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Biochemistry

분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/55790
Automatic Translation
1, 1
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council

Summary

자동화 시스템 및 스크린의 많은 수의 일상적인 준비에 대 한 프로토콜 및 nanoliter 결정 화 방울 증기 확산 실험에 대 한 설명 이며 토론.

Abstract

높은 품질 결정 엑스레이 diffract를 얻을 수 있습니다 때 결정 구조 원자 해상도 근처에서 해결 될 수 있습니다. 그러나 단백질, DNAs, RNAs, 그리고 그들의 복합물을 구체화 하는 조건을 수 없습니다 전망 했다. 고용 조건의 광범위 한 다양 한 품질 회절 결정의 수확량을 증가 하는 방법 이다. 2 완전 자동화 된 시스템 nanoliter 방울에 증기 확산 하 여에서 MRC 연구소의 분자 생물학 (케임브리지, 영국, MRC-LMB) 1920 초기 조건에 대 한 결정 화 심사를 용이 하 게 개발 되었습니다. 반자동된 프로토콜 또한 pH, 시 약의 농도 변경 하 여 또는 잠재적으로 결과 결정의 속성을 향상 시키는 첨가제를 도입 하 여 조건을 최적화 하기 위해 개발 되었습니다. 모든 해당 프로토콜에에서 대해서 자세히 설명 하 고 간단히 설명 됩니다. 그들은 편리 하 고 고효율 고분자 결정 화는 다중 사용자 기능에는 사용자가 그들의 실험의 주요 매개 변수 제어를 제공 하는 동안 활성화 함께 찍은.

Introduction

X 선 결정학은 더 원자 수준에서 생물학 및 질병 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 전진 하 고 이후에 약물 발견1합리적인 접근을 지원 하기 위해 광범위 하 게 적용 됩니다. 이 위해 순화 되며 단백질, DNA, RNA, 다른 ligands, 및 그들의 복합물의 집중된 (2-50 mg/mL) 고분자 샘플 trialed 양식에 그들의 성향을 결정 화2,3 통해 3 차원 격자 주문에 대 한 ,4. 높은 품질 결정 엑스레이 diffract를 얻을 수 있습니다 때 결정 구조 원자 해상도5,6근처에서 해결 될 수 있습니다. 결정적인 소설 샘플을 구체화 하는 조건을 예측할 수 없는 그리고 높은 품질 결정의 수익률은 대개 매우 낮은. 근본적인 이유는 관심의 많은 샘플 불안정 결정 (일반적으로 몇 일) 화에 대 한 해당 날짜 표시줄에 그들을 만드는 도전 생화학 속성. 마지막으로, 과정 샘플 및 샘플 변형, 생성 하 고 그들의 정화 및 결정 화7,8을 최적화 하는 데 필요한 시간에 의해 합성 된다.

결정 화 조건 샘플 용 해도 감소 시키는 비례적으로 솔루션 이며 조건에도 자주 버퍼 및 첨가제 포함. 이러한 시 약의 수백 그들은 낮은 성향 (예: 단백질 또는 핵 산 전개) 샘플 무결성을 방해 하는 결정 화 실험의 매개 변수를 변경 하 잘 적응 된다. 동안 수백만의 결정 화 시 약의 조합 테스트 하는 것이 불가능, 많은 검사 키트-다양 한 전략9와 공식화를 여러 테스트,10 -가능 하다 소형된 시련과 자동화 된 프로토콜. 이 관점에서 가장 의무가 기술이 이다 아마 100-200 nL 방울 전문된 결정 화 접시11 구현 결정 화 조건 (25-250 µ L)를 포함 하는 저수지 위에 작은 우물에 앉아 함께 증기 확산 , 12. 단백질 샘플 및 조건 자주 200의 전체 볼륨에 대 한 1:1 비율로 결합 nL 위 우물에서 물방울을 설정할 때. 로봇 nanoliter 단백질 결정 화는 대체 기술 및 플레이트-오일 일괄13 등 Lipidic 입방 단계14 (최신 하나는 횡단 막 단백질에 구체적으로 적용 되 고 구현 될 수 있습니다. 매우 저조한 물에 용 해).

MRC LMB에 결정 화 시설 2000 년대 초반에 시작 하 고 우리의 자동화 프로토콜의 초기 요약 200515에 제시 했다. 단백질 결정 화에 대 한 역사적 소개를 제시 했다 하 여도 로봇 nanoliter의 장점의 개요 (다음 일상적인 실험 소설 접근). 고분자의 결정 화 이후 품질 회절 결정16의 수익률 증가 고용 (적합 한) 초기 조건의 광범위 한 다양 한 매우 거의 또는 전혀 유용한 사전 정보를 기본적으로 확률 과정. 게다가, 초기 대형의 자주 간과 이점을 크게 샘플 및 많은 경우에 결정의 최적화에 대 한 필요성을 줄이는 것입니다. 물론, 하나 여전히 나중에 몇 가지 초기 조건의 최적화를 진행 하 고 해야 합니다. 일반적으로, 시 약의 pH 농도 체계적으로 조사 다음. 더 많은 시 약 또한 추가 결정의 매개 변수를 변경 하는 최적화 된 조건으로 도입 수 있습니다. 물론, 하나 신선한 샘플 결정 화를 시도 한다, 따라서 해당 프로토콜 해야 간단 하 고 사용 가능한 언제 든 지.

여기, 두 완전히 MRC LMB (시스템 1과 2)에서 설계 시스템 자동화 되 고 해당 프로토콜을 완벽 하 게 같습니다. 이 두 시스템의 주요 응용 프로그램은 초기 증기 확산 앉아 드롭 결정 화 접시에 의해 심사. 시스템 1 통합 액체 처리기, 재고 번호판 자동된 회전 목마, 플레이트 라벨에 대 한 잉크젯 프린터와는 접착 판 마감재. 시스템 1, 72 96 잘 접시는 상업적으로 이용 가능한 검사 키트 (시험관에 10ml의 시작 볼륨에서 저수지로 조건의 80 µ L)으로 가득, 레이블이 고 봉인. 판 다음 그들이 사용할 수 있는 사용자에 게 언제 든 지 (초기 화면 '좌 판' 이라고 함)으로 10 ° C 인큐베이터에 저장 됩니다.

시스템 2 통합 액체 처리기, nanoliter 디스펜서와 접착 판 마감재. 시스템에서 2, 증기 확산 실험에 대 한 방울 (100-1000 nL) 앉아 조건을 결합 하 여 생산 그리고 20 48 또는 96 잘 접시의 위 우물에서 샘플 미리로 조건. 즉, 1920 초기 심사 조건이 trialed 시스템 2에 20 LMB 접시를 사용 하는 경우.

로봇은 개별적으로 선택한 조건의 최적화에 대 한 및 해당 반자동된 프로토콜도 같습니다. 4 구석 방법17 최적화 화면을 생산 하기 위해 정기적으로 채택 된다. 해당 프로토콜은 처음 4 솔루션 ('A, B, C 및 D')의 수동 준비를 필요합니다. 다음 두 개의 선형 그라디언트 (두 가지 주요 결정 화 에이전트)에 대 한 농도의 결정 화 접시의 저수지에 직접 자동으로 생성 됩니다. 이 위해, 주사기 기반 액체 처리기는 다른 비율에서 4 코너 솔루션 dispenses.

추가 조건 최적화, 잠재적으로 결과 결정18의 속성을 향상 시키는 첨가제 화면 사용할 수 하나. 두 방법 첨가물 심사에 사용할 수 있습니다: 결정 화 접시의 저수지에 방울 (프로토콜 1)을 설정 하기 전에 적절 한 첨가제로 시작 하는 프로토콜 및 다른 프로토콜 추가 화면이 나 옵 직접에 방울 (프로토콜 2).

다른 유용한 개발 자동화 된 고분자 결정 화를 촉진 하기 위하여 MRC LMB에 시작 했다 또한 제공 됩니다. 기본적으로, 결정 화 접시와 관련 된 장치 등을 쌓을 수 있는 사회의 바이오 심사 (SBS)는 뚜껑에 2 시스템을 사용 하 여 조건의 증발을 최소화 해야 합니다.

간단히, 사용자가 기본 기능 및 nanoliter 디스펜서, 잉크젯 프린터와 접착 판 마감재의 유지 보수에 익숙한 가정 합니다. 달리 명시 하지 않는 한 접시 로봇의 갑판에 배치 되도록 잘 A1 ('A1-코너 ')는 플레이트 캐리어의 후면 좌측 구석으로.

Protocol

1. 두 개의 완전히 자동화 시스템 (초기 심사)

  1. 시스템 1: 72 96 잘 결정 화 접시의 준비 키트 (좌 판) 상영으로 가득
    1. 절차를 수행 하기 전에 시스템의 로봇 초기화 되 고 그들의 제어 소프트웨어는 확인 합니다. 주요 프로그램을 시작 하기 전에 약 30 분 튜브 냉각 캐리어의 냉각 장치를 켭니다.
    2. 플레이트 마감재의 동력된 SBS 캐리어에 테스트 접시를 놓습니다. 플레이트 마감재를 실행 하 고 영화 제대로 적용 된 확인 하십시오. 이 테스트 판 마감재 준비 되었는지 확인을 두 번 더 반복 합니다.
    3. 그런 다음 액체 처리기의 주요 컨테이너에 이온 물 20 L를 추가 합니다. 작은 컨테이너 (20% 에탄올 솔루션을 rinsing)에서 커플링 삽입을 분리 하 고 주요 컨테이너에 삽입 연결.
    4. 잉크젯 프린터 터치 스크린에 적절 한 화면 이름 (표 1)을 입력 합니다. 그런 다음 열고 회전 목마 회전 하는 회전 목마 문을 닫습니다. 첫 번째 스택 자체를 선물 하는 때 문을 엽니다.
    5. 완전히 로드 22 결정 화 접시, 각각 열 1 방향으로 첫 번째 스택 밖으로. 완전히 동일한 방법으로 다음 두 스택 로드.
    6. 나머지 6 접시 4 스택의 가장 높은 위치에 로드 합니다. 그런 다음, 회전 목마 문을 닫습니다.
    7. 냉각 장치 디스플레이 14 ° c.를 표시 되는지 확인 부드럽게 하 고 반복적으로 1 분 선택한 검사 키트를 반전. 그런 다음 액체 처리기의 전면 패널을 엽니다.
    8. 튜브를 열고 표준 96-잘 레이아웃 (A1, A2, 등등)에 따라 냉각 캐리어에 넣어. 캐리어에서 각 튜브를 배치, 시 같은 96 잘 레이아웃에 쟁반에 그것의 뚜껑을 놓습니다.
    9. 크로스 체크 튜브 위치 하 고 모든 관 수준의 고 캐리어에 정착 합니다. 다음, 전면 패널을 닫습니다.
    10. 액체 처리기 소프트웨어의 '시작' 창에서 '실행 유지 관리'를 선택 하 고 물 내리는 프로그램을 엽니다. 시스템에서 20%의 에탄올을 플러시 액체 분배 팁의 outsides를 세척 하 고 프로그램을 실행 합니다.
    11. 플러시 완료 되 면 '' '시작'으로 돌아가려면 취소를 클릭 합니다. '기존 프로세스 실행'을 선택 하 고 '선택 시작'을 클릭 합니다. 'MRC 키트 분배' 프로그램을 엽니다. 입력 '18' '인스턴스' 구성에서 화면 하 고 프로그램을 실행 합니다.
    12. 처음 4 개의 플레이트 표시, 가득, 고 봉인 시스템을 모니터링 합니다.
    13. 일단 모든 72 접시는 준비 하 고 다시 회전 목마에에서 배치, 작은 컨테이너 주요 컨테이너에서 커플링 삽입을 전환 합니다. '플러시 시작' 프로그램을 실행 (단계 1.1.10 참조).
    14. 냉각 장치를 해제 하 고 빈 삭제 키트 튜브를 상영. 회전 목마에서 72 준비 접시를 조심 스럽게 제거. 잘못 채워진 또는 제대로 밀폐 접시를 삭제 합니다. 10 ° c.에 준비-사용 판 저장
  2. 시스템 2: 20 좌 판에서 단일 샘플에서 결정 화 방울 (100 nL 단백질 + 100 nL 조건)을 설정
    1. 첫째, 그 시스템의 로봇에는, nanoliter 디스펜서는 그것의 소프트웨어, 오픈 되며 액체 처리기의 메서드 관리자는 확인 합니다. 메인 프로그램 시작 됩니다 전에 15 분 정도 microtube 냉각 캐리어를 켭니다.
    2. 플레이트 마감재의 동력된 SBS 캐리어에 테스트 접시를 놓습니다. 플레이트 마감재를 실행 하 고 접시 제대로 밀봉을 확인 합니다. 테스트 판 마감재 세 번.
    3. 그런 다음 테스트 플레이트에서 100-nL 방울 테스트 솔루션을 설정 하는 nanoliter 디스펜서를 실행 합니다. 현미경 방울 올바르게 설정 되어 있는지 확인 합니다. Nanoliter 디스펜서 소프트웨어 닫고 갑판에서 스트립 홀더 블록을 제거 합니다.
    4. 그런 다음 사용자 정의 설계 플레이트 홀더 삽입 ( 대표 결과참조 하십시오: LMB에 결정 화 장치 개발) (표 1)의 조건에서 휘발성 약의 높은 상대 수량 좌 판. 접시에서 접착 필름을 제거 합니다.
    5. 액체 처리기 전면 패널을 열고 첫 번째 슬라이딩 캐리어 뒤쪽 갑판에 봉인 되지 않은 접시를 장소 (사업자 슬라이딩 수 있습니다 꺼내 접근의 용이성에 대 한).
    6. SBS 알루미늄 뚜껑 접시 커버. 캐리어의 후면 왼쪽으로 뚜껑 뚜껑의 반대 코너에 부드러운 압력을 적용 하 여 정착.
    7. 벗기, 슬라이딩 사업자로 로드 하 고 같은 방식으로, 적어도 휘발성 조건에 가장에서 일하고 나머지 19 번호판 커버. 일단 microtube 냉각 캐리어 4 ° C에서 녹색 빛에 의해 표시 된 대로, 그것의 덮개를 제거 합니다.
    8. 단백질 샘플 (표 2)의 (적어도) 440 µ L을 포함 하는 microtube의 뚜껑을 잘라. 있는지 확인 하십시오 샘플 초승달 모양, 위의 아무 거품으로이 액체 감지 시스템에 방해가 됩니다. 튜브 microtube 냉각 캐리어의 위치 1에 배치 합니다.
    9. 어댑터 플레이트 이동 캐리어 앞 액체 처리기 갑판에 PCR 접시를 놓습니다. 다음, 전면 패널을 닫습니다.
    10. 갑판을 로드 한 후 nanoliter 디스펜서 갑판은 분명 스트립 홀더 블록의 50 µ L 팁 스택 뒤 캐리어는 알루미늄 SBS 뚜껑의 명확한 확인 합니다.
    11. 액체 처리기 ' 관리 방법 ' 인터페이스에서 '판 설치'를 선택 합니다. 두 시스템의 초기화를 모니터 하 고 실행된 매개 변수를 입력 합니다. 메서드 관리 인터페이스 (프롬프트, 수치 및 준비에 도움이 팁 관리 시스템)의 지침을 따르십시오.
    12. 필요한 모든 구성 요소는 준비 하 고 다음 과정을 시작 다시 확인 합니다.
    13. 모니터 시스템으로 nanoliter 디스펜서를 첫 번째 접시와 접시 마감재에 연속적으로 접시를 봉인.
    14. 일단 모든 20 접시는 결정 화 방울으로 준비 하 고 자동으로 슬라이딩 통신 사업자에 게 반환, 전면 패널을 열고 플레이트를 부드럽게 제거 합니다. 확인 판 결정 화에 대 한 그들을 저장 하기 전에 제대로 밀봉 된다.
    15. 스토리지에 대 한 액체 처리기의 왼쪽에 그들을 적재 하기 전에 20% 에탄올 솔루션 SBS 뚜껑 청소. PCR 플레이트와는 microtube 삭제 합니다.
    16. Microtube 냉각 캐리어를 끄고 응축을 닦아. 응축을 더 흡수 냉각기 표면 위에 종이 수건을 남겨 주세요. 다음, 캐리어 덮개를 장착 하 고 전면 패널을 닫습니다.

2입니다. 조건의 최적화

  1. 주사기-기반 액체 처리기: 결정 화 접시 (4 구석 방법)의 저수지에 농도의 2 개의 선형 그라디언트를 생산.
    1. 먼저, 액체 처리기에 고 오픈 소프트웨어 초기화를 확인 합니다.
    2. '그라데이션' 탭: 필요한 프로그램, 저수지 (표 3)에서 결정 화 접시 유형 및 최종 볼륨을 선택 합니다. [소 프로 파 놀] > 10 %v / v와 [MPD] > 20 %v 포함 하는 솔루션을 사용 하는 경우 / 대 3000 6000에서 '최대 총된 집'에 대 한 고급 설정을 인하 해야 한다
    3. 주사기를 준비 합니다. 각 주사기 (뾰족한 끝 아래)에 피스톤을 놓고 로봇 머리 아래 지정 된 홈에 주사기의 뒷면을 삽입 합니다. 주사기 (프로그램 제대로 연결 하는 모든 필요한 주사기 만으로 시작 됩니다) 위치에 고정 시계 방향으로 트위스트.
    4. 골짜기를 준비 합니다. 스테인리스 스틸 프레임을 제거 하 고 골짜기를 삽입. 왼쪽에는 4 개의 위치 4 모서리 A, B, C, D. 스위치 ( 표 3, 0.5 mL 죽은 볼륨 표시 볼륨에 추가 된)에 각 주사기에 필요한 솔루션의 볼륨을 표시 ' 설정 ' 탭에 해당 합니다. 그들의 각각 골짜기에 모서리 솔루션을 부 어 하 고 프레임 (프레임 고 위치는 갑판의 정면에 있는 2 작은 자석) 갑판에 배치. 이 단계를 계속 하는 다른 방법 때 그들은 이미 갑판에 배치 하는 골짜기에 솔루션을 부 어 하는 것입니다.
    5. 자동화 한 SBS 캐리어에 결정 화 접시를 놓습니다.
    6. '발음'을 클릭 하 고이 단계 (피스톤 중지 된 경우까지 그들의 방법을에) 완료를 기다립니다.
    7. '실행' 탭으로 전환 하 고 프로그램을 실행 합니다.
    8. 완료 되 면 프로그램, 다시 설정 탭으로 이동 하 고 '제거' 클릭: 시스템 남은 솔루션에서 주사기를 제거 하 고 다음 모든 방법을 최대 피스톤을 리프트. '제거' 대신 '제거'를 요구할 수 있습니다;이 하단에 위치, 발음 같은 주사기와 더 많은 솔루션 준비에 디트로이트를 떠날 것 이다.
    9. 반시계 그들을 왜곡 하 여 주사기를 제거 합니다.
    10. 주사기와 적절 한 빈 골짜기를 버리십시오 (또는 이온된 수 및 다음 다시 20 %v / v 에탄올 솔루션 린스).
    11. 접시를 봉인 하 고 높은 점성 솔루션 혼합 되는 1000 rpm에서 3 분 또는 10 분 microplate 믹서에 두십시오. 접시는 nanoliter 디스펜서에 결정 화 방울을 설정 하기 위한 준비가 되었습니다.
  2. 프로토콜 1 (미리 첨가제 화면 가득 96 잘 결정 화 접시에 결정 화 방울 설정)을 상영 하는 첨가제
    1. 첫째, 초기 농도의 약 10% (분 제 15 mL 액체 처리기 추가 화면에 컨테이너에서 상태를 전송 하는 경우)에 의해 증가 된 상태를 준비 합니다.
    2. 액체 처리기가 작동 준비가 있는지 확인 하십시오. '추가 화면을 첨가제' 단일 플레이트에 대 한 프로그램 (저수지에서 볼륨을 입력: '72 µ L'). 라는, 인물 및 로봇의 선택에 따라 작동 준비가 되었는지 만들기와 정보 관리 시스템 (12 x 1000 µ L 팁 필요) 도움말.
    3. -20 ° C 배양 기에서 추가 화면을 검색 하 고 알루미늄 인감 즉시 (플레이트 홀더 사용), 다음 접시 액체 처리기의 갑판에 배치. 프로그램 (접시는 캐리어의 전면 왼쪽에 있는 A1-코너 배치) 세로 레이아웃에 따라 운영 한다. 또한 또한 조건으로 채워진 컨테이너를 놓습니다. 프로그램을 실행 합니다.
    4. 접시의 저수지를 입력 미 판 통에 그것을 놓고 프로그램을 실행 합니다. 재사용을 위한 이온 물, 20% 에탄올 상태의 컨테이너를 씻어.
    5. Nanoliter 디스펜서에 방울을 설정합니다. 먼저, 결정 화 접시 (접시 홀더 사용)의 봉인을 해제. 다음, 접시와 8 잘 단백질 스트립 스트립 홀더 블록의 첫 번째 위치에 장소. '설정' 탭 제어 소프트웨어에 갑판에 각 부품의 실제 위치를 표시합니다. 각 로드 드롭 크기 필요 (표 4) 단백질 샘플 스트립의 잘. 방울을 준비 하는 프로그램을 실행.
    6. 완료 되 면 프로그램, 갑판에서 접시를 제거 하 고 즉시 그것을 봉인 (접시 마감재, 3 인치 넓은 접착 테이프를 사용 하 여). 적절 한 상자에 스트립을 삭제 합니다.
    7. 크기, 모양, 평가 및 저장 하기 전에 현미경 방울의 중심.
  3. 프로토콜 (재사용 가능한 첨가제 화면 96 잘 결정 화 접시에 결정 화 방울 설정) 2를 상영 하는 첨가제
    1. 먼저, 첨가제 화면 준비: 해당 냉동된 96 잘 셀 문화 접시 40 분 동안 실 온에서 해 동을 떠나. 그런 다음 2 분 1000 x g에서 첨가제 화면 원심.
    2. 조건 (분 제 15 mL 액체 처리기 추가 화면에 컨테이너에서 상태를 전송)을 준비 합니다.
    3. 상태와 결정 화 96 잘 접시의 저수지를 채우십시오. 액체 처리기에 프로토콜 1으로 같은 방식으로 진행, 2.2.2, 단계 하지만 저수지에서 볼륨에 대 한 '80 µ L'을 입력.
    4. (결정 화 접시와 8 잘 단백질 스트립 스트립 홀더 블록, 표 4의 첫 번째 위치에 추가 화면을 포함 하는 접시) 갑판에 3 구성 요소와 함께 nanoliter 디스펜서에 방울을 설정 합니다.
    5. 알루미늄 시트와 화면을 포함 하는 셀 문화 접시를 봉인 하 고 다시-20 ° C 인큐베이터에에서 배치.
    6. 크기, 모양, 평가 및 저장 하기 전에 현미경 방울의 중심.

Representative Results

1. 시스템 1과 좌 판

그림 1A 시스템 1 액체 처리기 액체 시스템 (deionised 물) 운영에 따라 보여 줍니다. 액체-시스템 구성 컨테이너, 펌프, 튜브, 밸브와 8 고정된 팁 8 주사기. 액체 클래스 설정 aspirate/분배 솔루션 및 다중의 광범위 한 다양 한 최적화 했다-4 판으로 분배 (멀티-분배 aspirated 볼륨의 비교적 큰 초과 필요 합니다). 22 L 물 컨테이너 및 20 %v / v 에탄올과 작은 컨테이너 (5 L) 액체 시스템 피드 시스템 아래 저장 됩니다. 각 컨테이너는 두 개의 커플링 삽입을 갖추고 있습니다. 1 삽입 (파란색) 액체 시스템 피드, 다른 하나 (레드) 초과 압력 감소 흐름-다시. 사용 후, 물 그리고 20 %v / v 에탄올 용액과 홍 조 미생물 성장을 방지 합니다. (또한 시스템 아래에 있는) 냉각 장치는 사용자 관 냉각 캐리어에 연결 된다. 시스템 1은 2050 mm 폭, 회전 목마, 깊은 760 mm 높이 88 m m 등 이다. 추가 550 mm 잉크젯 프린터와 접착 판 마감재의 제어 장치를 보유 하 고 작업 테이블에 대 한 전면에 필요 합니다. 또한 제어 PC에 대 한 추가 공간 시스템에 필요 합니다. 프로그램 (즉, 18 4 접시의 라운드) 72 미리 채워진된 접시를 생산 하는 3 h 50 분 걸립니다.

그림 1B 는 8 고정된 팁 (그림 1C) 탑재 자동된 pipetting 팔, 그리퍼, 팁 세척 역, SBS 판에 대 한 2 × 4 위치 사업자와 두 번째 팔과 튜브 냉각 캐리어에 장착 하는 주 갑판의 클로즈업. 주요 프로그램 4 접시는 회전 목마에서 자동으로 촬영 하 고 그들은 결정 화 조건 ( 그림 1D저수지에서 80 µ L)으로 채워진다는 갑판에 배치를 한 번에 처리 합니다. 팁은 전도성 액체 수준 감지 자동으로 됩니다. 액체 처리기는 격판덮개의 집합으로 조건 dispenses, 하는 동안 빈 접시의 또 다른 세트는 회전 목마에서 밖으로, 표시 이며 주 갑판에 배치. 액체 처리기의 후면 패널에 창과 작은 사용자 홀더 프린터 헤드와 메인 데크 뒤쪽의 센서 위치 필요 했다. 8 팁 플러시 고 저수지의 해당 열에 4 aliquots의 구성 된 각 분배 단계 후 주요 컨테이너에서 물으로 세척. 4 접시를 작성 한 후 자동으로 봉인 되며 회전 목마에서 그들의 원래 위치에 다시 배치 됩니다. 플레이트 마감재 (제어 소프트웨어에 의해 호출)는 특정 드라이버에 의해 트리거됩니다. 봉인 자 기계 압력 롤러와 함께 접시에 적용 되는 3 인치 넓은 접착제 테이프 롤을 사용 합니다. 완료 되 면 프로그램, 미리 채워진된 접시 회전 목마 스택에서 수동으로 제거 하 고 시설 내에 있는 10 ° C 인큐베이터에 저장.

Figure 1
그림 1 : 초기 심사 키트와 함께 저수지를 작성. 완전 자동화 된 시스템 1의 (A) 개요. 회전 목마 접시 더미와 별도 자동화 된 단위 이며 그것 오른쪽 메인 덱에 명확한 아크릴 시트의 우물에서 지 내게 된다. (B) (a) 튜브 냉각 캐리어와에서 액체 처리기의 메인 데크 (에 연결 된 아래, 재미 단위 표시 되지 않음), (b) 빠른 세척 역 (배수, 표시 되지 않음에 연결), (c) pipetting 팔 가져 (e)에 채워진된 접시 접시 마감재의 동력된 SBS 캐리어 그리퍼 팔 96 잘 결정 화 접시 (d)의 8 저수지를 채우는. 갑판 뒤에 마감재 아래 잉크젯 제어 장치 (g)에 연결 된 잉크젯 프린터의 (f)는 인쇄 머리 이다. (C) A 표시 판 (스크린 이름) 및 생산의 날짜 결정 화 조건 8 전도성 소계 코팅 스테인레스 스틸 팁 고정 충만. (D) 잘 된 결정의 단면. 저수지 (동안 위 잘 비어) 80 µ L의 결정 화 상태를 포함 합니다. 저수지와 위 잘 깊이 사양 밀리미터에 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 1 테스트 튜브에 상업적으로 이용 가능한 검사 키트에 대 한 다른 제형을 보여준다. 키트는 시스템 1 정기적으로 결정 화 96 잘 접시 (LMB01-LMB22)의 저수지를 채우는 데 사용 됩니다.

플레이트 이름 장비 이름 공급 업체 카탈로그 번호 튜브 기본 설명
LMB01 크리스털 화면 1 햄튼 연구 HR2-110 48 스파스 매트릭스 (pH 4.6-8.5)
크리스털 화면 2 햄튼 연구 HR2-112 48 확률적 샘플링 (pH 4.6-9.0)
LMB02 마법사 1 리가 1009530 48 확률적 샘플링 (pH 4.5 ~ 10.5)
마법사 2 리가 1009531 48 확률적 샘플링 (pH 4.5 ~ 10.5)
LMB03 그리드 화면 황산 암모늄 햄튼 연구 HR2-211 24 [AmS] 그리드 화면 = 0.8-3.2 M 및 버퍼 pH 4.0-9.0
그리드 화면 못/LiCl 햄튼 연구 HR2-217 24 그리드 화면, [말뚝 6000] = 0-30 %w / v, 하자마자 LiCl 1.0 M 및 버퍼 pH 4.0-9.0 =
빠른 화면 햄튼 연구 HR2-221 24 [NaKPO4] 그리드 화면 = 0.8-1.8에서 pH 5.0-8.2 M
그리드 화면 염화 나트륨 햄튼 연구 HR2-219 24 그리드 화면, [NaCl] 1.0-4.0 M 및 버퍼 pH 4.0-9.0 =
LMB04 그리드 화면이 던지다 6000을 햄튼 연구 HR2-213 24 그리드 화면, [말뚝 6000] 5-30 %w/v 및 버퍼 pH 4.0-9.0 =
그리드 화면 MPD 햄튼 연구 HR2-215 24 그리드 화면 [MPD] = 10-65 %w/v 및 버퍼 pH 4.0-9.0
MemFac 햄튼 연구 HR2-114 48 막 단백질 (pH 4.6-8.5)에 대 한 스파스 매트릭스
LMB05 못-이온 햄튼 연구 HR2-126 48 그리드 화면, [말뚝 3350] = 20 %w/v 및 다양 한 소금 0.2 M (버퍼)에
Natrix 햄튼 연구 HR2-116 48 불완전 한 계승값 (pH 5.6-8.5)
LMB06 크리스털 스크린 라이트 햄튼 연구 HR2-128 48 크리스털 스크린 1 원래 precipitant 농도의 절반
사용자 정의 라이트 화면 분자 크기 n/a 48 조건이 낮은 precipitant 농도와
LMB07 마법사 Cryo 1 리가 1009536 48 확률적 샘플링 조건 cryoprotected 낮은 MW 구슬 (pH 4.5-9.4)를 사용 하 여
마법사 Cryo 2 리가 1009537 48 확률적 샘플링 조건 cryoprotected 낮은 MW 구슬 (pH 4.5-10.1)를 사용 하 여
LMB08 JBS1 JenaBioScience CS-101 L 24 다양 한 나무 못 (pH 4.6-9.0)에 따라 불완전 한 계승
JBS2 JenaBioScience CS-102 L 24 불완전 한 계승값 던지다 4000 (pH 4.6-8.5)에 따라
JBS3 JenaBioScience CS-103 L 24 불완전 한 계승값 던지다 4000 (pH 4.6-8.5)에 따라
JBS4 JenaBioScience CS-104 L 24 불완전 한 계승값 중간 MW 구슬 (pH 6.5-8.5)에 따라
LMB09 JBS5 JenaBioScience CS-105 L 24 불완전 한 계승값 무거운 MW 구슬 (pH 6.5-9.5)에 따라
JBS6 JenaBioScience CS-106 L 24 불완전 한 계승값 AmS (pH 4.6-8.5)에 따라
JBS7 JenaBioScience CS-107 L 24 MPD (pH 4.6-8.5)에 기반 하는 불완전 한 계승
JBS8 JenaBioScience CS-108 L 24 불완전 한 계승값 MPD와 에탄올 (pH 4.6-8.5)에 따라
LMB10 JBS9 JenaBioScience CS-109 L 24 불완전 한 계승값 일반 소금에 따라 및 2-프로 판 올 (pH 4.6-8.5)
JBS10 JenaBioScience CS-110 L 24 일반 소금 (pH 4.6-8.5)에 기반 하는 불완전 한 계승
명확한 전략 화면 1 pH 4.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
명확한 전략 화면 1 pH 5.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
LMB11 명확한 전략 화면 1 pH 6.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
명확한 전략 화면 1 pH 7.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
명확한 전략 화면 1 pH 8.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
명확한 전략 화면 2 pH 4.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
LMB12 명확한 전략 화면 2 pH 5.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
명확한 전략 화면 2 pH 6.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
명확한 전략 화면 2 pH 7.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
명확한 전략 화면 2 pH 8.5 분자 크기 MD1-16LMB 24 다양 한 나무 못으로 표 화면
LMB13 인덱스 햄튼 연구 HR2-144 96 작은 스파스 매트릭스 및 그리드 화면 (pH 3.0-9.0)
LMB14 SaltRX 1 햄튼 연구 HR2-107 48 그리드 화면 22 고유를 포함 하 여 소금 소금 농도 및 pH (4.1-9.0)
SaltRX 2 햄튼 연구 HR2-109 48 그리드 화면 22 고유를 포함 하 여 소금 소금 농도 및 pH (4.1-9.0)
LMB15 MemStart 분자 크기 MD1-21 48 막 단백질 (pH 4.0-10.0)에 대 한 스파스 매트릭스
키워 분자 크기 MD1-25 48 막 단백질 (주로 나무 못, pH 3.5-9.5)에 대 한 표 화면
LMB16 JCSG + Qiagen 130720 96 스파스 매트릭스 (pH 4.0-10.0)
LMB17 모 피어스 화면 분자 크기 MD1-46 96 첨가제 및 cryoprotected 조건 (pH 6.5-8.5)의 믹스를 포함 한 그리드 화면
LMB18 Pi 최소한의 화면 JenaBioScience CS-127 96 불완전 한 계승값 (pH 4.0-9.5)
LMB19 Pi-말뚝 화면 JenaBioScience CS-128 96 막 단백질 (pH 4.8-8.8)에 대 한 불완전 한 계승
LMB20 모 피어스 II 화면 분자 크기 MD1-91 96 첨가제 (무거운 원자)와 cryoprotected 조건 (pH 6.5-8.5)의 믹스를 포함 한 그리드 화면
LMB21 LMB 결정 화 화면 분자 크기 MD1-98 96 LMB 간행물에서 선정 하는 조건을 포함 한 스파스 매트릭스
LMB22 모 피어스 III 화면 분자 크기 n/a 96 첨가제 (약 화합물) 및 cryoprotected (pH 6.5-8.5)의 믹스를 포함 한 그리드 화면

표 1: 좌 판에는 키트의 공식. 처음 테스트 튜브에에서 24/48/96 조건 각 상업 검사 키트에 의하여 이루어져 있다. 좌 판 그들이 사용할 수 있는 사용자에 게 언제 든 지 시설 내에 있는 10 ° C incubators에 갖춰져 있습니다.

2. 시스템 2와 방울을 설정 하기 위한 요구 사항

그림 2A 시스템 2 액체 처리기19 긍정적인 변위와 일회용 팁 운영에 따라 보여 줍니다. 일회용 팁 쌓을 선반 자동된 처리를 위해 적당 한에 제공 됩니다. 3-위치 갑판 nanoliter 디스펜서20 시스템의 오른쪽에 통합 되었다. Aspirate/nanoliter 디스펜서에 분배 또한 긍정적인 변위 일회용 microsyringes (큰 스풀에 제공)을 사용 하 여 작동 합니다. 독립형 로봇으로 이동식 스트립 홀더 블록 단백질 sample(s)를 로드 하는 데 사용 됩니다. 완전 자동화 된 프로세스에 대 한 384-잘 PCR 접시는 스트립 홀더를 대체합니다. 비슷한 시스템 1 접착 판 마감재 왼쪽에 통합 되었다. 마감재 및 nanoliter 디스펜서 (창 밖에 서 액세스 그리퍼에 대 한 액체 처리기의 두 측면 패널에서 잘라 했다이 두 통합된 로봇의 플레이트 캐리어를 도달 하는 주요 그리퍼에 대 한 순서에 주문 품, 제기 작업 테이블에 서 서 주 갑판)입니다. 때문에 트리거 nanoliter 분배 프로그램 및 봉인 자에 특정 드라이버를 호출 하는 주요 프로그램 시간. 2 시스템 이며 2,850 m m, 폭 800mm 깊이 높이 800 m m. 로봇 제어 PC의 디스플레이 대 한 다음 추가 공간이 필요 합니다. 2 폐기물 쓰레기통 팁 및 microsyringes (제어 PC는 저장 밑) 과정에서 폐기에 대 한 시스템 아래 있습니다. 시스템 2의 중요 한 특징은 앞에서 설명한 최적화 프로토콜 또는 결정 화 등 다른 곳에서 설명 하는 다른 프로토콜에 대 한 개별적으로 사용할 수 있도록 세 가지 로봇에 쉽게 접근할 수를 유지 전체 레이아웃 막 단백질 lipidic mesophases21 에 임의의 microseed 매트릭스의22를 상영.

그림 2B 는 하나의 로봇 팔을 장착 하는 갑판의 클로즈업입니다. 팔 12 독립 pipetting 프로브 및 주요 그리퍼를 통합합니다. 프로브 위치를 개별적으로 한 방향에서 프로브 또는 심지어 단일 튜브 축 따라 서로 다른 위치에 액세스 하려면 제어할 수 있습니다. 프로브는 일회용 팁 (1-12) 또는 플레이트 이동의 쌍을 선택할 수 있습니다 어댑터. 두 집합이 포함 된 50 µ L 일회용 팁 4 스택 처음 로드 됩니다. 팁은 전도성 액체 수준 감지 자동으로 됩니다. 플레이트 이동 어댑터는 필요할 때 선택적 그리퍼를 형성 하는 내부에 2 날카로운 핀 설계 되었습니다. 메인 데크에만 1-2 위치 여기 사용 샘플, 운반대 냉각 24 위치 microtube 위치 하 고 있습니다. 또한, PCR 플레이트 캐리어 및 또한 2 스토리지 캐리어 쌓을 수 있는, 사용자 SBS 뚜껑 (그림 2C)에 대 한 있다. 마지막으로, 거기 보균자 4 슬라이딩, 각각 5 위치 결정 화 접시 (4 x 5 = 20 접시).

Figure 2
그림 2 : 방울 증기 확산 실험에 대 한 설정. (2 완전 자동화 된 시스템의 개요 A). (B) (는) 저장 사업자 SBS 뚜껑, (b)는 쌓을 수 있는 팁, 2 (c) 냉각 캐리어 microtube, (d)에 샘플 캐리어의 스택을 위해 동작에 액체 처리기의 메인 데크 플레이트 이동 어댑터, (e) PCR 접시 10번째 의 SBS 뚜껑을 제거 하는 옵션 그리퍼 다시 그들의 초기 위치, (g)에 배치 된 봉인 nanoliter 처리 로봇, (f) 9 단백질 접시를 전송 하기 위한 접시에 대 한 액체 처리기, PCR, 결정 화 접시를 전송 하는 데 사용 되는 주요 그리퍼 SBS 뚜껑 위에, (나) 준비를 (h) 다음 10 접시의 갑판에 이송 (j) 주요 자동 팔 12 pipetting 프로브 (2 옵션 그리퍼로 작동 하는 데 사용 되 고) 및 주요 그리퍼 및 (k) 통합 nanoliter 디스펜서의 갑판. (C) 사내 사용자 지정 SBS 뚜껑 알루미늄의 했다. 뚜껑 조건의 증발 될 정확 하 게 고른-옵션 그리퍼에 의해 두 개의 작은 구멍을 피하기 위해 고무 시트 통합. (D) 횡단면 봉인된 결정 화 잘 어디 저수지 조건으로 채워집니다와 위 잘 포함 물방울의 단백질 견본 및 조건에서 구성. 작은 물방울에 비례적 조건에 보다 적게 집중 때문에, 모든 드롭의 구성 요소를 통해 상승의 농도 (매우 개요로 화살표로 표시 되는) 증기 확산에 의해 평형의 과정에서 손실을 물. 100의 (E) 가벼운 현미경 nL와 (F) 200 nL 방울 테스트 솔루션 (20 v/v % 폴 리 에틸렌 글리콜 400, 0.001 %w / v 붉은 염료로 Safranin) nanoliter 디스펜서에 의해 생산. 물방울의 형태와 크기는 chemicophysical 속성의 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

주요 프로그램 SBS 뚜껑을 제거 하는 첫 번째 결정 화 접시에서 선택적 그리퍼로 시작 합니다. 뚜껑은 해당 스토리지 캐리어를 후, 결정 화 접시 nanoliter 디스펜서의 갑판에 수송 된다. 다음 pipetting 팔 방울 일반적으로 냉장된 microtube에서 PCR 접시의 첫 번째 열을 설정 하기 위한 필요한 샘플의 양을 전송 합니다. 그 후, 주요 그리퍼 이동 시작에서 사용자가 선택한 옵션에 따라 방울을 준비할 것 이다 nanoliter 분배기의 갑판에 PCR 플레이트 (예. 작은 물방울 크기). 이 위해 단백질 샘플 먼저 위-웰 스 (를 사용 하 여 단일 8 microsyringes 및 다중 분배)에 적절 하 게 다음 결정 화 조건 (각 행 지금 필요 방지 하려면 8 새로운 microsyringes 단백질 방울에 적절 하 크로스-오염)입니다. 완료 되 면 방울을 설정 하는 프로그램, 주요 그리퍼 해당 접시 접시 마감재를 전송 후 PCR 플레이트 (더 많은 단백질은 될 적절 하 게 다음 접시에 대 한 PCR 플레이트의 다음 열에 그것의 원래 위치에 다시 배치 ). 마지막으로, 봉인된 결정 화 접시 이동 다시 원래 위치로 갑판: 증기 확산 실험이이 접시 (그림 2D)에 이미 시작 했습니다. 이 주기는 번호판의 수에 따라 반복 됩니다. 필요한 경우, 선택적 그리퍼 pipetting 팔 더 많은 도움말을 액세스를 허용 하는 빈 팁 랙을 제거 합니다. 프로그램은 2 시간 20 분 및 440 µ L 100 nL 샘플 + 100 nL 조건 (그림 2E 와 2F)를 사용 하 여 20 접시에 한 방울을 준비 하는 샘플의 걸립니다.

Nanoliter 디스펜서를 사용 하 여 (프로토콜, 1.2.3 단계 참조)의 추가 접시 두 개에 대 한 독립 실행형 로봇으로 때 초기 심사 접시 10 ° C 배양 기에서 사용할 수의 전체 집합을 설정할 수 있습니다 (22 좌 판 x 96 조건 = 2,112 조건).

표 2 는 2 시스템에 사용자의 선택에 따라 주요 프로그램에 대 한 요구 사항을 보여 줍니다.

플레이트 방울 크기 (nL) Sample(s) 팁 요구 사항 기간
번호 유형 제 1 (µ L) 집. 2 (µ L) 50 µ L 팁 Microsyringes
10 96-잘 100 240 0 80 1040 1 시간 12 분
20 96-잘 100 440 0 160 2080 2 시간 20 분
10 96-잘 100 240 240 160 2080 1 h 45 분
20 96-잘 100 440 440 320 4160 3 h 05 분
10 48-잘 1000 624 0 80 560 1 시간 10 분
20 48-잘 1000 1208 0 160 1120 2 h 16 분

표 2: 결정 화 방울을 설정 하기 위한 시스템 2에서 사용할 수 있는 주요 프로그램 옵션의 예. 필요한 양의 단백질 샘플, 팁 및 microsyringes는 프로그램 마다 다릅니다. 샘플의 볼륨 ' vol. 1' (드롭 1)와 ' vol. 2' (드롭 2)는 다음과 같이 계산 됩니다: (8 팁 x 필요한 PCR 플레이트 + 4 µ L의 당 볼륨 볼륨 손실) x 결정 화 접시 + microtube에서 40 µ L 죽은 볼륨의 수. 96-잘 결정 화 접시에 100 nL 방울에 대 한 PCR 플레이트의 당 필요한 볼륨은 2 µ L 6.8 µ L 48-잘 접시에 1000 nL 방울 필요 (PCR 격판덮개의 우물에 죽은 볼륨: 0.8 µ L). 샘플의 추가 볼륨은 고려 (' 볼륨 ')으로 인해 잃어버린 증발은 microtube 및 다른 손실 (예: 샘플 팁에 고정). 예를 들어 20 MRC 번호판, 100에 대 한 내셔널 리그, 1 드롭 프로토콜, 필요한 샘플의 볼륨은: (8 x 2 + 4) 20 + 40 = 440 x µ L (즉, 접시 당 22 µ L의 해당). 8 일회용 50 µ L 팁은 각 판과 각 샘플에 대 한 필요. 예 10 접시, 2 드롭 프로토콜을 필요한 팁의 번호는 2 x 10 x 8 = 160 팁. Microsyringes의 수는 다음과 같이 계산 됩니다: (8 + 접시 당 조건의 수) 샘플 수 x x 격판덮개의 수. 예를 들어, 10 x 48-잘 접시, 필요한 액체 처리기 팁의 번호는: (8 + 48) 1 x 10 = 560 x 팁.

3. 배합, 준비 및 4 코너 솔루션의 처리

두 공식 ('A, B, C, D') 4 코너 솔루션 및 해당 최적화 화면 (그림 3A)는 Excel 스프레드시트에 의해 자동으로 생성 됩니다. 조건의 다른 숫자에 대 한 다른 스프레드시트는-기본적으로 24, 48 그리고 96 조건-와 또한 스프레드시트 단일 플레이트에서 두 개의 서로 다른 최적화 화면을 준비 하. 하나 일반적으로 코너 솔루션 테스트 튜브는 2-3 최적화 화면 준비 될 수 있다에서 수와 양의 조건에 따라서 4 x 10 mL의 세트를 준비 합니다. 솔루션은 골짜기는 주사기 기반 액체 처리기에 의해 발음 되며 나중 접시 (그림 3B)에 직접 적절 하 게에 부 어. 농도의 2 개의 선형 그라디언트, 혼합에서 결과 B, C 및 D에 체계적으로 다양 한 비율 (그림 3C).

Figure 3
그림 3: 최적화 화면을 준비 하기 위한 4 구석 방법. (A) 농도 96 잘 접시 레이아웃에서의 두 개의 그라디언트의 표현입니다. (B) 4 주사기 로봇의 머리에 삽입과 화면을 준비 준비가 주사기 기반 액체 처리기. 결정 화 접시 동력된 SBS 캐리어에 앉아서 솔루션 (A, B, C 및 D)를 시작 하는 4 (솔루션 데모 용도로 색된 빨간색 되었습니다) 그들의 각각 골짜기에 적절 이미 있다. 96 저수지에 걸쳐 솔루션 A, B, C 및 D의의 (C) 비율 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

표 3 는 주사기 기반 액체 처리기에는 사용자에 게 사용할 수 있는 프로그램에 대 한 요구 사항을 보여 줍니다.

격판덮개 유형 롤 조건 플레이트 (저수지, µ L) 집. 물 (mL) 집. 기간
96-잘 48 80 1.6 2 분 5 초
96-잘 96 80 2.5 3 분 50 초
96-잘 2 x 48 80 1.6 2 분 50 초
48-잘 24 200 1.8 2 분 25 초
48-잘 48 200 3 4 분 20 초

표 3: 4 코너 방법 최적화 화면을 준비 하기 위한 주사기 기반 액체 처리기에서 사용할 수 있는 프로그램. 96 잘 접시 96 또는 48 조건 최적화 화면을 준비 하는 데 사용할 수 있습니다 (두 48 조건 화면을 동시에 준비 하는 때 로봇 갖추고 있어야 합니다 8 주사기와 8 골짜기). 다른 프로그램 48-잘 접시를 사용 하 여를 사용합니다. 골짜기에 나열 된 볼륨 필요한 죽은 볼륨 (0.5 mL)를 포함합니다.

4. 첨가제 심사

그림 4 쇼 중 96 첨가제 솔루션 결정 화 접시 (프로토콜 1)의 저수지에서 이미 나는 로우 프로 파일의 우물에는 첨가제 심사 시작을 수행 하는 단계 세포 문화 접시 재사용할 첨가제 화면 (로 사용 프로토콜 2)입니다. 표 4 는 두 가지 유형의 프로토콜에 따라 nanoliter 디스펜서에서 사용할 수 있는 프로그램을 나열합니다.

Figure 4
그림 4: 두 가지 유형의 첨가제 심사에 대 한 프로토콜. -20 ° c.에 96 추가 화면 저장 1 프로토콜, 다음 추가 화면 처음 결정 화 접시의 저수지에 추가 (이며이 이렇게 이상적으로 방류). 액체 처리기 또는 multipipette 포함 된 첨가제 솔루션 저수지에 상태를 분배 하는 (첨가제 화면의 볼륨 저수지에서 마지막 볼륨의 10%를 나타냅니다: 80 µ L 최종 볼륨 8 µ L). 혼합 후 microplate 믹서 (표시 되지 않음)에 조건, microsyringe 기반 nanoliter 디스펜서는 방울 (표 4)을 설정 하는 데 사용 됩니다. 2 프로토콜, 다음 추가 화면만 나중 결정 화 방울을 설정 하는 동안 추가 됩니다. 이 시간 nanoliter 디스펜서 갑판 (첨가제 화면을 포함 하는 재사용 가능한 셀 문화 접시)에 추가 된 구성 요소와 방울을 준비 하 채택 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

프로토콜 방울 크기 (nL) 스트립 종류 샘플 집 (µ L) 롤 microsyringes의 기간
유형 첨가제의 소스 단백질 조건 첨가제 각 잘 (스트립) 총
1 96-잘 결정 화 접시 100 100 0 2 Μ L 2 16 104 2 분
1 96-잘 결정 화 접시 200 200 0 5 Μ L 3.8 31 104 2 분 10 초
2 96-잘 셀 문화 플레이트 200 200 100 5 Μ L 3.8 31 200 3 분 45 초
2 96-잘 셀 문화 플레이트 500 500 100 5 Μ L 7.4 60 200 4 분 15 초

표 4: 첨가제 검열을 위한 microsyringe 기반의 nanoliter 디스펜서에서 사용할 수 있는 프로그램. 8 잘 스트립의 각 음에 샘플의 필요한 볼륨은 다음과 같이 계산 됩니다: 죽은 볼륨 + 12 x 크기를 드롭. 스트립 (2 µ L 5 µ L)의 2 종류가 있다. 죽은 볼륨은 2 µ L 우물 (포함 하는 수 있습니다 실제로 3.2 µ L 최대) 0.8 µ L 및 1.4 µ L 5 µ L 우물 (7.5 µ L 최대.). 필요한 단백질의 총 볼륨입니다: 8 x 볼륨 스트립 (라운드-최대 값)의 잘. 96-잘 셀 문화 접시의 V 자형 우물의 죽은 볼륨 2.5 µ L입니다. Microsyringes의 필요한 수는 8 + 96 = 104; (8 + 2 x 96 = 200) 선택 된 프로그램에 따라 다릅니다.

프로토콜 1 동안 첨가제와 함께 조건의 희석 때문에 조건이 처음 보다 비례적으로 높은 농도에 준비를 해야 합니다. 최종 농도 증가 계산 된 마지막 볼륨에 물의 최종 추가 감소 함으로써 가장 쉽게 이루어집니다. 이 후, 하나 단순히 진행 정상적인 세트를 상태와 샘플 (예를 들어, 100 nL 단백질 + 이미 첨가제와 혼합 100 nL 조건) 방울의. 프로토콜 (예를 들어, 200 nL 단백질 + 200 nL 조건 + 100 nL 첨가제) 2는 단순히 추가 첨가제 화면의 볼륨 변화 하 여 첨가제의 다른 농도에서 심사를 촉진 한다. 프로토콜 2 방울 (어떤 결정을 변경할 수 있습니다)의 희석 다소 의미 합니다.

시스템 2에서에서 액체 처리기 12 팁에서 충분 한 상태를 발음 하 고 8 aliquots 96 잘 접시의 저수지에 분배 하는 데 사용 수 ( 프로토콜, 단계 2.2.2 참조),이 단계 수 있습니다 물론 멀티 채널 피 펫 ( 와 수동으로 할 수 있지만 그림 4). (나중에 다른 첨가제 스크린 테스트)을 액체 처리기를 사용 하 여 동일한 조건으로 한 번에 여러 접시를 채울 수 있습니다. 2 접시를 준비할 때 적어도 23 mL로 시 약 용기를 채우십시오. 3 접시를 준비할 때 적어도 31 mL로 시 약 용기를 채우십시오.

5. 결정 화 접시와 관련 된 장치

안정적이 고 효율적인 자동된 결정 화 실험을 사용할 수 있는 특성을 제공 하는 두 MRC 앉아 드롭 증기 확산 결정 화 접시 (96-2 드롭 잘하고 48-잘 1-드롭, 그림 5A 와 그림 5B)의 디자인 특히 위 우물의 구형 모양와 방울의 중심으로 하는 경우 정확한 분배 하 고 또한 원심 분리를 용이 하 게 저수지의 약간의 V 자형이 필요 합니다. 또한, 위-웰 스 (폴리머는 자외선 UV 흡수 또는 형광 결정23의 탐지를 위해 전송 가능)는 stereomicroscope에서 최적의 조명 렌즈 효과가 있다.

사용자 지정 인감 (그림 5C) 드롭 결정 화 실험 접시 nanoliter 디스펜서 (프로토콜 표시 되지 않음)를 사용 하 여 두 가지 유형의 내 걸려 설정 수 있습니다. 마지막으로, 모두 MRC 접시 동일한 외부 차원 및 테두리가 있다. 테두리 제거 하기 위해 수동으로 배치/씰링 테이프 튀는 액체 없이 사용 되는 우리의 맞춤식 플레이트 홀더 (그림 5D)의 홈에 맞는.

Figure 5
그림 5: LMB에는 MRC 결정 화 접시와 관련 된 장치 개발. (A) A1-96 잘 접시의 코너. 저수지 (직사각형) 결정 화 음, 두 개의 구면 위 오른쪽에 우물의 왼쪽에 있다. 치수는 밀리미터에 있습니다. (B) A1-48-잘 접시의 코너. 저수지는 잘 (1 큰 위-잘만)의 오른쪽에 있습니다. (C) MRC 매달려 드롭 인감. (D) 사내 사용자 지정 접시 홀더. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

6. 단백질 결정

그림 6 우리의 자동화 프로토콜 얻은 유용한 결정의 예를 보여줍니다.

Figure 6
그림 6: 크리스탈 얻은 다음 자동된 프로토콜을 포함 하는 작은 물방울의 현미경 빛. (A, B) 2와 완벽 하 게 준비 하는 판에 OmpF 및 MreB의 초기 화면에서 크리스탈 자동화 시스템 ( 프로토콜 섹션 1.1과 1.2, 조건을 참조 하십시오: LMB07 잘 a 4와 LMB20 D12, 각각, 방울의 크기는 100 nL 단백질 + 100 nL 조건의 일 Andrzej Szewczak, LMB)24. (C, D) 4 구석 방법으로 초기 조건의 최적화 전후 도메인 결정을 바 (단계 2.1, LMB02 B6, 1000 nL + 1000 nL, 미 발표 작품의 레오나르도 알 메 이다-수 자, 좌). (E, F) 인간 다 1 N 맨끝 도메인 결정 전과 4 코너 방법으로 초기 조건의 최적화 후의 무거운 체인 (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, 다음 500 nL + 500 nL, 미 발표 작품의에 드가 모 랄 레 스-리오스, 좌). (G, H) 첨가제 검 조건의 최적화 전후 요소 D 크리스탈을 보완 (단계 2.2, 사내 사용자 정의 화면, 200에서에서 초기 조건 nL + 200 nL, 96-조건 추가 화면에서 추가 D6 되지 않은 마 티아 스 바 우 어의 작품 LMB)입니다. (I, J) 바이러스 성 봉투 당단백질25 결정 첨가제 검 조건의 최적화 전후 (단계 2.3, LMB20 a 2, 150 nL + 150 nL, 다음 200 nL 200nL + 100 nL 첨가제 E5 96 조건 추가 화면에서 되지 않은 Yorgo의 작품 Modis, 캠브리지 대학, 영국). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Discussion

1-준비 및 초기 스크린 판에 저장 된의 사용

가벼운 강 수 또는 단계 분리 저장 하는 동안 일부 튜브에서 발생 하기 때문에 접시에 분배 되 고 전에 키트 상영을 혼합 한다. 화면 두 키트 (2 x 48 튜브)로 구성 되어, 두 번째 키트의 첫 번째 튜브 E1 냉각 캐리어의 위치에서에 배치 됩니다. 때 화면 4 키트 (4 x 24 튜브)로 구성 되어, 두 번째 키트의 첫 번째 튜브에 위치 c 1에에서 배치 됩니다, 세 번째 키트의 첫 번째 튜브 E1 위치에 놓이고 4 키트의 첫 번째 튜브 위치 g 1에에서 배치 됩니다. 그들의 냉각 캐리어에 튜브를 삽입 하는 동안 뚜껑 표준 96-잘 가로 레이아웃에 따라 트레이에 배치 됩니다. 잘 번호 제조 업체에 의해 뚜껑 위에 표시 됩니다, 이후 수 있습니다 검사 경우 모든 튜브 올바른 순서에 배치 되었습니다. 이 또한 접시의 감소 된 수를 채울 때 튜브에 올바른 뚜껑을 대체 하기 도움이 됩니다.

10 ° C, 및 씰링과 악화 조건 및 문제를 일으킬 수 있는 4 ° C에서 스토리지를 피하기 위해 타협에서 미리 채워진된 접시 저장 합니다. 접시를 위한 저장 됩니다 일반적으로 눈에 띄는 비응결 내부 얼굴에는 인감의로 몇 개월. 이것은 LMB05, LMB06, LMB09 및 LMB10 번호판에 대 한 적은 사실 휘발성 약 (표 1)의 상대적으로 높은 농도 가진 조건 포함. 인감의 안쪽에 작은 양의 응축 봉인 하는 효율을 감소 시키고 번호판 봉인 하는 동안 우물 사이의 교차 오염을 일으킬 수 있습니다. 도움이 동안 초기 냉각 응축 방지, 접시는 하룻밤 4 ° C의 찬 룸에 저장 되어 있는 절연된 피크닉 쿨러에 회전 목마에서 먼저 전송할 수 있습니다. 봉인 된 우물 내의 온도 기울기의 개발을 최소화 하 고 따라서 응축을 감소 매우 느린 냉각 전체15. 또한, 일단 판을 10 ° C 인큐베이터에 저장 됩니다, 사내 사용자 지정 SBS 폴리스 티 렌 뚜껑 (표시 되지 않음) 각 스택 상단에 접시에 배치 됩니다.

우리의 미리 채워진된 접시의 전체 집합은 소설, 수용 성, 단백질 샘플에 대 한 큰 초기 화면으로 사용할 수 있습니다. 또는, 더 적은 접시 특정 요구 사항과 일치 하도록 선택할 수 있습니다. 예를 들어 LMB15 및 LMB19 막 단백질 샘플26,27, 특별히 공식화 화면 또는 LMB20 회절 데이터28 의 실험적인 단계적으로 촉진 하기 위하여 무거운 원자와 공식화 화면 (참고 : 모 피어스 단백질 결정 화 스크린의 공식).

2. 결정 화 방울 설정

2 시스템을 사용 하면 상당한 양의 휘발성 시 약 키트를 심사 해야 처리 처음. 이 뚜껑 처리 및 플레이트 씰링에 영향을 미칠 수 있는 SBS 뚜껑의 고무에 형성 하는 결로 방지 합니다. SBS 뚜껑은 처음 정렬 하는 데 필요한 이유는 접시 위에 때 클리어런스의 비트 ( 프로토콜, 단계 1.2.6 참조). PCR 격판덮개의 우물에서 단백질 죽은 볼륨은 상대적으로 관대 (0.8 µ L, 표 2의 참조 전설). Note는 동등 하 게 관대 한 죽은 볼륨은 고용 8 잘 스트립 (표 4)에 단백질으로 nanoliter 디스펜서를 개별적으로 사용 하는 경우. 그러나 작은 죽은 볼륨 작동 수 있습니다 일부 샘플 팁에 고착 하는, 로봇의 캘리브레이션 약간 정확 하지 않은 될 수 있습니다, 그리고 방을 평소, 등보다 따뜻한 될 수 있습니다. 모든 접근을 통합 하기 위하여 관대 한 죽은 볼륨에 의해 처리 하는 샘플 손실 이어질.

최근 개발 사용 추가 실험의 소형화 및 결정 화 조건 심사에 필요한 샘플의 볼륨을 해당 기술29,30 통합 하 여 크게 줄어들 수 있다 따라서 . 그러나, 더 소형화의 몇 가지 측면 방울31 의 증발 및 microcrystals32의 조작 등 신중한 검토가 필요합니다.

마지막으로, 결정 화 방울 (구형 위-웰 스)에서 설정할 때 원심 분리 (2000 rpm, 1 분) 접시의 일상적인 마지막 단계로 통합 될 수 있습니다. 보다 일관성 있는 크기와 모양 방울 원심에서 결과의 재현성 문제33,34을 줄일 수 있습니다. 확실 하 게 가운데 방울 전체 접시에 걸쳐 필요한 초점 거리와 비슷한 것으로 현미경을 사용 하 여 실험의 최신 평가 쉽게 것입니다.

3. 4 구석 방법의 장점

4 구석 방법의 가장 중요 한 장점은 단순, 오류를 최소화 하 고 간단한 자동화 프로토콜을 용이 하 게입니다. 예를 들어 4 코너 솔루션 항상 동일한 레이아웃에 따라 액체 처리기의 갑판에 배치 됩니다. 또한, 모든 프로그램은 (그림 3C) 솔루션 간의 고정된 비율 기반으로 합니다.
4 코너 솔루션의 수동 준비는 고 점도 될 수 있는 높은 농도에서 솔루션의 자동화 된 처리를 선호. 상대적으로 신속 하 고 정확한 포부/분배는 다음 대부분 액체 클래스의 최적화에 대 한 최소 요구 사항을 액체 처리기의 종류. 그럼에도 불구 하 고, 일부 코너 솔루션 여전히 너무 점성 액체-효율적으로 작동 하도록 시스템으로 운영 하는 로봇에 대 한 수 있습니다. 이 때문에 우리는 액체 처리기 긍정적인 변위 (그림 3B)와 운영에 대 한 하기로 했다.

농도의 2 선형 그라디언트, 뿐만 아니라 세 번째 구성 요소 (즉, 버퍼/첨가제의 집합) 편리한 방법으로 일정 농도에서 시험 수 있다. 이 위해, 다양 한 구성 요소를 제외 하 고 적당 하 게 높은 농도에 코너 솔루션의 핵심 집합의 비교적 큰 볼륨 먼저 준비 된다. 그런 다음이 구성 요소를 포함 하 여 재고 솔루션 최종 농도 조정에 추가 됩니다. 예를 들어 50 mL 4 코너 솔루션의 세트의 처음 보다 10% 높은 농도에서 준비 된다. 이 코어 세트는 다음 4 5 더 작은 하위 집합으로 분할 됩니다. 마지막으로, 다른 버퍼 pH 해결책의 볼륨의 10%는 각 하위 집합에 추가 됩니다.

4. 형식 및 첨가제 스크린의 종류

화면 때문에 그들은 정기적으로 사용 되지 않습니다-20 ° C (그림 4)에서 일반적으로 저장 되 고 휘발성/불안정 한 화합물을 포함. 깊은 우물 블록 (1 mL 스에서)에 저장 하는 냉동된 첨가제 스크린의 사용은 12-24 시간 실 온에서 완전히 해 동 모든 첨가제 솔루션에 대 한 걸릴 것입니다 때문에 일찍 계획 해야 합니다. 또한, 다양 한 사용자가 잠재적으로 교차 오염 문제를 일으키는 동일한 첨가제 화면을 공유 합니다. 마지막으로, 깊은 우물 블록의 높이 그들이 부적 절 한 대부분 nanoliter 디스펜서에 대 한 있습니다. 편리한 솔루션으로 이러한 문제를 회피, 로우 프로 파일 번호판 (그림 4) 화면 깊은 우물 블록에서 전송 한다.

역사적으로, 첨가제 화면 (단일 농도)와 단일 시 약의 광범위 한 다양 한 포함 하는 매우 인기 있는35,36되었습니다. 그러나, 다른 유형의 첨가제 화면 개발 되었습니다 첨가제37 또는 다른 농도38에서 발견 한 첨가제의 감소 된 수의 혼합을 통합 하는. 마지막으로, 상호 보완적인 접근 결정 화39,40이전 샘플에 첨가물의 효과 조사입니다.

5. 더 많은 고려 사항

좋은 연습: 나도 독성 물질을 포함 하는 대부분의 화면 하 고 따라서 적절 한 개인 보호 프로토콜 동안 고용 해야 합니다. 마찬가지로, 로봇의 부품을 이동 (비록 로봇의 대부분은 비상 정지 버튼/시스템) 프로그램이 실행 되는 동안 수동으로 방해 하려고 할 때 특히 부상, 발생할 수 있습니다. 참여, 일반 기술 복잡성 때문에 검사 로봇, 스크린 및 프로그램의 이전 특징 테스트 샘플 재현성의 지속적인된 높은 수준에 대 한 중요 하다.

처리량: 표시로 4000 8000 LMB 사이 격판덮개 생산 시스템 1 연간 (과 이후 초기 심사에 대 한 사용자). 그것은 하지 재고 다량 예상된 회전율은 4-5 개월 후, 어떤 조건으로 훨씬 낮은 때 10 ° C에서 미리 채워진된 접시의 악화 및 증발 하기 시작할 것 이다 적응. 작은-중간 크기 실험실41에 대 한 다른 접근 자동화 프로토콜을 구현 되었습니다.

저장 및 실험 평가: 방울을 준비 하 고, 후 접시에 긴밀 하 게 제어 된 온도 (± 0.5 ° C 최대 편차) 4 개 또는 18 ° C에서 낮은 진동 선반에 저장 됩니다. 실험 감기 빛 소스 현미경을 사용 하 여 평가 됩니다. 그러나 하나 신중 하 게 모든 측면을 고려해 다양 한 자동화 된 이미징 시스템 상업적으로 사용할 수 있습니다: 속도 접시를 스캔 하는 데 필요한 높은 처리량에 대 한 충분 한 것? 크리스탈 이외의 개체 자동 초점을 방해할 것 이다? 이미지의 결과 품질 (특히 주위에 작은 물방울의 가장자리) 자리 매우 작은 결정을 충분 한 것인가? 42 , 43 , 44

결정 화 조건 비교: 처음 얻은 결정의 본질에 대 한 신중한 조사 후 하나 LMB 화면 데이터베이스 또는45c 6 웹 도구사용 하 여 조건을 통해 트렌드와 유사성을 분석할 수 있습니다.

Disclosures

LifeArc가 다음 항목 이후 우리는 이로써 충돌 상업적인 관심 상태: 96-및 48-잘 MRC 번호판, MRC 매달려 드롭 물개, 모 피어스, Pi, ANGSTROM와 LMB 결정 화 화면.

Acknowledgments

MRC LMB 결정 화 시설이입니다 친절 하 게 의료 연구 위원회 (영국)에 의해 지원. 우리는 그들의 지원에 대 한 좌 클릭의 회원 감사 합니다: 올가 Perisic (PNAC), 토니 Warne, Fusinita 반 덴 Ent와 팻 에드워즈 (구조 연구), 스티브 Scotcher와 다른 구성원 기계 워크숍의 닐 그랜트와 조 웨스트 모어 랜드 (시각 보조 기능), 폴 하트와 톰 프랫 (그것)입니다. 우리는 또한 조지 스티븐 스와 도널드 Ogg (Alphabiotech, 스티브 엘리엇 (Tecan, 영국), 미첼 스튜어트 및 헤더 Ringrose (해밀턴 로봇, 영국), 폴 해 동, 로버트 루이스 및 Joby 젠킨스 (TTP Labtech, 영국), 폴 리어 (Swissci AG는, 스위스), 감사 하 고 싶습니다. 영국), 닐 윌리엄스 (: Markem Imaje, 영국)와 그레이엄 해리스 (클리블랜드 기관) 기술.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Robots
Freedom EVO® Tecan n/a Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. 
Microlab® STAR™ Hamilton n/a Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.
Mosquito® TTP Labtech n/a Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. 
Dragonfly® TTP Labtech n/a Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. 
Adhesive plate sealer Brandel n/a Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).
Inkjet printer 9232 Markem-Imaje n/a Integrated to System 1. Touchscreen interface.
Crystallization screens
Crystal Screen™ 1 Hampton Research HR2-110 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Crystal Screen 2™ Hampton Research HR2-112 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Wizard™ Classic 1 Rigaku 1009530 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Wizard™ Classic 2 Rigaku 1009531 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Grid Screen™ Ammonium Sulfate Hampton Research HR2-211 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG/LiCl Hampton Research HR2-217 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Quick Screen™ Hampton Research HR2-221 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ Sodium Chloride Hampton Research HR2-219 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG 6000 Hampton Research HR2-213 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
Grid Screen™ MPD Hampton Research HR2-215 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
MemFac™ Hampton Research HR2-114 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
PEG/Ion™ Hampton Research HR2-126 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Natrix™ Hampton Research HR2-116 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Crystal Screen Lite™ Hampton Research HR2-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Custom Lite screen Molecular Dimensions Ltd n/a Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Wizard™ Cryo 1 Rigaku 1009536 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
Wizard™ Cryo 2 Rigaku 1009537 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
JBS1 JenaBioScience CS-101L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS2 JenaBioScience CS-102L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS3 JenaBioScience CS-103L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS4 JenaBioScience CS-104L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS5 JenaBioScience CS-105L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS6 JenaBioScience CS-106L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS7 JenaBioScience CS-107L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS8 JenaBioScience CS-108L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS9 JenaBioScience CS-109L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
JBS10 JenaBioScience CS-110L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Index™ Hampton Research HR2-144 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13
SaltRX™ 1 Hampton Research HR2-107 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
SaltRX™ 2 Hampton Research HR2-109 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
MemStar™ Molecular Dimensions Ltd MD1-21 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
MemSys™ Molecular Dimensions Ltd MD1-25 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
JCSG-plus™ Suite Qiagen 130720 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16
MORPHEUS® screen Molecular Dimensions Ltd MD1-46 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17
Pi minimal screen JenaBioScience CS-127 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18
Pi-PEG screen JenaBioScience CS-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19
MORPHEUS® II screen Molecular Dimensions Ltd MD1-91 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20
LMB crystallization screen™ Molecular Dimensions Ltd MD1-98 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21
Additive screens
HT additive screen Hampton Research HR2-138 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93-500 Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93 Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100-FX Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well).
HIPPOCRATES additive screen Molecular Dimensions Ltd n/a 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III).
Other consumables
96-well MRC 2-drop plate Swissci MRC 96T-UVP Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80  µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.
48-well MRC 1-drop plate  ('MAXI plate') Swissci MMX01-UVP  Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200  µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible.
MRC hanging drop seal Swissci n/a Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.
Adhesive sealing tape Hampton Research HR4-50 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing.
Adhesive aluminium sheet Beckman Coulter 538619 Used to reseal additive screens.
Ink cartridge Markem-Imaje 9651 System 1 (inkjet printer).
Solvent cartridge Markem-Imaje 8652 System 1 (inkjet printer).
50 µL tips  Hamilton 235947 System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks.
Reagent container Hamilton 194052 Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. 
PCR plate Thermo Scientific™ AB-2150 System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.
microsyringes TTP Labtech 4150-03020 Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing).
strip-holder block TTP Labtech 3019-05013 SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'.
2 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03110 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL.
5 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03100 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL.
5 mL syringes TTP Labtech 4150-07100 Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100.
Troughs/Reservoirs TTP Labtech 4150-07103 Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50.
Orbital microplate shaker CamLab Limited n/a Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).
Microplate mixer TTP Labtech 3121-01015 MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.

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References

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생화학 문제 131 엑스레이 결정학 단백질 결정 화 높은 처리량 검열 완전 자동화 된 시스템 nanoliter 물방울 증기 확산 초기 화면 nanoliter 디스펜서 액체 처리기 크리스탈 최적화 4 코너 방법 첨가제 상영
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Gorrec, F., Löwe, J. Automated… More

Gorrec, F., Löwe, J. Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology. J. Vis. Exp. (131), e55790, doi:10.3791/55790 (2018).

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