Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Isolering af primære murin retinalganglionceller (RGC'er) ved flowcytometri

Published: July 5, 2017 doi: 10.3791/55785
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1,3,4, 1,2
1Department of Ophthalmology, Hamilton Eye Institute, University of Tennessee Health Science Center, 2Department of Microbiology, Immunology and Biochemistry, University of Tennessee Health Science Center, 3Department of Anatomy and Neurobiology, University of Tennessee Health Science Center, 4Department of Pharmaceutical Sciences, University of Tennessee Health Science Center

Summary

Millioner af mennesker lider af retinal degenerative sygdomme, der resulterer i irreversibel blindhed. Et fælles element i mange af disse sygdomme er tabet af retinale ganglionceller (RGC'er). Denne detaljerede protokol beskriver isoleringen af ​​primære murine RGC'er ved positiv og negativ selektion med flowcytometri.

Abstract

Neurodegenerative sygdomme har ofte en ødelæggende virkning på de berørte. Retinal ganglioncelle (RGC) tab er impliceret i en række sygdomme, herunder diabetisk retinopati og glaukom, ud over normal aldring. På trods af deres betydning har RGC'er været yderst vanskelige at studere indtil nu, dels skyldes, at de kun omfatter en lille procentdel af de mange forskellige celler i nethinden. Derudover bruger nuværende isoleringsmetoder intracellulære markører til at identificere RGC'er, der producerer ikke-levedygtige celler. Disse teknikker indebærer også lange isolationsprotokoller, så der mangler praktiske, standardiserede og pålidelige metoder til at opnå og isolere RGC'er. Dette arbejde beskriver en effektiv, omfattende og pålidelig metode til at isolere primære RGC'er fra mus retinae ved hjælp af en protokol baseret på både positive og negative udvælgelseskriterier. De fremlagte metoder gør det muligt for den fremtidige undersøgelse af RGC'er med det formål at forstå større størreFald i synsstyrke, der skyldes tabet af funktionelle RGC'er i neurodegenerative sygdomme.

Introduction

RGC'er er terminalt differentierede neuroner, og derfor kræves primære celler til forsøg. Udviklingen af ​​en protokol til isolering og berigelse af primære murin retinal ganglionceller (RGC'er) er grundlæggende for at afsløre mekanismerne for RGC-sundhed og degenerering in vitro . Dette er især vigtigt for studier, der søger at generere potentielle terapier til fremme af RGC-funktion og for at minimere deres død. Degenerationen af ​​RGC'er er forbundet med retinal degenerative sygdomme, såsom glaukom, diabetisk retinopati og normal aldring. Selvom de specifikke cellulære mekanismer, der ligger til grund for RGC-tab, er uklare, er der blevet identificeret en række risikofaktorer. Manglende oxygenation ved optisk nervehoved 1 , 2 , 3 forårsager RGC død 4 og virker som forstyrrelsen af ​​homeostasen mellem aktiveringen af ​​excitatoriske og iBinde receptorer inden for individuelle RGC'er 5 , 6 . En række udfordringer forhindrer fremskridt i retning af anvendelsen af ​​disse celler til dybdegående undersøgelser. For det første er antallet af RGC'er, der er til stede i en murin retina, lille. RGC'er udgør mindre end 1% af de samlede retinale celler 7 , 8 , 9 . For det andet er de fleste RGC-specifikke markører intracellulære proteiner 10 , 11 , 12 . Udvælgelse baseret på disse markører efterlader cellerne ikke-levedygtige, hvilket udelukker nedstrøms funktionelle analyser. Endelig er protokoller i øjeblikket lange og mangler standardisering 13 , 14 . Tidlige RGC-isolationsprotokoller var baseret på immunopanning-metoder. Barres et al. 15 Tilpasset den klassiske immunopløsningAnningsteknik og tilføjede et andet trin, som udelukkede monocytter og endotelceller fra hovedparten af ​​retinale celler forud for positivt udvalg baseret på immunopositivitet over for anti-thymocyt antigen (aka Thy1), en celleoverflademarkør. År senere, Hong et al. Kombinerede magnetiske perle isolationsteknikker med cellesorteringsstrategier til isolering af RGC'er med højere renhed 16 . Anvendelsen af ​​magnetiske perler anvendes stadig i mange videnskabelige applikationer. Sammen forbedrede magnetiske perler og flowcytometriprotokoller renheden af ​​isolerede celler. Imidlertid er disse oprensningssystemer endnu ikke blevet standardiseret til isolering af murine RGC'er fra dissocieret retinae.

Flowcytometri er en stærk analytisk metode, som måler optiske og fluorescensegenskaber ved cellesuspensioner. Celler analyseres både kvantitativt og kvalitativt med et højt niveau af følsomhed, hvilket tilvejebringer en multidimensionel analyse af cellepopulationention. Cellediskrimination er baseret på to hoved fysiske egenskaber: celle størrelse eller overfladeareal og granularitet eller intern kompleksitet 17 . En multidimensionel analyse kan udføres ved at kombinere antistoffer mærket med fluorokromer, der har lignende excitationsbølgelængder og forskellige emissioner. Flowcytometri er hurtig, reproducerbar og følsom. Multitep lasere tillader endnu større multidimensionale analyser af enkeltceller ved hjælp af flowcytometri. Det er således en attraktiv metode til undersøgelse af cytologiske prøver. Fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) anvender de multidimensionale fænotypiske forskelle identificeret ved flowcytometri til at sortere individuelle celler i forskellige subpopulationer.

I det sidste årti er flere overflade- og intracellulære proteiner blevet identificeret som potentielle biomarkører til udvælgelse af celler, herunder neuroner. Indledende undersøgelser, der forsøgte at isolere RGC'er fra rotter, brugte Thy1 som en ganglioncelleL markør. Desværre har Thy1, aka CD90, flere isoformer i andre gnaverarter 18 , 19 , 20 og udtrykkes af flere retinale celletyper 19 , 20 , hvilket gør det til en ikke-specifik markør for RGC'er. En anden overflademarkør, CD48, findes på monocytiske populationer i nethinden, herunder makrofager og microglia. Ved anvendelse af disse to overflademarkører blev en modificeret RGC signatur-Thy1 + og CD48 negceller udviklet 15 , 16 , 21 , 22 . Desværre er disse to udvælgelseskriterier ikke tilstrækkelige til at vælge en stærkt beriget RGC-population. For at imødegå dette ubehøvlede behov blev der udviklet en flowcytometriprotokol 23 baseret på flere lag positive og negative udvælgelseskriterier usiNg kendte celleoverflademarkører til berigelse og oprensning af primære murine RGC'er.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der er beskrevet i den følgende protokol, blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) bedømmelseskomité ved University of Tennessee Health Science Center (UTHSC) og fulgte ARVO-erklæringen for brug Af Dyr i Ophthalmic and Vision Research, ud over retningslinjerne for laboratoriedyr eksperimenter (Institut for Laboratorie Animalske Ressourcer, Folkesundhedspolitik om human pleje og brug af laboratoriedyr).

1. Forberedelse af instrumenter, løsninger og medier

Bemærk: Alle oplysninger om materialer, reagenser, værktøjer og instrumenter, der er rapporteret i protokollen, er angivet i Materialetabellen .

  1. Autoklaver alle dissektionsinstrumenter og opbevar dem i et sterilt område. Brug følgende instrumenter: 4 standard tang (2 lange og 2 korte) og 2 saks,Samt 2 tang (1 lang og 1 kort) og 1 saks til dissektionen; Hold et ekstra sæt som backup.
  2. Forbered 100 ml steril PBS / 1% FBS opløsning til brug under vask, immunolabeling procedurer og celle sortering trin. Opbevares opløsningen ved 4 ° C.
    Bemærk: Tilsæt ikke natriumazid (NaN 3 ) til opløsningen, da det kan være giftigt for levende celler.
    1. Fremstil 100 ml PBS / 1% FBS med 99 ml PBS og 1 ml FBS.
  3. Forbered 100 ml sterilt neuralt cellemedium suppleret med 3% FBS (se Materialetabellen ) til anvendelse som opsamlings- og dyrkningsmedium. Hold cellekulturmedium sterilt ved 4 ° C. Varm kun det til stuetemperatur (RT) inden brug.
    1. Forbered 100 ml neuralt cellemedium suppleret med 3% FBS ved anvendelse af 97 ml neuralt cellemedium og 3 ml FBS.
  4. Pre-chill-opsamlingsrør (15 ml rør) præcovert med 5 ml opsamlingsmedium ved at placere tHule i en isspand. Brug kun polypropylenrør for at forhindre, at cellerne klæber til røroverfladen.
  5. Placer 40 mm skål, 70 μm nylonstrimler, sprøjter, pistler til cellefiltret og sterile polypropylenrør i biosikkerhedskabinet. Steriliser alle varer forud for procedurerne og opretholde dem på en steril måde gennem hele procedurerne.
    Bemærk: Alle trin efter samlingen af ​​retinae vil blive udført i biosikkerhedskabinet.

2. Enukleation

Bemærk: I alt 10 unge (5-7 uger gamle) C57BL / 6J mus blev anvendt i dette forsøg til at isolere 1,0 x 106 RGC'er med fænotypen CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg .

  1. Euthaniser musene ved hjælp af CO 2 -inhalation efterfulgt af cervikal dislokation. Brug altid en sekundær eutanasi-metode for at sikre, at det euthaniserede dyr er dødt.
    2 . Ketamin anbefales ikke, da det er forbundet med en stigning i det intraokulære tryk (IOP), når det anvendes som inducer af anæstesi 24 , 25 .
  2. Indsæt tang under øjets klods, tag den optiske nerve og træk op; Kloden bliver enukleeret, med optisk nerve intakt. Anbring opsamlede øjne i et hætteglas, der indeholder PBS, og hold hætteglasset på is indtil næste trin.
    Bemærk: Ethvert personale kan udføre dette trin efter at have modtaget den passende uddannelse fra Laboratoriedyrplejeenheden (LACU).

3. Fremstilling af retinalcellesuspensionen

  1. Anbring det samlede øje på basispladen af ​​et dissektionsmikroskop for at starte hornhindefordelingen. Dissect hvert øje individuelt.
  2. Hold forsigtigt kloden på optisk nervebase ved hjælp af tang. For dette trin skal du bruge en lonG og en kort standard tang.
  3. Brug en skarp nål med 30 gauge (30G) til at punktere hornhinden, så den vandige humor kan evakuere fra øjet, hvilket gør det lettere at holde øjet med tangen.
  4. Hold hornhinden med tang og brug sakse til at lave et lille snit i hornhinden. Skal forsigtigt hornhinden og sclera ved hjælp af tangene. Når kloden er skrællet halvvejs, rul nethinden og linsen ud med tangen. Kassér hornhinden, sclera og linsen.
    Bemærk: Denne metode sikrer, at nethinden helt løsner fra resten af ​​øjet.
  5. Placer nethinden i en lille 40 mm petriskål indeholdende PBS / 1% FBS.
    Bemærk: Som et alternativ til petriskålen kan en cellekulturskål anvendes. Sørg altid for at holde retinaen fugtig, som i fysiologiske forhold.
    1. Vask hver retina tre gange med frisk steril PBS / 1% FBS inden for biosikkerhedskabinet.
  6. Placer op til 12 retinae påEn steril 70 μm nylonfilm fugtet med PBS / 1% FBS. Brug ryggen af ​​en 10 ml sprøjte, forsigtigt macerate retinae med en cirkelbevægelse for at løsne cellerne.
    1. Alternativt kan du bruge en pestle til celleservationsmaceration eller brug enzymatisk fordøjelse med en kombination af 15 IE / ml papain, 5 mM L-cystein og 200 U / ml DNase I i 15 minutter ved 37 ° C efterfulgt af inaktivering med PBS / 10% FBS.
      Bemærk: Der blev ikke observeret nogen ændringer i procenten af ​​de udvundne celler, når enzymatisk fordøjelse blev sammenlignet med maceration med enten back-end af sprøjten eller pistlen.
  7. For at overføre de isolerede celler anbringes den sterile 70 μm nylonfiltret over polypropylenopsamlingsrøret. Pass de samlede celler gennem silen ved hjælp af en P1000 pipette. Skyl silen ( trin 3.6 ) med PBS / 1% FBS for at frigive eventuelle resterende celler og overføre dem til opsamlingsrøret.
  8. Tilsæt PBS / 1% FBS til achEt slutvolumen på 1 ml pr. Nethinden. Centrifuge cellesuspensionen i 7 minutter ved 200 xg og RT.
    Bemærk: Afhængigt af antallet af macerated retinae (<6 retinae), kan cellepellet være for lille til at være synlig.
    1. Kassér cellesupernatanten og resuspender cellepelleten i PBS / 1% FBS ved anvendelse af et forhold på 1 ml pr. 5 retinae.
  9. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer.
    1. Rens et glas hæmocytometer og dækslip med 70% alkohol. Vrid forsigtigt røret, der indeholder cellerne, for at sikre, at retina cellesuspensionen er jævnt fordelt. Anbring 20 μl 0,4% trypanblåt i et mikrocentrifugerør og bland med 20 μl af cellesuspensionen.
    2. Bland forsigtigt og påfør 10 μL 0,4% trypanblå / cellesuspensionsblandingen til hæmocytometeret og fylder begge kamre; Kapillarvirkning vil trække 0,4% trypanblå / cellesuspensionsblandingen under dækslet. Tæl alle trypan-blå-negative celler ved hjælp af et mikroskop. thiS nummer repræsenterer levende celler.
    3. Bestem celle levedygtighed ved hjælp af følgende formel: antal levende celler / totalt antal celler =% levedygtighed.
      Bemærk: Hvis cellernes levedygtighed er mindre end 95%, kræves brug af fluorescerende farvestof for cellebærbarhedsdiskrimination under FACS.
  10. Brug et fluorescerende levedygtighedsfarvestof, der ikke er permeant til levende celler. Vask cellerne med PBS for at fjerne ethvert spor af serum. Tilsæt 1 μl fluorescerende farvestof til diskriminering af cellebærbarhed pr. 5,0 x 106 celler i et 100 μl slutvolumen. Inkubér ved stuetemperatur i 15 minutter, beskyttet mod lys. Tilsæt 10x volumenet af PBS / 1% FBS. Centrifuge i 5 minutter ved 200 xg og RT.
  11. Inkuber cellesuspension natten over ved 4 ° C, om nødvendigt. Hvis dette er gjort, skal du udfylde cellesuspensionsrøret med neuralt cellemedium i stedet for PBS / 1% FBS. Placer røret vandret og hold det ved 4 ° C.

4. Immunolabeling ReTinale celler

  1. Brug følgende konvertering til at bestemme mængden af ​​antistof pr. Celle nummer: 2 μl antistof pr. 5,0 x 106 celler i et 100 μl volumen.
  2. Vask cellerne og opretholde dem i PBS / 1% FBS. Tag en lille aliquot af celler (5,0 x 10 6 celler) til brug som en negativ kontrol (umærkede) på tidspunktet for sorteringsopsætningen.
    Bemærk: Denne negative kontrol er kritisk for korrekt kalibrering af celle sorteringen.
  3. For at minimere den ikke-specifikke binding af antistoffer mod celler, der udtrykker Fcγ-receptorerne II og III, tilsættes 1 μl af et anti-mus CD16 / 32 antistof pr. 1,0 x 106 celler i et 50 μl slutvolumen under anvendelse af PBS / 1% FBS. Inkubér i 10 minutter ved stuetemperatur.
  4. Tilsæt antistofcocktailen til prøven og bland forsigtigt ved pipettering. Inkubér i 30 minutter i en isspand. Sørg for, at isens spand er dækket, da lys kan kompromittere forsøget på grund af fotobildingen af ​​den mærket fluorphores.
    1. Forbered antistof-cocktail ved hjælp af følgende fluorescensmærkede anti-mus-antistoffer: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanin7, CD15 PE og ikke-mærket CD57.
      Bemærk: Brug for hvert antistof følgende koncentrationer pr. 5,0 x 106 celler: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-cyanin7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; Og u-mærket CD57, 0,4 μg.
      1. Brug volumener i henhold til følgende beregninger (baseret på de kommercielt tilgængelige antistoffer opført i Materialetabellen ): i alt 5,0 x 107 celler, der skal mærkes; 2 μl pr. 5,0 x 106 celler = 20 μl af hvert antistof; 4 forskellige antistoffer = 80 μl antistofcocktail; Slutvolumen = [(5,0 x 107 totale celler) / 5,0 x 106 celler] x 100 = 1000 μL; 80 μl Abs + 50 μl anti-mus CD16 / 32 + 870 μl PBS / 1% FBS = 1.000 μL.
        Bemærk: Denne kombination leveredeOptimal kombination af fluorokromer til instrumentkonfigurationen. Følgende parametre opsummerer emission og excitation: AF-700, emission på 719 nm, når den er ophidset med en 638 nm røddiode laser; PE-Cyanine7, emission af 767 nm, når den er ophidset med en 488 nm blå diode laser; Og PE, emission af 575 nm, når den er ophidset med en 488 nm blå diodelaser.
  5. Efter 30 minutters inkubation bringes volumen op til 5 ml under anvendelse af PBS / 1% FBS. Vask prøverne ved at centrifugere dem i 7 minutter ved 200 xg og RT. Gentag proceduren en gang for at fjerne alt ubundet antistof.
  6. Tilsæt 2 μL sekundært antistof (0,1 μg), som vil binde CD57 med 5,0 x 106 celler. Inkubér i 30 minutter i en isspand, som i trin 4.4 . Vask cellerne to gange, som i trin 4.5 .
    1. Mærk cellerne med sekundært antistof, hvis et u-mærket primært antistof blev anvendt i trin 4.4 .
      Bemærk: Den andenAryt antistof af valg til denne konfiguration er anført i Materialetabellen ; Den har en emissionsbølgelængde på 421 nm. Brug det med et bandpassfilter på 450/50 nm, når du er begejstret med den violette diodelaser ved 405 nm.
    2. Brug volumener i henhold til følgende beregninger (baseret på det kommercielt tilgængelige antistof, der er anført i Materialetabellen ): 2 μl pr. 5,0 x 106 celler = 20 μl sekundært antistof; Slutvolumen = [(5,0 x 10 7 totale celler) / 5,0 x 106 celler] x 50 = 500 μl; 20 μl Abs + 480 μl PBS / 1% FBS = 500 μl.
  7. Opbevar de mærkede celler i PBS / 1% FBS. Tæl cellerne ved hjælp af et hæmocytometer; Brug en endelig retinal celle koncentration på 3,0 - 4,0 x 107 celler / ml.
    Bemærk: Brug ikke cellekulturmedium til at fortynde cellerne, fordi phenolrødt kan øge autofluorescensen og derved reducere opløsningen mellem negatIve og positive celler. Den endelige cellekoncentration pr. Volumen er meget afhængig af volumenstrømshastigheden af ​​instrumentkonfigurationen.
  8. Brug enkeltfarvekontroller under opsætningen for at minimere fluorescensudslip.
    Bemærk: Dette trin, også kendt som kompensation, anvendes til at korrigere den støj, der er skabt af kombinationen af ​​fluorophorer. Polystyrenmikrosfærer i PBS / 0,1% BSA / 2 mM NaN3 med kapacitet til at binde fluorescensmærkede immunoglobulin (Ig) isotyper fra flere arter giver positive kontroller for at indstille kompensationen.
    1. Anbring 3 dråber af polystyrenmikrokuglerne i sterile FACS-rør, tildeling af en pr. Fluorofor. Tilsæt 1 μg af den respektive fluorophor til hvert rør. Inkubér i 15 minutter ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. Tilsæt 3 ml PBS / 1% FBS til prøverørene. Centrifuge i 5 minutter ved 200 xg og RT. Fjern forsigtigt supernatanten og resuspender i 250 μl PBS / 1% FBS.
    2. For at indstille den negative kontrOls, brug polystyren mikrosfærer, der ikke binder til Ig. Udfør dette trin dagen før, hvis det er nødvendigt.

5. Cell Sortering strategi

Bemærk: Specifikke instruktioner til instrumentopsætning for FACS med 355 nm, UV; 405 nm, violet; 488 nm, blå; Og 640 nm, røde lasere med henholdsvis 2, 2, 5 og 3 fluorescenskanalfordeling. Operationssoftwaren var DIVA version 8.0.1. Celle sortering blev udført med en 70 μm dyse, 70 psi kappe tryk, 87,5 frekvens, 48,6 amplitude med første dråbe breakoff ved 333, mellemrumsopstilling af 6, sort præcision sat til fire-vejs renhed med standard (32) renhedsmaske og drop Forsinkelse justeret til 42,98 ved anvendelse af perler.

  1. Brug 15 ml polypropylen koniske rør som opsamlingsbeholdere. Tilsæt 5 ml af opsamlingsmediet (cellekulturmedium) til hvert rør og drej røret for at belægge væggene.
    Bemærk: Dette trin forhindrer cellerne i at klæbe til siderne af tHan samlingsrør. Som et alternativ kan rør belægges med ufortyndet FBS.
  2. Tage i betragtning effektiviteten af ​​cellesorteringen for at estimere det endelige udbytte af celler.
    Bemærk: Sortens effektivitet varierer afhængigt af det anvendte flowcytometer. RGC'er med CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fænotypen omfatter ca. 1% af alle retinale celler.
  3. Har cellesorteringen udført af en uddannet operatør (normalt i en kernefacilitet). Sørg for, at instrumentet er renset og steriliseret med 70% ethanol før prøveudtagning. Tør forsigtigt udvendig af opsamlingsrør med 70% ethanol også.
  4. Hvis cellerne har sat sig eller aggregeret, pipetterer cellerne op og ned og filtrerer suspensionen gennem en steril 40 μm nylonfilm før opkøb. Sørg for at styre temperaturen og holde den ved 4 ° C, mens cellesorteringen udføres; Manglende evne til at gøre det vil reducere cellenJeg giver.
  5. Diskuter detaljerne af sorteringen med celle sorteringsoperatøren forud for udførelsen af ​​eksperimenterne.
    Bemærk: På tidspunktet for eksperimentet har celle sorteringsoperatøren klikket på en række knapper fra værktøjslinjen Arbejdsrums værktøjslinje til opkøbsprogrammet til cytometeret. Disse er Browser , Cytometer , Inspector , Worksheet og Acquisition Dashboard . Strategien med cellesortering brugt her er kendt som en 2-vejs sortering. To populationer indsamles: de berigede RGC'er og alle andre celletyper. Hvis yderligere populationer skal indsamles, kan op til to yderligere populationer isoleres som en 4-vejs sortering. Hvis yderligere populationer vil blive samlet, kræver celle sorteringen forskellige opsamlingsrør og opsætning.
  6. Udfør kompensation for at korrigere for spektral overlapning fra fluoroforerne.
    Bemærk: Denne proces kan gøres manuelt ved at justereHver indstilling, eller det kan ske automatisk som en del af den anvendte software. De fleste software til celle sorteringsudstyr har mulighed for en automatiseret kompensation. Det betragtes som guldstandarden og den mest præcise type kompensation. Den negative (ingen fluorofor) prøve og de enkelte kontroller fremstillet med polysterenmikrosfærer (kompensationskugler), der er fremstillet specifikt til at binde alle relevante monoklonale antistoffer anvendt i eksperimentet, vil blive anvendt i dette trin.
    1. Vælg Eksperiment> Kompensationsopsætning> Opret kompensationskontrol . Tilføj de fluorofor-specifikke kontroller fra listen, der vises på skærmen. Klik på OK .
      Bemærk: Et kompensationsrør for hver af kontrollerne vises.
      1. Brug en umærket kontrol (ikke fluorophore, trin 4.2 ) for at verificere det fremadskalede lys (FSC), det sidedistribuerede lys (SSC) og til at indlede den indledende population (P1).
    2. Installer det negative kontrolrør på cytometeret og klik på Load. Kontroller, at interessepopulationen vises og vælg den. Dette er befolkning 1 (P1). Højreklik på P1-porten, og vælg Anvend på alle kompensationskontroller . Klik på Record data . Når optagelsen er færdig, skal du klikke på Løsning og fjern røret.
    3. Installer det næste rør på cytometeret, som det vises på skærmen. Gentag trin 5.6.2, indtil alle data fra kontrollerne er optaget.
    4. Vælg Eksperiment> Kompensationsopsætning> Beregn kompensation . Gem opsætningen og navngiv eksperimentet. Klik på Link og gem .
      Bemærk: Kompensation er et nødvendigt trin, da det fjerner spektrumoverlapningen mellem detektorerne.
    5. Hvis manuel kompensation er nødvendig, skal du gøre det ved at justere middelene for de positive signaler, så de svarer til negativerne for eacH af de anvendte fluorokromer.
      Bemærk: Dette trin udføres af celle sorteringsoperationen og kan tage 30 minutter.
  7. Gating strategi ( Figur 3A ).
    1. Opsæt P1 ved at plotte FSC versus SSC; FSC er indikativ for størrelsen, og SSC indikerer cellernes interne kompleksitet. Se figur 3A .
    2. Tegn et pseudocolor-plot af SSC-H (højde) versus SSC-W (bredde) ved hjælp af den valgte population i trin 5.7.1 (P1); Pseudocolor-plottet muliggør den visuelle repræsentation af densiteten af ​​celler i forhold til hinanden.
      Bemærk: En lavere celletæthed er repræsenteret af blå og grøn, mens røde og orange områder repræsenterer højcelletæthed.
      1. Udfør dette trin for kun at indsamle enkelte celler; Enkeltcelleporten hedder P2. Se figur 3A .
    3. Gentag trin 5.7.2 tilPlot FSC-H versus FSC-W ved anvendelse af P2. Sørg for, at udvælgelsen af ​​enkeltceller som "dubletter" eller celleklumper indeholder både en positiv og en negativ markør, hvilket giver falsk positivitet.
    4. Tegn et pseudocolor plot af CD90.2 versus CD48. Vælg alle CD90.2 + CD48 negceller for at eliminere monocytter fra RGC-berigelsen; Kalder denne port CD90.2 + CD48 neg , eller P3. Se figur 3A .
    5. Brug den valgte CD90.2 + CD48 neg population eller P3 gate, tegne et pseudocolor plot af CD57 versus CD15 for at eliminere amakrine celleforurenende stoffer fra RGC berigelsen. Gate CD15 neg CD57 neg befolkningen. Se figur 3A .
  8. Definer de populationer, der skal indsamles for prøven, i vinduet "Sorter layout" og fortsæt med cellesorteringen; Prøven til indsamling er CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg p>.
    Bemærk: Den population, der skal sorteres, vælges fra rullemenuen Tilføj menu i sorteringsvinduet. Efter at have tilføjet befolkningen, vil den bede om målbegivenheder eller hvor mange arrangementer der skal indsamles. Sorteringslayoutet kan til enhver tid redigeres ved at klikke på feltet Sorter placering , der indeholder befolkningen. 0,9% ± 0,3 af RGC'er med fænotype CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg opnås fra unge (5-7 uger gamle) og 0,5% ± 0,3 og gamle (> 12 måneder gamle) C57BL / 6J mus 23 .
  9. Ved hjælp af 25.000 celler udføres en renhedskontrol 23 . Se figur 3B -E.
    Bemærk: Renhedskontrollen er processen til at analysere de sorterede celler igen for at kontrollere nøjagtigheden af ​​celle sorteringen. En lille aliquot af sorterede celler vil blive indlæst på cytometeret for at verificere effektiviteten af ​​sorteringen.
_title "> 6. Bekræftelse på RGC Intracellulære Markører

  1. Intracellulær mærkning.
    1. Fastsæt sorterede celler i 1 time og permeabiliser ved 4 ° C for at gøre cellerne metabolisk inaktive og for at muliggøre penetrering af intracellulære antistoffer.
    2. Fortynd de følgende antistoffer i permeabiliseringsopløsningen: anti-RNA-bindende protein med multiple splejsning (RBPMS) ved en 1: 100 fortynding i en 100 μg / ml stamme; Anti-synuclein gamma (SNCG), 1: 100 i en 1 mg / ml stamme; Hjerne-specifikt homeobox / POU-domæne protein 3A (BRN3A), 1: 100 i en 200 μg / ml stamme; Og anti-neuron-specifik klasse III beta-tubulin (TUJ1), 1: 100 i en 1 mg / ml stamme. Inkuber cellerne og antistofopløsningerne i 1 time i en overdækket isspand.
    3. Vask prøverne to gange med PBS / 1% FBS.
    4. Resuspender cellerne i det passende AF488-mærket sekundært antistof ved en 1: 200 fortynding i 30 minutter i en isspand.
    5. Vask prøverne som i trin 6.1.3. Hold cellerne iPBS / 1% FBS (250 μL) indtil klar til analyse.

7. Validering af cellen Sortering ved qPCR analyse

Bemærk: Se figur 4 .

  1. RNA-ekstraktion 23 .
    1. Ekstraherer RNA fra 5,0 x 105 sorterede celler ved cellelys og homogenisering efterfulgt af tilsætningen af ​​chloroform.
    2. Overfør den øvre farveløse fase til en ren mikrotube til alkoholpræcipitation efterfulgt af ekstraktkoncentration i en rotationssøjle. Udfør DNAse fordøjelse på søjlen.
    3. Vask kolonnen med RNase-frit vand til RNA-eluering.
    4. Vurder RNA-koncentrationen ved spektrofotometri.
  2. CDNA-syntese og præamplifikation.
    1. Brug 100 ng RNA materiale og bland med en opløsning indeholdende revers transkriptase enzym, rekombinant ribonuclease hæmmer (for at undgå RNA nedbrydning), magnesiumchlorid (MgCL2) og deoxynukleotider.
    2. Bland rørindholdet og inkuber i 10 minutter ved 25 ° C efterfulgt af 60 minutter ved 42 ° C. Afslut reaktionen med en 5 minutters inkubation ved 85 ° C. Opbevar det resulterende cDNA ved -20 ° C indtil det er klar til brug.
      Bemærk: cDNA-materialet kan opbevares ved -20 ° C i op til en måned, hvis præamplifikationstrinnet ikke kan udføres straks.
  3. Foramplifikation af cDNA.
    1. Pre-amplificere cDNA-materiale ved anvendelse af en række primere, der er specifikke for flere retinale celletyper, herunder: retinale ganglionceller, amakrine celler, astrocytter, Müller, bipolar, vandret, fotoreceptorer og retinale pigmentepitelceller som beskrevet i reference 23 og i tabellen Af materialer .
      Bemærk: Pre-amplificeringsreaktionen er fremstillet til at forøge sensitiviteten af ​​detektion til kvantificering. Preamplificeringsreaktionen indeholder en blanding af primerenBlander fra materialetabellen ; 2,5 μl cDNA, som startede ved 100 ng RNA; Reverse transkriptase enzym; Og nukleasefrit vand i et slutvolumen på 10 μl.
    2. Udfør enzymaktiveringstrinet ved 95 ° C i 10 minutter efterfulgt af 14 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder efterfulgt af 60 ° C i 4 minutter. Fortynd det forforstærkede materiale 1:10 i Tris EDTA buffer og hold det ved -20 ° C indtil det er klar til brug.
  4. 7.4 qPCR reaktion.
    1. Forbered alle qPCR-reaktioner i et 10 μl slutvolumen ved anvendelse af det fortyndede, foramplificerede cDNA (2,5 μL), primere (anført i Materialetabellen ), nukleasefrit vand og et koncentrat med DNA-polymerase og deoxynukleotider.
    2. Brug følgende instrumentbetingelser til at køre qPCR: et hold trin på 50 ° C i 2 min, efterfulgt af 95 ° C i 10 minutter. Kør i alt 40 cykler ved 95 ° C i 15 sekunder efterfulgt af 60 ° C i 1 min. Udfør alle målEments i replikater af tre.
    3. Udfør relativ kvantificering ved brug af den komparative tærskel (C T ) efter bestemmelse af værdierne for C T for husholdningsgenet og målgenene i hver prøve. Beregn den relative foldændring (R q ) ved hjælp af følgende ligning: R q = 2 T- AC , hvor ΔC T = C T målgen - C T referencegen 23 .
      Bemærk: C T er defineret som PCR-cyklen, hvormed fluorescenssignalet fra reporterfarvestoffet krydser en vilkårligt placeret tærskel 26 . C T er omvendt relateret til mængden af ​​amplicon (PCR-produkt) i reaktionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den dybtgående undersøgelse af RGC'er er hæmmet af mange faktorer, herunder deres lave frekvens og manglen på en robust og standardiseret metode til isolering. Figur 1 viser metoden anvendt til retinae-isolation. Variationer i enukleationsproceduren eksisterer baseret på typen af ​​analyse, såsom om enukleationen er en del af in vivo- forsøg 27 . Enukleering i denne protokol udføres på euthaniserede mus. Som vist i figur 1A- B , er tænger anbragt under øjet og trukket op for at forårsage minimal blødning og fjerne en øjenklod med en intakt optisk nerve.

Forskelle findes i antallet af RGC'er i forskellige musestammer, især i genetisk ændrede mus 23 , 28 ,Ef "> 29 , 30. Bevidsthed om disse forskelle er vigtig ved bestemmelse af antallet af mus, der skal anvendes. Retinae fra gamle C57BL / 6J mus har færre levende retinale celler end deres yngre modstykker 23. Derfor skal retinal dissektion udføres omhyggeligt til Maksimere celleudbyttet. En trin-for-trin fremgangsmåde til retinaldissektion er vist i figur 1C- J . Retinale celler er skrøbelige. Således placeres dissekerede retinae i nylonstrimler og macereres med enten enden af ​​en sprøjte som Vist i figur 2A eller med en pestle for celleforstærkere. Makerering af celler direkte i cellefiltret er hurtig og reducerer celleklumper. Et repræsentativt billede af cellesuspensionen er illustreret i figur 2B . Flere indre retinale celler kan visualiseres. På dette tidspunkt har RGC'erne mistet deres signatur morpholoGy på grund af axotomi under celleisolering og fremstilling af cellesuspensionen.

Det mest arbejdskrævende trin i denne metode er celle sorteringsopsætningen. Denne fase er et kritisk trin under flerfarvet FACS, da det maksimerer signal-til-støjopløsning. Figur 3A viser gatingstrategien anvendt til isolering af RGC'er. Denne strategi var rettet mod fjernelse af forurenende celler fra cellesuspensionen, som indbefattede monocytter, glial-, amakrine- og fotoreceptorceller. Som en del af metoden blev yderligere overflademarkører bekræftet ved immunhistokemisk analyse, før de blev anvendt som led i udelukkelsesstrategien. Tidligere data viste, at en lille procentdel af CD90.2 + celler er CD48 + . Udelukkelse af disse celler fjernede monocytter og muligvis microglia fra retinae cellepuljen. Det har tidligere vist sig, at den klassiske Thy1 + CD48 neg 23 , da disse celler udtrykker gener forbundet med amakrin, Müller, bipolær, vandret fotoreceptor og retinale pigmentepitelceller ( Figur 4A ). Dette behandles yderligere ved at undersøge yderligere markører for celleudstødelse. CD15 er blevet beskrevet som en markør for amacrine og bipolære celler 31 , hvilket bevirker dets anvendelse som en yderligere markør til negativt selektion. Arbejde fra Uusitalo et al. 32 beskrev CD57 som en identifikationsmarkør for glialceller og fotoreceptorer. Derfor blev dette antistof tilsat til cellesorteringsstrategien.

Derefter blev disse celler karakteriseret til at validere metoden til isolering af murine RGC'er. Fænotyperne af CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg- sorterede celler (<Stærk klasse = "xfig"> Figur 3B) blev evalueret for ekspressionen af ​​de følgende intracellulære markører associeret med RGCs 10 , 11 , 12 , 33 : SNCG, BRN3A, TUJ1 og RBPMS. Som vist i figur 3C udtrykte de sorterede celler alle fire RGC-associerede intracellulære proteiner. Dernæst blev billeddannelses-flowcytometri anvendt i figur 3D for at vise den intracellulære lokalisering af RBPMS og celleoverfladeekspression af CD90.2. Disse resultater blev testet i flere cytometersystemer, hvilket bekræfter reproducerbarheden og standardiseringen. Som vist i figur 3E begyndte nogle af de sorterede celler at vise morfologien associeret med RGC'er efter in vitro cellekultur.

Endelig en sammenligning af celler forud for berigelse og post-ceLl analyse blev udført ved qPCR analyse. Sammenligning af Thy1 + CD48 neg- fænotypen til CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg- sorterede celler viste, at Thy1 + CD48 neg- fænotypen udtrykker gener forbundet med RGC'er, men også med andre retinale celler. Den højt berigede sorterede cellepopulation ( Figur 4B ) viste imidlertid en mangefold stigning i generne, der koder for de RGC-specifikke intracellulære markører Sncg (SNCG), Pouf4l (BRN3A), Tubb3 (TUJ1) og Rbpms (RBPMS). Samlet validerede mRNA- og proteinvurderingen metoden.

figur 1
Figur 1 . Enukleation og okulær Dissektion til Retinal Isolation. Unge C57BL / 6J mus blev euthaniseret forud for tO fjernelse af øjenkloden med CO 2 og cervikal dislokation. A) Placer tænger under øjet og træk øjet op i en bevægelse. B) Øjet fjernes, herunder optisk nerve. CJ) Trin-for-trin vejledning til fjernelse af nethinden. C) En punktering udføres under anvendelse af en 30G nål før korneal fjernelse for at tillade den vandige humor at forlade øjet. D) Hornhinden holdes med tang for at gøre et lille snit. EF) Brug af tinder muliggør afskalning af hornhinden, retinal pigmentepitel, choroid og sclera. Nethinden løsnes fra scleraen, rulles og fjernes. G) Linsen fjernes og kasseres. HJ) Den samlede retinae placeres i en lille skål, der indeholder PBS / 1% FBS for altid at holde dem fugtige. Klik her for at se en større version af dennefigur.

Figur 2
Figur 2 . Retinal Cell Suspension efter Maceration af Collected Retinae. Den samlede retinae er anbragt i en lille skål for at isolere cellerne. A) Retinae anbringes i en 70 μm nylonfilm og macereres ved hjælp af en spids bagside. B) Repræsentativt billede af cellesuspensionen, hvor adskilte retinale celler observeres. Målestangen er 10 μm.

Figur 3
Figur 3 . Sortering af strategi for isolering af celler med CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg- fenotype og post-sorteringsanalyse. Sorteringsstrategien er baseret på inklusion af CD90.2-celler og udelukkelsen af ​​CD48-, CD15- og CD57-positive celler, som er forurenende celler. A) Som et første skridt, plotstørrelse (FSC) og intern kompleksitet (SSC) for at få et overblik over cellepopulationen. Indledende gated population (P1) bruges til at diskriminere mellem enkeltceller og klumpede celler eller aggregater ved hjælp af SSC-højden (H) versus bredden (W), P2. Valget af de enkelte celler bruges til at vælge CD90.2 + CD48 negcellerne. For at bekræfte fjernelse af alle dubletter udføres en plot af FSC-H versus FSC-W, P3 (mellempanel). Celler blev mærket med AF700-konjugeret anti-mus CD90.2, PE-Cyanin7-konjugeret anti-mus CD48, PE-konjugeret CD15 og anti-mouse CD57. Som et sekundært antistof til mærkning af anti-mus CD57 blev anti-mus BV421 anvendt. Befolkning 3 (P3) blev plottet i den fjerde </ Em> panel for at vælge CD90.2 + CD48 negcellerne, fjerne størstedelen af ​​forurenende celler. Derefter genereres en CD57 versus CD15 plot ved anvendelse af de valgte CD90.2 + CD48 negceller. Kvadrant 4 (Q4) er valgt, da den repræsenterer CD90.2 + CD48 negcellerne, der er negative for både CD15 og CD57. Den resulterende fænotype af den gated population er CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg . B) Efter-sorteringsanalyse af overflademarkørerne anvendt i A). Sorterede celler er homogene i størrelse, som vist i det første panel. De efterfølgende histogrammer viser procentdelen af ​​hver overflademarkør, der anvendes i sorteringsstrategien, der er beskrevet i A). I alt 95% af cellerne er CD90.2 + , som vist i den sorte linje sammenlignet med Ig-kontrollen, repræsenteret af det faste histogram. Disse celler blev gated for at evaluere procentsatserne af CD48, CD15 og CD57, repræsenteret af den røde, blå og greeN linjer. Resultater viser minimal ekspression af disse celleoverflademarkører. C) Bekræftelse af RGC-fænotypen ved anvendelse af de RGC-specifikke intracellulære markører SNCG, BRN3A, TUJ1 og RBPMS. Sorte linjer repræsenterer procentdelen af ​​celler, som udtrykker hver intracellulær markør. D) Repræsentative billeder taget i en billedceller sortering, der viser den intracellulære lokalisering af RBPMS, en RGC-specifik intracellulær markør og celleoverflademarkøren CD90.2. Målestangen er 20 μm. E) Repræsentativt billede af sorterede RGC'er efter 24 timer i kultur ved anvendelse af et konfokalt mikroskop. Målestangen er 20 μm. Billeder BE er tilpasset fra tidligere udgivet arbejde med tilladelse 23 . Billeder DE blev taget på 20X. Klik her for at se en større version af denne figur.


Figur 4 . Pre- og post-sortering mRNA analyse. Thy1 + CD48 neg og sorterede celler med fænotypen CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg blev vurderet ved qPCR analyse ved anvendelse af et panel på 25 gener udtrykt af retinale celler. Målgen-ekspressionsniveauer præsenteres som en Log 2- fold ændring ved anvendelse af Hprt som et husholdningsgen og vand som en negativ kontrol. Beregningen blev udført baseret på ΔC T- metoden. Mean ± SEM; N = 3 biologiske replikater blev udført i triplikat. Tal opnået fra tidligere offentliggjort arbejde med tilladelse 23 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

FACS er den valgte teknik til at rense cellepopulationer. Andre isoleringsmetoder indbefatter immunopanning, magnetiske perler og komplementfiksationsdepletion. Fordelen ved FACS over disse andre metoder er baseret på samtidig identifikation af celleoverflademarkører med varierende intensitetsgrader. Molekylens fluorescerende intensitet er proportional med mængden af ​​proteinekspression. Indtil nu var isoleringen af ​​RGC'er udelukkende baseret på Thy1 (CD90) positivitet og CD48 negativitet 15 , 16 , 22 , 34 , uanset den anvendte isolationsmetode. Det har for nylig vist sig, at Thy1 + CD48 neg- fænotypen ikke er tilstrækkelig til at isolere en homogen population af celler, der udtrykker RGC-intracellulære markører 23 . Identifikation af RGC-populationen er afgørende for deres isolation, isærY fordi de omfatter en lille procentdel af retinale celler 7 , 8 , 9 . Størstedelen af ​​RGC'er er placeret i retinaens inderste lag, medens et lille antal er placeret i de indre plexiforme lag (forskudte RGC'er 35 ). Sporing af RGC'er fra overlegen colliculi ved stereotaktiske injektioner og sporing med hydroxystillbamidin (et retrograd sporstof til skitsering af neuroner) blev således attraktive valg for mange laboratorier 36 , 37 , 38 . Disse systemer kræver indsprøjtning af sporer, som, hvis de ikke udføres ordentligt, kan medføre, at nogle retinale områder forlades uoptræk. Derudover er de mere teknisk krævende, og ligesom andre metoder som immunopanning er lange. Immunopanning ved hjælp af anti-Thy1- og -CD48-antistofferne tager 48 timer at fuldføre og opnår ikke mere end 95% Renhed. Dette værk beskriver en FACS-baseret metode, der tilbyder en hurtig og reproducerbar protokol til at isolere en homogen population af levende RGC'er med CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fænotype uden brug af sporstoffer, magnetiske perler eller immunopanningsteknikker .

Følgende faktorer er nødvendige for en vellykket isolering af rene RGC'er af FACS: 1) sorteringseffektivitet, hvilket meget afhænger af det anvendte udstyr; 2) optimal kombination af antistof-mærket fluorochrom for at minimere støj Og 3) celle sorteringsopsætning. Sorteringseffektiviteten beregnes ved at tage antallet af målhændelser valgt til sortering divideret med antallet af målhændelser, der er opdaget, udtrykt som en procentdel. Sort effektiviteten er en beregning leveret af udstyret. Denne effektivitet afhænger af opsætningen af ​​sorteringssystemet og cellesorteringsfunktionen. At vælge en optimal kombination af fluorokrom er en kompleks proces. Hvert influenzaOrochrome har forskellige egenskaber og er karakteriseret ved dets excitations- og emissionsbølgelængder. Mens excitationen læses med en laser, læses emissionen af ​​fotomultiplikatorrør, som er begrænset af de optiske filtre, der er tilgængelige i FACS sorteringsudstyr. Her tilvejebringes en kombination af antistof-mærket fluorochrom PE, PE-Cyanine7, AF700 og BV421. Dette blev bestemt efter overvejelse af flere fluorochromkombinationer, som gav den bedste opløsning, mens reduktion af spektral overlapning. Endelig er sorteringsopsætningen kritisk. Generelt er retinale celler skrøbelige. Således er det bedst at bruge et lavere tryk til at køre prøverne for at minimere stress på cellerne. Det er kritisk at holde prøven ved 4 ° C, fordi at holde murine RGC'er i længere tid ved stuetemperatur kan reducere celleudbyttet, især når der sorteres stort antal celler.

FACS-baseret sortering er en ideel metode til isolering af celler, der udgøres afUdskyder lille procentdel af cellesuspensionen. Processen, fra retinaldissektion til færdiggørelse af cellesortering, tager cirka 5 - 6 timer sammenlignet med immunopanning og sporingssystemer, som tager dage at fuldføre. Den multidimensionale analyse af FACS og udstyrets evne til at samle flere levedygtige populationer muliggør yderligere funktionelle analyser af celler. Protokollen beskrevet her er et kraftfuldt værktøj til isolering af primære murine RGC'er. På trods af dets mange fordele, herunder dens følsomhed, reproducerbarhed og den umiddelbare identifikation af levedygtige celler, er der nogle begrænsninger. For det første kræver det dyr instrumentering og en højtuddannet operatør. Normalt er operatøren en immunolog eller en højtuddannet individ i marken, med hvem der er nødvendigt at mødes på tidspunktet for forsøgsopsætningen. I dag har akademiske faciliteter flere kernefaciliteter, som kan lette udførelsen af ​​disse typer forsøg. For det andet mister RGC deres tyPical morfologi på grund af atoxomi, hvilket gør dem meget små i størrelse. På nuværende tidspunkt er det ikke kendt, om nogle af deres gener kan moduleres på grund af atoxomi.

Metoden, der præsenteres her, muliggør nedstrømsanalyse af RGC-funktion in vitro og er et værdifuldt værktøj til brug inden for syns- og sundhedsvidenskab. Vedligeholdelse af ganglioncelleudgang til hjernen er nødvendig for visuel opfattelse og er i fare i flere sygdomme. Disse celler kan anvendes til kontrolleret in vitro- forsøg, både i sunde og sygdomsmodeller. Elektrofysiologiske, farmakologiske, biokemiske og molekylære undersøgelser kan udføres på disse celler, som er ideel til udvikling af fremtidige terapeutiske mål.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke hr. Tim Higgins, Senior Illustrator fra Institut for Mikrobiologi, Immunologi og Biokemi, til teknisk videohjælp; Dr. Matthew W. Wilson til diskussioner og medlemmerne af laboratorierne Jablonski og Morales-Tirado for deres nyttige kommentarer. Dette arbejde blev støttet af Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T); Gerwin Pre-doctoral fellowship (ZKG), Institut for Forsvar Army Medical Research and Materiel Command (VMM-T) og det ubegrænsede tilskud fra forskning til forebyggelse af blindhed.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-mouse CD15 PE BioLegend 125606 Clone MC-480
Anti-mouse CD48 PE-Cy7 BioLegend 103424 Clone HM48-1
Anti-mouse CD57 Sigma Aldrich C6680-100TST Clone VC1.1
Anti-mouse CD90.2 AF700 BioLegend 105320 Clone 30-H12
Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgG BioLegend 405317 Clone Poly4053
Purified Anti-mouse CD16/32 BioLegend 101302 FcgRII/III block, Clone 93
Zombie Aqua  BioLegend 423102 Live cell/ Dead cell discrimination
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 U.S. origin
AbC Total Antibody Compensation Bead Kit Thermo Fisher Scientific A10497 Multi-species Ig
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Add serum to media prior to culture.
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 10010049 Saline solution
Dissection Microscope Olympus SZ-PT Model Stereo Microscope
Sorvall Centrifuge Thermo Scientific ST 16R All centrifugation performed  at RT
Base Plate – Dissection Pan Fisher Scientific SB15233FIM A wax plate can also be used
Forceps Aesculap 5002-7 4 ½ inches
Iris Scissors, Straight Aesculap 1360 5 ½ inches
Falcon 15 mL conical tubes Fisher Scientific 352097 Polypropylene tubes
Falcon 50 mL conical tubes Fisher Scientific 352098 Polypropylene tubes
BD FACS Tubes Fisher Scientific 352003 Polypropylene tubes
40 mm dishes MidSci TP93040 Tissue culture treated
70 μm nylon strainer MidSci 70ICS sterile
40 μm nylon strainer MidSci 40ICS sterile
 BD 10 mL syringe Fisher Scientific 301604 Disposable Syringe without needle
Pestles MidSci PEST sterile
Wheaton Vials Fisher Scientific 986734 No Liner
BD 30 G needle Fisher Scientific 305128 1 inch
Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting Chamber Fisher Scientific 0267151B Hemocytometer
Gibco Trypan blue 0.4% Solution Fisher Scientific 15250061 Viability Dye
Eppendorf tubes Fisher Scientific 05-402-25 1.5mL
EVOS Floid Cell Imaging Thermo Fisher Scientific 447113 Fluorescence Imaging with a 20X objective
100% Ethanol Fisher Scientific 04-355-452 Used to make 70% Ethanol
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+ Rainin 17014282 LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+ Rainin 17014391 LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+ Rainin 17014392 LTS Pipette
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000S Rainin 17005088 Blue Rack Sterile Tips
Rack LTS 250 mL – GPS-L250S Rainin 17005092 Green Rack Sterile Tips
Rack LTS 20 mL – GPS-L10S Rainin 17005090 Red Rack Sterile Tips
FACSAria II Cell Sorter BD Biosciences N/A Custom order
LSR II Cytometer BD Biosciences N/A Custom order
Abca8a Thermo Fisher Scientific Mm00462440_m1 Müller cells
Aldh1al Thermo Fisher Scientific Mm00657317_m1 Müller cells
Aqp4 Thermo Fisher Scientific Mm00802131_m1 Astrocytes
Calb2 Thermo Fisher Scientific Mm00801461_m1 Amacrine, Horizontal
Cd68 Thermo Fisher Scientific Mm03047340_m1 Retinal Pigment Epithelial Cells
Gad2 Thermo Fisher Scientific Mm00484623_m1 Amacrine
Hprt Thermo Fisher Scientific Mm01545399_m1 House keeping gene
Lhx1 Thermo Fisher Scientific Mm01297482_m1 Horizontal
Lim2 Thermo Fisher Scientific Mm00624623_m1 Horizontal
Nrl Thermo Fisher Scientific Mm00476550_m1 Photoreceptors
Ntrk1 Thermo Fisher Scientific Mm01219406_m1 Horizontal
Pcp4 Thermo Fisher Scientific Mm00500973_m1 Bipolar, Amacrine
Pou4f1 Thermo Fisher Scientific Mm02343791_m1 Retinal Ganglion Cells
Prdx6 Thermo Fisher Scientific Mm00725435_s1 Astrocytes
Prkca Thermo Fisher Scientific Mm00440858_m1 Bipolar
Prox1 Thermo Fisher Scientific Mm00435969_m1 Horizontal
Pvalb Thermo Fisher Scientific Mm00443100_m1 Amacrine
Rbpms Thermo Fisher Scientific Mm02343791_m1 Retinal Ganglion Cells
Rom1 Thermo Fisher Scientific Mm00436364_g1 Photoreceptors
Rpe65 Thermo Fisher Scientific Mm00504133_m1 Retinal Pigment Epithelial cells
Slc1a3 Thermo Fisher Scientific Mm00600697_m1 Astrocytes
Slc6a9 Thermo Fisher Scientific Mm00433662_m1 Amacrine
Sncg Thermo Fisher Scientific Mm00488345_m1 Retinal Ganglion Cells
Tubb3 Thermo Fisher Scientific Mm00727586_s1 Retinal Ganglion Cells
Vim Thermo Fisher Scientific Mm01333430_m1 Müller cells
Taqman Universal Master Mix Thermo Fisher Scientific 4440047 qPCR Reagent
miRNeasy Mini Kit Qiagen 217004 RNA Isolation
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit Thermo Fisher Scientific 11754250 cDNA synthesis
Taqman PreAmp Master Mix Thermo Fisher Scientific 4391128 Pre-Amplification step
BD Cytofix/ Cytoperm BD Biosciences 554714 Fixation/ Permeabilization Buffer
BD Perm/ Wash BD Biosciences 554723 Permeabilization Solution
RBPMS Santa Cruz Biotechnology sc-86815 intracellular antibody
SNCG Gene Tex GTX110483 intracellular antibody
BRN3A Santa Cruz Biotechnology sc-8429 intracellular antibody
TUJ1 BioLegend 801202 intracellular antibody

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
  2. Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
  3. Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
  4. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
  5. Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
  6. Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
  7. Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
  8. Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
  9. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  10. Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
  11. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  12. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  13. Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
  14. Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
  15. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
  16. Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
  17. Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
  18. Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
  19. Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
  20. Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
  21. Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
  22. Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
  23. Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93 (2016).
  24. Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
  25. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
  26. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  27. Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936 (2014).
  28. Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62 (2016).
  29. Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
  30. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  31. Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
  32. Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
  33. Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
  34. Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
  35. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99 (2014).
  36. Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
  37. Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
  38. Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).

Tags

Bioengineering udgave 125 retinale ganglionceller RGC flowcytometri neurodegeneration glaukom aldring
Isolering af primære murin retinalganglionceller (RGC&#39;er) ved flowcytometri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chintalapudi, S. R., Patel, N. N.,… More

Chintalapudi, S. R., Patel, N. N., Goldsmith, Z. K., Djenderedjian, L., Wang, X. D., Marion, T. N., Jablonski, M. M., Morales-Tirado, V. M. Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (125), e55785, doi:10.3791/55785 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter