Summary
Millioner mennesker lider av retinal degenerative sykdommer som resulterer i irreversibel blindhet. Et vanlig element i mange av disse sykdommene er tap av retinal ganglion celler (RGCs). Denne detaljerte protokollen beskriver isoleringen av primære murine RGCs ved positivt og negativt utvalg med strømningscytometri.
Abstract
Neurodegenerative sykdommer har ofte en ødeleggende effekt på de berørte. Retinal ganglioncelle (RGC) tap er implicert i en rekke sykdommer, inkludert diabetisk retinopati og glaukom, i tillegg til normal aldring. Til tross for deres betydning har RGCs vært ekstremt vanskelig å studere til nå, delvis på grunn av at de bare utgjør en liten prosentandel av det store antallet celler i netthinnen. I tillegg bruker nåværende isolasjonsmetoder intracellulære markører for å identifisere RGC, som produserer ikke-levedyktige celler. Disse teknikkene innebærer også lange isolasjonsprotokoller, så det er mangel på praktiske, standardiserte og pålitelige metoder for å oppnå og isolere RGCer. Dette arbeidet beskriver en effektiv, omfattende og pålitelig metode for å isolere primære RGCer fra mus retinae ved hjelp av en protokoll basert på både positive og negative utvalgskriterier. De fremlagte metodene tillater den fremtidige studien av RGCs, med målet om å bedre forstå majorenNedgang i synsskarphet som skyldes tap av funksjonelle RGC i neurodegenerative sykdommer.
Introduction
RGC er terminalt differensierte nevroner, og derfor er primære celler kreves for eksperimentering. Utviklingen av en protokoll for isolering og anrikning av primære murine retinale ganglionceller (RGC) er avgjørende for å avsløre mekanismer for RGC helse og degenerasjon in vitro . Dette er spesielt viktig for studier som søker å generere potensielle terapier for å fremme RGC-funksjonen og for å minimere deres død. Degenerasjonen av RGC er forbundet med retinal degenerative sykdommer, slik som glaukom, diabetisk retinopati og normal aldring. Selv om de spesifikke cellemekanismer som ligger til grund for RGC-tap er uklare, er det identifisert en rekke risikofaktorer. Mangel på oksygenering i optisk nervehodet 1 , 2 , 3 forårsaker RGC død 4 og virker som forstyrrelsen av homeostasen mellom aktiveringen av excitatoriske og jegInhibitorer innen individuelle RGC 5 , 6 . En rekke utfordringer hindrer fremgang i retning av bruk av disse cellene for dybdegående studier. For det første er antall RGC som er tilstede i en murin retina liten. RGCer utgjør mindre enn 1% av de totale retinale cellene 7 , 8 , 9 . For det andre er de fleste RGC-spesifikke markører intracellulære proteiner 10 , 11 , 12 . Utvalg basert på disse markørene etterlater cellene ikke-levedyktig, noe som utelukker nedstrømsfunksjonelle analyser. Til slutt er tilgjengelige protokoller lange og mangler standardisering 13 , 14 . Tidlige RGC-isolasjonsprotokoller ble basert på immunopaneringsmetoder. Barres et al. 15 Tilpasset den klassiske immunopløsningenAnningsteknikk og tilsatt et annet trinn, som ekskluderte monocytter og endotelceller fra hovedparten av retinale celler før positiv seleksjon basert på immunopositivitet mot anti-tymocytt antigen (aka Thy1), en celleoverflate-markør. År senere, Hong et al. Kombinert magnetisk vulst isolasjon teknikker med celle sortering strategier for å isolere RGCs med høyere renhet 16 . Bruken av magnetiske perler brukes fortsatt i mange vitenskapelige applikasjoner. Sammen forbedret magnetiske kuler og flytcytometriprotokoller renheten til isolerte celler. Imidlertid har disse rensningssystemene ennå ikke blitt standardisert for isolering av murine RGCer fra dissocierte retinae.
Flowcytometri er en kraftig analysemetode som måler optiske og fluorescensegenskaper ved cellesuspensjon. Celler analyseres både kvantitativt og kvalitativt med høy følsomhetsgrad, og gir en flerdimensjonal analyse av cellepopulasjonenasjon. Cellediskriminering er basert på to hoved fysiske egenskaper: celle størrelse eller overflateareal og granularitet eller intern kompleksitet 17 . En flerdimensjonal analyse kan utføres ved å kombinere antistoffer merket med fluorokrom som har lignende eksitasjonsbølgelengder og forskjellige utslipp. Flowcytometri er rask, reproduserbar og sensitiv. Multitep lasere tillater enda større flerdimensjonale analyser av enkeltceller ved hjelp av flytcytometri. Dermed er det en attraktiv metodikk for studier av cytologiske prøver. Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) bruker de multidimensjonale fenotypiske forskjellene identifisert ved hjelp av flytcytometri for å sortere individuelle celler i forskjellige subpopulasjoner.
I det siste tiåret har flere overflate- og intracellulære proteiner blitt identifisert som potensielle biomarkører for seleksjon av celler, inkludert nevroner. Første studier som forsøkte å isolere RGCer fra rotter brukte Thy1 som en ganglioncelleL markør. Dessverre har Thy1, aka CD90, flere isoformer i andre gnaverarter 18 , 19 , 20 og uttrykkes av flere retinale celletyper 19 , 20 , noe som gjør den til en ikke-spesifikk markør for RGC'er. En annen overflate markør, CD48, er funnet på monocytiske populasjoner i netthinnen, inkludert makrofager og microglia. Ved å bruke disse to overflate markørene ble en modifisert RGC signatur-Thy1 + og CD48 negceller utviklet 15 , 16 , 21 , 22 . Dessverre er disse to utvalgskriteriene ikke tilstrekkelig til å velge for en svært beriket RGC-befolkning. For å løse dette uoppløste behovet ble en flyt-cytometriprotokoll utviklet 23 basert på flere lag positive og negative utvalgskriterier usiNg kjente celleoverflate markører for å berike og rense primære murine RGCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som er beskrevet i følgende protokoll ble godkjent av Institutt for dyrepleie og brukskomité (IACUC), ved Universitetet i Tennessee Health Science Center (UTHSC), og fulgte ARVO-uttalelsene for bruk Dyr i Ophthalmic and Vision Research, i tillegg til retningslinjene for laboratoriedyreksperimenter (Institute of Laboratory Animal Resource, Public Health Service Policy for Human Care and Use of Laboratory Animals).
1. Forberedelse av instrumenter, løsninger og medier
Merk: All informasjon om materialer, reagenser, verktøy og instrumenter rapportert i protokollen er spesifisert i Materialetabellen .
- Autoklaver alle disseksjonsinstrumenter og lagre dem i et sterilt område. Bruk følgende instrumenter: 4 standard pincet (2 lange og 2 korte) og 2 saks,Samt 2 tang (1 lang og 1 kort) og 1 saks for disseksjonen; Hold et ekstra sett som en sikkerhetskopi.
- Forbered 100 ml steril PBS / 1% FBS løsning for bruk under vasker, immunolabeling prosedyrer og cellesorteringstrinn. Oppbevar oppløsningen ved 4 ° C.
Merk: Ikke legg natriumazid (NaN 3 ) i oppløsningen, da det kan være giftig for levende celler.- Fremstill 100 ml PBS / 1% FBS med 99 ml PBS og 1 ml FBS.
- Klargjør 100 ml sterilt nevrale cellemedium supplert med 3% FBS (se Materialetabell ) for bruk som oppsamlings- og kulturmedium. Hold cellekulturmedium sterilt ved 4 ° C. Bare varmet det til romtemperatur (RT) før bruk.
- Klargjør 100 ml nevrale cellemedium suppleret med 3% FBS ved bruk av 97 ml nevrale cellemedium og 3 ml FBS.
- Pre-chill-oppsamlingsrør (15 ml rør) pre-belagt med 5 ml oppsamlingsmedium ved å plassere tHule i en isbøtte. Bruk kun polypropylenrør for å hindre at cellene fester seg til røroverflaten.
- Plasser 40 mm retter, 70 μm nylonstrimler, sprøyter, pestler for cellefilteret og sterile polypropylenrør i biosikkerhetsskapet. Steriliser alle elementer før prosedyrene og opprettholde dem på en steril måte gjennom prosedyrene.
Merk: Alle trinn etter samlingen av retinae vil bli utført i biosikkerhetsskapet.
2. Enukleasjon
Merk: I alt 10 unge (5-7 uker gamle) C57BL / 6J mus ble brukt i dette eksperimentet for å isolere 1,0 x 10 6 RGCs med fenotypen CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg .
- Euthaniser musene ved å bruke CO 2 -inhalasjon etterfulgt av cervikal dislokasjon. Bruk alltid en sekundær eutanasi-metode for å sikre at det euthaniserte dyret er dødt.
- Sett inn tang under øyets klokke, grip den optiske nerveen og trekk opp; Kloden vil bli enucleated, med optisk nerve intakt. Plasser oppsamlede øyne i et hetteglass med PBS og hold hetteglasset på is til neste trinn.
Merk: Ethvert personell kan utføre dette trinnet etter å ha mottatt riktig opplæring fra Laboratory Animal Care Unit (LACU).
3. Fremstilling av retinalcellesuspensjonen
- Plasser det oppsamlede øyet på basisplaten av et disseksjonsmikroskop for å starte hornhindefordelingen. Disseksjon hvert øye individuelt.
- Hold forsiktig kloden på den optiske nervebasen ved hjelp av tang. For dette trinnet, bruk en lonG, og en kort standard tang.
- Bruk en 30-tommers skarp nål for å punktere hornhinnen slik at den vandige humor kan evakuere fra øyet, noe som gjør det lettere å holde øynene med tangen.
- Hold hornhinnen med tang og bruk saks for å lage et lite snitt i hornhinnen. Skyll forsiktig hornhinnen og sclera ved hjelp av tangen. Når jordkloden skales halvveis, ruller naken og linsen ut med tangen. Kast hornhinnen, sclera og linsen.
Merk: Denne metoden sikrer at netthinnen helt løsner fra resten av øyet. - Plasser netthinnen i en liten 40 mm petriskål som inneholder PBS / 1% FBS.
Merk: Som et alternativ til Petriskålen kan en cellekulturrett brukes. Pass på at du alltid holder retinaen fuktig, som i fysiologiske forhold.- Vask hver netthinnen tre ganger med frisk steril PBS / 1% FBS i biosikkerhetsskapet.
- Plasser opptil 12 retinae påEn steril 70 μm nylon silke fuktet med PBS / 1% FBS. Bruk baksiden av en 10 ml sprøyte, forsiktig macerate retinae ved hjelp av en sirkulær bevegelse for å løsne cellene.
- Alternativt, bruk en pestle for cellefiltermakeringen eller bruk enzymatisk fordøyelse med en kombinasjon av 15 IE / ml papain, 5 mM L-cystein og 200 U / ml DNase I i 15 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av inaktivering med PBS / 10% FBS.
Merk: Ingen endringer i prosentandel av gjenvunnet celler ble observert når enzymatisk fordøyelse ble sammenlignet med macerasjon med enten baksiden av sprøyten eller stammen.
- Alternativt, bruk en pestle for cellefiltermakeringen eller bruk enzymatisk fordøyelse med en kombinasjon av 15 IE / ml papain, 5 mM L-cystein og 200 U / ml DNase I i 15 minutter ved 37 ° C, etterfulgt av inaktivering med PBS / 10% FBS.
- For å overføre de isolerte cellene, plasser den sterile 70-nm nylonfilmen over polypropylenoppsamlingsrøret. Pass de oppsamlede cellene gjennom silen med en P1000 pipette. Skyll silen ( trinn 3.6 ) med PBS / 1% FBS for å frigjøre resterende celler og overføre dem til oppsamlingsrøret.
- Legg PBS / 1% FBS til achGi et sluttvolum på 1 ml per retina. Sentrifuger cellesuspensjonen i 7 minutter ved 200 xg og RT.
Merk: Avhengig av antall macerated retinae (<6 retinae), kan cellepellet være for liten til å være synlig.- Kast cellens supernatant og resuspender cellepelletet i PBS / 1% FBS ved bruk av et forhold på 1 ml pr. 5 retinae.
- Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer.
- Rengjør et glasshemocytometer og deksel med 70% alkohol. Vri forsiktig røret som inneholder cellene for å sikre at retinacellesuspensjonen er jevnt fordelt. Plasser 20 μl 0,4% trypanblå i et mikrocentrifugerør og bland med 20 μl av cellesuspensjonen.
- Bland forsiktig og påfør 10 μL av 0,4% trypanblå / celle suspensjonsblandingen til hemocytometeret, fyll begge kamrene; Kapillærvirkning trekker 0,4% trypanblå / cellesuspensjonsblandingen under dekslet. Bruk et mikroskop, telle alle trypanblå-negative celler; thiS tall representerer levende celler.
- Bestem celle-levedyktighet ved å bruke følgende formel: antall levende celler / totalt antall celler =% levedyktighet.
Merk: Hvis cellens levedyktighet er mindre enn 95%, er det nødvendig med bruk av fluorescerende fargestoffer for diskriminering av celledyrbarhet under FACS.
- Bruk et fluorescerende levedyktighetsfargestoff som ikke er gjennomtrengende for levende celler. Vask cellene med PBS for å fjerne eventuelle spor av serum. Tilsett 1 μl fluorescerende fargestoff for cellelevbarhetsdiskriminering per 5,0 x 106 celler i et 100 μl sluttvolum. Inkuber ved RT i 15 minutter, beskyttet mot lys. Tilsett 10x volumet av PBS / 1% FBS. Sentrifuger i 5 minutter ved 200 xg og RT.
- Inkuber cellesuspensjonen over natten ved 4 ° C, om nødvendig. Hvis dette er gjort, fyll opp cellesuspensjonsrøret med nevralcellemedium i stedet for PBS / 1% FBS. Plasser røret horisontalt og hold det ved 4 ° C.
4. Immunolabeling ReTinale celler
- Bruk følgende konvertering for å bestemme volumet av antistoff per celle nummer: 2 μl antistoff per 5,0 x 106 celler i et 100 μl volum.
- Vask cellene og opprettholde dem i PBS / 1% FBS. Ta en liten alikvot av celler (5,0 x 10 6 celler) for å bruke som en negativ kontroll (umerket) på tidspunktet for sorteringsoppsettet.
Merk: Denne negative kontrollen er kritisk for riktig kalibrering av celle sortereren. - For å minimere ikke-spesifikk binding av antistoffer mot celler som uttrykker Fcγ-reseptorene II og III, tilsett 1 μl av et anti-mus CD16 / 32 antistoff per 1,0 x 106 celler i et 50 μl sluttvolum ved å bruke PBS / 1% FBS. Inkuber i 10 minutter ved RT.
- Tilsett antistoffcocktailen til prøven og bland forsiktig ved pipettering. Inkubér i 30 minutter i en isbøtte. Sørg for at isbøtten er dekket, da lys kan kompromittere forsøket på grunn av fotobrytingen av den merkede fluorenphores.
- Forbered antistoffcocktailen ved hjelp av følgende fluorescensmerkede antimusantistoffer: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE og un-tagged CD57.
Merk: For hvert antistoff, bruk følgende konsentrasjoner per 5,0 x 106 celler: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Cyanine7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; Og un-merket CD57, 0,4 μg.- Bruk volumer i henhold til følgende beregninger (basert på kommersielt tilgjengelige antistoffer oppført i Materialetabellen ): totalt 5,0 x 107 celler som skal merkes; 2 μl per 5,0 x 106 celler = 20 μl av hvert antistoff; 4 forskjellige antistoffer = 80 μl antistoff-cocktail; Sluttvolum = [(5,0 x 10 7 totalt celler) / 5,0 x 106 celler] x 100 = 1000 μL; 80 μl Abs + 50 μl anti-mus CD16 / 32 + 870 μl PBS / 1% FBS = 1000 μL.
Merk: Denne kombinasjonen gaOptimal kombinasjon av fluorokrom for instrumentkonfigurasjonen. Følgende parametere oppsummerer utslipp og eksitasjon: AF-700, utslipp på 719 nm når den er opphisset med en 638 nm røddiode laser; PE-Cyanine7, utslipp på 767 nm når den er opphisset med en 488 nm blå diode laser; Og PE, utslipp på 575 nm når det er opphisset med en 488 nm blå diode laser.
- Bruk volumer i henhold til følgende beregninger (basert på kommersielt tilgjengelige antistoffer oppført i Materialetabellen ): totalt 5,0 x 107 celler som skal merkes; 2 μl per 5,0 x 106 celler = 20 μl av hvert antistoff; 4 forskjellige antistoffer = 80 μl antistoff-cocktail; Sluttvolum = [(5,0 x 10 7 totalt celler) / 5,0 x 106 celler] x 100 = 1000 μL; 80 μl Abs + 50 μl anti-mus CD16 / 32 + 870 μl PBS / 1% FBS = 1000 μL.
- Forbered antistoffcocktailen ved hjelp av følgende fluorescensmerkede antimusantistoffer: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE og un-tagged CD57.
- Etter 30 min inkubering, ta opp volum opptil 5 ml ved bruk av PBS / 1% FBS. Vask prøvene ved å sentrifugere dem i 7 minutter ved 200 xg og RT. Gjenta prosedyren en gang for å fjerne alt ubundet antistoff.
- Tilsett 2 μL sekundært antistoff (0,1 μg), som vil binde CD57 av 5,0 x 106 celler. Inkubér i 30 minutter i en isbøtte, som i trinn 4.4 . Vask cellene to ganger, som i trinn 4.5 .
- Merk cellerne med sekundært antistoff dersom et un-merket primært antistoff ble brukt i trinn 4.4 .
Merk: Den andreAryt antistoff av valg for denne konfigurasjonen er oppført i Materialetabellen ; Den har en utslippsbølgelengde på 421 nm. Bruk den med et bandpassfilter på 450/50 nm når du er begeistret med den violette diodelaseren ved 405 nm. - Bruk volumer i henhold til følgende beregninger (basert på det kommersielt tilgjengelige antistoffet som er oppført i Materialetabellen ): 2 μl per 5,0 x 106 celler = 20 μl sekundært antistoff; Sluttvolum = [(5,0 x 10 7 totale celler) / 5,0 x 106 celler] x 50 = 500 ul; 20 μl Abs + 480 μl PBS / 1% FBS = 500 μl.
- Merk cellerne med sekundært antistoff dersom et un-merket primært antistoff ble brukt i trinn 4.4 .
- Oppbevar de merkede cellene i PBS / 1% FBS. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer; Bruk en endelig retinalcellekonsentrasjon på 3,0 - 4,0 x 107 celler / ml.
Merk: Ikke bruk cellekulturmedium for å fortynne cellene fordi fenolrøden kan øke autofluorescensen og derved redusere oppløsningen mellom negatIve og positive celler. Den endelige cellekonsentrasjonen per volum avhenger høyt av volumstrømningshastigheten til instrumentkonfigurasjonen. - Bruk enfargekontroller under oppsett for å minimere fluorescens spillover.
Merk: Dette trinnet, også kjent som kompensasjon, brukes til å korrigere støyen som oppstår ved kombinasjonen av fluorforer. Polystyrenmikrosfærer i PBS / 0,1% BSA / 2 mM NaN3 med kapasiteten til å binde fluorescensmerket immunoglobulin (Ig) isotyper fra flere arter gir positive kontroller for å sette kompensasjonen.- Plasser 3 dråper av polystyrenmikrosfærene i sterile FACS-rør, tilsetning av en per fluorofor. Tilsett 1 μg av respektive fluorofore til hvert rør. Inkuber i 15 minutter ved RT, beskyttet mot lys. Tilsett 3 ml PBS / 1% FBS til prøverørene. Sentrifuger i 5 minutter ved 200 xg og RT. Fjern forsiktig supernatanten og resuspender i 250 μl PBS / 1% FBS.
- For å sette opp den negative kontrOls, bruk polystyren mikrosfærer som ikke binder seg til Ig. Utfør dette trinnet dagen før, om nødvendig.
5. Cell Sortering strategi
Merk: Spesifikke instruksjoner for instrumentoppsett for FACS med 355 nm, UV; 405 nm, fiolett; 488 nm, blå; Og 640 nm, røde lasere med henholdsvis 2, 2, 5 og 3 fluorescenskanalfordeling. Operasjonsprogramvaren var DIVA versjon 8.0.1. Cell sortering ble utført med en 70 μm dyse, 70 psi skjede trykk, 87,5 frekvens, 48,6 amplitud med første dråp breakoff på 333, gap skillnad på 6, sort presisjon satt til fireveis renhet med standard (32) renhetsmaske og slipp Forsinkelse justert til 42,98 ved hjelp av perler.
- Bruk 15 ml polypropylen koniske rør som oppsamlingsbeholdere. Tilsett 5 ml av oppsamlingsmediet (cellekulturmedium) til hvert rør og roter røret for å belegge veggene.
Merk: Dette trinnet forhindrer at cellene stikker til sidene av tHan samlingsrør. Som et alternativ kan rør belegges med ufortynnet FBS. - Ta hensyn til effektiviteten av celle sortereren for å estimere det endelige utbyttet av celler.
Merk: Effektiviteten av sorteringen varierer basert på det anvendte strømningscytometer. RGCer med CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fenotype utgjør ca. 1% av alle retinale celler. - Har cellesortering utført av en utdannet operatør (vanligvis i en kjernefasilitet). Kontroller at instrumentet er rengjort og sterilisert med 70% etanol før prøveinnsamling. Tørk forsiktig av utsiden av oppsamlingsrørene med 70% etanol også.
- Hvis cellene har avgjort eller aggregert, pipetter cellene opp og ned og filtrer suspensjonen gjennom en steril 40 μm nylonfilter før oppkjøpet. Sørg for å kontrollere temperaturen og hold den ved 4 ° C mens cellesorteringen utføres; Manglende å gjøre det vil redusere cellenJeg gir.
- Diskuter detaljene av sorteringen med celle sorteringsoperatøren før du utfører forsøkene.
Merk: På forsøkstidspunktet har cellen sorteringsoperatøren klikket på en rekke knapper fra verktøylinjeverktøylinjen til oppkjøpsprogrammet for cytometeret. Dette er nettleseren , cytometer , inspektør , regneark og oppkjøp dashboard . Strategien for cellesortering brukt her er kjent som en 2-veis sortering. To populasjoner samles: de berikede RGCene og alle andre celletyper. Hvis flere populasjoner skal samles, kan opptil to flere populasjoner isoleres som en 4-veis sortering. Hvis flere populasjoner blir samlet, krever celle sortereren forskjellige oppsamlingsrør og oppsett. - Utfør kompensasjon for å korrigere for spektraloverlapning fra fluoroforene.
Merk: Denne prosessen kan gjøres manuelt ved å justereHver innstilling, eller det kan gjøres automatisk som en del av programvaren som brukes. De fleste programvare for celle sorteringsutstyr har mulighet for en automatisert kompensasjon. Det regnes som gullstandarden og den mest nøyaktige typen kompensasjon. Den negative (ingen fluorofor) -prøve og de enkelte kontroller fremstilt med polysterenmikrosfærer (kompensasjonsperler) som er spesielt fremstilt for å binde alle relevante monoklonale antistoffer anvendt i forsøket, vil bli anvendt i dette trinn.- Velg Eksperiment> Kompensasjonsoppsett> Opprett kompensasjonskontroll . Legg til fluorofor-spesifikke kontroller fra listen som vises på skjermen. Klikk på OK .
Merk: Et kompensasjonsrør for hver av kontrollene vil bli vist.- Bruk en umerket kontroll (ikke fluorofore, trinn 4.2 ) for å verifisere det fremover spredte lyset (FSC), det spredte lyset (SSC), og for å sende den innledende befolkningen (P1).
- Sett det negative kontrollrøret på cytometeret og klikk på Last inn. Kontroller at interessepopulasjonen vises og velg den. Dette er populasjon 1 (P1). Høyreklikk på P1-porten og velg Bruk på alle kompensasjonskontroller . Klikk på Record data . Når opptaket er ferdig, klikker du Løs ut og fjern røret.
- Installer neste rør på cytometeret, som vist på skjermen. Gjenta trinn 5.6.2 til alle dataene fra kontrollene er registrert.
- Velg Eksperiment> Kompensasjonsoppsett> Beregn kompensasjon . Lagre oppsettet og oppgi eksperimentet. Klikk på Link og lagre .
Merk: Kompensasjon er et nødvendig trinn, da det fjerner spekteret overlapp mellom detektorene. - Hvis manuell kompensasjon er nødvendig, gjør det ved å justere middelene til de positive signalene slik at de er lik negative for eacH av de anvendte fluorokromer.
Merk: Dette trinnet utføres av cellesorteringsoperasjonen og kan ta 30 minutter.
- Velg Eksperiment> Kompensasjonsoppsett> Opprett kompensasjonskontroll . Legg til fluorofor-spesifikke kontroller fra listen som vises på skjermen. Klikk på OK .
- Gating strategi ( figur 3A ).
- Sett opp P1 ved å plotte FSC versus SSC; FSC er indikativ på størrelsen og SSC indikerer cellens interne kompleksitet. Se figur 3A .
- Tegn et pseudocolor-plott av SSC-H (høyde) versus SSC-W (bredde) ved å bruke den valgte befolkningen i trinn 5.7.1 (P1); Pseudocolor-plottet muliggjør den visuelle representasjonen av cellens tetthet i forhold til hverandre.
Merk: En lavere celletetthet er representert av blå og grønn, mens røde og oransje områder representerer høycelletetthet.- Utfør dette trinnet for å bare samle inn enkelte celler; Den enkle celleporten heter P2. Se figur 3A .
- Gjenta trinn 5.7.2 tilPlott FSC-H versus FSC-W ved bruk av P2. Sørg for at valget av enkeltceller som "dubletter" eller celleklumper inneholder både en positiv og en negativ markør, noe som gir falsk positivitet.
- Tegn en pseudocolor plott av CD90.2 versus CD48. Velg alle CD90.2 + CD48 negceller for å eliminere monocytter fra RGC-anrikningen; Ring denne porten CD90.2 + CD48 neg , eller P3. Se figur 3A .
- Ved å bruke den valgte CD90.2 + CD48 neg- befolkningen eller P3-porten, tegne et pseudocolor-plott av CD57 versus CD15 for å eliminere amakriske celleforurensninger fra RGC-anrikningen. Gate CD15 neg CD57 neg befolkningen. Se figur 3A .
- Definer populasjonene som skal samles inn for prøven i vinduet "Sorter layout" og fortsett med celle sortering; Prøven som skal samles er CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg p>.
Merk: Befolkningen som skal sorteres, er valgt fra rullegardinmenyen Legg til i sorteringsvinduet. Etter at befolkningen er lagt til, vil den be om målbegivenheter eller hvor mange hendelser som skal samles inn. Sorteringsoppsettet kan når som helst redigeres ved å klikke på Sorteringsfelt som inneholder befolkningen. 0,9% ± 0,3 av RGC med fenotypen CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg er oppnådd fra unge (5-7 uker gamle) og 0,5% ± 0,3 og gamle (> 12 måneder gamle) C57BL / 6J mus 23 . - Ved å bruke 25 000 celler, utfør en renhetskontroll 23 . Se figur 3B -E.
Merk: Renhetskontrollen er prosessen for å analysere de sorterte cellene for å bekrefte nøyaktigheten av celle sorteringen. En liten alikvot av sorterte celler vil bli lastet inn på cytometeret for å verifisere effektiviteten av sorteringen.
- Intracellulær merking.
- Fiks sorterte celler i 1 time og permeabiliser ved 4 ° C for å gjøre cellene metabolisk inaktive og for å tillate penetrering av intracellulære antistoffer.
- Fortynn følgende antistoffer i permeabiliseringsløsningen: anti-RNA-bindende protein med multiple spleising (RBPMS) ved en 1: 100 fortynning i en 100 μg / ml stamme; Anti-synuclein gamma (SNCG), 1: 100 i en 1 mg / ml stamme; Hjernespesifikke homobox / POU-domeneprotein 3A (BRN3A), 1: 100 i en 200 ug / ml stamme; Og anti-neuron-spesifikk klasse III beta-tubulin (TUJ1), 1: 100 i en 1 mg / ml stamme. Inkubér cellene og antistoffløsninger i 1 time i en dekket isbøtte.
- Vask prøvene to ganger med PBS / 1% FBS.
- Resuspender cellene i riktig AF488-merket sekundært antistoff ved en 1: 200 fortynning i 30 minutter i en isbøtte.
- Vask prøvene som i trinn 6.1.3. Hold cellene iPBS / 1% FBS (250 μL) til klar til å analysere.
7. Validering av cellen Sorter etter qPCR analyse
Merk: Se figur 4 .
- RNA-ekstraksjon 23 .
- Ekstraher RNA fra 5,0 x 10 5 sorterte celler ved cellelys og homogenisering etterfulgt av tilsetning av kloroform.
- Overfør den øvre, fargeløse fasen til en ren mikrotube for alkoholutfelling etterfulgt av ekstraktkonsentrasjon i en spinnkolonne. Utfør DNAse-fordøyelsen på kolonnen.
- Vask kolonnen med RNase-fri vann for RNA-eluering.
- Vurder RNA-konsentrasjonen ved spektrofotometri.
- CDNA-syntese og preamplifisering.
- Bruk 100 ng RNA-materiale og bland med en løsning som inneholder revers transkriptase-enzym, rekombinant ribonukleaseinhibitor (for å unngå RNA-nedbrytning), magnesiumklorid (MgCL2) og deoksynukleotider.
- Bland rørinnholdet og inkuber i 10 minutter ved 25 ° C etterfulgt av 60 min ved 42 ° C. Avslutt reaksjonen med en 5-minutters inkubasjon ved 85 ° C. Oppbevar den resulterende cDNA ved -20 ° C til klar til bruk.
Merk: cDNA-materiale kan lagres ved -20 ° C i opptil en måned hvis forforsterkningstrinnet ikke kan utføres umiddelbart.
- Pre-amplifisering av cDNA.
- Pre-amplifisere cDNA-materiale ved bruk av en serie primere som er spesifikke for flere retinale celletyper, inkludert: retinale ganglionceller, amakrine celler, astrocytter, Müller, bipolar, horisontale, fotoreceptorer og retinale pigmentepitelceller, som beskrevet i referanse 23 og i tabellen Av materialer .
Merk: Pre-amplifikasjonsreaksjonen er forberedt for å øke sensitiviteten til deteksjon for kvantifisering. Pre-amplifikasjonsreaksjonen inneholder en blanding av primerenBlander fra materialet ; 2,5 μl cDNA, som startet ved 100 ng RNA; Revers transkriptase enzym; Og nukleasefritt vann i et sluttvolum på 10 ul. - Utfør enzymaktiveringstrinnet ved 95 ° C i 10 minutter, etterfulgt av 14 sykluser ved 95 ° C i 15 s, etterfulgt av 60 ° C i 4 min. Fortynn det forforsterkede materialet 1:10 i Tris EDTA-buffer og hold det ved -20 ° C til det er klart for bruk.
- Pre-amplifisere cDNA-materiale ved bruk av en serie primere som er spesifikke for flere retinale celletyper, inkludert: retinale ganglionceller, amakrine celler, astrocytter, Müller, bipolar, horisontale, fotoreceptorer og retinale pigmentepitelceller, som beskrevet i referanse 23 og i tabellen Av materialer .
- 7,4 qPCR reaksjon.
- Forbered alle qPCR-reaksjoner i et 10 μl sluttvolum ved å bruke det fortynnede, forforsterkede cDNA (2,5 μL), primere (oppført i Materialet ), nukleasefritt vann og et konsentrat med DNA-polymerase og deoksynukleotider.
- Bruk følgende instrumentbetingelser for å kjøre qPCR: et holdesteg på 50 ° C i 2 minutter, etterfulgt av 95 ° C i 10 minutter. Kjør totalt 40 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder etterfulgt av 60 ° C i 1 min. Utfør alle målEments i replikater av tre.
- Utfør relativ kvantifisering ved bruk av komparativ terskel (C T ) etter å ha bestemt verdiene for C T for housekeeping-genet og målgenene i hver prøve. Beregn den relative foldendringen (R q ) ved å bruke følgende ligning: R q = 2 T- AC , hvor ΔC T = C T målgen - C T referansegen 23 .
Merk: C T er definert som PCR-syklusen ved hvilken fluorescenssignalet fra reporterfargen krysser en vilkårlig plassert terskel 26 . C T er omvendt relatert til mengden av amplikon (PCR-produkt) i reaksjonen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den grundige studien av RGC er hindret av mange faktorer, inkludert deres lave frekvens og mangelen på en robust og standardisert metode for isolasjon. Figur 1 viser metoden som brukes for retinae-isolasjon. Variasjoner i enukleasjonsprosedyren eksisterer basert på typen av analyse, slik som om enukleasjonen er en del av in vivo- eksperiment 27 . Enukleasjon i denne protokollen utføres på euthaniserte mus. Som vist i figur 1A- B , er tangene plassert under øyet og trukket opp for å forårsake minimal blødning og for å fjerne en øyeklobe med en intakt optisk nerve.
Forskjeller eksisterer i antall RGCer i forskjellige musestammer, spesielt i genetisk endrede mus 23 , 28 ,Ef "> 29 , 30. Bevissthet om disse forskjellene er viktig når man bestemmer antall mus som skal brukes. Retinae fra gamle C57BL / 6J mus har færre levende retinale celler enn deres yngre kolleger 23. Derfor må retinal disseksjon utføres nøye til Maksimere celleutbyttet. En trinnvis prosedyre for retinaldisseksjon er presentert i figur 1C- J . Retinale celler er skjøre. Dermed blir dissekerte retinae plassert i nylonstrimler og macerert med enten enden av en sprøyte, som Vist i figur 2A , eller med en pestle for celleforsterkere. Makerasjonen av celler direkte i cellefilteret er hurtig og reduserer celleklumper. Et representativt bilde av cellepensjonen er illustrert i Figur 2B . Flere indre retinale celler kan visualiseres. På dette tidspunktet har RGCene mistet signaturen morpholoGy på grunn av aksotomi under celleisolasjon og fremstilling av cellesuspensjonen.
Det mest arbeidsintensive trinnet i denne metoden er celle sorteringsoppsettet. Denne fasen er et kritisk trinn under flerfarget FACS, da det maksimerer signal-til-støyoppløsning. Figur 3A viser gatingstrategien som brukes for isolering av RGCer. Denne strategien retter seg mot fjerning av forurensende celler fra cellesuspensjonen, som inkluderte monocytter, glial-, amakrine- og fotoreceptorceller. Som del av metodikken ble ytterligere overflate markører bekreftet ved immunhistokemisk analyse før de ble brukt som en del av ekskluderingsstrategien. Tidligere data viste at en liten prosentandel av CD90.2 + celler er CD48 + . Utelukkelse av disse cellene fjernet monocytter og muligens microglia fra retinae cellebassenget. Det har tidligere blitt vist at den klassiske Thy1 + CD48 neg 23 , da disse cellene uttrykker gener forbundet med amakrin, Müller, bipolar, horisontal fotoreceptor og retinalpigmentepitelceller ( Figur 4A ). Dette behandles ytterligere ved å undersøke ytterligere markører for celleutestenging. CD15 har blitt beskrevet som en markør for amakrine og bipolære celler 31 , hvilket bevirker bruken som en ekstra markør for negativt utvalg. Arbeid fra Uusitalo et al. 32 beskrev CD57 som en identifikasjonsmarkør for glialceller og fotoreceptorer. Derfor ble dette antistoffet tilsatt cellesorteringsstrategien.
Deretter ble disse cellene karakterisert for å validere metodikken for isolering av murine RGCs. Fenotypene til CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg- sorterte celler (<Sterk klasse = "xfig"> Figur 3B) ble evaluert for ekspresjonen av de følgende intracellulære markører assosiert med RGCs 10 , 11 , 12 , 33 : SNCG, BRN3A, TUJ1 og RBPMS. Som vist i figur 3C uttrykte de sorterte celler alle fire RGC-assosierte intracellulære proteiner. Deretter ble bildebehandlingsstrømcytometri brukt i Figur 3D for å vise intracellulær lokalisering av RBPMS og celleoverflateekspresjonen av CD90.2. Disse resultatene ble testet i flere cytometer-systemer, som bekrefter reproduserbarhet og standardisering. Som vist i figur 3E begynte noen av de sorterte cellene å vise morfologien assosiert med RGCs etter in vitro cellekultur.
Til slutt, en sammenligning av celler før anrikning og post-ceLl analyse ble utført ved qPCR analyse. Sammenligning av Thy1 + CD48 neg fenotypen til CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg- sorterte celler viste at Thy1 + CD48 neg fenotypen uttrykker gener assosiert med RGCs, men også med andre retinale celler. Den høye berikede sorterte cellepopulasjonen ( Figur 4B ) viste imidlertid en mange ganger økning i gener som koder for de RGC-spesifikke intracellulære markørene Sncg (SNCG), Pouf4l (BRN3A), Tubb3 (TUJ1) og Rbpms (RBPMS). Samlet validerte mRNA- og proteinanalysene metodikken.
Figur 1 . Enukleasjon og okulær Disseksjon for Retinal Isolasjon. Unge C57BL / 6J-mus ble euthanisert før tO fjerning av øyejord med CO 2 og cervikal dislokasjon. A) Plasser tanger under øyet og trekk øyet i en bevegelse. B) Øyen er fjernet, inkludert optisk nerve. CJ) Steg-for-trinns veiledning for å fjerne retina. C) En punktering utføres ved bruk av en 30G nål før korneal fjerning for å tillate det vandige humøret å gå ut av øyet. D) Hornhinnen holdes med tanger for å lage et lite snitt. EF) Bruk av tetninger gjør det mulig å peeling av hornhinnen, retinalpigmentepitelet, choroid og sclera. Retina er løsrevet fra sclera, rullet og fjernet. G) Objektivet er fjernet og kassert. HJ) Den samlede retinae er plassert i en liten tallerken som inneholder PBS / 1% FBS for å holde dem fuktige hele tiden. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dettefigur.
Figur 2 . Retinalcell Suspension etter Maceration of Collected Retinae. Den samlede retinae er plassert i en liten tallerken for å isolere cellene. A) Retinae er plassert i en 70-nm nylon silke og macerated ved hjelp av enden av en sprøyte. B) Representativt bilde av cellesuspensjonen, hvor tydelige retinale celler observeres. Målestangen er 10 μm.
Figur 3 . Sortering av strategi for isolering av celler med CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57
Figur 4 . Pre- og post-sortering mRNA analyse. Thy1 + CD48 neg og sorterte celler med fenotypen CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg ble vurdert ved qPCR analyse ved bruk av et panel med 25 gener uttrykt av retinale celler. Målgeneksjonsnivåer presenteres som en Log 2- fold forandring ved bruk av Hprt som et husholdningsgen og vann som en negativ kontroll. Beregningen ble utført basert på ΔC T- metoden. Mean ± SEM; N = 3 biologiske replikater ble utført i tre eksemplarer. Tall hentet fra tidligere publisert arbeid med tillatelse 23 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FACS er den valgte teknikken for å rense cellepopulasjoner. Andre isolasjonsmetoder inkluderer immunopanning, magnetiske perler og komplementfiksjonsdepletjon. Fordelen med FACS over disse andre metoder er basert på samtidig identifisering av celleoverflate markører med varierende intensitetsnivåer. Den fluorescerende intensiteten til molekylet er proporsjonal med mengden proteinuttrykk. Inntil nå var isoleringen av RGC basert utelukkende på Thy1 (CD90) positivitet og CD48 negativitet 15 , 16 , 22 , 34 , uavhengig av isolasjonsmetoden som ble benyttet. Det har nylig blitt vist at Thy1 + CD48 neg fenotypen ikke er tilstrekkelig til å isolere en homogen populasjon av celler som uttrykker RGC-intracellulære markører 23 . Identifikasjon av RGC-befolkningen er viktig for deres isolasjon, spesieltY fordi de utgjør en liten prosentandel av retinale celler 7 , 8 , 9 . Flertallet av RGC er lokalisert i det indre laget av netthinnen, mens et lite antall er lokalisert i de indre plexiforme lagene (fordrevne RGC 35 ). Dermed ble sporing av RGCer fra overlegen colliculi ved stereotaktiske injeksjoner og sporing med hydroksystillbamidin (en retrograd sporingsenhet for å skissere nevroner) attraktive valg for mange laboratorier 36 , 37 , 38 . Disse systemene krever injeksjon av sporer, som, hvis de ikke utføres på riktig måte, kan føre til at noen retinale områder blir forlatt. I tillegg er de mer teknisk krevende og, som andre metoder som immunopanning, er lange. Immunopanning ved hjelp av anti-Thy1 og -CD48 antistoffene tar 48 timer å fullføre og oppnår ikke mer enn 95% Renhet. Dette arbeidet beskriver en FACS-basert metode som gir en rask og reproduserbar protokoll for å isolere en homogen populasjon av levende RGCer med CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fenotypen, uten bruk av sporstoffer, magnetiske perler eller immunopanningsteknikker .
Følgende faktorer kreves for en vellykket isolering av rene RGCer av FACS: 1) sorteringseffektivitet, som avhenger av det brukte utstyret; 2) optimal kombinasjon av antistoff-merkede fluorokrom, for å minimere støy Og 3) celle sorteringsoppsett. Sorteringseffektiviteten beregnes ved å ta antall målhendelser valgt for sortering dividert med antall målhendelser oppdaget, uttrykt som prosentandel. Sort effektiviteten er en beregning levert av utstyret. Denne effektiviteten avhenger av oppsettet av sorteringssystemet og cellesorteringsmodusen. Å velge en optimal kombinasjon av fluorokrom er en kompleks prosess. Hvert influensaOrochrome har forskjellige egenskaper og er preget av dens eksitasjons- og utslippsbølgelengder. Mens eksitasjonen leses med en laser, leses emisjonen av fotomultiplikatorrør, som er begrenset av de optiske filtene som er tilgjengelige i FACS sorteringsutstyr. Her er en kombinasjon av antistoff-merkede fluorokromer PE, PE-Cyanine7, AF700 og BV421 tilveiebrakt. Dette ble bestemt etter å ha vurdert flere fluorokromkombinasjoner som ga den beste oppløsningen mens man reduserte spektral overlapping. Til slutt er sorteringsoppsettet kritisk. Generelt er retinale celler brutale. Således er det best å bruke et lavere trykk for å lede prøver, for å minimere stresset på cellene. Det er avgjørende å opprettholde prøven ved 4 ° C, fordi å holde murine RGCs i lengre perioder ved romtemperatur kan redusere celleutbyttet, spesielt når man sorterer stort antall celler.
FACS-basert sortering er en ideell metode for isolering av celler som utgjør avOpprettholde liten prosentandel av cellesuspensjonen. Prosessen, fra retinal disseksjon til ferdigstillelse av celle sortering, tar ca 5 - 6 timer, sammenlignet med immunopanning og sporingssystemer, som tar dager å fullføre. Den flerdimensjonale analysen av FACS og evnen til utstyret til å samle flere levedyktige populasjoner tillater videre funksjonelle analyser av celler. Protokollen beskrevet her er et kraftig verktøy for isolering av primære murine RGCer. Til tross for sine flere fordeler, inkludert sensitivitet, reproduserbarhet og umiddelbar identifisering av levedyktige celler, er det noen begrensninger. For det første krever det dyr instrumentering og en høyt utdannet operatør. Vanligvis er operatøren en immunolog eller en høyt utdannet person i feltet, med hvem som er nødvendig for å møte på tidspunktet for eksperimentoppsettet. I dag har akademiske fasiliteter flere kjernemuligheter, noe som kan gjøre det lettere å utføre disse typer eksperimenter. For det andre mister RGC sine tyderPikal morfologi på grunn av atokomi, noe som gjør dem svært små i størrelse. På dette tidspunkt er det ikke kjent om noen av deres gener kan moduleres på grunn av atokomi.
Metoden som presenteres her muliggjør nedstrømsanalyse av RGC-funksjonen in vitro og er et verdifullt verktøy som skal brukes innen synsvitenskap og helsefag. Vedlikehold av ganglioncelleutgang til hjernen er nødvendig for visuell oppfatning og er i fare i flere sykdommer. Disse cellene kan brukes til kontrollert in vitro- eksperimentering, både i sunne og sykdomsmodeller. Elektrofysiologiske, farmakologiske, biokjemiske og molekylære studier kan utføres på disse cellene, som er ideell for utvikling av fremtidige terapeutiske mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke hr. Tim Higgins, senior illustrator fra Institutt for mikrobiologi, immunologi og biokjemi, for teknisk videohjelp; Dr. Matthew W. Wilson for diskusjoner og medlemmene av laboratoriene Jablonski og Morales-Tirado for deres nyttige kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T); Gerwin Pre-doctoral fellowship (ZKG), Institutt for forsvarshærens medisinsk forskning og materiellkommando (VMM-T), og ubegrenset tilskudd fra forskning for å forhindre blindhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-mouse CD15 PE | BioLegend | 125606 | Clone MC-480 |
| Anti-mouse CD48 PE-Cy7 | BioLegend | 103424 | Clone HM48-1 |
| Anti-mouse CD57 | Sigma Aldrich | C6680-100TST | Clone VC1.1 |
| Anti-mouse CD90.2 AF700 | BioLegend | 105320 | Clone 30-H12 |
| Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG | BioLegend | 405317 | Clone Poly4053 |
| Purified Anti-mouse CD16/32 | BioLegend | 101302 | FcgRII/III block, Clone 93 |
| Zombie Aqua | BioLegend | 423102 | Live cell/ Dead cell discrimination |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | U.S. origin |
| AbC Total Antibody Compensation Bead Kit | Thermo Fisher Scientific | A10497 | Multi-species Ig |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Add serum to media prior to culture. |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | Saline solution |
| Dissection Microscope | Olympus | SZ-PT Model | Stereo Microscope |
| Sorvall Centrifuge | Thermo Scientific | ST 16R | All centrifugation performed at RT |
| Base Plate – Dissection Pan | Fisher Scientific | SB15233FIM | A wax plate can also be used |
| Forceps | Aesculap | 5002-7 | 4 ½ inches |
| Iris Scissors, Straight | Aesculap | 1360 | 5 ½ inches |
| Falcon 15 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352097 | Polypropylene tubes |
| Falcon 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 352098 | Polypropylene tubes |
| BD FACS Tubes | Fisher Scientific | 352003 | Polypropylene tubes |
| 40 mm dishes | MidSci | TP93040 | Tissue culture treated |
| 70 μm nylon strainer | MidSci | 70ICS | sterile |
| 40 μm nylon strainer | MidSci | 40ICS | sterile |
| BD 10 mL syringe | Fisher Scientific | 301604 | Disposable Syringe without needle |
| Pestles | MidSci | PEST | sterile |
| Wheaton Vials | Fisher Scientific | 986734 | No Liner |
| BD 30 G needle | Fisher Scientific | 305128 | 1 inch |
| Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber | Fisher Scientific | 0267151B | Hemocytometer |
| Gibco Trypan blue 0.4% Solution | Fisher Scientific | 15250061 | Viability Dye |
| Eppendorf tubes | Fisher Scientific | 05-402-25 | 1.5mL |
| EVOS Floid Cell Imaging | Thermo Fisher Scientific | 447113 | Fluorescence Imaging with a 20X objective |
| 100% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-452 | Used to make 70% Ethanol |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ | Rainin | 17014282 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ | Rainin | 17014391 | LTS Pipette |
| Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ | Rainin | 17014392 | LTS Pipette |
| Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S | Rainin | 17005088 | Blue Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 250 mL – GPS-L250S | Rainin | 17005092 | Green Rack Sterile Tips |
| Rack LTS 20 mL – GPS-L10S | Rainin | 17005090 | Red Rack Sterile Tips |
| FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| LSR II Cytometer | BD Biosciences | N/A | Custom order |
| Abca8a | Thermo Fisher Scientific | Mm00462440_m1 | Müller cells |
| Aldh1al | Thermo Fisher Scientific | Mm00657317_m1 | Müller cells |
| Aqp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00802131_m1 | Astrocytes |
| Calb2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00801461_m1 | Amacrine, Horizontal |
| Cd68 | Thermo Fisher Scientific | Mm03047340_m1 | Retinal Pigment Epithelial Cells |
| Gad2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00484623_m1 | Amacrine |
| Hprt | Thermo Fisher Scientific | Mm01545399_m1 | House keeping gene |
| Lhx1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01297482_m1 | Horizontal |
| Lim2 | Thermo Fisher Scientific | Mm00624623_m1 | Horizontal |
| Nrl | Thermo Fisher Scientific | Mm00476550_m1 | Photoreceptors |
| Ntrk1 | Thermo Fisher Scientific | Mm01219406_m1 | Horizontal |
| Pcp4 | Thermo Fisher Scientific | Mm00500973_m1 | Bipolar, Amacrine |
| Pou4f1 | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Prdx6 | Thermo Fisher Scientific | Mm00725435_s1 | Astrocytes |
| Prkca | Thermo Fisher Scientific | Mm00440858_m1 | Bipolar |
| Prox1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00435969_m1 | Horizontal |
| Pvalb | Thermo Fisher Scientific | Mm00443100_m1 | Amacrine |
| Rbpms | Thermo Fisher Scientific | Mm02343791_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Rom1 | Thermo Fisher Scientific | Mm00436364_g1 | Photoreceptors |
| Rpe65 | Thermo Fisher Scientific | Mm00504133_m1 | Retinal Pigment Epithelial cells |
| Slc1a3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00600697_m1 | Astrocytes |
| Slc6a9 | Thermo Fisher Scientific | Mm00433662_m1 | Amacrine |
| Sncg | Thermo Fisher Scientific | Mm00488345_m1 | Retinal Ganglion Cells |
| Tubb3 | Thermo Fisher Scientific | Mm00727586_s1 | Retinal Ganglion Cells |
| Vim | Thermo Fisher Scientific | Mm01333430_m1 | Müller cells |
| Taqman Universal Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4440047 | qPCR Reagent |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | RNA Isolation |
| SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | 11754250 | cDNA synthesis |
| Taqman PreAmp Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4391128 | Pre-Amplification step |
| BD Cytofix/ Cytoperm | BD Biosciences | 554714 | Fixation/ Permeabilization Buffer |
| BD Perm/ Wash | BD Biosciences | 554723 | Permeabilization Solution |
| RBPMS | Santa Cruz Biotechnology | sc-86815 | intracellular antibody |
| SNCG | Gene Tex | GTX110483 | intracellular antibody |
| BRN3A | Santa Cruz Biotechnology | sc-8429 | intracellular antibody |
| TUJ1 | BioLegend | 801202 | intracellular antibody |
References
- Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
- Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
- Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
- Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
- Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
- Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
- Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
- Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
- Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
- Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
- Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
- Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
- Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
- Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
- Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
- Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
- Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
- Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
- Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
- Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
- Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).
- Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
- Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
- Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
- Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936 (2014).
- Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).
- Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
- Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
- Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
- Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
- Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
- Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
- Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99 (2014).
- Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
- Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
- Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).
