митральный клапан и позволяя идентифицировать большой митральный листок (передний) и маленький митральный листок (задний).
ПРИМЕЧАНИЕ. Антеро-латеральные и задние медиальные комиссуры определяют границу передней листочки и задней области. - Используя стерильные автоклавируемые ножницы и невращающиеся щипцы, рассекайте левый предсердие и толщину стенки желудочка по всей окружности всего митрального клапана .
- Определите непрерывность мито-аортального клапана.
ПРИМЕЧАНИЕ. Левый желудочек содержит весь митральный клапан и аккорды. - Отделите лист переднего митрального клапана от листочка нижнего митрального клапана, отрежьте задний лист по вставке с желудочком (комиссурой).
- Промойте задний лист в физиологическом растворе. Отрежьте листовку на мелкие кусочки (<1 см 2 ) и индивидуально оберните их алюминиевой фольгой. Заморозить их жидким азотом,
Осторожно: соблюдайте организационные правила безопасности при использовании жидкого азота.- Санифицируйте таблицу шкафа раствором 70% изопропилового спирта и 6% раствором перекиси водорода в конце процедуры.
2. Выделение белка
- Используйте пинцет для забора образца, хранящегося в жидком азоте, и немедленно поместите его на сухой лед, все еще обернув в алюминиевую фольгу. Не оставляйте образец для оттаивания во время любых передач.
- Перед шлифованием охладите фарфоровый / циркониевый раствор и пестик системы измельчителя ( например, CryoGrinder) вместе с образцом, помещая их в колбу Дьюара, содержащую жидкий азот (~ 500 мл).
Осторожно: соблюдайте организационные правила безопасности при использовании жидкого азота. - Поместите раствор и пестик в полистирол, содержащий сухой лед. Удалите образец из алюминиевой фольги и положите ее в раствор.
- Измельчить tОн образец с большим пестиком против раствора 15-20 раз, используя отвертку для вращения пестика. Смешайте образец с кончиком предварительно охлажденного шпателя во время процесса измельчения.
- Повторите с маленьким пестиком.
- Перенесите образец почвы в предварительно взвешенную трубку ( например, пробирку с центрифугой на 15 мл), повернув трубку, поместив ее поверх раствора и перевернув вместе, чтобы переместить образец в трубку. Используйте предварительно охлажденный шпатель для извлечения всего материала из раствора.
- Держите трубку с образцом на сухом льду, чтобы избежать оттаивания образца во время переноса.
- Рассчитайте чистый вес образца.
- Очистите ступку и пестик после каждого образца и дезактивируйте их автоклавированием или нагрейте их при 200 ° C в течение 2 часов.
- Перенесите порошкообразный образец из центрифужной трубки в стеклянную трубку гомогенизатора путем инверсии.
- Добавить фильтрованный буфер мочевиныR (8 М мочевина, 2 М тиомочевины, 4% мас. / Об. CHAPS, 20 мМ Трис и 55 мМ дитиотреитола) в стеклянную трубку, 200 мкл мочевинного буфера для каждых 10 мг порошкообразной ткани.
ПРИМЕЧАНИЕ. Остаточный порошкообразный образец, оставшийся в пробирке для центрифуги, может быть восстановлен с использованием части расчетного объема буфера мочевины. - Гомогенизируйте образец, используя мешалку, оборудованную боросиликатным стеклянным раствором и пептидом из политетрафторэтилена (ПТФЭ). Медленно нажмите пестик на образец с крутящим движением (1500 об / мин) 10 раз.
- Восстановите супернатант и перенесите его в чистую 1,7 мл центрифужную пробирку. Снова извлеките оставшийся образец свежим буфером мочевины, добавив половину объема, используемого во время первой экстракции.
- Повторите шаг 2.10.
- Восстановить супернатант и объединить его с супернатантом с шага 2.11. Поместите объединенный супернатант на ротатор трубки в течение 30 мин.
- Центрифугируйте пробирку в течение 30 минут при 13000 xg и 4 ° C.
- Восстановить супернатантD измерьте концентрацию белка, используя анализ белка Bradford, согласно инструкциям производителя. Храните образец при температуре -80 ° C до использования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Экстракция и растворение белков в мочевиновом буфере непосредственно совместимы с протеомными методами, основанными на изоэлектрофокусировке (двумерный электрофорез (2-DE) 11 и жидкофазная изоэлектрическая фокусировка (IEF) 12 ) и с иммуноблоттингом после разбавления в буфере Лаэмми 13 Содержащий коктейль ингибитора протеазы 14 .
Для методов , не содержащих геля, на основе масс-спектрометрии ( т.е. жидкостной хроматографии, связанной с независимым от данных масс-спектрометрическим анализом (LC / MS E ) и двумерным LC / MS E (2D-LC / MS E )) 15 , извлеченные образцы В описанном буфере мочевины необходимо дополнительно обработать, чтобы удалить мочевину и тиомочевину, которые могут препятствовать последующему расщеплению белка и жидкостной хроматографии. ThiЭтап обессоливания может быть выполнен с использованием коммерческих наборов для осаждения белков, следуя инструкциям производителя для осаждения белков. Затем образец может быть растворен в 25 мМ NH 4 HCO 3, содержащем 0,1% расщепляемых моющих средств для расщепления белка 16 . Осаждение белков может устранить буферные компоненты, минимально влияя на содержание белка (восстановление белка:> 85%), что делает образец подходящим для любого анализа.
Применение этого протокола для извлечения белка из митральных клапанов человека позволило идентифицировать в общей сложности 422 белка, объединив четыре разных подхода протеомики, которые были описаны выше подробно 11 , 15 . В частности, 169 белков были идентифицированы белками 2-DE, 330 белками IEF, 96 белков жидкой фазы с помощью LC / MS E и 148 белковПо 2D-LC / MS E (таблица 1).
Чтобы классифицировать 422 идентифицированных белка с точки зрения субклеточной локализации, программное обеспечение использовалось для анализа онтологии генов (GO) ( например, Cytoscape). Сеть, созданная с помощью программного обеспечения и соответствующего соответствующего подключаемого модуля, показала, что помимо ожидаемых белков, локализованных во внеклеточной области (см. Верхнюю правую часть фиг. 2 ), большинство белков, идентифицированных протеомными подходами, были получены из внутриклеточной области (Т. Е. Цитоплазма, органеллы, везикулы и цитоскелет). Были идентифицированы белки клеточной поверхности ( рис. 2 ).
Результаты были дополнительно подтверждены в трех независимых образцах митрального клапана. Иммуноблоттинг использовали для анализа группы из четырех белков ( например, септина-11, четырех с половиной белка LIM-домена 1 (FHL-1), derМатопонтин и альфа-кристаллин B (CryAB)), которые никогда не были идентифицированы в нормальном митральном клапане ( рис. 3 ).
Рисунок 1: Структура клапанов Mitral. Вид сверху человеческого сердца, показывающий закрытый ( A ) или открытый ( B ) митральный клапан человека. Вид спереди левого желудочка сердца человека ( C ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Анализ идентифицированных белков митрального клапана в терминах клеточного распределения. Cytoscape и плагин BiNGO использовались для обтаиN распределение терминов онтологии генов (GO) из категорий клеточных компонентов. Размер круга пропорционален количеству компонентов белка, связанным с выбранными условиями GO, и сообщается цветовая шкала для p-значения избыточного представления. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Иммуноблоттинг-анализ септина-11, FHL-1, дерматопонтина и CryAB в целом экстракт из трех человеческих нормальных митральных клапанов. Иммуноблоттинг проводили с использованием мышиного моноклонального антитела против CryAB и кроличьих поликлональных антител против антител септина-11, FHL-1 и дерматопонтина. пожалуйстаНажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| присоединение | Описание | 2-DE | 2D-LC | LC-MS E | Жидкая фаза IEF |
| A6NMZ7 | Коллаген альфа VI | Икс | |||
| O00151 | PDZ и белок домена LIM 1 | Икс | |||
| O00299 | Хлоридный внутриклеточный протеин 1 | Икс | |||
| O00764 | Пиридоксальная киназа | Икс | |||
| O14558 | Белки теплового шока бета 6 | Икс | |||
| O43399 | Опухоль белка D54 | Икс | |||
| O43488 | Афлатоксин B1 альдегидредуктазный член 2 | Икс | |||
| O43707 | Альфа-актинин 4 | Икс | Икс | ||
| O43866 | Антиген CD5 как предшественник | Икс | |||
| O60493 | Сортировка нексина 3 | Икс | |||
| O60701 | UDP глюкоза 6 дегидрогеназа | Икс | |||
| O75223 | Нехарактерный белок | Икс | |||
| O75368 | Связывание домена SH3 с глутаминовой кислотой, богатой белком | Икс | |||
| O75390 | Митохондриальный предшественник цитратной синтазы | Икс | |||
| O75489 | NADH-дегидрогеназа убихинон-белок железа 3 митохондриальный предшественник | Икс | Икс | ||
| O75608 | Ацилбетон тиоэстераза 1 | Икс | |||
| O75828 | Карбонилредуктаза NADPH 3 | Икс | |||
| O75874 | Изоцитратдегидрогеназа NADP цитоплазматическая | Икс | |||
| O75955 | Flotillin | Икс | |||
| O94760 | NG NG диметиларгининдиметиламиногидролаза 1 | Икс | |||
| O94788 | Сетчатая дегидрогеназа 2 | Икс | |||
| O95865 | NG NG диметиларгининдиметиламиногидролаза 2 | Икс | Икс | ||
| P00325 | Алкогольная дегидрогеназа 1В | Икс | Икс | ||
| P00338 | L лактатдегидрогеназа Цепочка | Икс | |||
| P00352 | Сетчатая дегидрогеназа 1 | Икс | |||
| P00441 | Супероксиддисмутаза Cu Zn | Икс | Икс | ||
| P00450 | Препарат Ceruloplasmin | Икс | Икс | ||
| P00488 | Коагуляционный фактор XIII Прекурсор цепи | Икс | |||
| P00491 | Пуриновая нуклеозидфосфорилаза | Икс | |||
| P00492 | Гипоксантин гуанинфосфорибозилтрансфераза | Икс | |||
| P00558 | Фосфоглицераткиназа 1 | <тд> хИкс | Икс | ||
| P00568 | Аденилат-киназный изофермент 1 | Икс | |||
| P00734 | протромбин | Икс | Икс | ||
| P00738 | Гаптоглобин | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P00739 | Предшественник белка, связанный с гаптоглобином | Икс | |||
| P00751 | Фактор комплемента B | Икс | Икс | Икс | |
| P00915 | Углеродная ангидраза 1 | Икс | |||
| P00918 | Углеродная ангидраза 2 | Икс | |||
| P01008 | Прекурсор антитромбина III | Икс | Икс | Икс | |
| P01009 | Альфа-1 антитрипсин | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P01011 | Альфа 1 антихимотрипсин | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P01019 | Препарат ангиотензиногена | Икс | Икс | ||
| P01023 | Макроглобулин Alpha 2 | Икс | Икс | ||
| P01024 | Дополнение C3 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P01033 | Препарат ингибитора 1 металлопротеиназы | Икс | |||
| P01042 | Препарат Kininogen 1 | Икс | |||
| P01593 | Цепочка Ig каппа VI область AG | Икс | |||
| P01598 | Цепочка Ig каппа VI регион ЕС | Икс | |||
| P01600 | Цепочка Ig каппа VI область Хау | Икс | Икс | ||
| P01611 | Цепь Ig каппа VI область Wes | Икс | |||
| P01620 | Цепочка Ig kappa V III область SIE | Икс | |||
| P01625 | Цепь Ig каппа V IV область Лен | Икс | |||
| P01766 | Ig тяжелая цепь V III область BRO | Икс | Икс | ||
| P01781 | Ig тяжелая цепь V III область GAL | Икс | |||
| P01834 | Цепочка цепи k каппа | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P01842 | Ig лямбда-цепи C-области | Икс | Икс | Икс | |
| P01857 | Ig-1-цепь-цепь | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P01859 | Ig-гамма-цепь 2-цепи | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P01860 | Ig-3-цепь C-области | Икс | Икс | Икс | |
| P01861 | Ig-гамма-цепь 4-цепи | Икс | Икс | Икс | |
| P01871 | Ig-цепь цепи C | Икс | Икс | Икс | |
| P01876 | Ig альфа 1 цепь C | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P01877 | Ig-2-цепь C-область | Икс | |||
| P02144 | Миоглобин | Икс | Икс | ||
| P02452 | Коллагеновая альфа-1 I цепь | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02511 | Альфа-кристаллин B-цепь | Икс | |||
| P02545 | Lamin AC 70 кДа ламин | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02647 | Аполипопротеин AI | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02649 | Аполипопротеин Е | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02671 | Фибриногенная альфа-цепь | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02675 | Бета-цепь фибриногена | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02679 | Гамма-цепь фибриногена | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02689 | Миелин Р2-белок | Икс | |||
| P02735 | Сывороточный амилоид Прекурсор белка | Икс | |||
| P02741 | C-реактивный белок | Икс | |||
| P02743 | Сывороточный амилоидный компонент | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02746 | Подкомпонент субкомпонентного компонента комплемента Libq B | Икс | Икс | ||
| P02747 | Компонент субкомпонентный субкомпонент Cq субкомбината Cq | Икс | |||
| P02748 | Компонент дополнения C9 | Икс | Икс | Икс | |
| P02749 | Бета 2 гликопротеин 1 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02750 | Лейцин-богатый альфа-2-гликопротеиновый предшественник | Икс | |||
| P02751 | фибронектина | Икс | Икс | ||
| P02760 | Препарат белка AMBP | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02763 | Альфа-1-гликопротеин 1 | Икс | Икс | Икс | |
| P02765 | Препарат гликопротеина альфа-2 HS | Икс | |||
| P02766 | Прекурсор транстиретина | Икс | Икс | Икс | |
| P02768 | Сывороточный альбумин | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02774 | Препарат белка связывания витамина D | Икс | |||
| P02787 | Serotransferrin | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02788 | Препарат лактотрансферрина | Икс | |||
| P02790 | гемопексина | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P02792 | Ферритовая легкая цепь | Икс | |||
| P04004 | витронектин | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P04075 | Фруктоза-бисфосфат-альдолаза А | Икс | |||
| P04083 | Приложение А1 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P04179 | Супероксиддисмутаза Mn митохондриальный предшественник | Икс | |||
| P04196 | Препарат, богатый гистидином гликопротеина | Икс | |||
| P04217 | Препарат гликопротеина альфа 1B | Икс | Икс | ||
| P04350 | Тубулин бета-4 цепи | Икс | |||
| P04406 | Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P04792 | Белки теплового шока бета 1 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P05091 | Препарат митохондрий альдегиддегидрогеназы | Икс | Икс | ||
| Прекурсор ингибитора плазменной протеазы С1 | Икс | ||||
| P05156 | Дополняющий фактор I предшественник | Икс | |||
| P05413 | Жирная кислота, связывающая белковое сердце | Икс | |||
| P05452 | Препарат Тетрантектина TN | Икс | Икс | ||
| P05787 | Цитоскелет типа II кератина | Икс | |||
| P06396 | Gelsolin | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P06576 | Субстрат субъединицы АТФ бета-митохондриального предшественника | Икс | Икс | ||
| P06732 | Тип креатинкиназы M | Икс | Икс | ||
| P06733 | Альфа-энолаза | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P06753 | Тропомиозиновая альфа-3-цепь | Икс | Икс | ||
| P07108 | Ацил-СоА-связывающий белок | Икс | |||
| P07195 | L-лактатдегидрогеназа B-цепь | Икс | Икс | Икс | |
| P07196 | Нейрофиламентный легкий полипептид | Икс | |||
| P07197 | Полипептид среды нейрофиламента | Икс | Икс | ||
| P07237 | Препарат предшественника дисульфида протеина | Икс | Икс | ||
| P07339 | Препарат катепсина D | Икс | Икс | ||
| P07355 | Приложение А2 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P07360 | Компонент предшественника гамма-цепи компонента C8 | Икс | |||
| P07437 | Бета-цепь тубулина | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P07585 | декорин | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P07737 | Профилин 1 | Икс | |||
| P07858 | Препарат катепсина В | Икс | |||
| P07900 | Белки теплового шока HSP 90 alpha | Икс | Икс | ||
| P07951 | Бета-цепь тропомиозина | Икс | |||
| P07954 | Митохондриальный предшественник фумарата гидратазы | Икс | |||
| P07996 | Тромбоспондин 1 | Икс | Икс | Икс | |
| P08107 | Тепловой удар 70 кДа белка 1А 1В | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P08123 | Коллаген альфа 2 I цепи | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P08133 | Приложение А6 | Икс | Икс | ||
| P08238 | Теплый белок HSP 90 beta | Икс | Икс | ||
| P08253 | Препарат коллагеназы типа IV типа 72 кДа | Икс | |||
| P08294 | Внеклеточная супероксиддисмутаза Cu Znursor | Икс | Икс | Икс | |
| P08590 | Миозиновый легкий полипептид 3 | Икс | Икс | ||
| P08603 | Фактор комплемента H | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P08670 | Виментин | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P08729 | Цитоскелет II типа кератина | Икс | |||
| P08758 | Приложение А5 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P09211 | Трансплантация глутатиона S P | Икс | Икс | Икс | |
| P09382 | Галектин 1 | Икс | Икс | Икс | |
| P09417 | Дигидроптеридинредуктаза | <TD> | Икс | ||
| P09493 | Тропомиозин 1 альфа-цепь | Икс | Икс | ||
| P09525 | Приложение А4 | Икс | Икс | ||
| P09651 | Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин A1 | Икс | |||
| P09871 | Дополнитель субкомпонента комплемента C1s | Икс | |||
| P09936 | Ubiquitin карбоксильный терминал гидролаза isozyme L1 | Икс | |||
| P09972 | Фруктоза-бисфосфат-альдолаза C | Икс | |||
| P0C0L4 | Дополнение C4 A-предшественник | Икс | |||
| P0CG05 | IgЛямбда 2 цепи С | Икс | |||
| P0CG38 | POTE анкирин домен член семьи I | Икс | |||
| P10515 | Дигидролипоиллизиновый остаток ацетилтрансферазного компонента комплекса пируватдегидрогеназы | Икс | |||
| P10768 | S формилглютатионгидролаза | Икс | |||
| P10809 | 60 кДа митохондриального предшественника белка теплового шока | Икс | |||
| P10909 | Clusterin | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P10915 | Гиалуронан и протеогликан связывают белок 1-предшественник | Икс | Икс | ||
| P11021 | 78 кДа гБелковый регулируемый белок | Икс | Икс | Икс | |
| P11047 | Предшественник субъединицы ламинина 1 | Икс | |||
| P11142 | Тепловой удар соответствует 71 кДа белка | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P11177 | Пируватдегидрогеназа E1 субъединица бета-митохондриального предшественника | Икс | |||
| P11217 | Мышечная форма гликогенфосфорилазы | Икс | |||
| P11310 | Среднеконтактный ацил-CoA-дегидрогеназа-митохондриальный предшественник | Икс | |||
| P11413 | Глюкоза-6-фосфат-1-дегидрогеназа | Икс | |||
| P11766 | Алкогольная дегидрогеназа класса 3 chi chain | Икс | |||
| P12036 | Нейрофиламентный тяжелый полипептид | Икс | |||
| P12109 | Цепочка коллагена альфа 1 VI | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P12110 | Цепочка коллагена альфа 2 VI | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P12111 | Цепочка коллагена альфа 3 VI | Икс | Икс | Икс | |
| P12277 | Тип креатинкиназы B | Икс | |||
| P12429 | Приложение А3 | Икс | Икс | ||
| P12814 | Альфа-актинин 1 | Икс | Икс | ||
| P12829 | Миозиновый легкий полипептид 4 | Икс | |||
| P12882 | Миозин 1 | Икс | |||
| P12883 | Миозин 7 | Икс | Икс | ||
| P12955 | Дипептидаза Xaa Pro | Икс | |||
| P13489 | Ингибитор рибонуклеазы | Икс | |||
| P13533 | Миосин 6 | Икс | Икс | ||
| P13611 | Экспериментальный предшественник первичного белка | Икс | Икс | ||
| P13639 | Коэффициент удлинения 2 | Икс | |||
| P13716 | Дегидратаза дельта аминолевулиновой кислоты | Икс | |||
| P13796 | Пластин 2 | Икс | |||
| P13804 | Экспрессия субъединицы альфа-митохондриального субъединицы транскрипта | Икс | |||
| P13929 | Бета-энолаза | Икс | Икс | ||
| P14136 | Глиальный фибриллярный кислый белковый астроцит | Икс | |||
| P14314 | Препарат субъединицы глюкозидазы 2 | Икс | |||
| P14550 | Алкогольная дегидрогеназа NADP | Икс | |||
| P14618 | Изоферменты пируват-киназы M1 M2 | Икс | Икс | Икс | |
| P14625 </ TD> | Препарат эндоплазмина | Икс | Икс | ||
| P15121 | Альдезоредуктаза | Икс | |||
| P15259 | Фосфоглицериновая мутация 2 | Икс | |||
| P16152 | Карбонилредуктаза NADPH 1 | Икс | |||
| P17066 | Тепловой удар 70 кДа белка 6 | Икс | Икс | Икс | |
| P17174 | Аспартат аминотрансфераза цитоплазматическая | Икс | |||
| P17540 | Креатин-киназный саркоммерный митохондриальный предшественник | Икс | |||
| P17661 | Desmin | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P17980 | 26S-регуляторная субъединица 6A | Икс | |||
| P17987 | T комплексный белок 1 субъединица альфа | Икс | |||
| P18206 | винкулина | Икс | Икс | ||
| P18428 | Препарат предшественника липополисахарида | Икс | |||
| P18669 | Фосфоглицериновая мутация 1 | Икс | |||
| P19105 | Контрольная легкая цепь миозина 2 | Икс | Икс | ||
| P19623 | Синтеза спермидина | Икс | |||
| P19652 | Альфа-1 кислотный гликопротеин 2-предшественник | Икс | Икс | ||
| P19823 | Ингибитор альфа-трипсина тяжелой цепи H2 | Икс | |||
| P19827 | Тяжелая цепь ингибитора альфа-трипсина H1 | Икс | Икс | ||
| P20073 | Приложение А7 | Икс | |||
| P20618 | Протеазома субъединица бета-типа 1-предшественник | Икс | |||
| P20774 | Mimecan | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P21266 | Трансплантация глутатиона S Mu 3 | Икс | |||
| P21333 | Филамин А | Икс | Икс | ||
| P21796 | Напряжение, зависимое от анионного белка белка1 | Икс | |||
| P21810 | бигликан | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P21980 | Протеин глутамин гамма глутамилтрансфераза 2 | Икс | Икс | ||
| P22105 | Tenascin X | Икс | Икс | ||
| P22314 | Ubiquitin активирующий фермент E1 | Икс | |||
| P22352 | Препарат глутатионпероксидазы 3 | Икс | Икс | ||
| P22626 | Гетерогенные ядерные рибонуклеопротеины A2 B1 | Икс | |||
| P22695 | Ubiquinol цитохром c редуктазы комплексный основной белок 2 митохондриальный предшественник | Икс | |||
| P23141 | Препарат печени карбоксиэстеразы 1 | Икс | |||
| P23142 | Фибулин 1 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P23284 | Префект пептидилпролилцис-транс-изомеразы В | Икс | |||
| P23381 | Триптофанильная тРНК-синтетаза цитоплазматическая | Икс | |||
| P23526 | Adenosylhomocysteinase | Икс | Икс | ||
| P23528 | Кофилин 1 | Икс | |||
| P24752 | Ацетил-CoA-ацетилтрансфераза митохондриального предшественника | Икс | |||
| P25311 | Цинк альфа 2 гликопротеидN предшественник | Икс | |||
| P25705 | АТФ-синтазная субъединица альфа-митохондриальная | Икс | |||
| P25788 | Протеасома субъединица альфа-типа 3 | Икс | Икс | ||
| P25789 | Протеасома субъединица альфа-типа 4 | Икс | |||
| P26447 | Протеин S100 A4 | Икс | |||
| P27348 | 14 3 3 белка тета | Икс | Икс | ||
| P27797 | Предшественник калькретинулина | Икс | |||
| P28066 | Протеасома субъединица альфа-типа 5 | Икс | |||
| P28070 | <Td> Препарат предшественника бета-типа 4 протеасомыИкс | Икс | |||
| P28072 | Протеасома субъединица бета-типа 6-предшественник | Икс | |||
| P28074 | Препарат предшественника бета-типа 5 протеасомы | Икс | |||
| P28331 | NADH убиквинон-оксидоредуктаза 75 кДа субъединица митохондриального предшественника | Икс | |||
| P28838 | Цитозол аминопептидаза | Икс | |||
| P29218 | Иноситол монофосфатаза | Икс | |||
| P29401 | транскетолаза | Икс | |||
| P29692 | Коэффициент удлинения 1 дельта | <TD> | Икс | ||
| P29966 | Миристоилированный аланин-богатый C-киназный субстрат | Икс | |||
| P30040 | Эндоплазматический ретикулярный белок ERp29-предшественник | Икс | |||
| P30041 | Пероксиредоксин 6 | Икс | Икс | ||
| P30043 | Флавин-редуктаза | Икс | |||
| P30044 | Пероксиредоксин 5 митохондриальный предшественник | Икс | |||
| P30085 | Киназа UMP CMP | Икс | |||
| P30086 | Фосфатидилэтаноламинсвязывающий белок 1 | Икс | |||
| P30101 | ПротейN дисульфид-изомераза A3-предшественник | Икс | Икс | Икс | |
| P30613 | Пироват-киназные изозимы RL | Икс | |||
| P30740 | Ингибитор лейкоцитарной эластазы | Икс | |||
| P31025 | Препарат липокалина 1 | Икс | |||
| P31937 | 3 митохондриального предшественника гидроксиизобутиратдегидрогеназы | Икс | |||
| P31942 | Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин H3 | Икс | |||
| P31943 | Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин H | Икс | |||
| P31946 | 14 3 3 белок beta alpha | Икс | Икс | ||
| P31948 | Стресс-индуцированный фосфопротеин 1 | Икс | |||
| P31949 | Протеин S100 A11 | Икс | |||
| P32119 | Пероксиредоксин 2 | Икс | Икс | ||
| P34931 | Тепловой удар 70 кДа белка 1, как | Икс | Икс | ||
| P34932 | Тепловой удар 70 кДа белка 4 | Икс | |||
| P35232 | прохибитин | Икс | |||
| P35237 | Serpin B6 | Икс | |||
| P35443 | Тромбоспонпин 4 | Икс | </ TR> | ||
| P35555 | Фибриллин 1 | Икс | Икс | ||
| P35579 | Миозин 9 | Икс | Икс | Икс | |
| P35580 | Миозин 10 | Икс | Икс | ||
| P35609 | Альфа-актинин 2 | Икс | |||
| P35625 | Ингибитор металлопротеиназы 3 | Икс | Икс | ||
| P35998 | 26S-регуляторная субстанция 7 | Икс | |||
| P36871 | Фосфоглюкомутаза 1 | Икс | Икс | ||
| P36955 | Фактор, вызванный пигментным эпителием | Икс | Икс | ||
| P37802 | <Td> Трансгелин 2Икс | Икс | |||
| P37837 | трансальдолазы | Икс | |||
| P38117 | Транспондерная субъединица флавопротеинов переноса электронов бета | Икс | |||
| P38646 | Претендент митохондриального протеина 70 стресса | Икс | Икс | ||
| P39687 | Кислотный лейцин-богатый ядерный фосфопротеин 32 член семьи A | Икс | |||
| P40121 | Макрофаговый укупоривающий белок | Икс | |||
| P40925 | Малетодегидрогеназа цитоплазматическая | Икс | |||
| P40926 | Митохондриальный предшественник малетдегидрогеназы | <TD> | Икс | ||
| P41219 | Peripherin | Икс | |||
| P42330 | Семейство Aldo keto reductase 1 член C3 | Икс | |||
| P45880 | Напряжение, зависящее от анионного избирательного канала белка 2 | Икс | |||
| P47755 | F-актин-укупорочная белковая субъединица альфа-2 | Икс | Икс | ||
| P47756 | F-актин-укупорочный белок субъединицы бета | Икс | Икс | ||
| P47985 | Ubiquinol цитохром c редуктазы субстрата субъединицы железа, митохондриального предшественника | Икс | |||
| P48047 | Субстрат митохондриальной субъединицы АТФ-синтазы | Икс | |||
| P48637 | Глутатионсинтетаза | Икс | |||
| P48741 | Тепловой удар 70 кДа белка 7 | Икс | Икс | ||
| P49189 | 4 триметиламинобутиральдегиддегидрогеназа | Икс | |||
| P49368 | T комплексный белок 1 субъединица гамма | Икс | |||
| P49747 | Хлорированный олигомерный матричный белок | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P49748 | Очень длинноцепочечный ацил-CoA-дегидрогеназа-митохондриальный предшественник | Икс | |||
| P50395 | Rab ингибитор диссоциации | Икс | х </ TD> | ||
| P50454 | Предшественник Serpin H1 | Икс | |||
| P50995 | Приложение А11 | Икс | |||
| P51452 | Двойная специфическая белковая фосфатаза 3 | Икс | |||
| P51884 | люмикан | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P51888 | Проларгин-предшественник | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P52565 | Ингибитор диссоциации Rho ВВП 1 | Икс | |||
| P52566 | Ингибитор диссоциации Rho ВВП 2 | Икс | |||
| P54652 | Связанный с тепловым шоком 70 кДа белок 2 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P55072 | Переходная эндоплазматическая ретикулярная АТФаза | Икс | |||
| P55083 | Микрофибрил ассоциированный гликопротеин 4 предшественник | Икс | Икс | ||
| P57053 | Histone H2B тип F | Икс | |||
| P60174 | Триозофосфатная изомераза | Икс | Икс | Икс | |
| P60660 | Миозиновый легкий полипептид 6 | Икс | Икс | ||
| P60709 | Актин цитоплазматический 1 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P60981 | Destrin | Икс | |||
| P61086 | Конъюгирующий фермент Ubiquitin E2 25 кДа | Икс | |||
| P61088 | Конъюгирующий фермент Ubiquitin E2 | Икс | |||
| P61224 | Ras-связанный белок Rap 1b-предшественник | Икс | |||
| P61978 | Гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин К | Икс | Икс | ||
| P61981 | 14 3 3 белка гамма | Икс | Икс | Икс | |
| P62258 | 14 3 3 белок эпсилон 14 3 3E | Икс | |||
| P62491 | Расовый белок | Икс | |||
| P62714 | Сыворотка треонина белковая фосфатаза 2А каталитическая субъединица бета-изоформа | Икс | |||
| P62736 | Актив аортальная гладкая мышца | Икс | Икс | Икс | |
| P62805 | Histone H4 | Икс | |||
| P62826 | GTP-связывающий ядерный белок Ran | Икс | |||
| P62873 | Гуаниновый нуклеотидный связывающий белок GIGSGT субъединица бета 1 | Икс | |||
| P62879 | Гуаниновый нуклеотидный связывающий белок GIGSGT субъединица бета 2 | Икс | |||
| P62937 | Пептидилпролилцис-транс-изомераза А | Икс | Икс | ||
| P62987 | Ubiquitin 60S рибосомальный белок L40 | Икс | |||
| P63104 | 14 3 3 proTein zeta delta | Икс | Икс | Икс | Икс |
| P63241 | Фактор инициации эукариотического трансляции 5A 1 | Икс | |||
| P63244 | Гуаниновая нуклеотидная связывающая белковая субъединица бета 2, как 1 | Икс | |||
| P63267 | Актин-гамма-кишечная гладкая мышца | Икс | Икс | ||
| P67936 | Тропомиозиновая альфа-4-цепь | Икс | |||
| P68032 | Актина альфа-сердечная мышца 1 | Икс | |||
| P68104 | Коэффициент удлинения 1 альфа 1 | Икс | Икс | Икс | |
| P68133 | Актина альфа-скелетная мышца | ||||
| P68363 | Тубулин альфа-1B-цепь | Икс | Икс | Икс | |
| P68371 | Целлюлоза бета 2C | Икс | Икс | Икс | |
| P68402 | Активирующий фактор тромбоцитов ацетилгидролаза IB субъединица бета | Икс | |||
| P68871 | Гемоглобин субъединицы бета | Икс | Икс | Икс | |
| P69905 | Гемоглобиновая субъединица альфа | Икс | Икс | ||
| P78371 | T комплексный белок 1 субъединица бета | Икс | |||
| P78417 | Глутатионтрансфераза омега 1 | Икс | Икс | ||
| P80748 | Ig лямбда-цепь VIII регион LOI | Икс | |||
| P98095 | Фибулин 2 | Икс | Икс | ||
| Q01082 | Цепь бета-цепи Spectrin 1 | Икс | |||
| Q01449 | Контрольная легкая цепь миозина 2 изоформы предсердий | Икс | |||
| Q01518 | Связанный с аденилилциклазой белок 1 | Икс | |||
| Q01995 | Трансгелин Гладкий мышечный белок 22 альфа | Икс | |||
| Q03252 | Ламин B2 | Икс | Икс | ||
| Q03591 | Фактор комплемента фактора H, связанный с белком 1 | Икс | Q04917 | 14 3 3 белок eta | Икс | Икс |
| Q06323 | Субстрат комплекса активатора протеасомы 1 | Икс | |||
| Q06828 | Фибромодулин | Икс | Икс | Икс | Икс |
| Q06830 | Пероксиредоксин 1 | Икс | Икс | ||
| Q07507 | Dermatopontin | Икс | Икс | Икс | Икс |
| Q07960 | Rho GTPase-активирующий белок 1 | Икс | |||
| Q08257 | Хиноноксидоредуктаза | Икс | |||
| Q08431 | Lactadherin | Икс | Икс | ||
| Q12765 | SEcernin 1 | Икс | |||
| Q13011 | Delta 3 5 Delta 2 4 диеноил-CoA-изомераза митохондриальный предшественник | Икс | Икс | ||
| Q13228 | Селенсвязывающий белок 1 | Икс | Икс | ||
| Q13404 | Конъюгирующий фермент Ubiquitin E2 вариант 1 | Икс | |||
| Q13409 | Цитоплазматическая динеин 1 промежуточная цепь 2 | Икс | |||
| Q13509 | Тубулин бета-3-цепь | Икс | Икс | Икс | |
| Q13642 | Четыре с половиной белка LIM белка 1 | Икс | |||
| Q13765 | Связанная с полипептидом комплексная субъединица альфа | Икс | |||
| Q13885 | N-тубулин бета-2А-цепь | Икс | Икс | ||
| Q14194 | Связанный с дигидропиримидазой белок 1 | Икс | |||
| Q14195 | Связанный с дигидропиримидазой белок 3 | Икс | Икс | Икс | Икс |
| Q14624 | Препарат H4 тяжелой цепи ингибитора альфа-трипсина | Икс | |||
| Q14697 | Нейтральная альфа-глюкозидаза AB-предшественник | Икс | |||
| Q14764 | Основной белок-хранилище | Икс | |||
| Q14767 | Скрытый трансформирующий фактор роста бета-связывающий белок 2 | Икс | <TD>Икс | ||
| Q14894 | Mu crystalin homolog NADP регулирует тиреоидный гормон-связывающий белок | Икс | |||
| Q15063 | Перистиновый предшественник | Икс | Икс | Икс | Икс |
| Q15084 | Прекурсор предшественника дисульфид-изомеразы белка A6 | Икс | |||
| Q15113 | Проколлаген C энтопептидаза-энхансер 1 предшественник | Икс | |||
| Q15181 | Неорганическая пирофосфатаза | Икс | |||
| Q15365 | Полиинверсионный белок 1 | Икс | |||
| Q15366 | Полиинверсионный белок 2 | Икс | |||
| Q15582 | Трансформирующий белок, индуцированный бета-фактором роста | Икс | Икс | Икс | |
| Q15819 | Конъюгирующий фермент Ubiquitin E2 вариант 2 | Икс | |||
| Q16352 | Альфа-интернейсин | Икс | |||
| Q16473 | Предполагаемый tenascin XA | Икс | |||
| Q16555 | Связанный с дигидропиримидазой белок 2 | Икс | Икс | Икс | |
| Q16698 | 2 4 митохондриального предшественника диеноил-CoA-редуктазы | Икс | |||
| Q16891 | Митохондриальная внутренняя мембрана | Икс | |||
| Q562R1 | Бета-актин, как белок 2 | Икс | |||
| Q6S8J3 | POTE член семьи ankyrin член E | Икс | |||
| Q6UWY5 | Олфактомедин, как белок 1, предшественник | Икс | Икс | ||
| Q71U36 | Тубулин альфа-1А-цепь | Икс | Икс | Икс | |
| Q7Z7G0 | Цель предшественника Nesh SH3 | Икс | Икс | Икс | |
| Q8WUM4 | Запрограммированный клеточный гибель 6 взаимодействующих белков | Икс | |||
| Q8WWX9 | Тиоредоксин, как предшественник селенопротеина М | Икс | |||
| Q92597 | Белки NDRG1 | Икс | |||
| Q92945 Фармацевтический белок 2 | Икс | ||||
| Q96CN7 | Область Isochorismatase, содержащая белок 1 | Икс | |||
| Q96CX2 | BTB POZ домен, содержащий белок | Икс | |||
| Q96KK5 | Histone H2A тип 1 H | Икс | Икс | ||
| Q96KP4 | Цитозольная неспецифическая дипептидаза | Икс | |||
| Q99426 | Тубулин специфический шаперон B | Икс | |||
| Q99497 | Протеиновый DJ 1 | Икс | Икс | ||
| Q99536 | Синаптический мембранный белок пузырьков | Икс | Икс | Икс | |
| Q99714 | 3 гидроксиацил-CoA-дегидрогеназа типа 2 | Икс | |||
| Q99715 | Коллаген альфа 1 XII цепь | Икс | Икс | ||
| Q99798 | Митохондриальный предшественник аконата гидратазы | Икс | |||
| Q9BQE3 | Тубулин альфа-6-цепь | Икс | |||
| Q9BUF5 | Тубулин бета 6 цепь | Икс | Икс | ||
| Q9BUT1 | 3 гидроксибутиратдегидрогеназы типа 2 | Икс | |||
| Q9BVA1 | Тубулин бета-2B-цепь | Икс | Икс | Икс | |
| Q9BXN1 | Asporin | Икс | х </ TD> | Икс | Икс |
| Q9H0W9 | Эфирная гидролаза C11orf54 | Икс | |||
| Q9H4B7 | Тубулин бета 1 цепь | Икс | |||
| Q9NRN5 | Олфактомедин, подобный предшественнику белка 3 | Икс | Икс | ||
| Q9NRV9 | Хемсвязывающий белок 1 | Икс | |||
| Q9NSB2 | Кутикулярный кубик типа Кератин Hb4 | Икс | Икс | ||
| Q9NVA2 | Септик 11 | Икс | |||
| Q9UBR2 | Препарат катепсина Z | Икс | |||
| Q9UBX5 | Фибулин 5 | Икс | Икс | ||
| Q9UK22 | F box только белок 2 | Икс | |||
| Q9Y277 | Зависимый от напряжения анион-избирательный белок канала 3 | Икс | |||
| Q9Y281 | Кофилин 2 | Икс | |||
| Q9Y490 | Талин 1 | Икс | |||
| Q9Y696 | Хлоридный внутриклеточный протеин 4 | Икс | |||
| Q9Y6C2 | EMILIN 1 | Икс | Икс |
Таблица 1: Список белков, идентифицированных в экстракте ткани митрального клапана при применении четырех различных протеомических подходов: двухмерный электрофорез (2-DE), двумерный LC-MS E (2D-LC / MS E ), LC / MS E и жидкофазный IEF. Сообщается о способе идентификации каждого белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из важных шагов этого протокола является использование жидкого азота для замораживания образца и охлаждения системы измельчителя. Использование жидкого азота предотвращает биологическую деградацию и позволяет эффективно напылять, но требует специальной подготовки для безопасного обращения.
В этом протоколе представлена система измельчителя для шлифования образцов, поскольку небольшие образцы трудно восстановить из стандартных растворов и пестиков. В этом случае небольшие образцы распространяются как мелкий порошок поверх поверхности раствора, что затрудняет сбор. Другим преимуществом является то, что измельчитель моторизирован, что позволяет обрабатывать большее количество образцов воспроизводимым образом и без дополнительной усталости. Одно ограничение на использование дробилки заключается в том, что размер образца, который должен быть небольшим (100 мг или менее) для пестика, эффективно прижиматься к ступке. Кроме того, компоненты шлифовального станка должны быть нагреты до комнатной температуры между использованием для очистки г. Следовательно, процедура занимает много времени, и, если многие образцы обрабатываются ежедневно, требуется множество наборов.
Дополнительным критическим шагом является подготовка экстракционного буфера. Концентрации соли, особенно для мочевины (8 М) и тиомочевины (2 М), довольно высоки; Таким образом, объем соли составляет почти половину общего объема раствора. Кроме того, растворение нелегко, учитывая, что необходимо избегать тепла, поскольку при температуре выше 37 ° C мочевина может приводить к карбамилированию белков на N концах белков / пептидов и в аминогруппах боковой цепи лизиновых и аргининовых остатков 17 , После растворения буфер мочевины должен быть отфильтрован фильтрами 0,22 мкм и может храниться при -80 ° C в течение 4 недель, не влияя на его эффективность экстракции, но перед использованием его необходимо нагревать до более чем 15 ° C, чтобы обеспечить полное растворение ,
Модификации и устранение неполадок
В этом протоколе экстракция белка выполняется с использованием описанного буфера мочевины, потому что он является одним из наиболее часто используемых растворов для экстракции белков для протеомических исследований из-за его совместимости с изоэлектрофокусировкой и его эффективности при солюбилизации малорастворимых белков 18 . Продемонстрировал, что этот буфер может очень эффективно солюбилизировать малорастворимые белки, такие как интегральные мембранные белки 19 , или белки, которые сильно подвержены агрегации, такие как тубулин 18. Кроме того, этот буфер полностью совместим с анализом Брэдфорда для определения концентрации белка и Его можно использовать непосредственно в анализах 2-DE и жидкофазном IEF.Однако этот буфер не идеален для солюбилизации всех белков, присутствующих в образце. Возможно, что различные экстракционные буферы могут выявлять белки, не поддающиеся определению по этому протоколу. Например, это хорошо knoWn, что рибосомные и ядерные белки можно было бы лучше экстрагировать кислотной экстракцией или осаждением трихлоруксусной кислоты / ацетона 20 , тогда как щелочные уровни рН более подходят для мембранных белков 21 , 22 . Поэтому использование альтернативных буферов может потребовать дополнительных шагов для осаждения белка для устранения солей, которые препятствуют 2-DE или жидкофазной IEF.
Ограничения техники
Количество белков, идентифицированных по этому протоколу, относительно невелико, но количество идентификаций и охват протеомного анализа может быть дополнительно увеличено за счет использования более современных инструментов, чья точность и скорость секвенирования значительно увеличились за последние несколько лет 23. Можно покрыть большую часть протеома без каких-либо шагов префракционирования, используя длинный градиент для жидкого chРазделение роматографии в сочетании с прибором MS высокого разрешения, который имеет быструю скорость 24 секвенирования.
Значение метода в отношении существующих / альтернативных методов
Способность идентифицировать и количественно определять белки в сердечных клапанах человека, таких как митральный клапан, является важной и сложной задачей, которая поможет выявить механизмы физиологических / патологических процессов при заболеваниях клапанов. Определение изменений протеома митрального клапана значительно увеличит понимание природы биологических процессов, связанных с болезненным состоянием ткани.
Современные знания о физиопатологии митрального клапана ограничены и обычно получают путем анализа отдельных белков, участвующих в конкретных процессах, таких как ремоделирование внеклеточного матрикса, гемостаз, воспаление или окислительный стресс 25 9 , 10 .
Отсутствие всесторонних протеомных исследований может быть связано со сложностью этой ткани с низкой клеткой, которая богата белками внеклеточного матрикса ( т.е. протеогликанами, коллагеном и эластином). Эти белки составляют около 80% от общего количества, что затрудняет анализ белков с низким уровнем обилия 26 .
Таким образом, необходимо было установить эффективный протокол экстракции, чтобы максимизировать солюбилизацию белка для описания протеома этой ткани. Этот протокол позволил выделить 50 мкг белка из 1 мг ткани. Это относительно низкий выход по сравнению с «мягкой» тканью, такойКак печень (~ 135 мкг из 1 мг ткани), но достаточно выполнить анализ белка на отдельных образцах. Это особенно актуально при определении внутриличностной изменчивости явления.
Кроме того, этот метод имеет то преимущество, что он совместим со многими аналитическими приложениями. Белки митрального клапана, растворенные в предлагаемом экстракционном буфере, могут быть непосредственно использованы для иммуноблоттинга и протеомического анализа на основе двумерного электрофореза и изоэлектрофореза в жидкой фазе 11 , 12 или после осаждения белка для устранения интерференции буферных компонентов для других анализов, таких как Масс-спектрометрия без геля 15 .
С применением этого протокола экстракции более полная характеристика белковых компонентов нормальной ткани митрального клапана была получена путем идентификации многих внутрицепочечных. Эти белки локализуются в цитозоле или органеллах не только во внеклеточном матриксе, но и имеют различные молекулярные и биологические функции. Также были идентифицированы другие интересные белки ( например, CryAB, септин-11, FHL-1 и дерматопонтин). Эти белки имеют неизвестные функции в митральном клапане, но их биологические свойства указывают на возможную роль в заболеваниях клапанов.
Будущие приложения или направления после освоения этой техники
С помощью этого протокола можно сопоставить данные об экспрессии белка с данными о количественной экспрессии мРНК и не количественных иммуногистохимических анализах. Действительно, при совместном использовании эти подходы приведут к более полному пониманию молекулярных механизмов, лежащих в основе болезни, от мРНК до посттрансляционной модификации белка. Таким образом, этот метод может представлять интерес для исследователей, ориентированных на физиопатологию сердечного клапана. ПлавникЭтот протокол также может быть применен к митральному клапану свиньи, который имеет близкое сходство с человеческим клапаном 27 и используется в качестве экспериментальной модели для оценки функции клапана.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Министерство здравоохранения Италии поддержало это исследование (RC 2013-BIO 15). Мы благодарим Барбару Мишели за ее отличную техническую помощь.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline solution | 0.9 % NaCl | ||
| Eurocollins A | SALF | 30874046 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Eurocollins B | SALF | 30874022 | Balanced organ's transport medium. Combine 400 mL of Eurocollins A with 100 mL Eurocollins B to obtain balanced medium Eurocollins |
| Wisconsin | Bridge life | RM/N 4081 | Balanced organ's transport medium |
| Biohazard vertical flow air | Burdinola | Class A GMP classification | |
| Dewar Flask | Thermo Scientific | Nalgene 4150-1000 | |
| Cryogrinder system | OPS diagnostics | CG 08-01 | Grinder system containing mortars, pestles and screwdriver |
| Stainless steel forceps | |||
| Stainless steel spatula | |||
| Disposable sterile scalpel | Medisafe | MS-10 | |
| Stainless steel scissors | Autoclavable | ||
| Stainless steel picks | Autoclavable | ||
| Disposable sterile drap | Mon&Tex | 3.307.08 | |
| Sterilizing solution with isopropyl alcohol | 70% isopropyl alcohol | ||
| Sterilizing solution with hydrogen peroxide | 6% hydrogen peroxide | ||
| Micropipette, 1 mL, with tips | |||
| 15 mL centrifuge tubes | VWR international | 9278 | |
| 1.7 mL centrifuge tubes | VWR international | PIER90410 | |
| Urea buffer | 8 M urea, 2 M thiourea, 4 % w/v CHAPS, 20 mM Trizma, 55 mM Dithiotreitol | ||
| Urea | Sigma aldrich | U6504-1KG | To be used for Urea buffer |
| Thiourea | Sigma aldrich | T8656 | To be used for Urea buffer |
| CHAPS | Sigma aldrich | C3023-5GR | To be used for Urea buffer |
| Dithiotreitol | Sigma aldrich | D0632-5G | To be used for Urea buffer |
| Syringe 50 mL | PIC | To be used to filter Urea buffer | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGP033RB | To be used to filter Urea buffer |
| PFTE Pestle, 2 mL | Kartell | 6302 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Borosilicate glass mortar | Kartell | 6102 | Part of Potter-Elvehjem homogenizer |
| Stirrer | VELP scientifica | Stirrer DLH | To be used for homogenization by Potter-Elvehjem |
| Bradford Protein assay | Bio-Rad laboratories | 5000006 | |
| Tube rotator | Pbi International | F205 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Aluminum foil | |||
| Ice | |||
| Polystyrene box | |||
| Dry ice | |||
| Centrifuge | For centrifugation of 1.7 mL centrifuge tubes at 13,000 x g | ||
| Freezer -80°C | |||
| Precision balance | |||
| Autoclave | For sterilization | ||
| Cryogenic gloves for liquid nitrogen | |||
| Gloves | |||
| Professional forced ventilation and natural air convection oven | For sterilization | ||
| Protease inhibitor cocktail | Sigma aldrich | P8340-5ML | 100X solution |
| ProteoExtract Protein Precipitation Kit | Calbiochem | 539180 | |
| RapiGest | Waters | 186001861 | |
| Cytoscape | www.cytoscape.org | version 2.7 | Software platform for Gene Ontology analysis |
| BiNGO | http://apps.cytoscape.org/apps/bingo | version 3.0.3 | Plugin for Gene ontology analysis |
| AlphaB Crystallin/CRYAB Antibody | Novus Biologicals | NBP1-97494 | Mouse monoclonal antibody against CryAB |
| Septin-11 Antibody | Novus Biologicals | NBP1-83824 | Rabbit polyclonal antibody against septin-11 |
| FHL1 Antibody | Novus Biologicals | NBP-188745 | Rabbit polyclonal antibody against FHL-1 |
| Dermatopontin Antibody | Novus Biologicals | NB110-68135 | Rabbit polyclonal antibody against dermatopontin |
| Goat Anti mouse IgG HRP | Sigma aldrich | A4416-0.5ML | Secondary antibody for immunoblotting |
| Goat Anti rabbit IgG HRP | Bio-Rad laboratories | 170-5046 | Secondary antibody for immunoblotting |
References
- Vogel, C., Marcotte, E. M. Insights into the regulation of protein abundance from proteomic and transcriptomic analyses. Nat Rev Genet. 13 (4), 227-232 (2012).
- de Sousa Abreu, R., Penalva, L. O., Marcotte, E. M., Vogel, C. Global signatures of protein and mRNA expression levels. Mol Biosyst. 5 (12), 1512-1526 (2009).
- Hanash, S. Disease proteomics. Nature. 422 (6928), 226-232 (2003).
- Ahram, M., Petricoin, E. F. Proteomics Discovery of Disease Biomarkers. Biomark Insights. 3, 325-333 (2008).
- Chandramouli, K., Qian, P. Y. Proteomics: challenges, techniques and possibilities to overcome biological sample complexity. Hum Genomics Proteomics. 2009, (2009).
- Singleton, C. Recent advances in bioanalytical sample preparation for LC-MS analysis. Bioanalysis. 4 (9), 1123-1140 (2012).
- Williams, T. H., Jew, J. Y. Is the mitral valve passive flap theory overstated? An active valve is hypothesized. Med Hypotheses. 62 (4), 605-611 (2004).
- Rabkin, E., et al. Activated interstitial myofibroblasts express catabolic enzymes and mediate matrix remodeling in myxomatous heart valves. Circulation. 104 (21), 2525-2532 (2001).
- Martins Cde, O., et al. Distinct mitral valve proteomic profiles in rheumatic heart disease and myxomatous degeneration. Clin Med Insights Cardiol. 8, 79-86 (2014).
- Tan, H. T., et al. Unravelling the proteome of degenerative human mitral valves. Proteomics. 15 (17), 2934-2944 (2015).
- Banfi, C., et al. Proteome of platelets in patients with coronary artery disease. Exp Hematol. 38 (5), 341-350 (2010).
- Banfi, C., et al. Proteomic analysis of human low-density lipoprotein reveals the presence of prenylcysteine lyase, a hydrogen peroxide-generating enzyme. Proteomics. 9 (5), 1344-1352 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J Biol Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Banfi, C., et al. Very low density lipoprotein-mediated signal transduction and plasminogen activator inhibitor type 1 in cultured HepG2 cells. Circ Res. 85 (2), 208-217 (1999).
- Brioschi, M., et al. Normal human mitral valve proteome: A preliminary investigation by gel-based and gel-free proteomic approaches. Electrophoresis. 37 (20), 2633-2643 (2016).
- Brioschi, M., Lento, S., Tremoli, E., Banfi, C. Proteomic analysis of endothelial cell secretome: a means of studying the pleiotropic effects of Hmg-CoA reductase inhibitors. J Proteomics. 78, 346-361 (2013).
- Sun, S., Zhou, J. Y., Yang, W., Zhang, H. Inhibition of protein carbamylation in urea solution using ammonium-containing buffers. Anal Biochem. 446, 76-81 (2014).
- Rabilloud, T., Adessi, C., Giraudel, A., Lunardi, J. Improvement of the solubilization of proteins in two-dimensional electrophoresis with immobilized pH gradients. Electrophoresis. 18 (3-4), 307-316 (1997).
- Santoni, V., Molloy, M., Rabilloud, T. Membrane proteins and proteomics: un amour impossible? Electrophoresis. 21 (6), 1054-1070 (2000).
- Shechter, D., Dormann, H. L., Allis, C. D., Hake, S. B. Extraction, purification and analysis of histones. Nat Protoc. 2 (6), 1445-1457 (2007).
- Fujiki, Y., Hubbard, A. L., Fowler, S., Lazarow, P. B. Isolation of intracellular membranes by means of sodium carbonate treatment: application to endoplasmic reticulum. J Cell Biol. 93 (1), 97-102 (1982).
- Gorg, A., Weiss, W., Dunn, M. J. Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics. Proteomics. 4 (12), 3665-3685 (2004).
- Mann, M., Kelleher, N. L. Precision proteomics: the case for high resolution and high mass accuracy. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18132-18138 (2008).
- Thakur, S. S., et al. Deep and highly sensitive proteome coverage by LC-MS/MS without prefractionation. Mol Cell Proteomics. 10 (8), M110.003699 (2011).
- Loardi, C., et al. Biology of mitral valve prolapse: the harvest is big, but the workers are few. Int J Cardiol. 151 (2), 129-135 (2011).
- Schoen, F. J. Evolving concepts of cardiac valve dynamics: the continuum of development, functional structure, pathobiology, and tissue engineering. Circulation. 118 (18), 1864-1880 (2008).
- Lelovas, P. P., Kostomitsopoulos, N. G., Xanthos, T. T. A comparative anatomic and physiologic overview of the porcine heart. J Am Assoc Lab Anim Sci. 53 (5), 432-438 (2014).
