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Bioengineering

फ्लो साइटोमेट्री द्वारा प्राथमिक मुरीन रेटिनल गंगलायन कोशिकाओं (आरजीसी) का अलगाव

Published: July 5, 2017 doi: 10.3791/55785
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3,4, 1,2
1Department of Ophthalmology, Hamilton Eye Institute, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Microbiology, Immunology and Biochemistry, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmaceutical Sciences, University of Tennessee Health Science Center

Summary

लाखों लोगों को रेटिनल डिगेरेटिव बीमारियों से पीड़ित होता है जिनके कारण अपरिवर्तनीय अंधापन होता है। इनमें से कई रोगों का एक आम तत्व रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (आरजीसी) की हानि है। यह विस्तृत प्रोटोकॉल प्रवाह कोशिकामितीय के साथ सकारात्मक और नकारात्मक चयन द्वारा प्राथमिक मुरुइन आरजीसी के अलगाव का वर्णन करता है।

Abstract

न्यूरोडेगनेरेटिव रोगों का अक्सर प्रभावित लोगों पर एक विनाशकारी प्रभाव पड़ता है। रेटिनल नाड़ीग्रन्थि कोशिका (आरजीसी) हानि सामान्य वृद्धावस्था के अतिरिक्त मधुमेह के रेटिनोपैथी और ग्लूकोमा सहित कई बीमारियों में फैल जाती है। उनके महत्व के बावजूद, आरजीसी को अब तक अध्ययन करना बेहद मुश्किल रहा है क्योंकि इस तथ्य के भाग में यह तथ्य है कि रेटिना में वे विभिन्न प्रकार के कोशिकाओं का केवल एक छोटा प्रतिशत शामिल हैं। इसके अलावा, वर्तमान अलगाव पद्धतियों ने आरजीसी की पहचान करने के लिए इंटरासेल्युलर मार्कर का उपयोग किया है, जो गैर-व्यवहार्य कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं। इन तकनीकों में लंबा अलगाव प्रोटोकॉल भी शामिल है, इसलिए आरजीसी प्राप्त करने और अलग करने के लिए व्यावहारिक, मानकीकृत और भरोसेमंद तरीकों की कमी है। यह काम सकारात्मक और नकारात्मक चयन मानदंड दोनों के आधार पर एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके चूहों की रेटिना से प्राथमिक आरजीसी को अलग करने के लिए एक कुशल, व्यापक, और विश्वसनीय पद्धति का वर्णन करता है। प्रस्तुत तरीकों ने आरजीसी के भविष्य के अध्ययन के लिए, बड़ी समझ को बेहतर ढंग से समझने का लक्ष्य दियादृश्य तीक्ष्णता में गिरावट जो न्यूरोडेनेरेटिव रोगों में कार्यात्मक आरजीसी की हानि से उत्पन्न होती है।

Introduction

आरजीसीएं नतीजतन विभेदित न्यूरॉन्स हैं, और इसलिए, प्रयोग के लिए प्राथमिक कोशिकाओं की आवश्यकता होती है। प्राइमरी मूरीन रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं (आरजीसी) के अलगाव और संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल का विकास, आरजीसी स्वास्थ्य के तंत्रों और इन विट्रो में अधूरेपन को प्रकट करने के लिए मौलिक है। यह अध्ययन के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जो आरजीसी कार्य को बढ़ावा देने और उनकी मृत्यु को कम करने के लिए संभावित उपचार तैयार करना चाहते हैं। आरजीसी के अध: पतन रेटल डिजनजनेटिव बीमारियों से जुड़ा है, जैसे कि ग्लूकोमा, मधुमेह रेटिनोपैथी, और सामान्य उम्र बढ़ने। हालांकि आरजीसी हानि के अधीन विशिष्ट सेलुलर तंत्र स्पष्ट नहीं हैं, जोखिम कारकों की एक श्रृंखला की पहचान की गई है। ऑप्टिक तंत्रिका सिर 1 , 2 , 3 में ऑक्सीजन के अभाव में आरजीसी की मौत 4 का कारण बनता है और उत्तेजना के सक्रियण के बीच होमियोस्टेसिस की परेशानियों के रूप में कार्य करता है और मैंव्यक्तिगत आरजीसी 5 , 6 के भीतर नश्वर रिसेप्टर चुनौतियों की एक श्रृंखला गहन अध्ययन के लिए इन कोशिकाओं के उपयोग की दिशा में प्रगति बाधित है। सबसे पहले, एक मुरिन रेटिना में उपस्थित आरजीसी की संख्या छोटी है। आरजीसी कुल 7 % , 8 , 9 के कुल रेटिनल कोशिकाओं के 1% से कम के लिए खाता है। दूसरा, अधिकांश आरजीसी-विशिष्ट मार्कर इंट्रासेल्युलर प्रोटीन 10 , 11 , 12 हैं । इन मार्करों के आधार पर चयन ने कोशिकाओं को गैर-व्यवहार्य छोड़ दिया है, जो डाउनस्ट्रीम कार्यात्मक विश्लेषण को रोकता है। अंत में, वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल लंबा और मानकीकरण 13 , 14 की कमी है प्रारंभिक आरजीसी अलगाव प्रोटोकॉल इम्युनोपेनिंग विधियों पर आधारित थे। बैरस एट अल 15 क्लासिक इम्यूनॉप अनुकूलितएनिंग तकनीक और एक दूसरे चरण में जोड़ा गया, जिसमें रक्ताल्पता कोशिकाओं के थोक से मोनोसाइट्स और एन्डोथेलियल कोशिकाओं को शामिल किया गया था जो कि थिओमोसाइट एंटीजेन (उर्फ थेय 1), एक सेल-सतह मार्कर के लिए immunopositivity के आधार पर सकारात्मक चयन से पहले होता है। साल बाद, हांग एट अल उच्च शुद्धता के साथ आरजीसी को अलग करने के लिए सेल सॉर्टिंग रणनीतियों के साथ संयुक्त चुंबकीय मनका अलगाव तकनीक कई वैज्ञानिक अनुप्रयोगों में चुंबकीय मोती का उपयोग अभी भी किया जाता है। एक साथ, चुंबकीय मोती और प्रवाह cytometry प्रोटोकॉल पृथक कोशिकाओं की शुद्धता में सुधार। हालांकि, इन शुद्धि प्रणालियां अब तक अलग-अलग रिक्तियां से मुरिन आरजीसी के अलगाव के लिए मानकीकृत नहीं हुई हैं।

प्रवाह cytometry एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक तरीका है जो सेल निलंबन की ऑप्टिकल और प्रतिदीप्ति विशेषताओं को मापता है। कोशिकाओं का मात्रात्मक और गुणात्मक दोनों स्तरों पर संवेदनशीलता का विश्लेषण किया जाता है, जिससे सेल लोकल के बहु-आयामी विश्लेषण प्रदान किया जा सकता है।समझना। सेलुलर भेदभाव दो मुख्य भौतिक गुणों पर आधारित होता है: सेल आकार या सतह क्षेत्र और ग्रैन्यूलिटी या आंतरिक जटिलता 17 । एक बहु-आयामी विश्लेषण फ्लोरोरेम्रोम्स के साथ टैग एंटीबॉडी को जोड़कर किया जा सकता है जो समान उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और अलग-अलग उत्सर्जन करता है। प्रवाह cytometry तेज, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, और संवेदनशील है। Multitpe लेसरों प्रवाह cytometry द्वारा एकल कोशिकाओं के भी अधिक से अधिक बहु आयामी विश्लेषण की अनुमति इस प्रकार, यह कोशिकीय नमूने के अध्ययन के लिए एक आकर्षक पद्धति है प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) अलग-अलग कोशिकाओं में विशिष्ट उप-जननुपातों को क्रमबद्ध करने के लिए फ्लो साइटमैट्री द्वारा पहचाना गया बहु-आयामी फ़िनोटीपिक अंतर का उपयोग करता है।

पिछले दशक में, न्यूरॉन्स सहित कई कोशिकाओं के चयन के लिए कई सतह और इंट्रासेल्युलर प्रोटीन को संभावित बायोमार्कर के रूप में पहचान किया गया है। प्रारंभिक अध्ययन जो चूहों से आरजीसी को अलग करने की मांग करते थे Thy1 एक नाड़ीग्रन्थि सेल के रूप में इस्तेमाल करते थेएल मार्कर दुर्भाग्य से, Thy1, उर्फ सीडी 90 में, अन्य कृंतक प्रजातियों 18 , 1 9 , 20 में एकाधिक ईसोफर्म है और कई रेटिना सेल प्रकार 1 9 , 20 द्वारा व्यक्त की गई है, जिससे यह आरजीसी के लिए एक गैर-विशिष्ट मार्कर बना रहा है। एक अन्य सतह मार्कर, सीडी 48, रेटिना में मोनोसाइटेटिक आबादी पर पाया जाता है, जिसमें मैक्रोफेज और माइक्रोग्लिया शामिल हैं। इन दो सतह के मार्करों का उपयोग करके, एक संशोधित आरजीसी हस्ताक्षर-Thy1 + और CD48 neg कोशिकाएं-विकसित की गईं 15 , 16 , 21 , 22 । दुर्भाग्य से, इन दो चयन मानदंडों को अत्यधिक समृद्ध आरजीसी आबादी के लिए चुनने के लिए पर्याप्त नहीं हैं। इस अपरिवर्तनीय आवश्यकता को पूरा करने के लिए, एक प्रवाह साइटोमैट्री प्रोटोकॉल विकसित किया गया था 23 बहु-स्तरित सकारात्मक और नकारात्मक चयन मानदंडों के आधार परप्राथमिक मूरिन आरजीसी को समृद्ध और शुद्ध करने के लिए ज्ञात सेल सतह मार्कर

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Protocol

निम्नलिखित प्रोटोकॉल में विस्तृत सभी प्रक्रियाएं, टेनेसी हेल्थ साइंस सेंटर (यूटीएससी) विश्वविद्यालय में इंस्टीट्यूशनल एनीमल केयर एंड यूज कमेटी (आईएसीयूसी) रिव्यू बोर्ड द्वारा अनुमोदित की गईं और एसोसिएशन फॉर रिसर्च इन विजन एंड ओप्थल्मोलॉजी (एआरवीओ) स्टेटमेंट्स फॉर यूज प्रयोगशाला पशु प्रयोगों (प्रयोगशाला पशु संसाधन संस्थान, मानवीय देखभाल और सार्वजनिक प्रयोगशाला प्रयोगशालाओं पर जन स्वास्थ्य सेवा नीति) के लिए दिशानिर्देशों के अलावा, नेत्र और विजन अनुसंधान में पशुओं का।

1. उपकरण, समाधान, और मीडिया की तैयारी

नोट: प्रोटोकॉल में रिपोर्ट की गई सामग्री, अभिकर्मक, उपकरण और उपकरणों के बारे में सभी जानकारी सामग्री की तालिका में निर्दिष्ट की गई है।

  1. सभी विच्छेदन उपकरण आटोक्लेव करें और उन्हें बाँझ क्षेत्र में संग्रहीत करें। निम्नलिखित उपकरणों का प्रयोग करें: 4 मानक संदंश (2 लंबी और 2 छोटी) और 2 कैंची,साथ ही विच्छेदन के लिए 2 संदंश (1 लंबी और 1 छोटी) और 1 कैंची; बैकअप के रूप में एक अतिरिक्त सेट रखें
  2. धोने, immunolabeling प्रक्रियाओं, और सेल सॉर्टिंग चरण के दौरान उपयोग करने के लिए 100 एमएल बाँझ पीबीएस / 1% एफबीएस समाधान तैयार करें। समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंडा रखें
    नोट: समाधान में सोडियम एजाइड (नाएन 3 ) को न जोड़ें, क्योंकि यह कोशिकाओं को जीवित करने के लिए विषाक्त हो सकता है।
    1. 99 एमएल पीबीएस और 1 एमएल ऑफ एफबीएस के साथ 100 एमएल की पीबीएस / 1% एफबीएस तैयार करें।
  3. संग्रह और संस्कृति माध्यम के उपयोग के लिए 3% एफबीएस ( सामग्री की सारणी देखें) के साथ पूरक 100 एमएल बाँझ तंत्रिका सेल माध्यम तैयार करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल संस्कृति के मध्यम बाँझ रखें केवल उपयोग करने के पहले कमरे के तापमान (आरटी) में इसे गर्म करें
    1. 3 9 एफआरएस के 97 मिलीलीटर तंत्रिका कोशिका माध्यम के 3 एमएल और 3 एमएल एफबीएस के साथ पूरक 100 मिलीलीटर तंत्रिका सेल माध्यम तैयार करें।
  4. पूर्व-ठंडा संग्रह ट्यूब (15-एमएल ट्यूब) 5 एमएल का संग्रह माध्यम रखकर पूर्व लेपितएक बर्फ की बाल्टी में हेम केवल ट्यूब सतह का पालन करने से कोशिकाओं को रोकने के लिए केवल polypropylene ट्यूब का उपयोग करें।
  5. बायोसाफेटी कैबिनेट में 40 मिमी व्यंजन, 70-माइक्रोन नायलॉन स्ट्रेनर्स, सिरिंज, मस्तिष्क की थैली, और बाँझ पॉलीप्रोपीलीन ट्यूब रखें। प्रक्रियाओं से पहले सभी चीजों को जड़ें और सभी प्रक्रियाओं में एक बाँझ तरीके से उन्हें बनाए रखें।
    नोट: रेटिना के संग्रह के बाद के सभी चरणों को जैव सुरक्षा कैबिनेट में किया जाएगा।

2

नोट: इस प्रोजेक्ट में 10 युवा (5-7 सप्ताह पुरानी) सी 57 बीएल / 6 जे चूहों का उपयोग 1 9 x 10 6 आरजीसी को सीडी 90.2 + सीडी 48 एनजीआर सीडी 15 डेग सीडी 57 एनजी के साथ अलग करने के लिए किया गया था।

  1. गर्भनाल अव्यवस्था के बाद सीओ 2 इनहेलेशन का उपयोग कर चूहों को कुचलना। हमेशा यह सुनिश्चित करने के लिए एक माध्यमिक इच्छामृत्यु विधि का उपयोग करें कि euthanized जानवर मर चुका है।
    2 के विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है केटमाइन की अनुशंसा नहीं की जाती है, क्योंकि यह इंट्रोक्लॉयलर प्रेशर (आईओपी) में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है जब एनेस्थेसिया 24 , 25 के एक उद्यमी के रूप में इस्तेमाल किया जाता है।
  2. आँख के ग्लोब के नीचे संदंश सम्मिलित करें, ऑप्टिक तंत्रिका को पकड़ो, और खींचो; ऑप्टिक तंत्रिका बरकरार के साथ, ग्लोब को शुरू किया जाएगा। पीबीएस युक्त एक शीशी में एकत्र आँखें रखें और अगले चरण तक बर्फ पर शीशी रखें।
    नोट: प्रयोगशाला पशु देखभाल इकाई (एलएसीयू) से उचित प्रशिक्षण प्राप्त करने के बाद कोई भी कर्मचारी इस कदम को पूरा कर सकता है।

3. रेटिना सेल निलंबन की तैयारी

  1. कॉर्नियल विच्छेदन शुरू करने के लिए विच्छेदन माइक्रोस्कोप की बेस प्लेट पर एकत्र की गई आँख रखें। प्रत्येक आँख को अलग-अलग टुकड़े करना
  2. संदंश का उपयोग करके ऑप्टिक तंत्रिका आधार पर दुनिया को ध्यान से रखें। इस कदम के लिए, एक लोन का उपयोग करेंजी, और एक छोटे मानक संदंश
  3. एक 30-गेज (30 जी) तेज सुई का उपयोग कॉर्निया को छिड़कने के लिए जलीय हास्य को आंखों से खाली करने के लिए अनुमति दें, जिससे संदंश के साथ आंख को पकड़ना आसान हो जाता है।
  4. कॉर्निया को संदंश के साथ पकड़ो और कॉर्निया में एक छोटा चीरा बनाने के लिए कैंची का उपयोग करें। संदंश का उपयोग करके कॉर्निया और चक्कर को धीरे से छील कर दें जब विश्व आधा रास्ते पर सूख जाता है, तो संदंश का उपयोग करके रेटिना और लेंस को रोल करें। कॉर्निया, सैक्लेयर, और लेंस को त्यागें
    नोट: यह विधि सुनिश्चित करता है कि रेटिना पूरी तरह से आंख के शेष हिस्सों से अलग हो जाती है।
  5. पीबीएस / 1% एफबीएस वाले एक छोटे 40 मिमी पेट्री डिश में रेटिना रखें
    नोट: पेट्री डिश के विकल्प के रूप में, एक सेल कल्चर डिश का उपयोग किया जा सकता है शारीरिक परिस्थितियों के रूप में, हमेशा रेटिना नमी रखने के लिए सुनिश्चित करें
    1. जैव सुरक्षा कैबिनेट में ताजा बाँझ पीबीएस / 1% एफबीएस के साथ प्रत्येक रेटिना को तीन बार धोएं।
  6. 12 रिटिनाइए तक रखेंएक बाँझ 70-माइक्रोन नायलॉन छलनी पीबीएस / 1% एफबीएस के साथ सिक्त हुआ 10-एमएल सिरिंज के बैक-एंड का उपयोग करके, कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक परिपत्र आंदोलन का उपयोग करके रेटिना को धीरे से मिलाएं।
    1. वैकल्पिक रूप से, सेल स्ट्रेनर मैट्रेशन के लिए मूसल का उपयोग करें या 15 आईयू / एमएल पेजैन, 5 एमएम एल-सिस्टीन, और 200 यू / एमएल डीएनस आई के संयोजन से 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के साथ एंजाइमैटिक पाचन का उपयोग करें, इसके बाद पीबीएस / 10% एफबीएस
      नोट: एंजाइमेटिक पचाने की तुलना सिरिंज के बैक-एंड या मूसल के साथ की गई थी, जब बरामद कोशिकाओं के प्रतिशत में कोई परिवर्तन नहीं देखा गया।
  7. पृथक कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए, polypropylene संग्रह ट्यूब पर बाँझ 70-माइक्रोन नायलॉन छलनी रखें। एक P1000 पिपेट का उपयोग करते हुए छलनी के माध्यम से एकत्रित कोशिकाओं को पास करें। किसी भी शेष कोशिकाओं को रिहा करने के लिए पीबीएस / 1% एफबीएस के साथ छलनी ( चरण 3.6 ) कुल्ला करें और उन्हें संग्रह ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  8. एबीएच में पीबीएस / 1% एफबीएस जोड़ेंप्रति व्यक्ति रेटि 1 एमएल के एक अंतिम मात्रा के अनुसार। 200 xg और आरटी पर 7 मिनट के लिए सेल निलंबन अपकेंद्रित्र
    नोट: मैकेरेटेड रेटिनेई (<6 रेटिनाइ) की संख्या के आधार पर, सेल गोली दृश्यमान होने में बहुत छोटी हो सकती है।
    1. सेल सतह पर तैरनेवाला को त्याग दें और पीबीएस / 1% एफबीएस में सेल गोली resuspend प्रति 5 रेटिना के लिए 1 एमएल के अनुपात का उपयोग करें।
  9. एक हेमोसिटामीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें
    1. 70% अल्कोहल के साथ एक ग्लास हीमोसाइटोमीटर और कंडोलिप को साफ करें। धीरे-धीरे यह सुनिश्चित करने के लिए कि रेटिना सेल निलंबन समान रूप से वितरित किया जाता है, कोशिकाओं से युक्त ट्यूब घूमती है। एक माइक्रोसेंट्रिज्यूज ट्यूब में 20% माइक्रोन का 0.4% ट्राइपैन नीला रखें और सेल निलंबन के 20 μL के साथ मिश्रण करें।
    2. धीरे से मिक्स करें और हेमोजिटोमीटर के लिए 0.4% ट्राइपैन नीली / सेल निलंबन मिश्रण के 10 μL को लागू करें, दोनों कक्षों को भरना; केशिका की कार्रवाई coverslip के तहत 0.4% ट्रिपैन नीली / सेल निलंबन मिश्रण आकर्षित करेगी। माइक्रोस्कोप का प्रयोग करना, सभी ट्राइपैन नीले-नकारात्मक कोशिकाओं की गणना करना; थीएस नंबर लाइव कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है
    3. निम्न सूत्र का उपयोग करके सेल व्यवहार्यता निर्धारित करें: लाइव सेल गणना / कुल सेल संख्या =% व्यवहार्यता
      नोट: यदि कोशिकाओं की व्यवहार्यता 95% से कम है, तो सेल व्यवहार्यता भेदभाव के लिए फ्लोरोसेंट डाई का उपयोग एफएसीएस के दौरान आवश्यक है।
  10. एक फ्लोरोसेंट व्यवहार्यता डाई का प्रयोग करें जो जीवित कोशिकाओं के लिए गैर-पारगम्य है। पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धो लें ताकि सीरम के किसी भी निशान को हटा दें। 100 μL अंतिम मात्रा में 5.0 x 10 6 कोशिकाओं प्रति सेल व्यवहार्यता भेदभाव के लिए फ्लोरोसेंट डाई के 1 μL जोड़ें। 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते, प्रकाश से सुरक्षित। पीबीएस / 1% एफबीएस की मात्रा 10x जोड़ें 200 मिनट और आरटी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र
  11. यदि आवश्यक हो तो 4 डिग्री सेल्सियस पर सेल निलंबन को रातोंरात सेते रहें यदि यह किया जाता है, तो पीबीएस / 1% एफबीएस की बजाय सेल सेलुलर ट्यूब को न्यूरल सेल के माध्यम से भरें। ट्यूब को क्षैतिज रूप से रखें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।

4. फिर से immunolabelingटिनल सेल

  1. प्रति सेल एंटीबॉडी की मात्रा निर्धारित करने के लिए निम्न रूपांतरण का उपयोग करें: प्रति 100 μL मात्रा में 5.0 x 10 6 कोशिकाओं प्रति 2 μL एंटीबॉडी।
  2. कोशिकाओं को धोएं और उन्हें पीबीएस / 1% एफबीएस में बनाए रखें सॉर्ट सेटअप के समय नकारात्मक नियंत्रण (unlabeled) के रूप में उपयोग करने के लिए कोशिकाओं (5.0 x 10 6 कोशिकाओं) के एक छोटे से विभाज्य लो।
    नोट: यह नकारात्मक नियंत्रण सेल सॉर्टर के उचित अंशांकन के लिए महत्वपूर्ण है।
  3. एफसीआईपी रिसेप्टर II और III को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को कम करने के लिए, पीबीएस / 1% का उपयोग करके 50-μL अंतिम मात्रा में एक एंटी-माउस सीडी 16/32 एंटीबॉडी प्रति 1.0 x 10 6 कोशिकाओं को जोड़ें। एफबीएस। आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं
  4. नमूना में एंटीबॉडी कॉकटेल जोड़ें और pipetting द्वारा धीरे मिश्रण। एक बर्फ की बाल्टी में 30 मिनट के लिए सेते हैं। सुनिश्चित करें कि बर्फ की बाल्टी को कवर किया गया है, क्योंकि प्रकाश फ्लोरो के फोटोबलीचिंग के कारण प्रयोग से समझौता कर सकता हैphores।
    1. निम्नलिखित फ्लोरोसेंटली टैग एंटी-माउस एंटीबॉडी का उपयोग करके एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें: CD90.2 एफ़ -700, सीडी 48 पीई-साइनाइन 7, सीडी 15 पीई, और संयुक्त राष्ट्र-टैग सीडी 57।
      नोट: प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए, 5.0 x 10 6 कोशिकाओं प्रति निम्नलिखित सांद्रता का उपयोग करें: CD90.2 AF700, 1 μg; सीडी 48 पीई-साइनाइन 7, 0.4 माइक्रोग्राम; सीडी 15 पीई, 0.02 माइक्रोग्राम; और अन-टैग किया गया सीडी 57, 0.4 माइक्रोग्राम।
      1. निम्न गणना के अनुसार मात्रा का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉड्स के आधार पर): कुल 5.0 x 10 7 कोशिकाओं को लेबल किया जाना; 5.0 x 10 6 कोशिकाओं के प्रति 2 μL = प्रत्येक एंटीबॉडी के 20 μL; 4 अलग एंटीबॉडीज = 80 μL एंटीबॉडी कॉकटेल; अंतिम मात्रा = [(5.0 x 10 7 कुल कोशिकाओं) /5.0 x 10 6 कोशिकाओं] x 100 = 1,000 μL; 80 μL AB + 50 μL विरोधी माउस सीडी 16/32 + 870 μL पीबीएस / 1% एफबीएस = 1,000 μL
        नोट: यह संयोजन प्रदान की गईसाधन कॉन्फ़िगरेशन के लिए फ्लोरोरेम्रोम का इष्टतम संयोजन निम्न पैरामीटर उत्सर्जन और उत्तेजना का सार: एएफ -700, 719 एनएम का उत्सर्जन जब 638-एनएम लाल डायोड लेजर के साथ उत्साहित है; पीई-साइनाइन 7, 767 एनएम का उत्सर्जन जब 488-एनएम ब्लू डायोड लेजर के साथ उत्साहित हो; और पीई, 575 एनएम का उत्सर्जन जब 488 एनएम ब्लू डायोड लेजर के साथ उत्साहित है।
  5. 30 मिनट के ऊष्मायन के बाद, पीबीएस / 1% एफबीएस का इस्तेमाल करते हुए 5 एमएल तक की मात्रा लाएं। नमूनों को उन्हें 200 xg और आरटी पर 7 मिनट के लिए सेंटीफ्यूगिंग करके धोएं। सभी अनबाउंड एंटीबॉडी को हटाने के लिए एक बार प्रक्रिया दोहराएं
  6. 2 μL माध्यमिक एंटीबॉडी (0.1 माइक्रोग्राम) जोड़ें, जो 5.0 x 10 6 कोशिकाओं के सीडी 57 को बाँध देगा। चरण 4 के रूप में, एक बर्फ की बाल्टी में 30 मिनट सेते हैं। कदम 4.5 के रूप में, दो बार कोशिकाओं को धो लें।
    1. स्टेप 4.4 में एक गैर-टैग प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया गया था, तो द्वितीयक एंटीबॉडी वाली कोशिकाओं को लेबल करना।
      नोट: दूसराइस कॉन्फ़िगरेशन के लिए पसंद की एरी एंटीबॉडी सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध है; इसमें 421 एनएम का उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य है। 405 एनएम पर वायलेट डायोड लेजर के साथ उत्साहित जब 450/50 एनएम के एक bandpass फिल्टर के साथ इसका इस्तेमाल करें।
    2. निम्न गणना के अनुसार मात्रा का उपयोग करें ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध वाणिज्यिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी के आधार पर): प्रति 5.0 ± 10 x 6 कोशिकाओं = 20 μL माध्यमिक एंटीबॉडी के 2 μL; अंतिम मात्रा = [(5.0 x 10 7 कुल कोशिकाओं) /5.0 x 10 6 कोशिकाओं] x 50 = 500 μL; 20 μL एब्स + 480 μL पीबीएस / 1% एफबीएस = 500 μL
  7. पीबीएस / 1% एफबीएस में लेबल वाली कोशिकाओं को रखें एक हेमोसाइटेटोमीटर का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना करें; 3.0 - 4.0 x 10 7 कोशिकाओं / एमएल के अंतिम रेटिना सेल एकाग्रता का उपयोग करें।
    नोट: कोशिका संस्कृति माध्यम का उपयोग कोशिकाओं को पतला करने के लिए न करें क्योंकि फिनोल लाल ऑटोरफ़्लोरेसेंस को बढ़ा सकता है, जिससे नकारात्मकता के बीच संकल्प को कम किया जा सकता हैIve और सकारात्मक कोशिकाएं प्रति खंड की अंतिम सेल एकाग्रता अत्यधिक साधन विन्यास की मात्रा प्रवाह दर पर निर्भर करती है।
  8. फ्लोरोसेंस स्पिलोवर को कम करने के लिए सेटअप के दौरान एकल-रंग नियंत्रण का उपयोग करें।
    नोट: यह कदम, जिसे मुआवजे के रूप में भी जाना जाता है, फ्लोरोफोर्स के संयोजन द्वारा बनाई गई शोर को ठीक करने के लिए लागू किया गया है। पीबीएस / 0.1% बीएसए / 2 एमएम ना एनएन 3 में पॉलीस्टाइनिन माइक्रोज़र, जिसमें फ्लुरोसेंटली टैग इम्युनोग्लोब्युलिन (आईजी) के कई प्रकार की प्रजातियां हैं, मुआवजे को निर्धारित करने के लिए सकारात्मक नियंत्रण प्रदान करते हैं।
    1. बाँझ एफएसीएस ट्यूबों में पॉलीस्टाइन माइक्रोस्फेरस के 3 बूंदों को रखें, एक प्रति फ्लोरोफोरे आवंटित करें। प्रत्येक ट्यूब में संबंधित फ्लोरोफोर के 1 माइक्रोग्राम जोड़ें। आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते, रोशनी से सुरक्षित। नमूना ट्यूबों में 3 एमएल की पीबीएस / 1% एफबीएस जोड़ें। 200 मिनट और आरटी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 250 μL पीबीएस / 1% एफबीएस में सतह पर तैरने वाले और रेसस्पेंड को ध्यान से हटा दें।
    2. नकारात्मक contr सेट करने के लिएओएलएल, पोलीस्टाइनिन माइक्रोस्फेर का प्रयोग करें जो आईजी को बाँध नहीं करते हैं यदि आवश्यक हो, तो इससे पहले एक दिन पहले यह कदम उठाएं।

5. सेल वर्गीकरण रणनीति

नोट: 355 एनएम, यूवी के साथ एफएसीएस के लिए उपकरण सेटअप के लिए विशिष्ट निर्देश; 405 एनएम, वायलेट; 488 एनएम, नीला; और 640 एनएम, क्रमशः 2, 2, 5, और 3 प्रतिदीप्ति चैनल वितरण वाले लाल लेसरों। ऑपरेटिंग सॉफ्टवेयर DIVA संस्करण 8.0.1 था। सेल सॉर्टिंग को 70 माइक्रोन नोजल, 70 साई शीथ दबाव, 87.5 आवृत्ति, 48.6 आयाम के साथ 333 में पहला ड्रॉप ब्रेकऑफ के साथ किया गया था, 6 की आसेटिंग के साथ, डिफॉल्ट (32) शुद्धता मुखौटा के साथ चार तरह की पवित्रता के लिए सेट की गई, और ड्रॉप मोतियों का इस्तेमाल करते हुए 42.98 में समायोजित विलंब

  1. संग्रह वाहिकाओं के रूप में 15-एमएल पॉलीप्रोपीलीन सीनेटिक ट्यूबों का उपयोग करें। प्रत्येक ट्यूब में संग्रह माध्यम (कोशिका संस्कृति माध्यम) का 5 एमएल जोड़ें और ट्यूब को कोट को दीवारों पर घुमाएं।
    नोट: यह कदम टी के पक्षों से चिपके हुए से कोशिकाओं को रोकता हैवह संग्रह ट्यूब एक विकल्प के रूप में, ट्यूब को undiluted FBS के साथ लेपित किया जा सकता है।
  2. कोशिकाओं के अंतिम उपज का अनुमान लगाने के लिए सेल सॉर्टर की दक्षता को ध्यान में रखें।
    नोट: प्रकार की दक्षता प्रयुक्त प्रवाह cytometer के आधार पर भिन्न होती है। CD90.2 + CD48 neg सीडी 15 निग सीडी 57 नकारात्मक फेनोटाइप के साथ आरजीसी सभी रेटिनल कोशिकाओं के लगभग 1% शामिल हैं।
  3. एक प्रशिक्षित ऑपरेटर (आमतौर पर एक कोर सुविधा में) द्वारा सेल वर्गीकरण किया गया है नमूना अधिग्रहण से पहले यह सुनिश्चित करें कि उपकरण को साफ किया गया और 70% इथेनॉल के साथ निष्फल हो गया। ध्यान से 70% इथेनॉल के साथ संग्रह ट्यूबों के बाहर पोंछते हैं।
  4. यदि कक्षों को तय या एकत्रित किया गया है, तो कोशिकाओं को ऊपर और नीचे पिपेट कर और अधिग्रहण से पहले एक बाँझ 40-माइक्रोन नायलॉन छलनी के माध्यम से निलंबन फ़िल्टर करें। सुनिश्चित करें कि तापमान को नियंत्रित करें और इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जबकि सेल वर्गीकरण किया जा रहा है; ऐसा करने में विफलता सेएल कम हो जाएगाएल उपज
  5. प्रयोग करने से पहले सेल सॉर्टर ऑपरेटर के साथ सॉर्ट के विवरण पर चर्चा करें।
    नोट: प्रयोग के समय, सेल सॉर्टर ऑपरेटर साइटोमीटर के लिए अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के वर्कस्पेस टूलबार से कई बटनों को क्लिक करेगा। ये ब्राउज़र , साइटोमीटर , इंस्पेक्टर , वर्कशीट और अधिग्रहण डैशबोर्ड हैं । यहां इस्तेमाल की जाने वाली सेल सॉर्टिंग की रणनीति को 2-रास्ता प्रकार के रूप में जाना जाता है दो आबादी एकत्र की जाती हैं: समृद्ध आरजीसी और अन्य सभी प्रकार के सेल यदि अतिरिक्त जनसंख्या एकत्रित की जानी है, तो दो अतिरिक्त आबादी तक 4-रास्ता प्रकार के रूप में पृथक किया जा सकता है यदि अतिरिक्त आबादी एकत्र की जाएगी, तो सेल सॉर्टर को अलग-अलग संग्रह ट्यूबों और सेटअप की आवश्यकता होती है।
  6. फ्लोरोफोर्स से वर्णक्रमीय ओवरलैप के लिए सही मुआवजा करें
    नोट: इस प्रक्रिया को समायोजित करके मैन्युअल रूप से किया जा सकता हैप्रत्येक सेटिंग को स्थापित करना, या इसे उपयोग में सॉफ़्टवेयर के हिस्से के रूप में स्वचालित रूप से किया जा सकता है। सेल सॉर्टिंग उपकरण के लिए अधिकांश सॉफ्टवेयर एक स्वचालित मुआवजे का विकल्प है। इसे सोने के मानक और मुआवजे का सबसे सटीक प्रकार माना जाता है। नकारात्मक (कोई फ्लोरोफोरे) नमूना नहीं है और पॉलीफेरीन माइक्रोस्फेरस (मुआवजा मोती) के साथ तैयार किए गए एकल नियंत्रण विशेष रूप से प्रयोग में उपयोग किए जाने वाले सभी प्रासंगिक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी को बांधने के लिए इस चरण में उपयोग किए जाएंगे।
    1. प्रयोग> मुआवज़ा सेटअप> मुआवजा नियंत्रण बनाएं चुनें। स्क्रीन में प्रदर्शित सूची से फ्लोरोफोरे-विशिष्ट नियंत्रण जोड़ें। ठीक क्लिक करें
      नोट: प्रत्येक नियंत्रण के लिए एक मुआवजा ट्यूब प्रदर्शित किया जाएगा।
      1. फॉरवर्ड-बिखरे हुए प्रकाश (एफएससी), साइड-बिखरे हुए प्रकाश (एसएससी) को सत्यापित करने के लिए और प्रारंभिक आबादी (पी 1) के द्वार तक एक अनलेैबैड नियंत्रण (कोई फ्लोरोफोरे, चरण 4.2 ) का उपयोग करें।
    2. नकारात्मक नियंत्रण ट्यूब को साइटमीटर पर स्थापित करें और लोड करें पर क्लिक करें। सत्यापित करें कि ब्याज की जनसंख्या प्रदर्शित की जाती है और इसे चुनें। यह जनसंख्या 1 (पी 1) है। P1 गेट पर राइट-क्लिक करें और सभी मुआवजा नियंत्रणों पर लागू करें चुनें। रिकॉर्ड डेटा पर क्लिक करें रिकॉर्डिंग पूर्ण होने के बाद, अनलोड करें और ट्यूब को निकालें पर क्लिक करें।
    3. स्क्रीन पर प्रदर्शित होने वाली साइटोमीटर पर अगली ट्यूब स्थापित करें। चरण 5.6.2 दोहराएं जब तक सभी नियंत्रणों के सभी डेटा दर्ज नहीं किए जाते हैं।
    4. प्रयोग करें > क्षतिपूर्ति सेटअप> मुआवजा की गणना करें सेटअप सहेजें और प्रयोग का नाम दें। लिंक और सहेजें पर क्लिक करें
      नोट: मुआवजा एक आवश्यक कदम है, क्योंकि यह डिटेक्टरों के बीच स्पेक्ट्रम ओवरलैप को निकालता है।
    5. यदि मैनुअल मुआवजे की जरूरत है, तो सकारात्मक संकेतों के माध्यम से समायोजित करें ताकि वे ईएसी के लिए नकारात्मक होफ्लोरोरेक्रोम का एच इस्तेमाल किया।
      नोट: यह चरण सेल सॉर्टर ऑपरेशन द्वारा किया जाता है और इसमें 30 मिनट लग सकते हैं।
  7. गेटिंग रणनीति ( चित्रा 3 ए )
    1. एसएससी बनाम एफएससी की साजिश रचने से पी 1 सेट करें; एफएससी आकार का संकेत है और एसएससी कोशिकाओं की आंतरिक जटिलता को इंगित करता है। चित्र 3 ए देखें
    2. चरण 5.7.1 (पी 1) में चयनित आबादी का उपयोग करते हुए एसएससी-एच (ऊंचाई) बनाम एसएससी-डब्ल्यू (चौड़ाई) के एक छद्मलकलॉट प्लॉट को खींचें; एक दूसरे के सापेक्ष कोशिकाओं के घनत्व के दृश्य प्रतिनिधित्व के लिए छद्मलकल प्लॉट की अनुमति देता है।
      नोट: निचले सेल घनत्व को नीले और हरे रंग से दर्शाया जाता है, जबकि लाल और नारंगी क्षेत्र उच्च कोशिका घनत्व का प्रतिनिधित्व करते हैं।
      1. केवल एकल कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए इस कदम को पूरा करें; एकल कक्ष गेट को पी 2 कहा जाता है। चित्र 3 ए देखें
    3. चरण 5.7.2 को दोहराएंभूखंड एफएससी-एच बनाम एफएससी-डब्ल्यू पी 2 का उपयोग करते हुए सुनिश्चित करें कि "डबल" या सेल क्लंप के रूप में एकल कोशिकाओं के चयन में एक सकारात्मक और नकारात्मक मार्कर दोनों शामिल हैं, जो झूठी सकारात्मकता प्रदान करते हैं।
    4. सीडी 7 9 बनाम सीडी 4 9 8 के एक छद्मलकलॉट प्लॉट को बनाएं। आरजीसी संवर्धन से मोनोसाइट्स को खत्म करने के लिए सभी सीडी 90.2 + सीडीआईएएल सेग कोशिकाओं का चयन करें; इस गेट सीडी 090.2 + सीडी 4 9 , या पी 3 को कॉल करें। चित्र 3 ए देखें
    5. चयनित सीडी 90.2 + सीडी 4 9 नकारात्मक जनसंख्या या पी 3 गेट का उपयोग करना, सीडी 557 बनाम सीडी15 की सीड्यूडोकोलोर प्लॉट को आरजीसी संवर्धन से एमैट्रिन सेल संदूषकों को खत्म करने के लिए खींचें। गेट सीडी 15 नेग CD57 neg जनसंख्या चित्र 3 ए देखें
  8. "क्रमबद्ध लेआउट" विंडो में नमूने के लिए जनसंख्या को एकत्रित करने के लिए परिभाषित करें और सेल सॉर्टिंग के साथ आगे बढ़ें; जमा करने के लिए नमूना CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg है p>।
    नोट: आबादी को सॉर्ट करने के लिए सॉर्ट विंडो में ड्रॉप-डाउन ऐड मेन्यू से चुना गया है। आबादी को जोड़ने के बाद, यह लक्षित घटनाओं के लिए पूछेगा या कितनी घटनाएं एकत्रित की जानी चाहिए। किसी भी समय, सॉर्ट लेआउट को जनसँख्या युक्त क्रमबद्ध स्थान फ़ील्ड पर क्लिक करके संपादित किया जा सकता है। फ़िनोटाइप सीडी 090.2 + सीडी 4 9 सीडी 15 ओग सीडी 57 एनजी 0.9% ± 0.3 आरजीसी के साथ युवा (5-7 सप्ताह पुरानी) और 0.5% ± 0.3 और पुराने (> 12 महीने पुरानी) सी 57 बीएल / 6 जे 23 चूहों के साथ मिलते हैं।
  9. 25,000 कोशिकाओं का उपयोग करते हुए, शुद्धता जांच 23 करें आकृति 3-बी देखें
    नोट: सेल्युलर की सटीकता को सत्यापित करने के लिए सॉर्ट किए गए कक्षों का पुनः विश्लेषण करने के लिए शुद्धता जांच प्रक्रिया है। सॉर्ट किए गए कक्षों का एक छोटा विभाज्य सॉर्ट के प्रभाव को सत्यापित करने के लिए साइटोमीटर पर लोड किया जाएगा।
6. आरजीसी इंट्ररासेलुलर मार्करों पर पुष्टि

  1. इंट्रासेल्युलर लेबलिंग
    1. 1 घंटे के लिए क्रमबद्ध कोशिकाओं को ठीक करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर परिमेय करें ताकि कोशिकाओं को मेटाबोलिक रूप से निष्क्रिय किया जा सके और इंट्रासेल्युलर एंटीबॉडी के प्रवेश की अनुमति दें।
    2. Permeabilization समाधान में निम्नलिखित एंटीबॉडी पतला: एकाधिक splicing (आरबीपीएमएस) के साथ एंटी-आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन 100 μg / एमएल स्टॉक में 1: 100 कमजोर पड़ने पर; एंटी-सिंक्यूक्लिइन गामा (एसएनसीजी), 1: 100 1 एमजी / एमएल स्टॉक में; मस्तिष्क विशिष्ट होमबोक्स / पीओओ डोमेन प्रोटीन 3 ए (बीआरएन 3 ए), 1: 100 में 200 माइक्रोग्राम / एमएल स्टॉक; और एंटी-न्यूरॉन-विशिष्ट वर्ग III बीटा ट्यूबलिल (टीयूजे 1), 1: 100 एक 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक में। एक कवर बर्फ बाल्टी में 1 घंटे के लिए कोशिकाओं और एंटीबॉडी समाधान सेते हैं।
    3. पीबीएस / 1% एफबीएस के साथ नमूनों को दो बार धो लें
    4. बर्फ की बाल्टी में 30 मिनट के लिए 1: 200 कमजोर पड़ने पर उपयुक्त एएफए 488 टैग किए गए माध्यमिक एंटीबॉडी में कोशिकाओं को फिर से खोलें।
    5. चरण 6.1.3 के रूप में नमूनों को धो लें । कोशिकाओं को अंदर रखेंविश्लेषण करने के लिए तैयार होने तक पीबीएस / 1% एफबीएस (250 μL)

7. qPCR विश्लेषण द्वारा क्रमबद्ध सेल के सत्यापन

नोट: चित्रा 4 देखें

  1. आरएनए निष्कर्षण 23
    1. क्लोरोफॉर्म के अलावा, सेल lysis और homogenization द्वारा 5.0 एक्स 10 5 सॉर्टेड कोशिकाओं से आरएनए निकालें।
    2. स्पिन कॉलम में एकाग्रता को निकालने के बाद शराब के लिए एक साफ माइक्रोट्रूज़ में ऊपरी, रंगहीन चरण को स्थानांतरित करें। स्तंभ पर DNse पाचन प्रदर्शन करें
    3. आरएनए अल्युशन के लिए आरएनज मुक्त पानी के साथ स्तंभ धो लें।
    4. स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा आरएनए एकाग्रता का आकलन करें
  2. सीडीएनए संश्लेषण और पूर्व-प्रवर्धन
    1. 100 एनजी आरएनए सामग्री का उपयोग करें और रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ एंजाइम, पुनः संयोजक रिबोन्यूकेस अवरोधक (आरएनए डिग्रेडेशन से बचने के लिए), मैग्नीशियम क्लोराइड (एमजीसीएल 2 ), और डॉक्सिनक्लियोक्लाइड्स।
    2. ट्यूब की सामग्री को मिलाएं और 25 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए और 42 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए सेते हैं। 85 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के ऊष्मायन के साथ प्रतिक्रिया समाप्त करें उपयोग करने के लिए तैयार होने तक परिणामी सीडीएनए -20 डिग्री सेल्सियस को स्टोर करें।
      नोट: सीडीएनए सामग्री को -20 डिग्री सेल्सियस पर एक महीने तक जमा किया जा सकता है अगर पूर्व-प्रवर्धन कदम तुरंत नहीं किया जा सकता है।
  3. सीडीएनए का पूर्व-प्रवर्धन
    1. रेडियल नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं, एमैकार्इन कोशिकाओं, एस्ट्रोसाइट्स, म्युलर, द्विध्रुवी, क्षैतिज, फोटोरिसेप्टर, और रेटिना वर्णक उपकला कोशिकाओं के लिए, जिनमें रेफरल 23 और संदर्भ में विस्तृत बताया गया है, के लिए विशिष्ट प्राइमरों की एक श्रृंखला का उपयोग सीडीएनए सामग्री को पूर्व बढ़ाएं। सामग्री का
      नोट: पूर्व-प्रवर्धन प्रतिक्रिया मात्रा का ठहराव के लिए पहचान की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए तैयार है। पूर्व प्रवर्धन प्रतिक्रिया में प्राइमर का मिश्रण होता हैसामग्री की तालिका से घोला जा सकता है; सीडीएनए की 2.5 μL, जो आरएनए की 100 एनजी पर शुरू हुई; रिवर्स ट्रांस्क्रिप्टेज़ एंजाइम; और 10 μL की अंतिम मात्रा में न्युकेलेज मुक्त पानी।
    2. 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एंजाइम सक्रियण कदम उठाएं, 15 चक्रों के लिए 14 चक्रों को 95 डिग्री सेल्सियस और उसके बाद 60 डिग्री सेल्सियस 4 मिनट के लिए। ट्रिस EDTA बफर में पूर्व-प्रवर्धित सामग्री 1:10 को पतला करें और उपयोग के लिए तैयार होने तक इसे -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  4. 7.4 qPCR प्रतिक्रिया
    1. पतले, पूर्व-प्रवर्धित सीडीएनए (2.5 μL), प्राइमरों ( सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध), न्युकले-मुक्त पानी, और डीएनए पोलीमरेज़ और डॉक्सिनक्लियोक्लाइड्स के साथ ध्यान केंद्रित करके 10 μL अंतिम मात्रा में सभी qPCR प्रतिक्रियाओं को तैयार करें।
    2. QPCR चलाने के लिए निम्नलिखित उपकरण की स्थिति का उपयोग करें: 2 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस के एक पकड़ चरण, 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के बाद 15 डिग्री के लिए कुल 40 चक्र 95 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस चलाएं। सभी माप को पूरा करेंतीन की प्रतिकृतियां में एमेंट्स
    3. हाउसकीपिंग जीन के लिए सी टी के मूल्यों और प्रत्येक नमूने में लक्ष्य जीन के निर्धारण के बाद तुलनात्मक सीमा (सी टी ) का उपयोग करके सापेक्ष मात्रा का निर्धारण करना। निम्नलिखित समीकरण का उपयोग करके रिश्तेदार गुना परिवर्तन (आर क्यू ) की गणना करें: आर क्यू = 2 टी- टीसी , जहां एसी टी = सी टी लक्ष्य जीन - सी टी संदर्भ जीन 23
      नोट: सी टी को पीसीआर चक्र के रूप में परिभाषित किया जाता है जिस पर रिपोर्टर डाई के फ्लोरोसेंट संकेत एक मनमाने ढंग से रखा थ्रेसहोल्ड 26 को पार करता है। सी टी प्रतिकूल प्रतिक्रिया में amplicon (पीसीआर उत्पाद) की मात्रा से संबंधित है।

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Representative Results

आरजीसी का गहराई से अध्ययन कई कारकों से बाधित है, जिसमें उनकी कम आवृत्ति और उनके अलगाव के लिए एक मजबूत और मानकीकृत पद्धति की कमी है। चित्रा 1 चित्रा 1 रेटिनाई अलगाव के लिए इस्तेमाल की जाने वाली पद्धति को दर्शाता है। न्यूक्लेक्शन प्रक्रिया में बदलाव विश्लेषण प्रकार के आधार पर मौजूद हैं, जैसे कि एन्यूक्लेक्शन विवो प्रयोग 27 का हिस्सा है। इस प्रोटोकॉल में न्यूक्लेक्शन euthanized चूहों पर किया जाता है। जैसा कि चित्रा 1 ए- बी में दिखाया गया है, संदंश आंखों के नीचे रखे जाते हैं और खून बहने के लिए कम से कम खून बह रहा है और एक अक्षत ऑप्टिक तंत्रिका के साथ एक आंखों को दूर करने के लिए खींचा जाता है।

विभिन्न माउस उपभेदों में आरजीसी की संख्या में अंतर मौजूद है, विशेषकर आनुवंशिक रूप से परिवर्तित चूहों 23 , 28 ,2 9 , 30. इन भिन्नताओं की जागरूकता महत्वपूर्ण है जब चूहों की संख्या का निर्धारण किया जाता है। पुराने सी 57 बीएल / 6 जे चूहों से रेटिना में उनके छोटे समकक्षों की तुलना में कम रेटिनल कोशिकाएं हैं। इसलिए, रेटिना विच्छेदन सावधानी से किया जाना चाहिए रेटिना विच्छेदन के लिए एक कदम-दर-चरण प्रक्रिया चित्रा -1 सी- जे में प्रस्तुत की जाती है। रेटिना कोशिकाएं नाजुक होती हैं, इसलिए विच्छेदित रेटिनना नायलॉन छलकों में रखी जाती हैं और एक सिरिंज के पीछे की ओर या तो के साथ संकीर्ण होती है चित्रा 2 ए में दिखाया गया है, या सेल स्ट्रेनर्स के लिए मस्तूल के साथ। कोशिका झरनी में सीधे कोशिकाओं का मरोड़ा तेजी से होता है और सेल क्लंप को कम करता है। सेल निलंबन की एक प्रतिनिधि छवि चित्रा 2 बी में सचित्र है। एकाधिक आंतरिक रेटिना कोशिकाओं को देखा जा सकता है। इस बिंदु पर, आरजीसी ने अपने हस्ताक्षर morpholo खो दिया हैकोशिका अलगाव के दौरान कुंडली और सेल निलंबन की तैयारी के कारण gy।

इस पद्धति का सबसे श्रम-गहन कदम सेल सॉर्टिंग सेटअप है। यह चरण बहुरंगा एफएसीएस के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम है, क्योंकि यह सिग्नल-टू-शोर रेज़ोल्यूशन को अधिकतम करता है। चित्रा 3 ए आरजीसी के अलगाव के लिए इस्तेमाल की गई gating रणनीति को दर्शाता है। इस रणनीति ने सेल निलंबन से दूषित कोशिकाओं को हटाने का लक्ष्य रखा था, जिसमें मोनोसाइट, ग्लियाल, एमैट्रिन और फोटोरिसेप्टर कोशिकाएं शामिल थीं। कार्यप्रणाली के हिस्से के रूप में, अपवर्जन रणनीति के हिस्से के रूप में उपयोग किए जाने से पहले अतिरिक्त सतह मार्करों को इम्युनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण द्वारा पुष्टि किया गया था। पिछला डेटा दिखाता है कि CD90.2 + कोशिकाओं का एक छोटा प्रतिशत CD48 + है । इन कोशिकाओं के बहिष्करण ने रेटिना सेल पूल से मोनोसाइट्स और संभवतः माइक्रोग्लिया को हटा दिया। यह पहले से दिखाया गया है कि क्लासिक Thy1 + CD48 neg 23 की पहचान और पृथक करने के लिए पर्याप्त नहीं है, क्योंकि इन कोशिकाओं को एमाइक्रन, म्युलर, द्विध्रुवी, क्षैतिज फोटोरिसेप्टर, और रेटिना रंगद्रव्य उपकला कोशिकाओं ( चित्रा 4 ए ) से जुड़े जीन प्रकट होते हैं। यह आगे सेल बहिष्करण के लिए अतिरिक्त मार्करों की जांच करके संबोधित किया गया है। सीडी 15 को एमाकिरिन और द्विध्रुवी कोशिकाओं 31 के एक मार्कर के रूप में वर्णित किया गया है, जो नकारात्मक चयन के लिए एक अतिरिक्त मार्कर के रूप में इसका उपयोग करने के लिए प्रेरित करता है। Uusitalo एट अल से काम 32 glial कोशिकाओं और फोटोरिसेप्टर के लिए एक पहचान चिह्नक के रूप में वर्णित CD57। इसलिए, यह एंटीबॉडी सेल सॉर्टिंग रणनीति में जोड़ा गया था

इसके बाद, इन कोशिकाओं को मूरीन आरजीसी के अलगाव के लिए पद्धति को मान्य करने के लिए विशेषता थी। सीडी 90.2 + सीडी 4 9 सीडी 15 ओग सीडी 57 एनएजीएल के फेनोटाइप सेल (<मजबूत वर्ग = "xfig"> चित्रा 3 बी) आरजीसी 10 , 11 , 12 , 33 : एसएनसीजी, बीआरएन 3 ए, टीयूजे 1 और आरबीपीएमएस से जुड़े निम्नलिखित इंट्रासेलुलर मार्करों की अभिव्यक्ति के लिए मूल्यांकन किया गया था। जैसा कि चित्रा -3 सी में दिखाया गया है, सॉर्टेड कोशिकाओं ने सभी चार आरजीसी-जुड़े इंट्रासेल्युलर प्रोटीन व्यक्त किए। अगला, इमेजिंग फ्लो साइटोमैट्री का प्रयोग चित्रा 3 डी में आरबीपीएमएस के इंटरेसेल्युलर लोकिकीकरण और सीडी90.2 की सेल की सतह अभिव्यक्ति दिखाने के लिए किया गया था। इन परिणामों का परीक्षण कई साइटोमीटर प्रणालियों में किया गया, जिससे पुनरुत्पादन और मानकीकरण की पुष्टि की गई। जैसा कि चित्रा 3 ई में दिखाया गया है, कुछ क्रमबद्ध कोशिकाओं ने इन विट्रो सेल संस्कृति में आरजीसी से जुड़े आकारिकी दिखाना शुरू किया।

अन्त में, संवर्धन और सीईई से पहले की कोशिकाओं की तुलनाQPCR विश्लेषण द्वारा विश्लेषण किया जाएगा सीडी 90.2 + सीडी 4 99 सीडी15 नेग सीडी 57 एनएजीक नेक के कोशिकाओं के लिए Thy1 + CD48 neg phenotype की तुलना में पता चला है कि Thy1 + CD48 neg phenotype आरजीसी से जुड़े जीन को व्यक्त करता है, लेकिन अन्य रेटिनल कोशिकाओं के साथ भी। हालांकि, अत्यधिक समृद्ध सॉर्टेड सेल आबादी ( चित्रा 4 बी ) ने आरजीसी -विशिष्ट इंट्रासेल्युलर मार्कर एसएनसीजी (एसएनसीजी), पीओएफ 4 एल (बीआरएन 3 ए), टीबजे 3 ( टीयूजे 1 ), और आरबीपीएमएस (आरबीपीएमएस) के लिए जीन कोडन में कई गुना वृद्धि दिखायी है। सामूहिक रूप से, एमआरएनए और प्रोटीन मूल्यांकनों ने पद्धति को मान्य किया।

आकृति 1
चित्रा 1 रेटिना अलगाव के लिए एन्यूक्लेक्शन और ओकुलर डिसेक्शन। यंग सी 57 बीएल / 6 जे चूहों को पूर्व में euthanized थेसीओ 2 और ग्रीवा अव्यवस्था के साथ आंखों का ग्लोब हटाने ए) आंखों के नीचे स्थान संदंश और आंख को एक आंदोलन में खींचें। बी) ऑप्टिक तंत्रिका सहित आंख को हटा दिया गया है। सीजे) रेटिना हटाने के लिए चरण-दर-चरण मार्गदर्शिका सी) आयन से बाहर निकलने के लिए जलीय हास्य को अनुमति देने के लिए कॉर्नियल हटाने से पहले एक 30 जी सुई का उपयोग करके एक पंचर किया जाता है। डी) कॉर्निया एक छोटे से चीरा बनाने के लिए संदंश के साथ आयोजित किया जाता है। ईएफ) संदंश का उपयोग कॉर्निया, रेटिना वर्णक एपिथेलियम, कोरॉयड, और श्वेतपटल से छीलने की अनुमति देता है। रेटिना स्क्लेरा, लुढ़का, और हटाए जाने से अलग है। जी) लेंस निकाल दिया जाता है और हटा दिया जाता है। एचजे) एकत्रित रेटिना एक छोटी सी डिब्बे में रखी गई है जिसमें पीबीएस / 1% एफबीएस शामिल हैं, ताकि उन्हें हर समय नम हो। कृपया इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा।

चित्र 2
चित्रा 2 एकत्रित रेटिनाई के मैक्रेशन के बाद रेटिना सेल निलंबन कोशिकाओं को अलग करने के लिए एकत्रित रेटिना को एक छोटे से डिश में रखा जाता है। ए) रेटिना एक 70-माइक्रोन नायलॉन छलनी में रखा गया है और एक सिरिंज के बैक-एंड का उपयोग करके मैकेरेटेड किया गया है। बी) सेल निलंबन की प्रतिनिधि छवि, जहां अलग रेटिना कोशिकाओं को मनाया जाता है। स्केल बार 10 माइक्रोन है

चित्र तीन
चित्रा 3 CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 के साथ सेल के अलगाव के लिए छंटनी की रणनीति नेग फेनोटाइप और पोस्ट-सॉर्टिंग विश्लेषण सॉर्टिंग रणनीति CD90.2 कोशिकाओं को शामिल करने और CD48-, CD15-, और CD57-सकारात्मक कोशिकाओं को शामिल करने पर आधारित होती है, जो दूषित कोशिकाएं हैं। ए) सेल आबादी का अवलोकन करने के लिए पहला कदम, साजिश आकार (एफएससी) और आंतरिक जटिलता (एसएससी) के रूप में एसएससी-ऊँचाई (एच) बनाम चौड़ाई (डब्ल्यू), पी 2 का उपयोग करते हुए प्रारंभिक गेट वाली आबादी (पी 1) का उपयोग एकल कोशिकाओं और दबंग कोशिकाओं या समुच्चय के बीच भेदभाव करने के लिए किया जाता है। एकल कोशिकाओं का चयन CD90.2 + CD48 neg कोशिकाओं को चुनने के लिए किया जाता है। सभी दुश्मनों को हटाने की पुष्टि करने के लिए, एफएससी-एच बनाम एफएससी-वाई बनाम, पी 3 ( मध्य पैनल) का प्लॉट किया जाता है। कोशिकाओं को एएफ 700-संयुग्मित एंटी-माउस सीडी 90.2, पीई-साइनाइन 7-संयुग्मित एंटी-माउस सीडी 48, पीई संयुग्मित सीडी 15 और एंटी-माउस सीडी 57 के साथ लेबल किया गया था। एंटी-माउस सीडी 57 को टैग करने के लिए एक द्वितीयक एंटीबॉडी के रूप में, एंटी-माउस BV421 इस्तेमाल किया गया था। चौथे < में जनसंख्या 3 (पी 3) का प्लॉट किया गया था/ डीएम> पैनल को सीडी 90.2 + सीडी 4 9 नकारात्मक कोशिकाओं का चयन करने के लिए, अधिकतर दूषित कोशिकाओं को निकालते हैं। इसके बाद, सीडी 57 बनाम सीडी 5 प्लॉट चयनित सीडी 090.2 + सीडीआईएएल नेग कोशिकाओं का उपयोग करते हुए उत्पन्न होता है। क्वाड्रंट 4 (क्यू 4) का चयन किया गया है, क्योंकि यह CD90.2 + सीडी 4 9 नकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है जो दोनों सीडी 15 और सीडी 57 के लिए ऋणात्मक हैं। गेट की जनसंख्या के परिणामस्वरूप फ़िनोटाइप CD90.2 + CD48 neg सीडी 15 डेविड सीडी57 नीग है। बी) ए) में इस्तेमाल किए गए सतह के मार्करों के पोस्ट-सॉर्ट विश्लेषण। क्रमबद्ध कोशिकाएं आकार में एकसमान होती हैं, जैसा कि पहले पैनल में दिखाया गया है। बाद के हिस्टोग्राम प्रत्येक सतह मार्कर का प्रतिशत दिखाते हैं जो ए में वर्णित छँटाई की रणनीति में प्रयुक्त होता है। कुल 95% कोशिकाएं CD90.2 + हैं , जैसा कि आईजी नियंत्रण की तुलना में काली रेखा में दिखाया गया है, जो कि ठोस हिस्टोग्राम द्वारा दर्शाया गया है। इन कोशिकाओं को सीडी 48, सीडी 15, और सीडी 57 के प्रतिशत का मूल्यांकन करने के लिए गेट किया गया, जो लाल, नीले, और ग्रीरीक्रमशः एन लाइनें परिणाम इन सेल सतह मार्करों की न्यूनतम अभिव्यक्ति दिखाते हैं। सी) आरजीसी-विशिष्ट इंट्रासेल्युलर मार्कर एसएनसीजी, बीआरएन 3 ए, टीयूजे 1, और आरबीपीएमएस का उपयोग करके आरजीसी फेनोटाइप की पुष्टि। ब्लैक लाइन प्रत्येक इंट्रासेल्युलर मार्कर को व्यक्त करने वाले कोशिकाओं के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं। डी) इमेजिंग सेल सॉर्टर में ली गई प्रतिनिधि छवियां जो आरबीपीएमएस के इंटरेसेल्युलर लोकिकरण, एक आरजीसी-विशिष्ट इंट्रासेल्युलर मार्कर और सेल की सतह के मार्कर सीडी90.2 दिखाती हैं। स्केल बार 20 माइक्रोन है ई) सांस्कृतिक सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करते हुए 24 घंटे के बाद सॉर्ट किए गए आरजीसी की प्रतिनिधि छवि स्केल बार 20 माइक्रोन है छवियों को अनुमति के साथ पहले प्रकाशित किए गए कार्य से अनुकूलित किया गया है 23 छवियां डीए को 20X में लिया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 4 प्री- और पोस्ट-सॉर्टिंग एमआरएनए विश्लेषण रेटीक कोशिकाओं द्वारा व्यक्त की गई 25 जीन के एक पैनल का उपयोग करके q1.15 सीडी 790 + सीडी 4 9 सीडी 15 ओडिड सीडी 57 एनजी के क्यूपीसीआर विश्लेषण द्वारा थ्री 1 + सीडी 4 9 एनएजी और सॉर्ट किए गए कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया। लक्षित जीन अभिव्यक्ति के स्तर को एक लॉग इन 2- फेल्ड चेंज के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जो एचपीआरटी को घरेलू नियंत्रण जीन के रूप में और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में पानी का उपयोग करते हैं। गणना टी टी विधि के आधार पर की गई थी। मीन ± एसईएम; N = 3 जैविक प्रतिकृतियां प्रतिलिपि में किया गया अनुमति के साथ पहले प्रकाशित किए गए कार्य से हासिल आंकड़े 23

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Discussion

एफएसीएस सेल आबादी शुद्ध करने की पसंद की तकनीक है। अन्य अलगाव विधियों में इम्युनोपेनिंग, चुंबकीय मोती और पूरक निर्धारण की कमी शामिल है। इन अन्य तरीकों पर एफएसीएस का लाभ सेल-सतह मार्करों की एक साथ पहचान की तीव्रता के विभिन्न डिग्री के आधार पर आधारित है। अणु के फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोटीन अभिव्यक्ति की मात्रा के लिए आनुपातिक है। अब तक, आरजीसी का अलगाव केवल थाई 1 पर आधारित था (सीडी 90) सकारात्मकता और सीडी 48 नकारात्मकता 15 , 16 , 22 , 34 , भले ही अलगाव विधि का इस्तेमाल किया जाए। यह हाल ही में दिखाया गया है कि थ्री 1 + सीडी 4 9 का फेनोटाइप आरजीसी इंट्रासेल्युलर मार्कर 23 को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की समरूप आबादी को अलग करने के लिए पर्याप्त नहीं है। आरजीसी जनसंख्या की पहचान उनके अलगाव के लिए आवश्यक है, विशेष रूप सेY क्योंकि वे रेटिनल कोशिकाओं का एक छोटा प्रतिशत 7 , 8 , 9 शामिल करते हैं । आरजीसी के बहुमत रेटिना के अंदरूनी परत में स्थित हैं, जबकि एक छोटी संख्या भीतरी पिल्क्सिफ़ॉर्म लेयर (विस्थापित RGCs 35 ) में स्थित हैं। इस प्रकार, आरएजीसी को स्टीरियोटेक्टिक इंजेक्शन द्वारा उच्चतम कॉलिकुली से ट्रेसिंग और हाइड्रॉक्सीस्टिलबामाइडिन (न्यूरॉन्स के रूपरेखा के लिए एक अनुवांशिक ट्रेसर) के साथ ट्रेसिंग कई प्रयोगशालाओं 36 , 37 , 38 के लिए आकर्षक विकल्प बन गए। इन प्रणालियों के लिए ट्रेसर के इंजेक्शन की आवश्यकता होती है, जो कि अगर ठीक से नहीं किया जाता है, तो कुछ रेटिना क्षेत्रों से अनदेखी छोड़ दी जाती है। इसके अलावा, वे अधिक तकनीकी रूप से मांग कर रहे हैं और, इम्युनोपेनिंग जैसे अन्य तरीकों की तरह, लंबा है। विरोधी-Thy1 और -CD48 एंटीबॉडी का उपयोग करके इम्यूनोपैनिंग को पूरा करने के लिए 48 घंटे लगते हैं और 95 से अधिक प्राप्त नहीं करते हैं% शुद्धता यह काम एक एफएसीएस आधारित पद्धति का वर्णन करता है जो सीडी 90.2 + सीडी 4 9 सीडी 15 निग सीडी 57 एनजे फेनोटाइप के साथ जीआर आरजीसी की एकसमान आबादी को अलग करने के लिए एक तेज और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रदान करता है, बिना किसी ट्रैसर, चुंबकीय मोती या इम्युनोपाइनिंग तकनीक ।

एफएसीएस द्वारा शुद्ध आरजीसी के सफल अलगाव के लिए निम्न कारकों की आवश्यकता है: 1) सॉर्ट कार्यक्षमता, जो इस्तेमाल किए गए उपकरणों पर निर्भर करता है; 2) शोर को कम करने के लिए एंटीबॉडी-टैग फ्लोरोरेमों का इष्टतम संयोजन; और 3) सेल सॉर्टिंग सेटअप। सॉर्ट की दक्षता का आकलन लक्ष्यित घटनाओं की संख्या से विभाजित सॉर्टिंग के लिए चयनित लक्ष्य ईवेंट की संख्या लेने के द्वारा की जाती है, जो एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया गया है। सॉर्ट कार्यक्षमता उपकरण द्वारा प्रदान की गई गणना है। यह दक्षता सॉर्टिंग सिस्टम और सेल सॉर्टिंग मोड की स्थापना पर निर्भर करता है। फ्लोरोरेम्रोम का एक इष्टतम संयोजन चुनना एक जटिल प्रक्रिया है। प्रत्येक फ्लूओरोक्रोम के विशिष्ट गुण हैं और इसकी उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य की विशेषता है। जबकि उत्तेजना लेजर के साथ पढ़ी जाती है, उत्सर्जन को प्रकाशिकीय ट्यूबों द्वारा पढ़ा जाता है, जो एफएसीएस सॉर्टिंग उपकरण में उपलब्ध ऑप्टिकल फिल्टर द्वारा सीमित हैं। यहां, एंटीबॉडी-टैग फ्लोरारोमों पीई, पीई-साइनाइन 7, एएफ 2700 और बीवी 421 का एक संयोजन प्रदान किया गया है। यह कई फ्लोराकोरम संयोजनों पर विचार करने के बाद निर्धारित किया गया था जो कि वर्णक्रमीय ओवरलैप को कम करते हुए सबसे अच्छा संकल्प प्रदान करता है। अंत में, सॉर्ट सेटअप महत्वपूर्ण है। सामान्य तौर पर, रेटिना कोशिका नाजुक होती हैं इस प्रकार, कोशिकाओं पर तनाव को कम करने के लिए नमूनों को चलाने के लिए कम दबाव का उपयोग करना सबसे अच्छा होता है। यह नमूना 4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि कमरे के तापमान पर लंबे समय के लिए मूरिन आरजीसी को रखने से सेल की पैदावार कम हो सकती है, खासकर जब बड़ी संख्या में कोशिकाओं को छांटते हैं।

एफएसीएस आधारित सॉर्टिंग एक ऐसी आदर्श पद्धति है जो कोशिकाओं के अलगाव के लिए आदर्श है, जो कि एवी बनाता हैसेल निलंबन के कुछ छोटे प्रतिशत रेटिनल विच्छेदन से सेल सॉर्टिंग के पूरा होने की प्रक्रिया, इम्युनोपेनिंग और ट्रेसर सिस्टम की तुलना में लगभग 5-6 घंटे लगते हैं, जो पूरे दिन लगते हैं। एफएसीएस के बहुआयामी विश्लेषण और कई व्यवहार्य आबादी एकत्र करने के लिए उपकरणों की क्षमता कोशिकाओं के आगे कार्यात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्राथमिक मुरिन आरजीसी के अलगाव के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। इसके कई लाभों के बावजूद, इसकी संवेदनशीलता, प्रजनन क्षमता, और व्यवहार्य कोशिकाओं की तत्काल पहचान सहित, कुछ सीमाएं हैं सबसे पहले, इसमें महंगा इंस्ट्रूमेंटेशन और उच्च प्रशिक्षित ऑपरेटर की आवश्यकता होती है। आमतौर पर, ऑपरेटर एक प्रतिरक्षाविज्ञानी या क्षेत्र में एक उच्च प्रशिक्षित व्यक्ति है, जिसे प्रयोग के समय के दौरान मिलना आवश्यक है। आजकल, शैक्षिक सुविधाओं में कई प्रमुख सुविधाएं हैं, जो इन प्रकार के प्रयोगों को प्रदर्शित करने की सुविधा प्रदान कर सकती हैं। दूसरे, आरजीसी अपने टी खो देते हैंआक्साइड की वजह से पीकल आकृति विज्ञान, उन्हें आकार में बहुत छोटा बना दिया इस समय, यह ज्ञात नहीं है कि विषाक्तता के कारण उनके कुछ जीन को मृदुयुक्त किया जा सकता है।

यहां प्रस्तुत पद्धति इन विट्रो में आरजीसी फ़ंक्शन के डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए अनुमति देता है और दृश्य और स्वास्थ्य विज्ञान के क्षेत्र में उपयोग करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है। मस्तिष्क में नाड़ीग्रन्थि सेल उत्पादन को बनाए रखने के लिए आवश्यक दृश्य धारणा के लिए आवश्यक है और कई रोगों में जोखिम है। ये कोशिकाओं को स्वस्थ और बीमारियों के दोनों मॉडल में इन विट्रो प्रयोगों में नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इन कोशिकाओं पर इलेक्ट्रोफिजिकल, औषधीय, जैव रासायनिक और आणविक अध्ययन किया जा सकता है, जो भविष्य के चिकित्सीय लक्ष्य के विकास के लिए आदर्श है।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की है कि उनके पास कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हित नहीं है

Acknowledgments

लेखकों तकनीकी वीडियो सहायता के लिए माइक्रोबायोलॉजी, इम्यूनोलॉजी और बायोकैमिस्ट्री विभाग के वरिष्ठ इलस्ट्रेटर श्री टिम हिगिंस का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं; डा। मैथ्यू डब्लू। विल्सन चर्चाओं और उनके सहयोगी टिप्पणियों के लिए जब्लोंस्की और मोरालेस-तिरडो प्रयोगशालाओं के सदस्यों के लिए। यह काम एल्कोन रिसर्च इंस्टिट्यूट युवा जांचकर्ता पुरस्कार (वीएमएम-टी), टेनेसी रिसर्च फाउंडेशन विश्वविद्यालय (वीएमएम-टी), नेशनल आई इंस्टीट्यूट ईवाय 02200 (एमएमजे), गारविन फैलोशिप (वीएमएम-टी) द्वारा समर्थित था; गर्विन प्री-डॉक्टरेट फेलोशिप (जेडकेजी), डिफेंस आर्मी मेडिकल रिसर्च और मैटेरियल कमान (वीएमएम-टी), और अनियंत्रित अनुदान से रिसर्च टू द ब्लिंडनेस।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse CD15 PE BioLegend 125606 Clone MC-480
Anti-mouse CD48 PE-Cy7 BioLegend 103424 Clone HM48-1
Anti-mouse CD57 Sigma Aldrich C6680-100TST Clone VC1.1
Anti-mouse CD90.2 AF700 BioLegend 105320 Clone 30-H12
Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG BioLegend 405317 Clone Poly4053
Purified Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302 FcgRII/III block, Clone 93
Zombie Aqua  BioLegend 423102 Live cell/ Dead cell discrimination
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 U.S. origin
AbC Total Antibody Compensation Bead Kit Thermo Fisher Scientific A10497 Multi-species Ig
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Add serum to media prior to culture.
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 Saline solution
Dissection Microscope Olympus SZ-PT Model Stereo Microscope
Sorvall Centrifuge Thermo Scientific ST 16R All centrifugation performed  at RT
Base Plate – Dissection Pan Fisher Scientific SB15233FIM A wax plate can also be used
Forceps Aesculap 5002-7 4 ½ inches
Iris Scissors, Straight Aesculap 1360 5 ½ inches
Falcon 15 mL conical tubes Fisher Scientific 352097 Polypropylene tubes
Falcon 50 mL conical tubes Fisher Scientific 352098 Polypropylene tubes
BD FACS Tubes Fisher Scientific 352003 Polypropylene tubes
40 mm dishes MidSci TP93040 Tissue culture treated
70 μm nylon strainer MidSci 70ICS sterile
40 μm nylon strainer MidSci 40ICS sterile
 BD 10 mL syringe Fisher Scientific 301604 Disposable Syringe without needle
Pestles MidSci PEST sterile
Wheaton Vials Fisher Scientific 986734 No Liner
BD 30 G needle Fisher Scientific 305128 1 inch
Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber Fisher Scientific 0267151B Hemocytometer
Gibco Trypan blue 0.4% Solution Fisher Scientific 15250061 Viability Dye
Eppendorf tubes Fisher Scientific 05-402-25 1.5mL
EVOS Floid Cell Imaging Thermo Fisher Scientific 447113 Fluorescence Imaging with a 20X objective
100% Ethanol Fisher Scientific 04-355-452 Used to make 70% Ethanol
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ Rainin 17014282 LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ Rainin 17014391 LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ Rainin 17014392 LTS Pipette
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S Rainin 17005088 Blue Rack Sterile Tips
Rack LTS 250 mL – GPS-L250S Rainin 17005092 Green Rack Sterile Tips
Rack LTS 20 mL – GPS-L10S Rainin 17005090 Red Rack Sterile Tips
FACSAria II Cell Sorter BD Biosciences N/A Custom order
LSR II Cytometer BD Biosciences N/A Custom order
Abca8a Thermo Fisher Scientific Mm00462440_m1 Müller cells
Aldh1al Thermo Fisher Scientific Mm00657317_m1 Müller cells
Aqp4 Thermo Fisher Scientific Mm00802131_m1 Astrocytes
Calb2 Thermo Fisher Scientific Mm00801461_m1 Amacrine, Horizontal
Cd68 Thermo Fisher Scientific Mm03047340_m1 Retinal Pigment Epithelial Cells
Gad2 Thermo Fisher Scientific Mm00484623_m1 Amacrine
Hprt Thermo Fisher Scientific Mm01545399_m1 House keeping gene
Lhx1 Thermo Fisher Scientific Mm01297482_m1 Horizontal
Lim2 Thermo Fisher Scientific Mm00624623_m1 Horizontal
Nrl Thermo Fisher Scientific Mm00476550_m1 Photoreceptors
Ntrk1 Thermo Fisher Scientific Mm01219406_m1 Horizontal
Pcp4 Thermo Fisher Scientific Mm00500973_m1 Bipolar, Amacrine
Pou4f1 Thermo Fisher Scientific Mm02343791_m1 Retinal Ganglion Cells
Prdx6 Thermo Fisher Scientific Mm00725435_s1 Astrocytes
Prkca Thermo Fisher Scientific Mm00440858_m1 Bipolar
Prox1 Thermo Fisher Scientific Mm00435969_m1 Horizontal
Pvalb Thermo Fisher Scientific Mm00443100_m1 Amacrine
Rbpms Thermo Fisher Scientific Mm02343791_m1 Retinal Ganglion Cells
Rom1 Thermo Fisher Scientific Mm00436364_g1 Photoreceptors
Rpe65 Thermo Fisher Scientific Mm00504133_m1 Retinal Pigment Epithelial cells
Slc1a3 Thermo Fisher Scientific Mm00600697_m1 Astrocytes
Slc6a9 Thermo Fisher Scientific Mm00433662_m1 Amacrine
Sncg Thermo Fisher Scientific Mm00488345_m1 Retinal Ganglion Cells
Tubb3 Thermo Fisher Scientific Mm00727586_s1 Retinal Ganglion Cells
Vim Thermo Fisher Scientific Mm01333430_m1 Müller cells
Taqman Universal Master Mix Thermo Fisher Scientific 4440047 qPCR Reagent
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA Isolation
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific 11754250 cDNA synthesis
Taqman PreAmp Master Mix Thermo Fisher Scientific 4391128 Pre-Amplification step
BD Cytofix/ Cytoperm BD Biosciences 554714 Fixation/ Permeabilization Buffer
BD Perm/ Wash BD Biosciences 554723 Permeabilization Solution
RBPMS Santa Cruz Biotechnology sc-86815 intracellular antibody
SNCG Gene Tex GTX110483 intracellular antibody
BRN3A Santa Cruz Biotechnology sc-8429 intracellular antibody
TUJ1 BioLegend 801202 intracellular antibody

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References

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जैव अभियांत्रिकी अंक 125 रेटिना नाड़ीग्रन्थि कोशिकाओं आरजीसी फ्लो साइटोमेट्री न्यूरॉइड जनरेशन ग्लूकोमा वृद्धावस्था
फ्लो साइटोमेट्री द्वारा प्राथमिक मुरीन रेटिनल गंगलायन कोशिकाओं (आरजीसी) का अलगाव
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Chintalapudi, S. R., Patel, N. N., Goldsmith, Z. K., Djenderedjian, L., Wang, X. D., Marion, T. N., Jablonski, M. M., Morales-Tirado, V. M. Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55785, doi:10.3791/55785 (2017).

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