Summary
Автоматизированные системы и протоколы для регулярной подготовки большого числа экранов и nanoliter кристаллизации капельки для экспериментов диффузии паров описаны и обсуждены.
Abstract
Когда высокое качество кристаллов получаются которые преломлять рентгеновские лучи, Кристаллическая структура может быть решена в вблизи атомных резолюции. Условия для кристаллизации белков, ДНК, РНК и их комплексы, однако, не может быть предсказано. Используя широкий спектр условий является способом увеличить выход качество дифракции кристаллов. Два полностью автоматизированных систем разработаны на MRC лаборатории молекулярной биологии (Кембридж, Англия, MRC-LMB), способствовать кристаллизации скрининг против 1,920 начальных условий путем диффузии пара в nanoliter капель. Полуавтоматические протоколы были также разработаны для оптимизации условий путем изменения концентрации реагентов, рН, или путем введения добавки, которые потенциально улучшают свойства результирующего кристаллов. Все соответствующие протоколы будут подробно описаны и кратко обсудили. Взятые вместе, они позволяют удобно и очень эффективным макромолекулярных кристаллизации в объекте нескольких пользователей, давая пользователям контроль над ключевыми параметрами своих экспериментов.
Introduction
Рентгеноструктурного анализа широко применяется для дальнейшего продвижения нашего понимания механизмов биологического и болезни на атомном уровне и впоследствии оказать рациональные подходы к обнаружения наркотиков1. Для этого, очищенной и концентрированные (2-50 мг/мл) высокомолекулярных образцы белков, ДНК, РНК, других лигандов и их комплексы тестируется для их склонность к форме приказал трехмерной решетки через кристаллизации2,3 ,4. Когда высокое качество кристаллов получаются которые преломлять рентгеновские лучи, Кристаллическая структура может быть решена в вблизи атомных резолюции5,6. Самое главное условий кристаллизоваться Роман образец не может быть предсказана и доходность высококачественных кристаллов обычно очень низка. Основная причина, что многие образцы интерес сложных биохимических свойств, которые делают их нестабильным на соответствующей шкале для кристаллизации (обычно через несколько дней). Наконец этот процесс осложняется время, необходимое для получения образцов и образцов вариантов и оптимизировать их очистки и кристаллизации7,,8.
Условие кристаллизации представляет собой решение с осадителя, что уменьшает растворимость образца, и условия также часто содержат буферов и добавок. Изменить параметры кристаллизации экспериментов, как у них низкая склонность к мешать образца целостность (например, белка или нуклеиновых кислот разворачивается) хорошо подходят сотни таких реагентов. Хотя тестирование миллионы комбинаций кристаллизации реагентов не осуществимо, тестирование нескольких до многих наборы скрининг - сформулированы с различными стратегиями9,10 - возможна с миниатюризировано испытания и автоматизированные протоколы. С этой точки зрения наиболее поддаются техника, вероятно, диффузии паров с 100-200 nL капельки, сидя на небольшой хорошо выше водохранилища, содержащий состояние кристаллизации (25-250 мкл), в специализированных кристаллизации пластины11 , 12. Образец протеина и состояния часто комбинируются в соотношении 1:1 общий объем 200 nL при настройке капельки в верхнем Уэллс. Робот nanoliter кристаллизации белка может быть реализован с альтернативные методы и пластины как заместитель нефти партии13 и липидный кубической фазы14 (последний применяется специально для транс мембранных белков, которые являются очень плохо растворим в воде).
Средство кристаллизации на MRC-LMB было начато в начале 2000-х и начале резюме наших автоматизированных протоколов был представлен в 2005 году15. Был представлен исторический введение в кристаллизации белка и также наброски преимущества роботов nanoliter подход (затем новаторский подход к обычной эксперименты). С макромолекулярных кристаллизации является по существу стохастический процесс с очень мало или вообще не предварительного информацию, используя широкий спектр (подходит) начальных условий увеличить выход качество дифракции кристаллы16. Кроме того преимуществом часто упускается из виду большой начальный экран является значительно сократить потребность в оптимизации образцов и кристаллов во многих случаях. Конечно может все еще нужно приступить к оптимизации некоторых первоначальных условий позднее. Как правило затем систематически исследованы концентрации реагентов и рН. Больше реагентов может быть также введено в оптимизированный условие(я) далее изменить параметры кристаллизации. Конечно один следует попытаться кристаллизации с образцом свежеприготовленные, поэтому соответствующие протоколы должны быть просто и доступно любое время.
Здесь два полностью автоматизированных систем, направленных на MRC-ЛКМ (системы 1 и 2) и полностью описаны соответствующие протоколы. Основное применение этих двух систем первоначальный отбор путем диффузии паров в сидя падение кристаллизации пластины. Система 1 интегрирует жидкого обработчик, автоматизированных карусель на складе пластины, струйный принтер для маркировки пластины и герметик клей пластины. В системе 1 72 96-луночных пластины заполнены с коммерчески доступных скрининг наборы (80 мкл состояния переданы водохранилища от начального объема 10 мл в пробирки), помечены и опечатаны. Пластины, затем хранятся в 10 ° C инкубатор, где они доступны для пользователей в любое время (как первоначальный экраны под названием «ЛКМ пластины»).
Система 2 интегрирует жидкого обработчик, диспенсером nanoliter и герметик клей пластины. В системе 2, сидя капельки (100-1000 nL) для экспериментов диффузии пара производится путем объединения условий и образец в верхнем Уэллс 20 пластин 48 или 96-луночных предварительно заполнены с условиями. Это означает, что 1,920 условия первоначальной проверки тестируется при использовании 20 пластин ЛКМ в системе 2.
Роботы используются также индивидуально для оптимизации выбранных условий, а также описываются соответствующие полуавтоматические протоколы. 4-угол метод17 используется регулярно производить оптимизации экраны. Соответствующий протокол сначала требует ручной подготовки 4 решения («A, B, C и D»). Затем два линейных градиентов концентраций (для двух основных кристаллизации агентов) автоматически создаются непосредственно в водоемы кристаллизации плиты. Для этого обработчик жидкого шприц обходится 4 угла решения в различных соотношениях.
Для дальнейшей оптимизации условие, можно использовать добавки экраны, которые потенциально улучшают свойства результате кристаллы18. Существуют два подхода для добавка скрининга: протокол, начиная с добавками, обойтись в водоемы кристаллизации пластины перед настройкой капельки (протокол 1) и еще один протокол, где распределяется добавка экран непосредственно на капельки (протокол 2).
Также представлены другие полезные события, которые были инициированы на MRC-ЛКМ для облегчения автоматизированных макромолекулярных кристаллизации. По существу кристаллизации пластины и связанных устройств, таких как стекируемых общества из биомолекулярных скрининг (SBS) крышкой, что сводит к минимуму испарения условий при использовании системы 2.
Для краткости предполагается, что пользователи знакомы с основными функциями и поддержания nanoliter распылитель, струйный принтер и sealer клейкой пластины. Если не указано иное, пластины на палубе роботов расположены таким образом, что хорошо A1 («A1-уголок») — к обратно левый угол пластины перевозчика.
Protocol
1. два полностью автоматизированных систем (первоначальный отбор)
-
Система 1: подготовка 72 96-луночных кристаллизации плит заполнены с экранирующей наборы (LMB пластины)
- Перед выполнением процедуры, убедитесь, что роботы системы инициализируются и их контроля программное обеспечение является открытым. Включите Чиллер перевозчик трубки охлаждения около 30 минут, прежде чем основная программа будет запущена.
- Место испытательной пластине на моторизованных SBS несущей пластины герметика. Запустите sealer пластины и проверьте, что фильм применяется надлежащим образом. Повторите этот тест дважды больше для проверки готовности sealer пластины.
- Затем добавьте 20 Л деионизированной воды основного контейнера обработчика жидкость. Отключите соединительной вставки от небольшой контейнер (20% этанола полоскания раствор) и подключите вставки для основного контейнера.
- Введите имя соответствующего экрана (Таблица 1) на сенсорном экране струйный принтер. Затем откройте и закройте дверцу карусель, чтобы вызвать вращение карусели. Открываете дверь, когда первый стек представляет себя.
- Полностью загрузить первый стек с 22 кристаллизации пластин, каждая с облицовкой столбец 1 вне. Полностью Загрузите следующие два стеки таким же образом.
- Загрузите оставшиеся 6 пластин в высоких позициях четвертой стека. Затем закройте дверцу карусель.
- Убедитесь, что охладитель дисплей показывает 14 ° C. Нежно и неоднократно Инвертируйте наборы выбранный скрининг на 1 минуту. Затем откройте передней панели жидкого обработчика.
- Откройте трубы и поместите их в охлаждения перевозчика согласно стандартных 96-луночных макет (A1, A2 и т.д.). После размещения каждой трубы в держателе, место на подносе в один и тот же макет 96-луночных его крышкой.
- Кросс проверить трубки позиций и убедитесь, что все трубы являются уровень и поселился в держателе. Закройте переднюю панель.
- В окне «Старте» жидкого обработчика программного обеспечения выберите «Run обслуживание» и откройте программу, промывки. Запустите программу для сброса 20% этанола из системы и мыть наружными советы дозирования жидкости.
- После завершения промывки нажмите кнопку «Отмена», чтобы вернуться к «Старте». Выберите «Запустить существующий процесс» и нажмите кнопку «Начать свой выбор». Откройте программу «MRC комплект дозирования». Заполните '18', «Экземпляров» в конфигурации экрана и запустить программу.
- Монитор системы как помечены первые четыре пластины, заполнены и опечатаны.
- После того, как все 72 пластины были подготовлены и размещены в Карусель, переключатель вставки муфты от основного контейнера в небольшой контейнер. Запустите программу «Начать флеш» (см. шаг 1.1.10).
- Выключить чиллера и выбросьте пустой Скрининг комплект труб. Осторожно удалите 72 подготовленных пластины из карусели. Выбросите заполнены неправильно или плохо запечатанном пластины. Магазин готовых к использованию плит на 10 ° C.
-
Система 2: настройка кристаллизации капельки (100 nL белка + 100 nL состояния) от одного образца в 20 пластин ЛКМ
- Во-первых обеспечить системы роботы на, диспенсер nanoliter инициализируется с его программного обеспечения с открытым, и жидкость обработчик метода менеджер открыт. Включите перевозчик Микропробирка охлаждения около 15 минут, прежде чем основная программа будет запущена.
- Место испытательной пластине на моторизованных SBS несущей пластины герметика. Запустите sealer пластины и убедитесь, что пластины должным образом опечатаны. Протестируйте sealer пластины три раза.
- Затем запустите nanoliter распределитель для задания 100-nL капель раствора тест в испытательной пластине. Проверить под микроскопом, что капли установлены правильно. Закройте распылитель программного обеспечения nanoliter и удалите стрипов блок с палубы.
- Затем вставить в специально пластина держателя (см. Представитель результаты: кристаллизации устройства разработаны на ЛКМ) пластину ЛКМ с высоким относительное количество летучих реагентов в его условиях (Таблица 1). Удаления клейкая пленка от пластины.
- Откройте переднюю панель жидкого обработчик и место пластину распечатал на палубе, на задней панели первого скольжения перевозчика (раздвижные перевозчиков может быть вытащил для удобства доступа).
- Крышка с SBS алюминиевой крышкой. Урегулировать крышки к задней левый угол перевозчика, применяя мягкое давление в противоположный угол крышки.
- Распечатать, загрузить в скольжения перевозчиков и оставшиеся 19 накладки таким же образом, работающих от наиболее до наименее нестабильных условиях. После охлаждения Микропробирка перевозчика на 4 ° C, как указано на зеленый свет, удалите его крышку.
- Отрежьте крышку Микропробирка, содержащие (по крайней мере) 440 мкл пример белка (Таблица 2). Убедитесь, что образец имеет не пены выше мениска, как это будет вмешиваться с системой жидкого обнаружения. Место трубки в позиции 1 охлаждения Микропробирка перевозчика.
- Место, ПЦР-планшете на палубе жидкого обработчик перед перевозчиком адаптер пластина перемещение. Закройте переднюю панель.
- После загрузки на палубе, обеспечить четкие полосы держатель блока nanoliter распределитель палубе и что перевозчиков на задней оконечности стеки 50 мкл ясны алюминиевых крышек SBS.
- В интерфейсе жидкого обработчик «Метод управления» выберите «Установки пластин». Контролировать инициализацию обеих систем и заполнить в параметрах запуска. Следуйте указаниям интерфейса метода управления (приглашения, цифры и помочь с подготовкой системы подсказка управления).
- Проверьте, что все необходимые компоненты готовы, а затем начать процесс.
- Монитор системы как распылитель nanoliter задает капли в первой пластины и sealer пластины впоследствии уплотнения пластину.
- После того, как все 20 пластины были подготовлены с капельками кристаллизации и автоматически вернулся в скольжения перевозчиков, откройте переднюю панель и осторожно выньте пластины. Убедитесь, что пластины правильно загерметизированы перед сохранением им кристаллизации.
- Очистите SBS крышки с 20% этанола раствор перед укладывая их на левой стороне жидкого обработчика для хранения. Отменить, ПЦР-планшете и микропробирок.
- Выключить охлаждения Микропробирка перевозчика и вытереть конденсации. Оставьте бумажное полотенце на верхней поверхности кулера поглощать дальнейшей конденсации. Затем закройте крышку перевозчика и закрыть переднюю панель.
2. Оптимизация условий
-
Шприц основе жидкого обработчик: производство двух линейных градиентов концентраций в водоемы кристаллизации плиты (метод 4-угол).
- Во-первых убедитесь, что жидкость на и обработчик инициализирован с его программного обеспечения с открытым.
- На «Градиент» вкладке: откройте нужную программу, выберите тип плиты кристаллизации и окончательный объем в водоемах (Таблица 3). Дополнительные параметры для «Макс выстрел vol» должна быть снижена от 6000 до 3000 при использовании растворов, содержащих [изопропанол] > 10% v/v и [MPD] > 20% v / v.
- Подготовьте шприцы. Место поршень в каждый шприц (заостренными концами вниз) и вставьте обратно шприцы в назначенный канавки под голова робота. Твист шприца по часовой стрелке для фиксации в положении (программа будет запускаться только с всех необходимых шприцев, придает правильно).
- Подготовьте желоба. Удаление фрейма из нержавеющей стали и вставьте желоба. 4 позиции слева соответствуют 4 углах A, B, C, D. Переключитесь на вкладку «Настройка», который отображает объемы необходимых решений в каждом шприце (на таблице 3, 0.5 мл мертвого объема был добавлен к томам отображается). Налить углу решений в их соответствующих желоба и поместите рамку обратно на палубе (в рамке содержится в положении с 2 маленькие магниты, расположенные в передней части палубы). Альтернативный способ продолжить этот шаг является налить решения в желоба, когда они уже размещены на палубе.
- Место пластину кристаллизации на моторизованных SBS перевозчика.
- Нажмите кнопку «Удалить» и ждать этот шаг, чтобы быть завершена (когда поршни остановился на их пути вверх).
- Перейдите на вкладку «RUN» и запустить программу.
- После завершения работы программы, вернитесь на вкладку Настройка и нажмите кнопку «Удалить»: система чистки шприцы из оставшихся решения и затем поднимает поршни весь путь вверх. «Очистить» может быть запрошена вместо «REMOVE»; это оставит поршни в нижней позиции, готовы аспирационная больше решений с же шприцы.
- Удаление шприцы, поворачивая их против часовой стрелки.
- Шприцы и желоба в соответствующие ячейки (или промойте деионизованной водой, а затем 20% v/v этанола раствор для повторного использования).
- Печать пластину и поместить его на Гонав смеситель для 3 мин при 1000 об/мин, или 10 мин, когда высоковязких решения смешиваются. Пластину готов к настройке кристаллизации капельки на дозатор nanoliter.
-
Добавка, скрининг протокол 1 (настройка кристаллизации капельки в 96-луночных кристаллизации пластины, предварительно заполнены с добавкой экрана)
- Во-первых Подготовьте состояние с начальной концентрации реагентов, увеличилось на 10% (том 15 мл при передаче условие из контейнера на экране добавка с обработчиком жидкого мин).
- Убедитесь, что обработчик жидкого готов к работе. Откройте программу «Добавить экран добавки» на одной пластине (введите объем водохранилищ: '72 мкл»). Запрашивает, цифры и подсказка управления системы (12 x 1000 мкл советы требуется) помочь с убедившись, что робот готов действовать согласно настройкам.
- Извлечение добавка экрана от-20 ° C инкубатора и снять ее алюминиевой печать немедленно (используйте пластину держателя), а затем место пластину на палубе жидкого обработчика. Программа действует согласно макет портрет (пластина помещается с А1 уголок, расположенный в левой передней части перевозчика). Также место также заполнены с состоянием контейнера. Запустите программу.
- После заполнения резервуаров пластину поместить его на Гонав шейкер и запустить программу. Промывайте контейнер состояния с дейонизированной воды и 20% этанола для повторного использования.
- Настройка капельки на дозатор nanoliter. Во-первых вскрыть пластину кристаллизации (используйте пластину держателя). Затем, место пластину и 8-Ну белка полосы в первой позиции полосы держатель блока. На вкладке «Setup» на контрольного программного обеспечения отображаются фактической позиции каждого компонента на палубе. Загрузить каждый хорошо полосы, с образец протеина согласно необходимого размера капли (Таблица 4). Запустить программу подготовить капельки.
- По завершении программы, удалить пластину из колоды и запечатать его немедленно (используйте герметик пластины, 3-дюймовый широкий скотч). Отказаться от полосы в соответствующей ячейке.
- Оценить размер, форма и центрирование капель под микроскопом перед хранением.
-
Добавка, скрининг протокол 2 (настройка кристаллизации капельки в 96-луночных кристаллизации плита с многоразовые добавка экрана)
- Во-первых, подготовить добавка экрана: оставить пластину культуры соответствующего замороженных клеток 96-луночных разморозить при комнатной температуре за 40 мин. Затем центрифуга добавка экрана на 1000 x g на 2 мин.
- Подготовьте условие (том 15 мл при передаче условие из контейнера на экране добавка с обработчиком жидкого мин).
- Заполните резервуары плиты 96-луночных кристаллизации с условием. На обработчик жидкости действовать так же, как протокол 1, шаг 2.2.2, но ввести '80 мкл» для тома в водохранилищах.
- Настройка капельки на nanoliter распределитель с 3 компонентами на палубе (латы, содержащие добавки экрана, наряду с пластину кристаллизации и 8-Ну белка полосы в первой позиции блока стрипов, Таблица 4).
- Печать пластину культуры клетки, содержащие экран с алюминиевого листа и поместить его обратно в инкубатор-20 ° С.
- Оценить размер, форма и центрирование капель под микроскопом перед хранением.
Representative Results
1. система 1 и ЛКМ пластины
На рисунке 1A показана системы на основе жидкого обработчик, работающих с системой жидкости (деионизированной воды) 1. Жидкости система включает в себя контейнер насоса, трубы, 8 шприцы оснащены клапанами и 8 фиксированных советы. Параметры жидкости класса были оптимизированы отказаться аспирата/широкий спектр решений и мульти-обойтись на 4 тарелки (multi-обойтись требует относительно большое превышение объема без наддува). 22 Л воды контейнер и контейнер меньше (5 Л) с 20% v/v этанола хранятся под системы кормить системе жидкости. Каждый контейнер оборудован двумя вставками сцепного устройства. Одна накладка (синим цветом) каналы системы с жидкостью, другой (красный) — обратный поток для снижения избыточного давления. После использования промывка водой, а затем 20% v/v этанола раствор предотвращает рост микроорганизмов. Блок охлаждения (также расположен под системы) подключен к заказ перевозчик трубки охлаждения. Система 1-2050 мм в ширину, включая карусель, 760 мм глубиной и высотой 88 мм. В фронте для рабочего стола, который держит блок управления струйный принтер и sealer клейкой пластины требуется дополнительно 550 мм. Необходимо также дополнительное пространство рядом с системы для управления ПК. Программа для производства 72 предварительно заполненные пластины (т.е. 18 выстрелов из 4 пластин) занимает 3 ч. и 50 мин.
Рисунок 1B является крупным планом главной палубы, которая оснащена 8 фиксированных советы (рис. 1 c) смонтированы на автоматического дозирования arm, вторая рука с захвата, кончик стирки станции, 2 x 4-позицию перевозчиков для SBS пластин и перевозчик трубки охлаждения. Основная программа обрабатывает 4 пластины в то время, автоматически вынимают из карусели и расположенные на палубе, где они заполнены с условиями кристаллизации (80 мкл в водохранилищах, рис. 1 d). Жидкий уровни автоматически обнаруживаются как советы, проводящие. В то время как жидкий обработчик распределяет условий в набор пластин, другой набор пустых плиты вынимают из карусели, помечены и размещены на главной палубе. Небольшой заказ держателя и окна в задней панели обработчик жидкости должны были позиции головка принтера и его датчик на задней части главной палубы. 8 советы очищены и промывают водой из основного контейнера после каждого дозирования шага, который состоит из 4 аликвоты в соответствующих колонках водохранилищ. После того, как были заполнены 4 тарелки, они автоматически опечатаны и помещен обратно в их первоначальное положение в карусели. Sealer пластины инициируется конкретный драйвер (называемых контрольного программного обеспечения). Sealer использует рулон 3-дюймовый широкий клейкой лентой, которая применяется к пластинку с роликами под механического давления. По завершении программы, предварительно заполненные пластины вручную удалены из карусели стеки и хранятся в инкубаторе 10 ° C, расположенные в пределах объекта.
Рисунок 1 : Заполнение водохранилища с комплекты первоначальных скрининг. (A) Обзор полностью автоматизированной системы 1. Карусель представляет собой отдельный автоматизированный блок с пластинчатых и он расположен в хорошо сделаны из акрилового листа на правой стороне главной палубе. (B) главной палубе жидкого обработчика в операции с (a) перевозчик трубки охлаждение (подключенных к сдерживающее устройство под, не показан), (b) быстро стирки станции (подключенных к дренаж, не показан), (c) дозирования руку заполнение 8 водохранилищ 96-луночных кристаллизации плиты, (d) захвата рукой, принося заполненные пластину на (e) моторизованных SBS перевозчик sealer пластины. Задней части палубы является руководитель (f) печать струйный принтер подключен к (g) блока управления струйных под уплотнитель. (C) A помечены пластины (имя экрана) и Дата производства наполняется кристаллизации условий 8 проводящих фиксированной советы из политетрафторэтилена покрытием из нержавеющей стали. (D) сечение запечатанном кристаллизации хорошо. Водохранилище содержит 80 мкл кристаллизации состояния (в то время как верхняя хорошо пуст). Водохранилище и глубины верхней ну характеристики находятся в миллиметрах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
В таблице 1 показаны различные формулировки для коммерчески доступных скрининг наборы в пробирках. Комплекты используются для заполнения резервуаров 96-луночных кристаллизации пластин (LMB01-LMB22) на регулярной основе с системой 1.
| Имя пластины | Kit имя | поставщик | Номер каталога | трубы | Основное описание | ||
| LMB01 | Кристалл экран 1 | Хэмптон исследования | HR2-110 | 48 | Разреженная матрица (рН 4,6-8.5) | ||
| Кристалл экран 2 | Хэмптон исследования | HR2-112 | 48 | Стохастической выборки (рН 4,6-9.0) | |||
| LMB02 | Мастер 1 | Rigaku | 1009530 | 48 | Стохастической выборки (рН 4,5-10,5) | ||
| Мастер 2 | Rigaku | 1009531 | 48 | Стохастической выборки (рН 4,5-10,5) | |||
| LMB03 | Сульфат аммония сетки экрана | Хэмптон исследования | HR2-211 | 24 | Экран сетки, [AmS] = 0,8-3.2 М и буферы рН 4,0-9.0 | ||
| Сетке экрана PEG/LiCl | Хэмптон исследования | HR2-217 | 24 | Экран сетки, [PEG 6000] = 0-30 %w/v, высококонцентрированные LiCl = 1,0 М и буферы рН 4,0-9.0 | |||
| Быстрый экран | Хэмптон исследования | HR2-221 | 24 | Экран сетки, [NaKPO4] = 0,8-1.8 М при pH 5,0-8,2 | |||
| Хлорид натрия сетки экрана | Хэмптон исследования | HR2-219 | 24 | Экран сетки, [NaCl] = 1.0-4.0 М и буферы рН 4,0-9.0 | |||
| LMB04 | Экран сетки КОЛЫШЕК 6000 | Хэмптон исследования | HR2-213 | 24 | Экран сетки, [PEG 6000] = 5-30 %w/v и буферы рН 4,0-9.0 | ||
| Экран сетки MPD | Хэмптон исследования | HR2-215 | 24 | Экран сетки [MPD] = 10-65 %w/v и буферы рН 4,0-9.0 | |||
| MemFac | Хэмптон исследования | HR2-114 | 48 | Разреженная матрица для мембранных белков (рН 4,6-8.5) | |||
| LMB05 | ПЭГ Ион | Хэмптон исследования | HR2-126 | 48 | Экран сетки, [PEG 3350] = 20 %w/v и различные соли на 0,2 М (без буферов) | ||
| Гадюковый | Хэмптон исследования | HR2-116 | 48 | Неполные факториал (рН 5,6-8.5) | |||
| LMB06 | Кристалл экран Lite | Хэмптон исследования | HR2-128 | 48 | Кристалл экрана 1 с половины оригинального осадителя концентрации | ||
| Настраиваемый экран Lite | Молекулярные аспекты | н/д | 48 | Дополнительные условия с низкой концентрацией осадителя | |||
| LMB07 | Мастер крио 1 | Rigaku | 1009536 | 48 | Стохастической выборки с cryoprotected условий, используя низкие колья МВт (рН 4,5-9.4) | ||
| Крио мастер 2 | Rigaku | 1009537 | 48 | Стохастической выборки с cryoprotected условий, используя низкие колья МВт (рН 4,5-10.1) | |||
| LMB08 | JBS1 | JenaBioScience | CS - 101 Л | 24 | Неполные факториал, основанные на различных колышки (рН 4,6-9.0) | ||
| JBS2 | JenaBioScience | CS - 102 Л | 24 | Неполные факториал, основанный на 4000, ПЭГ (рН 4,6-8.5) | |||
| JBS3 | JenaBioScience | CS - 103 Л | 24 | Неполные факториал, основанный на 4000, ПЭГ (рН 4,6-8.5) | |||
| JBS4 | JenaBioScience | CS - 104 Л | 24 | Неполные факториал, основанные на средних МВт колышки (рН 6,5-8,5) | |||
| LMB09 | JBS5 | JenaBioScience | CS - 105L | 24 | Неполные факториал, основанные на тяжелых МВт колышки (рН 6,5-9.5) | ||
| JBS6 | JenaBioScience | CS - 106 Л | 24 | Неполные факториал, основанный на AmS (рН 4,6-8.5) | |||
| JBS7 | JenaBioScience | CS - 107L | 24 | Неполные факториал, основанный на MPD (рН 4,6-8.5) | |||
| JBS8 | JenaBioScience | CS - 108 Л | 24 | Неполные факториал, основанный на MPD и этанола (рН 4,6-8.5) | |||
| LMB10 | JBS9 | JenaBioScience | CS - 109 Л | 24 | Факториал неполной основе общего соли и 2-пропанол (рН 4,6-8.5) | ||
| JBS10 | JenaBioScience | CS - 110L | 24 | Неполные факториал, основанные на общих солей (рН 4,6-8.5) | |||
| Очистить экран 1 стратегия pH 4.5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | |||
| Очистить экран 1 стратегия рН 5,5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | |||
| LMB11 | Очистить экран 1 стратегия рН 6,5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | ||
| Очистить экран 1 стратегия рН 7,5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | |||
| Очистить экран 1 стратегия рН 8,5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | |||
| Очистить экран 2 Стратегия pH 4.5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | |||
| LMB12 | Очистить экран 2 Стратегия рН 5,5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | ||
| Очистить экран 2 Стратегия рН 6,5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | |||
| Очистить экран 2 Стратегия рН 7,5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | |||
| Очистить экран 2 Стратегия рН 8,5 | Молекулярные аспекты | МД1 16LMB | 24 | Экран сетки с различными колышки | |||
| LMB13 | Индекс | Хэмптон исследования | HR2-144 | 96 | Малые разреженные матрицы и сетки экраны (pH 3.0-9.0) | ||
| LMB14 | SaltRX 1 | Хэмптон исследования | HR2-107 | 48 | Экран сетки, включая 22 уникальный солей против концентрации соли и pH (4.1-9.0) | ||
| SaltRX 2 | Хэмптон исследования | HR2-109 | 48 | Экран сетки, включая 22 уникальный солей против концентрации соли и pH (4.1-9.0) | |||
| LMB15 | MemStart | Молекулярные аспекты | МД1-21 | 48 | Разреженная матрица для мембранных белков (рН 4,0-10,0) | ||
| MemSys | Молекулярные аспекты | МД1-25 | 48 | Экран сетки для мембранных белков (главным образом, колышки, рН 3,5-9.5) | |||
| LMB16 | JCSG + | Qiagen | 130720 | 96 | Разреженная матрица (рН 4,0-10,0) | ||
| LMB17 | МОРФЕУС экран | Молекулярные аспекты | МД1-46 | 96 | Экран сетки, включая смеси добавок и cryoprotected условий (рН 6,5-8,5) | ||
| LMB18 | Минимальный экран Пи | JenaBioScience | CS-127 | 96 | Неполные факториал (рН 4,0-9.5) | ||
| LMB19 | Пи-PEG экран | JenaBioScience | CS-128 | 96 | Неполные факториал для мембранных белков (рН 4.8-8.8) | ||
| LMB20 | МОРФЕУС II экран | Молекулярные аспекты | МД1-91 | 96 | Экран сетки, включая смеси добавок (тяжелых атомов) и cryoprotected условий (рН 6,5-8,5) | ||
| LMB21 | ЛКМ кристаллизации экран | Молекулярные аспекты | МД1-98 | 96 | Разреженная матрица, включая условия, выбранных из публикаций ЛКМ | ||
| LMB22 | МОРФЕУС III экран | Молекулярные аспекты | н/д | 96 | Экран сетки, включая смеси добавок (наркотиков соединений) и cryoprotected условий (рН 6,5-8,5) | ||
Таблица 1: составы наборы, нашли в ЛКМ пластины. Каждый коммерческий Скрининг комплект состоит из 24/48/96 условий первоначально в пробирки. ЛКМ плиты хранятся в 10 ° C инкубаторы, расположенных в пределах объекта, где они доступны для пользователей в любое время.
2. системы 2 и требования для создания капель
Рисунок 2A показывает системы на основе жидкого обработчик19 с положительным смещением и одноразовые советы 2. Одноразовые советы поставляются в наращиваемый стеллажи подходит для автоматизированной обработки. Распределитель 3-место для загара в nanoliter20 была интегрирована в правой части системы. Аспирационная/обойтись на nanoliter дозатор работает также с положительным смещением, используя одноразовые Микрошприцы (поставляется в крупных катушек). Как автономный робот съемный стрипов блок используется для загрузки образцов белка. Для полностью автоматизированного процесса ПЦР-планшете 384-ну заменяет стрипов. Подобный герметик клей пластины к системе 1 была интегрирована с левой стороны. Sealer и Диспенсер nanoliter стоять на заказ, поднял таблиц в порядке для основных захвата до пластины носителей этих двух комплексных роботов (окно пришлось сократить в обеих боковых панелей жидкого обработчика для захвата для получения доступа за пределами Главная палуба). Основная программа вызывает определенные драйверы для триггера nanoliter дозирования программы и sealer в надлежащее время. Система 2-2850 мм, 800 мм и глубиной 800 мм. Дополнительное пространство необходимо рядом с робот для отображения контрольный компьютер. Две мусорные баки расположены под системы советы и Микрошприцы, отбрасываются в процессе (контроль PC также хранится под). Важной особенностью системы 2 является общий макет, который сохраняет легкий доступ к трем роботов, так что они могут быть использованы отдельно для оптимизации протоколы, описанные ранее, или другие протоколы, описанных в других таких кристаллизации мембранных белков в липидный мезофаз21 и случайные microseed матрицы отбора22.
Рисунок 2B является крупным планом палубы, который оснащен один манипулятор. Руку объединяет 12 независимых дозирования зондов и основные захвата. Позиции зондов может управляться индивидуально в одном направлении с целью доступа к различных местах вдоль оси между зондов или даже одной трубы. Зонды можно забрать одноразовые советы (1-12) или пару пластина подвижных адаптеров. Сначала загружаются два комплекта 4 стеки, содержащих 50 мкл одноразовые советы. Жидкий уровни автоматически обнаруживаются как советы, проводящие. Плита перемещение адаптеры разработаны с 2 резкое штыри внутри, которые формируют дополнительный захват при необходимости. На главной палубе расположены 24-позиция Микропробирка охлаждения перевозчика для выборки, хотя здесь используются только 1-2 позиции. Кроме того есть носитель для ПЦР-планшете и также 2 складских носителей для штабелирования, заказных SBS крышки (рис. 2 c). Наконец, есть 4 раздвижные перевозчиков, каждый с 5 места для кристаллизации пластин (4 x 5 = 20 пластин).
Рисунок 2 : Настройка капельки для экспериментов диффузии паров. (A) Обзор полностью автоматизированной системы 2. (B) главной палубе жидкого обработчика в операции с () хранения носителей для стеков SBS крышками, (b) стекируемых советы, (c) охлаждение носитель с образцом в Микропробирка, (d) Перевозчик 2 пластины перемещение адаптеры, (e) ПЦР пластины для передачи белка для nanoliter обработки робот, (f) 9 герметичный пластины, которые были помещены обратно в их исходные позиции, (g) Факультативный захвата, удаления SBS крышку 10тыс пластина о перевозиться на палубу жидкого обработчика, (h) следующая 10 пластин должен быть подготовлен с SBS крышками на вершине, (я) основные захвата, которая используется для транспортировки плиты ПЦР и кристаллизации, (j) основных автоматизированных рукоятка интеграции 12 дозирования зонды (2 используется для работы в качестве факультативного захвата) и основной захвата и (k) палубе nanoliter распылителя. (C) собственных пользовательских SBS крышки изготовлены из алюминия. Крышки интегрировать резиновый лист, чтобы избежать испарения условий и два маленьких отверстия, чтобы быть точно выбрали вверх по Факультативным захвата. (D) сечение запечатанном кристаллизации хорошо где водохранилище заполняется с условием и верхний ну содержит капельку состоит из Образец протеина и состояния. Потому что осадителя в капли менее концентрированным, чем в состоянии, концентрации всех компонентов в раскрывающемся списке подняться через воды потери во время процесса уравновешивания путем диффузии паров (очень схематично представлено стрелкой). (E) света микроскопии 100 nL и (F) 200 nL капельки, производимые nanoliter распылитель раствором тест (20% v/v полиэтиленгликоля 400, 0,001% w/v Safranin как красный краситель). Размер и форма капель может варьироваться chemicophysical свойства состояния. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Основная программа начинается с Факультативным захвата, удаление крышки SBS из первой пластины кристаллизации. После того, как крышка был передан перевозчику соответствующее хранения, пластину кристаллизации транспортируется на палубу nanoliter распылителя. Затем руку дозирования передает количество образцов, необходимых для создания капель от обычно охлажденные Микропробирка в первый столбец ПЦР-планшете. Впоследствии главный захвата перемещает пластину ПЦР на палубе nanoliter распределитель, который подготовит следующие опции, выбранной пользователем в начале капельки (например. Размер капли). Для этого первый образец протеина разливают в верхней Уэллс (используя единый набор из 8 Микрошприцы и multi дозирования), то в условиях кристаллизации обойтись на протеина капель (каждая строка теперь требует 8 новых Микрошприцы, чтобы избежать перекрестное загрязнение). После завершения программы установки капельки главный захвата перевозит соответствующие пластины для sealer пластины, а затем помещает ПЦР пластины обратно в исходное положение (больше белка будет обойтись в следующем столбце ПЦР пластины для следующих пластины ). Наконец, запечатанный кристаллизации пластины перемещается обратно в свое первоначальное положение на палубе: эксперименты диффузии пара уже начали в этом пластины (Рисунок 2D). Этот цикл повторяется в зависимости от количества пластин. При необходимости, дополнительный захват удаляет пустой оконечности стойку, позволяя дозирования руку, чтобы получить доступ к более советы. Программа занимает 2 часа и 20 минут и 440 мкл пример подготовить единый капель в 20 пластин с использованием выборки 100 nL + 100 nL состояния (Рисунок 2E и 2F).
При использовании распылителя nanoliter как самостоятельные робот для двух дополнительных пластин (см. Протокол, шаг 1.2.3), можно настроить весь набор первоначальный отбор плит доступны в инкубаторе 10 ° C (22 ЛКМ пластины x 96 условия = 2 112 условия).
Таблица 2 показывает требования для основной программы согласно настройкам пользователя в системе 2.
| Плиты | Размер капли (nL) | Представленном(ых) | Совет требования | Продолжительность | |||
| Номер | Тип | Vol. 1 (мкл) | Vol. 2 (мкл) | 50 мкл советы | Микрошприцы | ||
| 10 | 96-луночных | 100 | 240 | 0 | 80 | 1040 | 1 ч 12 мин |
| 20 | 96-луночных | 100 | 440 | 0 | 160 | 2080 | 2 ч 20 мин |
| 10 | 96-луночных | 100 | 240 | 240 | 160 | 2080 | 1 ч 45 мин |
| 20 | 96-луночных | 100 | 440 | 440 | 320 | 4160 | 3 ч 05 мин |
| 10 | 48-а | 1000 | 624 | 0 | 80 | 560 | 1 ч 10 мин |
| 20 | 48-а | 1000 | 1208 | 0 | 160 | 1120 | 2 ч 16 мин |
Таблица 2: Примеры вариантов основной программы в системе 2 для создания кристаллизации капельки. Необходимое количество белка образца, советы и Микрошприцы зависят от программы. Объемы выборки ' vol. 1' (выпадение 1) и ' vol. 2' (падение 2) рассчитываются следующим: (8 x требуется объем за хорошо ПЦР пластина + 4 мкл потерял объем советы) x количество пластин кристаллизации + 40 мкл мертвого объема в микропробирок. Необходимый объем за хорошо ПЦР пластины для 100 nL капельки в 96-луночных кристаллизации плита находится 2 мкл, а 6,8 мкл требуется для 1000 nL капельки в 48-ну пластине (мертвого объема в скважинах ПЦР пластины: 0,8 мкл). Дополнительного объема образца принимается во внимание («потерял тома») из-за испарения из Микропробирка и прочих потерь (например примеры наклеивания на советы). Например, для 20 MRC пластин, 100 nL, 1 капля протокол, объем выборки требуется это: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 мкл (то есть, эквивалент 22 мкл на пластину). Для каждой пластины и каждого образца требуются восемь одноразовые 50 мкл советы. Например, для 10 тарелок, протокол 2-падение, количество необходимых советов является 8 x 10 x 2 = 160 советы. Количество Микрошприцы рассчитывается следующим: (8 + количество условий каждой пластины) x количество образцов x количество пластин. Например, для 10 x 48-ну пластин, количество жидких обработчик советы требуется это: (8 + 48) x 1 x 10 = 560 советы.
3. Разработка, подготовка и обработка решений 4-угловой
Обе формулировки решений 4 угла («A, B, C и D») и соответствующей оптимизации экрана (рис. 3A) генерируются автоматически электронной таблицы Excel. Существуют различные электронные таблицы для различного числа условий — по существу 24, 48 и 96 условия — и также таблицы подготовить две различные оптимизации экраны в одной пластине. Обычно один готовит набор 4 x 10 мл углу решения в пробирках, из которых 2 – 3 Оптимизация экраны могут быть подготовлены, в зависимости от числа и объема необходимых условий. Решения наливают в желоба, от которых они придыханием обработчиком на основе шприца жидкости и позднее обойтись непосредственно в пластины (рис. 3B). Два линейных градиентов концентраций в результате смешивания A, B, C и D в систематически различные коэффициенты (рис. 3 c).
Рисунок 3: метод 4-уголок для приготовления оптимизации экраны. (A) представление двух градиентов концентраций по всему макет 96-луночных пластины. (B) на основе шприца жидкости обработчик готовы подготовить экран с 4 шприцы, вставляется голова робота. Плита кристаллизации сидит в моторизованных SBS перевозчика и 4, начиная с решения (A, B, C и D) уже отменен в их соответствующих желоба (решения были красного цвета только для демонстрационных целей). (C) соотношения решения A, B, C и D через 96 водохранилищ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 3 показывает требования для программ, доступных для пользователей на основе шприца жидкости обработчик.
| Тип плиты | LOL условия | Vol. в пластине (резервуары, мкл) | Vol. в корыте (мл) | Продолжительность |
| 96-луночных | 48 | 80 | 1.6 | 2 мин 5 сек |
| 96-луночных | 96 | 80 | 2.5 | 3 мин 50 сек |
| 96-луночных | 2 x 48 | 80 | 1.6 | 2 мин 50 сек |
| 48-а | 24 | 200 | 1.8 | 2 мин 25 сек |
| 48-а | 48 | 200 | 3 | 4 мин 20 сек |
Таблица 3: программы, доступные на шприц основе жидкого обработчик для подготовки оптимизации экраны по методу 4-угловой. 96-луночных плиты могут использоваться для подготовки 96 - или 48-условие оптимизации экрана (когда одновременно готовятся два 48-условие экраны, робот должны быть оснащены 8 шприцы и 8 желоба). Другие программы позволяют использование пластин, 48-а. Перечисленных тома в желоба включают мертвого объема (0,5 мл).
4. Аддитивные скрининг
Рисунок 4 показывает шаги для выполнения добавка скрининга, начиная с 96 добавка решения уже в водоемах пластину кристаллизации (протокол 1) или в скважинах низкопрофильные клетки культуры плита используется как многоразовый добавка экрана ( Протокол 2). В таблице 4 перечислены программы, доступные на nanoliter дозатор согласно двух типов протоколов.
Рисунок 4: два типа протоколов для добавка скрининга. 96-добавка экраны хранятся при температуре-20 ° C. После протокола 1, добавка экран первоначально добавляется водохранилища кристаллизации пластин (и идеально заполненный таким образом). Multipipette или жидкий обработчик используется отказаться условие в резервуары, содержащие добавки решения (объем добавка экрана составляет 10% от окончательного объема в водохранилищах: 8 мкл для 80 мкл заключительного тома). После смешивания условий на мешалке Гонав (не показан), на основе microsyringe nanoliter дозатор используется для задания до капельки (Таблица 4). После 2 протокола экране добавка добавляется только позже при настройке кристаллизации капельки. На этот раз nanoliter дозатор используется подготовить капельки с дополнительным компонентом на палубе (плита многоразовые клеток культуры, содержащие добавки экрана). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Протокол | Размер капли (nL) | Тип газа | Образец vol. (мкл) | LOL из Микрошприцы | Продолжительность | ||||
| Тип | Источник добавок | Белка | Состояние | Добавка | В каждом хорошо (газа) | Итого | |||
| 1 | 96-луночных кристаллизации пластина | 100 | 100 | 0 | 2 МКЛ | 2 | 16 | 104 | 2 мин |
| 1 | 96-луночных кристаллизации пластина | 200 | 200 | 0 | 5 МКЛ | 3.8 | 31 | 104 | 2 мин 10 сек |
| 2 | 96-луночных клетки культуры пластина | 200 | 200 | 100 | 5 МКЛ | 3.8 | 31 | 200 | 3 мин 45 сек |
| 2 | 96-луночных клетки культуры пластина | 500 | 500 | 100 | 5 МКЛ | 7.4 | 60 | 200 | 4 мин 15 сек |
Таблица 4: программы, доступные на nanoliter на основе microsyringe Размотчик добавка скрининг. Необходимый объем выборки в каждой скважине полосы 8-Ну рассчитывается следующим образом: мертвый объем + 12 x падение размер. Есть 2 типа полос (2 мкл и 5 мкл). Мертвые объемы являются 0,8 мкл для 2 мкл скважин (которые на самом деле может содержать 3.2 мкл Макс.) и 1.4 мкл для 5 мкл скважин (7,5 мкл Макс.). Общий объем белка требуется: 8 x объем в хорошо полосы (раунд ап значение). Мертвый объем V-образные скважины пластину культуры клеток 96-луночных составляет 2,5 мкл. Требуемое количество Микрошприцы варьируется в соответствии с выбранной программой (8 + 96 = 104; или 8 + 2 x 96 = 200).
Из-за размывание состояния с добавкой во время протокола 1 условие необходимо подготовить на пропорционально более высокой концентрации, чем первоначально. Увеличение концентрации окончательный легче всего достичь путем уменьшения окончательное добавление воды в вычисляемых окончательный объем. После этого один просто продолжается с нормальной набором вверх капель, которые смешивают состояния и выборки (например, 100 nL белка + 100 nL состояния уже смешаны с добавками). Протокол 2 (например, 200 nL белка + 200 nL состояния + 100 nL добавка) облегчает скрининга в различных концентрациях, добавок, просто изменяя объем добавка экрана добавлена. Протокол 2 предполагает более или менее разрежения капель (которые могут изменить кристаллизации).
Обработчик жидкости из системы 2 может использоваться для аспирационная достаточное условие в 12 советов и отказаться от 8 аликвоты в водоемы 96-луночных плиты (см. протокол, шаг 2.2.2), хотя этот шаг, конечно может быть сделано вручную с многоканальные пипетки ( Рисунок 4). Несколько пластин может быть заполнен одновременно с же условием при использовании жидкого обработчика (для тестирования различных присадок экраны позже). При подготовке 2 пластины, заполните контейнер реагента с по крайней мере 23 мл. При подготовке 3 пластины, заполните контейнер реагента с по крайней мере 31 мл.
5. кристаллизации пластины и связанных устройств
Дизайн обеих MRC сидя капли пара диффузии кристаллизации пластин (96-2-падение и 48-ну 1-падение, Рисунок 5A и Рисунок 5B) предоставляет характеристики, которые позволяют надежные и эффективные автоматизированные кристаллизации экспериментов, с особенно сферическую форму верхней скважин и незначительные V-образные водохранилищ, облегчающие точное дозирование и также центрифугирования, когда центрирование капель не требуется. Кроме того верхний скважин имеют эффект линзы для оптимального освещения под стереомикроскопом (полимер-УФ, передаваемых для обнаружения УФ поглощения или флуоресцентные кристаллы23).
Пользовательские печать (рис. 5 c) позволяет настраивать висит падение кристаллизации экспериментов в рамках обоих типов плит с помощью nanoliter распределитель (протоколы не показано). Наконец оба MRC плиты имеют же внешние размеры и ОПРАВЫ. Обод вписывается в пазах наш заказ пластины держателя (рис. 5 d), который используется для ручного размещения/удаления Уплотнительная лента без брызг жидкости.
Рисунок 5: MRC кристаллизации пластины и связанных устройств разработана на ЛКМ. (A) A1-угол 96-луночных пластины. Водохранилище (продолговатая) находится на левой стороне и кристаллизации, два сферических верхний скважин на право. Размеры указаны в миллиметрах. (B) A1-угол пластины 48-хорошо. Водохранилище находится на правой стороне хорошо (1 большой верхний Ну только). (C) MRC висит падение печать. (D) собственных пользовательских пластина держателя. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
6. белковых кристаллов
Рисунок 6 показывает примеры полезных кристаллов, полученные с нашей автоматизированной протоколов.
Рисунок 6: свет микроскопии капель, содержащих кристаллы получены следующие автоматизированные протоколы. (A, B) Кристаллы с начального экрана ОМПФ и MreB в тарелки, приготовленные в 2 полностью автоматизированных систем (см. разделы протокол 1.1 и 1.2, условия: хорошо A4 LMB07 и LMB20 также D12, соответственно, размер капель 100 nL белка + 100 nL состояния, работа Анджей Szewczak, ЛКМ)24. (C, D) Бар домена кристаллы до и после оптимизации начальных условий с помощью метода 4-угловой (шаг 2.1, LMB02 B6, 1000 nL + 1000 nL, неопубликованные работы Леонардо Алмейда-Соуза, LMB). (E, F) Тяжелые цепи человека Динеин 1 N-концевой домен кристаллов до и после оптимизации начальных условий с помощью метода 4-угловой (LMB20 E6, 200 nL + 200 nL, затем 500 nL + 500 nL, неопубликованные работы Эдгара Моралес-Риос, LMB). (G, H) Дополняют фактор D кристаллы до и после оптимизации состояния с добавкой скрининг (шаг 2,2, первоначальное условие из собственного пользовательского экрана, 200 nL + 200 nL, добавка D6 с 96-условие добавка экрана, неопубликованные работы Matthias Бауэр, LMB). (I, J) Вирусная конверт гликопротеина25 кристаллы до и после оптимизации состояния с добавкой скрининг (шаг 2.3, LMB20 A2, 150 nL + 150 nL, затем 200 nL + 200nL + 100 nL добавка E5 с добавкой экрана 96-условие, неопубликованные работы Иорго MODIS, Кембриджский университет, Великобритания). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
1 - подготовка и использование первоначального экранов, хранящиеся в плитах
Скрининг комплекты должна быть смешанной перед будучи обойтись в тарелки, потому что легких осадков или фаза разделение происходит в некоторых трубы во время хранения. Когда экран состоит из двух комплектов (2 x 48 трубки), первый трубки второй комплект помещается в расположение E1 охлаждения перевозчика. Когда экран состоит из 4 наборы (4 x 24 трубки), первый трубки второй комплект помещается в расположение C1, первый трубки третий комплект помещается в расположение E1 и первый трубки четвертое комплект помещается в расположение G1. Во время вставки трубы в их охлаждения перевозчика, крышки размещаются на подносе после стандартных 96-луночных пейзаж макета. Так как производители верхней крышки указаны также номера, это позволяет перекрестная проверка если все трубы были помещены в правильном порядке. Это также помогает заменить правильное крышки на трубы при заполнении снижение количество пластин.
Мы храним предварительно заполненные пластин при 10 ° C, компромисс, чтобы избежать замораживания и хранения при 4 ° C, который может вызвать ухудшение условий и проблем с уплотнением. Плиты хранятся до нескольких месяцев с обычно не заметно конденсация на внутренней стороне печати. Это менее верно для плиты LMB05, LMB06, LMB09 и LMB10, как они содержат условия с относительно высокой концентрации летучих реагентов (Таблица 1). Небольшое количество конденсата на внутренней стороне печати снижает эффективность герметизации и может вызвать перекрестного загрязнения между скважинами при вскрытии пластины. Чтобы помочь с предотвращения конденсации во время первоначального охлаждения, пластины могут передаваться сначала от Карусель в изолированные пикник кулер, который хранится в холодной комнате 4 ° C на ночь. Очень медленное охлаждение минимизирует развитие температурных градиентов в запечатанном скважин и тем самым снижает конденсации общий15. Кроме того после пластины хранятся в инкубаторе 10 ° C, собственных пользовательских SBS полистирола крышкой помещается на плите в верхней части каждого стека (не показан).
Весь набор наших предварительно заполненные плит может использоваться как большой начальный экран против образец роман, водорастворимые, белка. Кроме того меньше пластин может быть выбран в соответствии с конкретными требованиями. К примеру, LMB15 и LMB19 являются экраны разработаны специально для мембранных белков образцы26,27, или LMB20 является экран, сформулированы с тяжелым атомы для облегчения экспериментальных этапов дифракции данных28 (см. также : Формулирование экранов кристаллизации белка МОРФЕУС).
2. настройка кристаллизации капельки
При использовании системы 2, скрининг комплекты с значительное количество летучих реагенты должны обрабатываться в первую очередь. Это позволяет избежать конденсации, образуя на резиновые крышки SBS, которые могут повлиять на обработку крышкой и уплотнительные пластины. SBS-крышка имеет немного разминирования при вершине пластины, именно поэтому они должны быть выровнены первоначально (см. протокол, шаг 1.2.6). Белок мертвых тома в скважинах ПЦР пластины являются сравнительно щедрые (0,8 мкл, легенда см. Таблицу2). Обратите внимание, что одинаково щедрым мертвых тома работают при использовании nanoliter распределитель индивидуально с белком в 8-Ну полоски (Таблица 4). Меньшие объемы мертвых может работать, однако некоторые образцы придерживаться советов, калибровка робот может стать немного неточен, комната может быть теплее, чем обычно, и т.д. Все ведут к образца потерь, охватываемых щедрой мертвых томов с целью консолидации подхода.
Последние события позволили дальнейшего миниатюризация экспериментов и следовательно объем выборки, необходимых для отбора кристаллизации условий может быть значительно снижено путем интеграции соответствующих технологий29,30 . Однако некоторые аспекты дальнейшей миниатюризации нуждаются тщательного рассмотрения, например испарение капелек31 и манипуляции микрокристаллов32.
Наконец центрифугирования пластины (2000 об/мин, 1 мин) могут быть включены в качестве обычной последнего шага при настройке кристаллизации капель (в сферических верхний скважин). Более последовательной размер и форму капель результате центрифугирования может уменьшить воспроизводимость вопросы33,34. Конечно по центру капли облегчит позднее оценки экспериментов с использованием микроскопа как Фокусное будет похож по всей пластине.
3. преимущества метода 4-угловой
Наиболее важным преимуществом метода 4-угол является его простота, которая минимизирует ошибки и облегчает простой автоматизированные протоколы. Например 4 угла решения всегда будет делаться на палубе жидкого обработчика после тот же макет. Кроме того все программы основываются на фиксированных соотношений между решениями (рис. 3 c).
Ручная подготовка 4 угла решений является предпочтительным для автоматизированной обработки решений при высоких концентрациях, которые могут быть высоковязких. Относительно быстрый и точный стремление/дозирования затем возможно на большинстве типов жидких обработчиков с минимальным требованиям для оптимизации жидкого классов. Тем не менее некоторые решения угол может быть слишком вязкие робота с жидкостью системы эффективно работать. Вот почему мы выбрали для обработчика жидкость с положительным смещением (рисунок 3B).
В дополнение к 2 линейных градиентов концентраций третий компонент (например, набор буферов/добавок) может испытываться при постоянной концентрации удобным способом. Для этого относительно большой объем основного набора решений угол в достаточно высокой концентрации, за исключением компонента, чтобы быть разнообразны, подготовлен впервые. Затем запасов решения, включая этот компонент добавляется отрегулировать последний концентрации. Например 50 мл набора 4 угла решений готовятся при более высоких концентрациях 10% чем первоначально. Этот основной набор затем делится на 5 небольших подмножеств 4. Наконец 10% объема различных буфера рН растворов добавляется к каждому подмножеству.
4. форматы и типы добавка экранов
Экраны обычно хранятся при температуре-20 ° C (рис. 4), так как они не используются регулярно и содержат летучих/нестабильных соединений. Использование замороженных добавка экрана, хранящиеся в блоке глубоких скважин (1 мл в скважинах) должна быть спланирована рано, потому что это займет 12-24 hr для всех добавка решения полностью разморозить при комнатной температуре. Кроме того множество пользователей доля же добавка экрана, потенциально вызывая проблемы с перекрестного загрязнения. Наконец высота глубинно блоков делает их непригодными для большинства nanoliter распылителей. Как удобное решение для обхода этих проблем экран должны быть переданы из блока глубинно низкопрофильные пластины (рис. 4).
Исторически добавка экраны, которые включают в себя широкий спектр одного реагентов (с одной концентрации) были очень популярны в35,36. Однако были разработаны другие виды добавка экранов, которые интегрируют смеси добавок37 или уменьшение количества одного добавок в различных концентрациях38. Наконец дополнительный подход является исследовать влияние добавок на образцах до кристаллизации39,40.
5. Дополнительные соображения
Хорошая практика: Большинство экранов содержат вредных или даже токсичных веществ и следовательно надлежащей личной защиты должны быть использованы во время протоколов. Аналогичным образом движущихся частей роботов может привести к травм, особенно при попытке вручную вмешаться во время программы (хотя большинство роботов имеют кнопки/системы аварийной остановки). Из-за технических сложностей, участвующих, регулярные проверки роботов, экраны и программ с ранее характеризуется испытательные образцы имеют важное значение для устойчивого высокий уровень воспроизводимости.
Пропускная способность: Как признак между 4000 до 8000 ЛКМ пластины производится ежегодно с системой 1 (и впоследствии занятых пользователями для первоначальной проверки). Она не адаптирована к складе большое количество предварительно заполненные пластин при 10 ° C, когда ожидаемый оборот значительно ниже, поскольку после 4-5 месяцев, некоторые условия начнут ухудшаться и испаряются. Различные подходы к автоматизации протоколы были реализованы для малого и среднего размера лаборатории41.
Хранение и оценки экспериментов: После подготовки капельки, пластины, хранятся на полках низкой вибрации в комнате на 4 или 18 ° C с плотно контролируемой температуре (+ /-0,5 ° C максимальное отклонение). Эксперименты, оцениваются с помощью Микроскопы источник холодного света. Различных автоматизированных систем тепловидения коммерчески доступны, однако следует тщательно рассмотреть все аспекты: скорость, необходимые для сканирования пластина будет достаточно для обеспечения высокой пропускной способности? Помешает ли объекты, отличные от кристаллов с автофокусом? Результирующее качество изображения будет достаточно, чтобы пятно очень маленькие кристаллы (особенно вокруг края капель)? 42 , 43 , 44
Сравнение условий кристаллизации: После тщательного исследования о природе первоначально полученные кристаллы можно анализировать тенденции и сходство через условий с использованием ЛКМ экран базы данных или C6 Веб-инструмент45.
Disclosures
Мы заявляю конфликтующие коммерческий интерес, так как LifeArc коммерциализирует следующие пункты: 96 и 48 хорошо MRC плиты, MRC висит падение печать, MORPHEUS, Pi, Ангстрем и ЛКМ кристаллизации экранов.
Acknowledgments
Средство кристаллизации MRC-LMB любезно поддерживается путем Совета медицинских исследований (Великобритания). Мы благодарим членов ЛКМ для их поддержки: Ольга Perisic (PNAC), Тони Warne, Ent ван ден Fusinita и ПЭТ Эдвардс (структурные исследования), Стив Scotcher и других членов механическую мастерскую, Нил Грант и Джо Westmoreland (вспомогательные), Пол Харт и тома Пратт, (он). Мы также хотели бы поблагодарить Стив Эллиот (Текан, Великобритания), Стюарт Митчелл и Хизер Рингроуз (Гамильтон робототехника, Великобритания), Пол оттепель, Роберт Льюис и Joby Дженкинс (ТТП Labtech, Великобритания), Пол Реардон (Swissci AG, Швейцария), Джордж Стивенс и Ogg (Alphabiotech, Дональд Великобритания), Нейл Уильямс (Markem-Imaje, Великобритания) и Грэхем Харрис (Кливленд агентство) для получения технической помощи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Robots | |||
| Freedom EVO® | Tecan | n/a | Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. |
| Microlab® STAR™ | Hamilton | n/a | Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface. |
| Mosquito® | TTP Labtech | n/a | Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. |
| Dragonfly® | TTP Labtech | n/a | Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. |
| Adhesive plate sealer | Brandel | n/a | Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot). |
| Inkjet printer 9232 | Markem-Imaje | n/a | Integrated to System 1. Touchscreen interface. |
| Crystallization screens | |||
| Crystal Screen™ 1 | Hampton Research | HR2-110 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Crystal Screen 2™ | Hampton Research | HR2-112 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Wizard™ Classic 1 | Rigaku | 1009530 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Wizard™ Classic 2 | Rigaku | 1009531 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Grid Screen™ Ammonium Sulfate | Hampton Research | HR2-211 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG/LiCl | Hampton Research | HR2-217 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Quick Screen™ | Hampton Research | HR2-221 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ Sodium Chloride | Hampton Research | HR2-219 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG 6000 | Hampton Research | HR2-213 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| Grid Screen™ MPD | Hampton Research | HR2-215 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| MemFac™ | Hampton Research | HR2-114 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| PEG/Ion™ | Hampton Research | HR2-126 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Natrix™ | Hampton Research | HR2-116 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Crystal Screen Lite™ | Hampton Research | HR2-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Custom Lite screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Wizard™ Cryo 1 | Rigaku | 1009536 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| Wizard™ Cryo 2 | Rigaku | 1009537 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| JBS1 | JenaBioScience | CS-101L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS2 | JenaBioScience | CS-102L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS3 | JenaBioScience | CS-103L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS4 | JenaBioScience | CS-104L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS5 | JenaBioScience | CS-105L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS6 | JenaBioScience | CS-106L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS7 | JenaBioScience | CS-107L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS8 | JenaBioScience | CS-108L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS9 | JenaBioScience | CS-109L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| JBS10 | JenaBioScience | CS-110L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Index™ | Hampton Research | HR2-144 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13 |
| SaltRX™ 1 | Hampton Research | HR2-107 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| SaltRX™ 2 | Hampton Research | HR2-109 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| MemStar™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-21 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| MemSys™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-25 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| JCSG-plus™ Suite | Qiagen | 130720 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16 |
| MORPHEUS® screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17 |
| Pi minimal screen | JenaBioScience | CS-127 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18 |
| Pi-PEG screen | JenaBioScience | CS-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19 |
| MORPHEUS® II screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-91 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20 |
| LMB crystallization screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-98 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21 |
| Additive screens | |||
| HT additive screen | Hampton Research | HR2-138 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93-500 | Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93 | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100-FX | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well). |
| HIPPOCRATES additive screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III). |
| Other consumables | |||
| 96-well MRC 2-drop plate | Swissci | MRC 96T-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80 µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible. |
| 48-well MRC 1-drop plate ('MAXI plate') | Swissci | MMX01-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200 µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible. |
| MRC hanging drop seal | Swissci | n/a | Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible. |
| Adhesive sealing tape | Hampton Research | HR4-50 | 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing. |
| Adhesive aluminium sheet | Beckman Coulter | 538619 | Used to reseal additive screens. |
| Ink cartridge | Markem-Imaje | 9651 | System 1 (inkjet printer). |
| Solvent cartridge | Markem-Imaje | 8652 | System 1 (inkjet printer). |
| 50 µL tips | Hamilton | 235947 | System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks. |
| Reagent container | Hamilton | 194052 | Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. |
| PCR plate | Thermo Scientific™ | AB-2150 | System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells. |
| microsyringes | TTP Labtech | 4150-03020 | Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing). |
| strip-holder block | TTP Labtech | 3019-05013 | SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'. |
| 2 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03110 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL. |
| 5 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03100 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL. |
| 5 mL syringes | TTP Labtech | 4150-07100 | Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100. |
| Troughs/Reservoirs | TTP Labtech | 4150-07103 | Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50. |
| Orbital microplate shaker | CamLab Limited | n/a | Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm). |
| Microplate mixer | TTP Labtech | 3121-01015 | MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins. |
References
- Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
- McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
- Bergfors, T. M. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
- Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285 (2011).
- Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
- Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
- Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
- Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
- Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
- Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
- Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
- Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
- Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
- Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
- Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
- Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
- Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
- Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
- DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
- Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
- Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000 (2012).
- Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548 (2013).
- Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
- Szewczak, A. Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , University of Cambridge, UK. (2016).
- Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
- Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
- Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
- Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
- Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
- Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
- Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
- Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
- Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
- Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
- McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
- Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
- McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
- Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
- Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
- Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
- Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
- Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
- Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
- Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
- Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).
