Summary
自動化されたシステムと画面の大きい数のルーチンの準備のためのプロトコル、蒸気拡散実験のためのナノリットル結晶滴は説明し、説明しました。
Abstract
X 線を回折する高品質の結晶が得られるとき、結晶構造は原子分解能の近くで解決できるかもしれない。蛋白質、Dna、Rna、その錯体の結晶化条件はない、しかし予測します。さまざまな条件を用いた回折結晶の品質の収穫を増加する方法です。2 つの完全に自動化されたシステムは、ナノリットル液滴を用いた蒸気拡散によってで、MRC 分子生物学実験施設 (ケンブリッジ、イギリス、MRC LMB) 1,920 の初期条件に対する結晶化を容易にする開発されています。半自動化されたプロトコルは、試薬、pH、濃度を変更するか、可能性のある結果の結晶の特性を向上させる添加物を導入することによって条件を最適化する開発されています。対応するすべてのプロトコルの詳細に説明・簡潔に説明されます。一緒に取られて、彼らは便利で高効率高分子結晶化マルチ ユーザー機能でユーザーに彼らの実験の主要なパラメーターを制御を与えている間を有効にします。
Introduction
さらに原子レベルで生物学と疾患のメカニズムの私達の理解を進めるため、その後薬物探索1への合理的なアプローチを支援するために、x 線結晶構造解析が広く適用されます。このため、精製、蛋白質、DNA、RNA、その他配位子およびその錯体の濃縮 (2-50 mg/mL) 高分子サンプルは、フォームの傾向を命じた三次元格子結晶化2,3 を試験的 ,4。X 線を回折する高品質の結晶が得られるとき、結晶構造は原子分解能5,6の近くで解決できるかもしれない。重大に、新しいサンプルを結晶化条件を予測できず、高品質結晶の収量が通常非常に低い。根本的な理由は、興味の多くのサンプルが結晶化 (通常は数日) の対応するタイム スケールでそれらを不安定にさせる挑戦の生化学的特性を持っていることです。最後に、プロセスは、サンプルとサンプルのバリエーションを生産し、彼らの精製と結晶化7、8を最適化するために必要な時間によって合成されます。
結晶化条件のサンプルの溶解度を低減する共沈剤とソリューションであり、条件は頻繁にまたバッファーおよび添加物を含みます。何百ものような試薬、サンプルの完全性 (蛋白質、核酸の展開など) と干渉する性向が低いので結晶化実験のパラメーターを変更する適しています。結晶化試薬の組み合わせの数百万のテストは可能ではない、様々 な戦略9配合 - 多くのスクリーニング キットにはいくつかのテスト,10 - は小型の試験やプロトコル自動で可能です。このような観点で最も従順の技術はおそらく特殊な結晶化プレート11で実装された結晶化条件 (25 250 μ L) を含む貯水池の上の小さな井戸の上に座って 100 200 nL 水滴と水蒸気拡散,12. 蛋白質のサンプルと条件は頻繁に 200 の合計ボリュームの 1:1 の比率で結合 nL 上井戸における液滴を設定するとき。代替技術や下油バッチ13など脂質キュービック相14 (最新のものは膜貫通タンパク質に特に適用されるプレートで実装可能なロボット ナノリットル タンパク質結晶化非常に悪い水で溶ける)。
MRC LMB に結晶化設備は 2000 年代初頭に開始され、2005年15で私達の自動化されたプロトコルの初期の概要が発表されました。タンパク質結晶化への歴史的導入が発表され、またロボット ナノリットルの利点の概要のアプローチ (その後、日常的な実験への新しいアプローチ).高分子結晶化以来、さまざまな (最適) の初期条件を採用、非常にほとんど、あるいは全く役立つ事前情報が本質的に確率過程品質回折結晶16の収量を高めます。その上、大初期画面のしばしば見落とされる利点はサンプルと多くの場合結晶の最適化の必要性を大幅に削減します。もちろん、1 つはまだ後でいくつかの初期条件の最適化を続行する必要があります。通常、試薬の pH 濃度は体系的に調査します。多くの試薬は、さらに結晶化のパラメーターを変更する最適化された条件に組み入れることもできます。確かに、1 つは作りたてのサンプルの結晶化を試みる必要があります、それゆえ対応するプロトコルなりません簡単で利用可能ないつでも。
ここで、2 つは完全に MRC LMB (システム 1 と 2) で設計されたシステムを自動化し、対応するプロトコルの記述に完全に。これらの 2 つのシステムの主な用途は初期座ってドロップ結晶化プレートを用いた蒸気拡散によってスクリーニングです。システム 1 は、液体ハンドラー、株式板に自動化されたカルーセル、プレートの分類のためのインク ジェット プリンタと接着プレート シーラーを統合します。システム 1、72 96 ウェル プレート、市販のスクリーニング キット (試験管に 10 mL の開始ボリュームから貯水池に転送条件の 80 μ L) でいっぱい、ラベルおよびシールします。プレートは、利用可能なユーザーにいつでも (初期画面と呼ばれる 'LMB プレート') として 10 ° C の定温器に保存されます。
システム 2 は、粘着プレート シーラー、ナノリッター ディスペンサー液体ハンドラーを統合します。システムの蒸気拡散実験の滴 (100-1,000 nL) に座って 2 は条件を組み合わせることによって生成され、20 の 48 または 96 ウェル プレートの上井戸にサンプルは事前条件でいっぱい。これは 1,920 の選考条件は試験的システム 2 で 20 LMB プレートを使用する場合を意味します。
ロボットは選択した条件の最適化にも個別に使用され、対応する半自動化されたプロトコルについても説明します。4 コーナー方法17を日常的に利用して、最適化画面を生成します。対応するプロトコルは最初 4 ソリューション ('A、B、C、および D') のマニュアルの準備を要求します。(2 主な結晶化剤の濃度の 2 つの線形グラデーションは結晶化プレートの貯水池に直接は自動的に生成されます。このため、注射器ベースの液体ハンドラーは異なる比率で 4 コーナー ソリューションを分配します。
条件をさらに最適化するには、可能性のある結果の結晶18の特性を高める添加物スクリーン採用できます。添加剤のスクリーニングのため 2 つの方法があります: 液滴 (プロトコル 1) を設定する前に結晶化プレートの貯水池に分配される添加物から始まるプロトコルと添加物の画面が分配される別のプロトコル直接に水滴 (プロトコル 2)。
自動の高分子の結晶化を容易にする MRC LMB で開始された他の有用な開発はまた掲載されています。基本的には、結晶化プレートとふたを積み重ね可能な社会の生体分子スクリーニング (SBS) などの関連するデバイスはシステム 2 を使用して、条件の蒸発を最小限にします。
簡潔にするため、ユーザーが基本機能とナノリッター ディスペンサー、インク ジェット プリンター、および接着剤板シーラーのメンテナンスに精通していることが想定されます。ロボットのデッキ プレートが配置されている限り、そのよく A1 (A1 コーナー) はプレート キャリアの左後ろの方。
Protocol
1. 2 つの完全自動システム (第一次選考)
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システム 1: 72 96 ウェルの結晶化プレートの準備はスクリーニング キット (LMB 板) でいっぱい
- 手順を実行する前にシステムのロボットが初期化され、制御ソフトウェアが開いていることを確認します。チラー チューブ冷却キャリアのメイン プログラムが開始する前に約 30 分を入れます。
- プレート シーラーのモーターを備えられた SBS キャリアのテスト プレートを配置します。プレート シーラーを実行し、フィルムが正しく適用されることを確認します。プレート シーラーが準備ができていることを確認する 2 回以上このテストを繰り返します。
- 20 L の脱イオン水を液体ハンドラーのメイン コンテナーに追加します。小さなコンテナー (20% エタノールの解決の洗浄) からカップリング挿入を外し、メインのコンテナーに挿入を接続します。
- インク ジェット プリンターのタッチ スクリーンに適切なスクリーン名 (表 1) を入力します。開くし、カルーセルの回転をトリガーするカルーセル ドアを閉じます。最初のスタックがそれ自身を示すときは、ドアを開きます。
- 22 の結晶化プレートをそれぞれ 1 列向きを持つ最初のスタックは完全に読み込むをします。完全に同じ方法で次の 2 つのスタックをロードします。
- 4 番目のスタックの最も高い位置で残り 6 プレートをロードします。カルーセルのドアを閉じます。
- 冷凍機の表示は 14 ° c. を示すことを確認します。ゆっくりと繰り返し 1 分選択したスクリーニング キットを反転します。次に、液体ハンドラーのフロント パネルを開きます。
- 管を開き、標準の 96 ウェル レイアウト(A1、A2)によると冷却キャリア内に配置します。各管に配置するとキャリアで、同じ 96 ウェル レイアウト トレイにその蓋を配置します。
- クロス チェック チューブ位置し、すべてのチューブが、レベルでキャリアに定住しました。フロント パネルを閉じます。
- 液体ハンドラー ソフトウェアの 'スタートアップ' ウィンドウで '実行メンテナンス' を選択し、フラッシュのプログラムを開きます。液体分注チップの外側を洗浄するシステムから 20% エタノールをフラッシュするプログラムを実行します。
- フラッシュが完了すると、「スタートアップ」に戻るには、[キャンセル] をクリックします。'既存のプロセスの実行'、'あなたの選択を開始' をクリックします。「MRC キット調剤' プログラムをを開きます。入力 '18' 'インスタンス' 構成の画面し、プログラムを実行します。
- 最初の 4 つのプレート、ラベル、いっぱい、密封システムを監視します。
- すべて 72 プレートを準備し、カルーセルで再配置するは、小さな容器に主なコンテナーからカップリング挿入を切り替えます。'フラッシュを開始' プログラムを実行 (手順 1.1.10 参照)。
- チを切り、空を破棄スクリーニング キット チューブ。カルーセルから 72 準備板を慎重に取り外します。誤って充填が不十分な密閉型またはプレートを破棄します。10 ° c. ですぐに使用できるプレートを保存します。
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システム 2: 設定の 20 LMB プレートの 1 つのサンプルから結晶化液滴 (100 nL タンパク質 + 100 nL 条件)
- まず、システムのロボットが、ナノリッター ディスペンサーは、オープン ソフトウェアで初期化されます、液体ハンドラーのメソッド マネージャーが開いていることを確認します。チューブ冷却キャリアをオンに、メイン プログラムが開始する前に約 15 分。
- プレート シーラーのモーターを備えられた SBS キャリアのテスト プレートを配置します。プレート シーラーを実行し、プレートを適切にシールされていることを確認します。テスト プレート シーラー 3 回。
- ナノリッター ディスペンサー テスト プレートで試験溶液の 100 nL 液滴を設定するを実行します。顕微鏡下で水滴が正しく設定されていることを確認します。ナノリットル ディスペンサー ソフトウェアを閉じて、デッキからストリップ ホルダー ・ ブロックを削除します。
- 次に、カスタム デザインのプレート ホルダーに挿入 (代表の結果を参照してください: 結晶デバイス開発、LMB) 条件 (表 1) 揮発性試薬の最高の相対量を用いた LMB プレート。プレートから粘着フィルムを削除します。
- 液体ハンドラーの前面パネルを開き、最初のスライド キャリアの後ろのデッキで封印されていないプレートを置き (スライド キャリアが引き出されるアクセスの容易さのため)。
- カバー、SBS アルミ蓋付きプレート。キャリアの後部の左上隅に向かって蓋を蓋の反対側の角に穏やかな圧力を適用することによって解決します。
- 開封、スライド キャリアに読み込む作業から最も少なく揮発性の条件を同じ方法で残りの 19 のプレートをカバーします。マイクロ チューブ冷却キャリアが 4 ° c と緑色のライトによって示されるように、カバーを外します。
- 蛋白質のサンプル (表 2) の (少なくとも) 440 μ L を含むマイクロ チューブの蓋をカットします。この液体検知システムの妨げとなりますのでサンプルには、メニスカスの上の泡はありませんを確認します。マイクロ チューブ冷却キャリアの位置 1 にチューブを置きます。
- プレート移動アダプター キャリアの前に液体ハンドラー デッキに PCR プレートを配置します。フロント パネルを閉じます。
- デッキをロードした後ナノリットル ディスペンサー デッキはストリップ ホルダー ・ ブロックのクリアと 50 μ L チップ スタックの後ろにキャリアがアルミ SBS 蓋の明確であるを確認します。
- 液体ハンドラーのメソッド管理 ' インターフェイス 'セットアップ プレート' を選択します。両方のシステムの初期化を監視し、実行のパラメーターを入力します。(プロンプト、数字および準備を手伝ってチップ管理システム) のメソッド管理インターフェイスのガイドラインに従ってください。
- 必要なすべてのコンポーネントの準備が整ったと、プロセスを開始することを再確認してください。
- モニター システム ナノリッター ディスペンサーはその後最初のプレートとプレートのシーラーで滴をセットとしては、プレートをシールします。
- すべて 20 プレートを結晶滴で準備し、自動的にスライド式のキャリアに戻ると、フロント パネルを開くし、プレートを慎重に取り外します。プレートが結晶化のそれらを格納する前に密封されて正しくことを確認します。
- ストレージの液体ハンドラーの左側にそれらを積み重ねる前に 20% エタノール溶液と SBS の蓋をきれい。PCR プレートと、チューブを破棄します。
- マイクロ チューブ冷却キャリアを切り、結露を拭きします。さらに結露を吸収するクーラーの表面の上にペーパー タオルを残します。キャリア カバーを交換し、フロント パネルを閉じます。
2. 条件の最適化
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注射器ベースの液体ハンドラー: 結晶化プレート (4 コーナー方法) の貯水池に濃度の 2 つの線形グラデーションを作成します。
- 液体ハンドラーはオープン ソフトウェアで初期化されて最初を確認します。
- 'グラデーション' タブ: 必要なプログラムを開き、貯水池 (表 3) の結晶化プレート型と最終巻を選択。[イソプロパノール] > 10 %v/v と [警視庁] > 20 %v を含むソリューションを使用する場合/v は、3,000、6,000 から 'max ショット集」の高度な設定を引き下げるべき
- 注射器を準備します。各注射器 (ダウン先の尖った端) にピストンを配置、注射器の背面をロボットの頭の下に指定の溝に挿入します。注射器を (プログラムが正しく接続されているすべての必要な注射器でのみ開始) 位置でロックを時計回りにねじる。
- 谷を準備します。ステンレス製のフレームを削除し、谷を挿入します。左側の 4 つの位置は、4 コーナー A、B、C、D. (表 3、0.5 mL のデッド ボリュームが表示されているボリュームに追加された) の各シリンジのソリューションに必要なボリュームを表示する '設定' タブにスイッチに対応します。彼らのそれぞれの谷にコーナー ソリューションを注ぎ、デッキ (デッキの前面にある 2 つの磁石の位置に保持するフレーム) にフレームを置きます。には既にデッキに置かれるとき、谷にソリューションを注ぐには、この手順を続行する方法です。
- モーターを備えられた SBS キャリアの結晶化プレートを配置します。
- 「吸引」をクリック、(ピストンを途中で止まって) ときに完了するこの手順を待ちます。
- '実行'] タブに切り替えて、プログラムを実行します。
- プログラムを修了すると、設定タブに戻り、[削除]: システムが残ったソリューションから注射器をパージし、ピストンをわざわざ持ち上げます。'削除' の代わりに '削除' があります; これは同じ注射器でより多くのソリューションを吸引する準備ができて下の位置でピストンを残しています。
- 注射器をそれらを反時計回りに回して取り外します。
- 注射器と適切な箱に谷を破棄 (または脱イオン水とし、再利用するため 20 %v/v エタノール溶液で洗浄し)。
- プレート シール、高粘性溶液が混合されているとき、1,000 rpm 3 分または 10 分のマイクロ プレート ミキサーに置きます。プレートはナノリッター ディスペンサーに結晶化液滴を設定可能です。
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添加剤のスクリーニング プロトコル (結晶化液滴添加物画面であらかじめ塗りつぶさ 96 ウェルの結晶化プレートを設定) 1
- まず、初期濃度 10% (分 vol. 15 mL 液体ハンドラーと添加物の画面上にコンテナーから状態を転送するとき) 増加した試薬の状態を準備します。
- 液体ハンドラーが動作するように準備ができていることを確認します。プログラム「一枚板の添加剤追加画面」を開く (貯水池ボリュームを入力: '72 μ').プロンプト、フィギュアやロボットは、選択した内容に従って動作するように準備ができていることを確かめるとチップ管理システム (必要な 12 x 1,000 μ L ヒント) ヘルプします。
- -20 ° C の定温器から添加物の画面を取得し、そのアルミ シールをすぐに (プレート ホルダーを使用) を削除、液体ハンドラーのデッキ プレートを配置します。プログラム (プレートはキャリアのフロント左にある A1 コーナーに) 縦レイアウトに従って動作します。条件を満たしたを配置もできます。プログラムを実行します。
- プレートの貯水池が入力されている後は、マイクロ プレート シェーカーにし、プログラムを実行します。再利用の脱イオン水と 20% エタノールを状態のコンテナーをすすいでください。
- ナノリッター ディスペンサーで水滴を設定します。まず、開封結晶化プレート (プレート ホルダーを使用します)。その後、ストリップ ホルダー ・ ブロックの最初の位置に帯プレートと 8 もタンパク質。制御ソフトウェアの 'セットアップ' タブにはデッキ上の各コンポーネントの実際の位置が表示されます。それぞれを読み込む必要なドロップ サイズ (表 4) によると蛋白質のサンプルを有する帯板のも。液滴を準備するプログラムを実行します。
- プログラムを修了すると、デッキからプレートを削除し、すぐにそれを封印 (プレート シーラー、3 インチ幅の粘着テープを使用)。適切な箱にストリップを破棄します。
- サイズ、形状を評価し、保管する前に顕微鏡下で水滴の中心します。
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添加剤のスクリーニング プロトコル (再使用可能な添加物スクリーン 96 ウェルの結晶化プレートにおける結晶化液滴を設定) 2
- まず、添加物の画面を準備: 40 分間室温で解凍に対応する冷凍の 96 ウェル細胞培養プレートを残します。その後、2 分間 1,000 x g で添加物の画面を遠心分離機します。
- 条件 (分 vol. 15 mL 液体ハンドラーと添加物の画面上にコンテナーから状態を転送するとき) を準備します。
- 条件で 96 ウェルの結晶化プレートの貯水池を埋めます。液体ハンドラーのプロトコル 1 として同じ道を進む、2.2.2、ステップしますが、貯水池のボリュームの '80 μ L' を入力してください。
- デッキ (結晶化プレートと 8 よくタンパク質ストリップ ストリップ ホルダー ・ ブロック、表 4の最初の位置に、添加物の画面を含むプレート) の 3 つのコンポーネントを持つナノリッター ディスペンサーで水滴を設定します。
- アルミニウム シート、スクリーンを含む細胞培養プレートを密封し、-20 ° C の定温器に戻ってそれを置きます。
- サイズ、形状を評価し、保管する前に顕微鏡下で水滴の中心します。
Representative Results
1 システム 1 と LMB プレート
図 1 aは、1 液系 (脱イオン水) と液体ハンドラーに基づいてシステムを示しています。液系には、コンテナー、ポンプ、チューブ、バルブ、8 固定ヒント 8 注射器が装備されています。液体のクラス設定は、さまざまなソリューションおよびマルチを吸引/分注に最適化されたが-4 プレートに分注 (マルチ-調剤吸引量の比較的大きな過剰が必要です)。22 L の水容器と小さい容器 (5 L) 20 %v/v エタノール液システムを供給するシステムの下に格納されます。各コンテナーには 2 つのカップリング挿入が備わっています。1 つの挿入 (青色) フィード液システム、液帰還が過剰な圧力を減らすためには、その他のもの (赤)。使用後は、微生物成長を防ぐ水し 20 %v/v エタノール溶液で洗浄します。(また、システム下にある) 冷却ユニットは、特注チューブ冷却キャリアに接続されます。システム 1 は 2050 mm 幅、カルーセル、深さ 760 mm 高さ 88 mm などです。追加 550 mm は、インク ジェット プリンターは、粘着プレート シーラーのコントロール ユニットを保持する作業の前に必要です。追加のスペースは、制御している PC のシステムの横にも必要です。(すなわち18 4 板のラウンド) 72 あらかじめ板を作成するプログラムは、3 時間 50 分かかります。
図 1 bは 8 固定ヒント (図 1) マウント、自動ピペッティング アーム、グリップ、チップ洗浄ステーション、SBS プレート 2 x 4 位キャリアで別のアーム チューブ冷却キャリアを装備したメインデッキのクローズ アップです。メイン プログラムは、カルーセルから自動的に取得され、結晶化条件 (貯水池、図 1で 80 μ L) 満ちている彼らはデッキに置か時 4 プレートを処理します。液体のレベルは、先端が導電性に自動的に検出されます。液体ハンドラーは、プレートのセットに条件を分配、間空の皿の別のセットはカルーセルから取り出して、ラベル、メインデッキに配置。小さな特注ホルダーと液体ハンドラーの背面パネルのウィンドウ プリンタ ヘッドとメインデッキの後ろにそのセンサーを配置する必要があります。8 のヒントがフラッシュされ、貯水池の対応する列に 4 の因数で構成される各調剤手順の後主要な容器から水で洗浄します。4 プレートを塗りつぶした後彼ら自動的に封止、カルーセルの元の場所に戻されます。プレート シーラーは、(制御ソフトウェアと呼ばれる) 特定のドライバーによってトリガーされます。シーラーは、機械圧力の下でローラーとプレートに適用する 3 インチ幅の粘着テープのロールを使用します。プログラムを修了すると、あらかじめ入力されたプレートがカルーセル スタックから手動で削除、施設内にある 10 の ° C の定温器に格納します。
図 1: 最初のスクリーニング キットで貯水池を充填します。完全に自動化されたシステム 1 の (A) の概要。カルーセルはプレートのスタックを別々 の自動ユニット、右側メインデッキに透明なアクリル シートは、よく建物します。(B) 操作 (、) 管冷却キャリアの液体ハンドラーのメインデッキ (に接続されての下に冷却機示されていない)、(b) 高速洗浄駅 (示されていない排水に接続)、(c) ピペッティングの腕(e) 上に塗りつぶされたプレート プレート シーラーのモーターを備えられた SBS キャリアをもたらすグリッパー アーム 96 ウェルの結晶化プレート (d) の 8 の貯水池を充填します。デッキの後ろに (g) にシーラーの下にインク ジェットのコントロール ユニットに接続されているインク ジェット プリンターの印刷 (f) ヘッドです。(C) A ラベル プレート (画面の名前) と製造年月日 8 導電性四フッ化エチレン樹脂コーティングされたステンレス製のヒントを固定で結晶化条件で満たされています。(D) 断面も封印された結晶。貯水池には、結晶化条件の 80 μ L が含まれています (中にも上部は空です)。貯留層上井戸深さ仕様がミリメートル単位で。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 1は、試験管で市販のスクリーニング キット別の処方を示します。キットは、1 システムで定期的に 96 ウェルの結晶化プレート (LMB01-LMB22) の貯水池を埋めるに使用されます。
| 板名 | キット名 | サプライヤー | カタログ番号 | チューブ | 基本的な説明 | ||
| LMB01 | 液晶画面 1 | ハンプトンの研究 | HR2-110 | 48 | 疎行列 (pH 4.6 8.5) | ||
| 液晶画面 2 | ハンプトンの研究 | HR2-112 | 48 | 確率的サンプリング法 (pH 4.6 9.0) | |||
| LMB02 | ウィザード 1 | リガク | 1009530 | 48 | 確率的サンプリング法 (pH 4.5 10.5) | ||
| ウィザード 2 | リガク | 1009531 | 48 | 確率的サンプリング法 (pH 4.5 10.5) | |||
| LMB03 | グリッド画面のアンモニウムの硫酸塩 | ハンプトンの研究 | HR2-211 | 24 | グリッド画面で、[AmS] = 0.8 3.2 M とバッファー pH 4.0 9.0 | ||
| グリッド画面ペグ/LiCl | ハンプトンの研究 | HR2-217 | 24 | グリッド画面で、[PEG 6000] 0-30 %w/v、濃度 LiCl を = = 1.0 M とバッファー pH 4.0 9.0 | |||
| クイック スクリーン | ハンプトンの研究 | HR2-221 | 24 | グリッド画面で、[NaKPO4] = 0.8 1.8 ph 5.0 8.2 M | |||
| グリッド画面塩化ナトリウム | ハンプトンの研究 | HR2-219 | 24 | グリッド画面で、[食塩] = 1.0 4.0 M とバッファー pH 4.0 9.0 | |||
| LMB04 | グリッド画面 PEG 6000 | ハンプトンの研究 | HR2-213 | 24 | グリッド画面で、[PEG 6000] = 5 30 %w/v とバッファー pH 4.0-9.0 | ||
| グリッド画面 MPD | ハンプトンの研究 | HR2 215 | 24 | グリッド画面 [警視庁] = 10 65 %w/v とバッファー pH 4.0-9.0 | |||
| MemFac | ハンプトンの研究 | HR2-114 | 48 | 膜タンパク質 (pH 4.6 8.5) 疎行列 | |||
| LMB05 | ペグ イオン | ハンプトンの研究 | HR2-126 | 48 | グリッド画面で、[ペグ 3350] = 20 %w/v と種々 の塩 0.2 M (バッファーなし) | ||
| ヤマドリ | ハンプトンの研究 | HR2-116 | 48 | 不完全な階乗 (pH 5.6 8.5) | |||
| LMB06 | Lite の液晶画面 | ハンプトンの研究 | HR2-128 | 48 | 元の沈殿の濃度の半分と液晶画面 1 | ||
| カスタム ライト スクリーン | 分子の大きさ | n/a | 48 | 低変性濃度と追加条件 | |||
| LMB07 | クライオ ウィザード 1 | リガク | 1009536 | 48 | 確率サンプリング条件 cryoprotected 低 MW ペグ (pH 4.5 9.4) を使用して、 | ||
| クライオ ウィザード 2 | リガク | 1009537 | 48 | 確率サンプリング条件 cryoprotected 低 MW ペグ (pH 4.5 10.1) を使用して、 | |||
| LMB08 | JBS1 | JenaBioScience | CS-101 L | 24 | 様々 なペグ (pH 4.6 9.0) に基づいて不完全な階乗 | ||
| JBS2 | JenaBioScience | CS-102 L | 24 | PEG 4000 (pH 4.6 8.5) に基づく不完全な階乗 | |||
| JBS3 | JenaBioScience | CS-103 L | 24 | PEG 4000 (pH 4.6 8.5) に基づく不完全な階乗 | |||
| JBS4 | JenaBioScience | CS-104 L | 24 | 中型 MW ペグ (pH 6.5 8.5) に基づく不完全な階乗 | |||
| LMB09 | JBS5 | JenaBioScience | CS-105 L | 24 | 重い MW ペグ (pH 6.5 9.5) に基づく不完全な階乗 | ||
| JBS6 | JenaBioScience | CS-106 L | 24 | AmS (pH 4.6 8.5) に基づく不完全な階乗 | |||
| JBS7 | JenaBioScience | CS-107 L | 24 | MPD (pH 4.6 8.5) に基づく不完全な階乗 | |||
| JBS8 | JenaBioScience | CS-108 L | 24 | MPD とエタノール (pH 4.6 8.5) に基づいて不完全な階乗 | |||
| LMB10 | JBS9 | JenaBioScience | CS-109 L | 24 | 不完全な階乗共通塩に基づいて、2-プロパノール (pH 4.6 8.5) | ||
| JBS10 | JenaBioScience | CS-110 L | 24 | 共通塩 (pH 4.6 8.5) に基づく不完全な階乗 | |||
| 戦略画面 1 pH 4.5 をクリアします。 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | |||
| 明確な戦略画面 1 pH 5.5 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | |||
| LMB11 | 明確な戦略画面 1 pH 6.5 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | ||
| 明確な戦略画面 1 pH 7.5 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | |||
| 明確な戦略画面 1 pH 8.5 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | |||
| 戦略画面 2 pH 4.5 をクリアします。 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | |||
| LMB12 | 明確な戦略画面 2 pH 5.5 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | ||
| 明確な戦略画面 2 pH 6.5 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | |||
| 明確な戦略画面 2 pH 7.5 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | |||
| 明確な戦略画面 2 pH 8.5 | 分子の大きさ | MD1 16LMB | 24 | 様々 なペグのグリッド画面 | |||
| LMB13 | インデックス | ハンプトンの研究 | HR2-144 | 96 | 小さなスパース行列とグリッド画面 (pH 3.0 9.0) | ||
| LMB14 | SaltRX 1 | ハンプトンの研究 | HR2-107 | 48 | ユニークな 22 を含むグリッド画面塩塩濃度と pH (4.1 9.0) | ||
| SaltRX 2 | ハンプトンの研究 | HR2-109 | 48 | ユニークな 22 を含むグリッド画面塩塩濃度と pH (4.1 9.0) | |||
| LMB15 | MemStart | 分子の大きさ | MD1 21 | 48 | 膜タンパク質 (pH 4.0 10.0) 疎行列 | ||
| MemSys | 分子の大きさ | MD1 25 | 48 | 膜タンパク質 (主ペグ、pH 3.5 9.5) グリッド画面 | |||
| LMB16 | JCSG + | Qiagen | 130720 | 96 | 疎行列 (pH 4.0 10.0) | ||
| LMB17 | モーフィアス画面 | 分子の大きさ | MD1 46 | 96 | 添加物および cryoprotected 条件 (pH 6.5 8.5) の組み合わせを含むグリッド画面 | ||
| LMB18 | Pi 最小限の画面 | JenaBioScience | CS 127 | 96 | 不完全な階乗 (pH 4.0 9.5) | ||
| LMB19 | Pi ペグ画面 | JenaBioScience | CS 128 | 96 | 膜タンパク質 (pH 4.8 8.8) 不完全な階乗 | ||
| LMB20 | モーフィアス II スクリーン | 分子の大きさ | MD1 91 | 96 | 添加剤 (重原子) および cryoprotected 条件 (pH 6.5 8.5) の組み合わせを含むグリッド画面 | ||
| LMB21 | LMB 結晶化画面 | 分子の大きさ | MD1 98 | 96 | LMB の出版物から選択した条件を含む疎行列 | ||
| LMB22 | モーフィアス III 画面 | 分子の大きさ | n/a | 96 | 添加剤 (薬剤化合物) および cryoprotected 条件 (pH 6.5 8.5) の組み合わせを含むグリッド画面 | ||
表 1: LMB プレートに発見したキット製剤。各商業スクリーニング キットは、試験管で最初 24/48/96 条件で構成されます。LMB プレートは、施設内にある、彼らはいつでもユーザーが利用できる、10 ° C のインキュベーターで貯蔵されます。
2. システム 2 と液滴をセットアップするための要件
図 2 aは、システムの正の変位・使い捨てチップの営業液体ハンドラー19に基づいて 2 を示しています。積み重ねラック自動処理に適した使い捨てチップが備わっています。3 位デッキ ナノリットル ディスペンサー20システムの右側に統合されていた。(スプール中大付属) 使い捨てのシリンジを使用して肯定的な変位もナノリッター ディスペンサーを吸引/分注動作します。スタンドアロンのロボットとしては、取り外し可能なストリップ ホルダー ブロックを使用して蛋白質試料を読み込みます。完全に自動化されたプロセスでは、384 ウェル PCR プレートはストリップ ホルダーを置き換えます。似たようなシステム 1 に接着プレート シーラーは左側に統合されました。シーラーとナノリッター ディスペンサー (ウィンドウ外のアクセスを得るためにグリッパーの液体ハンドラーの両サイドのパネルでカットしていたメイン グリップのこれらの 2 つの統合ロボット プレート キャリアに到達するために特注、調達の作業テーブルの上に立つメインデッキは不要)。メイン プログラムが期限までにトリガー ナノリットル調剤プログラムやシーラーに特定のドライバーを呼び出す時間。システム 2 です 2,850 mm、幅 800 mm、高さ 800 mmロボット制御している PC のディスプレイの横に追加のスペースが必要です。ヒントとシリンジ (制御している PC はまたの下に格納されている) プロセスで破棄のためのシステムの下に 2 つのゴミ箱があります。2 システムの重要な特徴は、全体のレイアウトは、3 つのロボットに簡単にアクセスが保持されるので、前述した最適化のプロトコルまたは結晶化など他の場所で説明されているその他のプロトコルに個別に使える膜タンパク質脂質メソ相21と22をスクリーニング ランダム microseed マトリックスの。
図 2 bシングル ロボット アームが装備されているデッキのクローズ アップがあります。12 独立分注プローブやメイン グリップ、腕が統合されています。プローブの位置は、一方向にプローブまたは単一の管の間の軸に沿って異なる場所にアクセスするために、個別に制御できます。プローブは使い捨てチップ (1-12) またはプレート移動のペアのいずれかを拾うことができるアダプター。50 μ L の使い捨てチップを含む 4 スタックの 2 つのセットが最初に読み込まれます。液体のレベルは、先端が導電性に自動的に検出されます。プレート移動のアダプターは、必要なとき、オプションのグリップを形成する内側に 2 の鋭いピンが付いて設計されています。メインのデッキに配置して冷却サンプルは、キャリア 24 位置チューブのみ 1-2 位置はここに使用されます。さらに、PCR プレート用キャリアとも積み重ね可能な特注の SBS 蓋 (図 2) の 2 のストレージ キャリアがあります。最後に、結晶化プレートの 5 拠点でそれぞれ 4 スライド キャリアがあります (4 x 5 = 20 プレート)。
図 2: 気相拡散実験のための液滴を設定します。(A) 完全に自動化されたシステム 2 の概要。(B) SBS 蓋、(b)、積み重ね可能なヒント、(c) 冷却キャリア チューブ、(d) でサンプルとキャリア 2 のスタックの操作 (、) ストレージ キャリアの液体ハンドラーのデッキのメイン プレート移動10thの SBS 蓋を取り外しオプションのグリップ (g)、初期位置に戻って配置されているタンパク質ナノリットル ハンドリング ロボット、9 (f) シール板を転送するためのアダプター、PCR プレート (e)プレートについて液体ハンドラー、PCR および結晶化プレートを輸送に使用される主なグリッパー上 (私) SBS 蓋を準備する (h) 次の 10 板のデッキに運ばれる (j) 主な自動化腕のナノリッター ディスペンサーのデッキ 12 ピペッティング プローブ (オプションのグリップとして動作するように使用されている 2) とメイン グリップと (k) を統合します。(C) 社内カスタム SBS 蓋アルミ製です。蓋は、条件の蒸発と正確にピックアップによってオプションのグリップに 2 つの小さな穴を避けるためにゴムのシートを統合します。封印された結晶化もあり、貯水池は満水状態で、アッパーも格納液滴の (D) 断面は蛋白質のサンプルと条件の両方から構成されます。しぶきの鉛塩法は条件によりより少なく集中された、ドロップのコンポーネントを介して上昇すべての濃度水の損失の平衡化のプロセス中に蒸気拡散 (非常に図式は矢印で表されます)。(E) 光顕微鏡 100 nL および (F) 200 nL 液滴ナノリッター ディスペンサー テスト ソリューション (20 %v/v ポリエチレング リコール 400、0.001 %w/v 赤色染料としてサフラニン) をプロデュースします。サイズと滴の形状は、条件の物理, 化学的性質によると異なる場合があります。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
メイン プログラムは最初の結晶化プレートから SBS 蓋を取り外しオプションのグリップに始まります。後蓋は、対応するストレージ キャリアに承継され、結晶化プレートはナノリッター ディスペンサーのデッキに移送されます。ピペッティングの腕は PCR プレートの最初の列に通常冷蔵チューブから液滴を設定するために必要な試料の量を転送します。その後、メイン グリップ移動開始時にユーザーが選択したオプションに続く液滴を準備ナノリッター ディスペンサーのデッキに PCR プレート (e.g。 液滴サイズ)。このため、蛋白質のサンプルが (シングル 8 シリンジのセット、マルチ調剤を使用)、上井戸に分配される最初し、結晶化条件は蛋白質のしぶき (各行今必要を避けるために 8 の新しいシリンジに分配されます。クロス汚染)。液滴のセットアップ プログラムが完了したら、メインのグリッパーはプレート シーラーに対応するプレートを輸送し、(より多くの蛋白質に次のプレートの PCR プレートの次の列に分配されることが元の位置に戻って PCR プレートを配置).最後に、封印された結晶化プレートが戻る上に移動元の位置デッキ: 気相拡散実験はすでにこのプレート (図 2 D) で開始。プレートの数によると、このサイクルが繰り返されます。必要に応じて、オプションのグリップはより多くのヒントにアクセスする分注の腕を許可する空のチップラックを削除します。プログラムは、2 時間 20 分と 440 μ 100 nL サンプル + 100 nL 条件 (図 2 eおよび 2 f) を使用して 20 の板における単一液滴を準備するためにサンプルを取ります。
10 の ° C の定温器で使用可能な最初のスクリーニング プレートの全体のセットを設定できます (ステップ 1.2.3 のプロトコルを見なさい) 2 つの追加プレート スタンドだけでロボットとしてナノリッター ディスペンサーを使用する場合 (22 LMB プレート x 96 条件 = 2,112 条件)。
表 2は、システム 2 にユーザーの選択に従ってメイン プログラムの要件を示します。
| プレート | ドロップ サイズ (nL) | 見本 | ヒントの要件 | 期間 | |||
| 番号 | タイプ | Vol. 1 (μ L) | Vol. 2 (μ L) | 50 μ L のヒント | シリンジ | ||
| 10 | 96 ウェル | 100 | 240 | 0 | 80 | 1040 | 1 時間 12 分 |
| 20 | 96 ウェル | 100 | 440 | 0 | 160 | 2080 | 2 時間 20 分 |
| 10 | 96 ウェル | 100 | 240 | 240 | 160 | 2080 | 1 時間 45 分 |
| 20 | 96 ウェル | 100 | 440 | 440 | 320 | 4160 | 3 時間 05 分 |
| 10 | 48 ウェル | 1000 | 624 | 0 | 80 | 560 | 1 時間 10 分 |
| 20 | 48 ウェル | 1000 | 1208 | 0 | 160 | 1120 | 2 時間 16 分 |
表 2: システム 2 結晶化液滴を設定するために使用可能なメイン プログラムのオプションの例です。蛋白質のサンプル、ヒント、シリンジの必要量は、プログラムによって異なります。サンプルのボリューム '第 1' (ドロップ 1) と' vol. 2」(ドロップ 2) は以下の通り計算されます: (x/ウェル PCR プレート + 4 μ L のボリュームは、ボリュームを失ったために必要な 8 つのヒント) 結晶化プレート + 40 μ L マイクロ チューブの容積の数 x。96 ウェルの結晶化プレート 100 nL 液滴の PCR プレートのウェルあたりの必要量は 2 μ L 6.8 μ L は 48 ウェル プレートでの 1,000 の nL 液滴に必要な (PCR プレートのウェルにデッド ボリューム: 0.8 μ L)。サンプルの追加量は、('失われたボリューム) 蒸発により考慮したマイクロ チューブとその他の損失 (例えばサンプル ヒントに付着) から取得されます。たとえば、20 MRC プレート、100 nL、1 滴のプロトコルは、必要なサンプル量は: (8 x 2 + 4) x 20 + 40 = 440 μ L (すなわち、プレートごと 22 μ L に相当)。8 つの使い捨て 50 μ L チップは、各プレートと各サンプルに必要です。10 皿、2 アンド ドロップ プロトコル必要のヒントの数のための例は 2 x 10 x 8 = 160 のヒントします。シリンジの数は以下の通り計算される: (8 + プレートごとの条件数) × サンプル数 x プレートの数。たとえば、10 x 48 ウェル プレート、必要な液体ハンドラーのヒントの数は: (8 + 48) 1 x 10 = 560 x のヒント。
3. 定式化、準備および 4 コーナー ソリューションの処理
4 コーナー ソリューション ('A、B、C および D') および対応する最適化画面 (図 3 a) の両方の製剤は、 Excel スプレッドシートによって自動的に生成されます。条件の異なった数のため別のスプレッドシートがある-本質的に 24、48、および 96 の条件- ともワークシートを単一の平板の 2 つの異なる最適化画面を準備します。1 つは通常 4 x 10 mL のセット 2-3 最適化画面を準備することができますから、数と必要な条件のボリュームによって試験管内コーナー ソリューションを準備します。ソリューションは、そこから注射器ベースの液体ハンドラーによって吸気し、(図 3 b) のプレートに直接分配後は谷に注がれます。濃度の 2 つの線形グラデーションに起因する混合、B、C、および D 体系的に様々 な比率 (図 3)。
図 3: 最適化画面を準備するため 4 コーナー方法。(A) 濃度 96 ウェル プレート レイアウト全体の 2 つのグラデーションの表現。(B) 注射器ベース液体ハンドラーがロボットの頭部に挿入される 4 注射器画面を準備します。結晶化プレートがモーターを備えられた SBS キャリアに座って、出発溶液 (A、B、C、および D) 4 が既に (ソリューションは、デモンストレーションのみを目的の色の赤をされている) 彼らのそれぞれの谷に分配されました。(C) 比 96 貯水池で A、B、C、および D のソリューション。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
表 3は、注射器を用いた液体ハンドラーのユーザーに利用可能なプログラムのための要件を示します。
| プレート型 | ポップ条件の | プレート (貯水池、μ L) の巻 | トラフ (mL) の巻 | 期間 |
| 96 ウェル | 48 | 80 | 1.6 | 2 分 5 秒 |
| 96 ウェル | 96 | 80 | 2.5 | 3 分 50 秒 |
| 96 ウェル | 2 x 48 | 80 | 1.6 | 2 分 50 秒 |
| 48 ウェル | 24 | 200 | 1.8 | 2 分 25 秒 |
| 48 ウェル | 48 | 200 | 3 | 4 分 20 秒 |
テーブル 3: プログラム 4 コーナー方法に従って最適化画面を準備するための注射器ベースの液体ハンドラーで利用可能です。96 ウェル プレートは 96 または 48 条件最適化画面を準備する使用ことができます (2 つの 48 条件画面を同時に準備したとき、ロボット装備しなくてはならない 8 注射器や 8 谷)。他のプログラムは、48 ウェル プレートの使用を有効にします。谷に記載されているボリュームには、必要なデッド ボリューム (0.5 mL) が含まれます。
4. 添加物スクリーニング
図 4ショー 96 添加剤溶液結晶化プレート (プロトコル 1) の貯水池の中または低プロファイルの井戸の中のいずれか、添加剤のスクリーニング開始の手順細胞培養プレートの再使用可能な添加物画面 (として使用プロトコル 2)。表 4には、プロトコルの 2 つのタイプに従ってナノリッター ディスペンサーで使用可能なプログラムが一覧表示されます。
図 4: 2 種類の添加剤のスクリーニングのためのプロトコル。96 無添加画面は-20 ° C で保存されます。プロトコル 1、添加物の画面は結晶化プレートの貯水池に最初に追加 (、理想的にはこの方法を貯蔵)。液体ハンドラーまたは multipipette 使用添加剤溶液を含む貯水池に条件を分配する (添加物の画面のボリュームが貯水池の最終巻の 10% を占める: 80 μ L 最終巻の 8 μ L)。(表示されていません) マイクロ プレート ミキサーで撹拌、変らずベース ナノリッター ディスペンサーが水滴 (表 4) を設定する使用されます。2 のプロトコルに従い添加物の画面が結晶化液滴のセットアップ中だけ後で追加されます。今回はそのデッキ (添加物のスクリーンを含む再使用可能な細胞培養プレート) で追加のコンポーネントと液滴の準備にナノリッター ディスペンサーを採用します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| プロトコル | ドロップ サイズ (nL) | ストリップ型 | サンプル集 (μ L) | 違います。シリンジの | 期間 | ||||
| タイプ | 添加物のソース | タンパク質 | 条件 | 添加剤 | 各井戸 (ストリップ) | 合計 | |||
| 1 | 96 ウェルの結晶化プレート | 100 | 100 | 0 | 2 Μ L | 2 | 16 | 104 | 2 分 |
| 1 | 96 ウェルの結晶化プレート | 200 | 200 | 0 | 5 Μ L | 3.8 | 31 | 104 | 2 分 10 秒 |
| 2 | 96 ウェルの細胞培養プレート | 200 | 200 | 100 | 5 Μ L | 3.8 | 31 | 200 | 3 分 45 秒 |
| 2 | 96 ウェルの細胞培養プレート | 500 | 500 | 100 | 5 Μ L | 7.4 | 60 | 200 | 4 分 15 秒 |
表 4: プログラム添加剤スクリーニング変らずベース ナノリッター ディスペンサーで利用可能です。8 よくストリップのサンプルの必要量は次のように計算: デッド ボリューム + 12 x のサイズをドロップします。ストリップ (2 μ L、5 μ L) の 2 種類があります。デッド ボリュームが (これは実際に 3.2 μ L の最大を含めることができます) 2 μ L 井戸 0.8 μ L、5 μ L 井戸 (7.5 μ max) の 1.4 μ L。必要なタンパク質の総量: ストリップ (ラウンド アップ値) の井戸で 8 x ボリューム。96 ウェルの細胞培養プレートの V 字井戸のデッド ボリュームが 2.5 μ L です。シリンジの必要数は、選択したプログラム (8 + 96 = 104; または 8 + 2 x 96 = 200) によって異なります。
プロトコル 1 間添加条件の希釈、ため条件を当初よりも比例して高い濃度で準備する必要があります。最終濃度の増加は最も簡単に計算される最終巻水の最終の添加を減らすことによって達成されます。この後、1 つだけ進む通常セットを条件と (例えば、100 nL タンパク質 + 添加剤と調合済み 100 nL 条件) のサンプルが混在する液滴の。プロトコル (例えば、200 nL タンパク質 + 200 nL 条件 + 100 nL 添加剤) 2 は、追加添加物の画面のボリュームを単に変えることによって添加物の異なる濃度のスクリーニングを促進します。プロトコル 2 はもっとまたはより少なく (結晶化を変更することがあります) 水滴の希釈を意味します。
12 のヒントで十分な条件を吸引し、96 ウェル プレートの貯水池に 8 因数を分配するシステム 2 から液体ハンドラーを使用できます (プロトコル2.2.2 のステップを参照)、この手順は手動でマルチ チャンネル ピペット (と実行もちろんできますが図 4)。(添加物の異なる画面を後でテスト) に液体ハンドラーを使用する場合、同じ条件で一度にいくつかのプレートを入力できます。2 プレートを準備しているときは、少なくとも 23 ml 試薬コンテナーを入力します。3 プレートを準備しているときは、少なくとも 31 ml 試薬コンテナーを入力します。
5 結晶化プレートと関連デバイス
両方 MRC シッティング ドロップ蒸気拡散結晶化プレート (96 ウェル 2 ドロップと 48 ウェル 1 ドロップ、図 5 aと図 5 b) のデザインは、信頼性と効率的な自動結晶化実験を可能にする特性を提供します特に上井戸の球形の形および液滴のセンタリングと正確な調剤と遠心分離を容易にする貯水池のわずかな V 形が必要です。さらに、上井戸 (ポリマーは紫外線 UV 吸収や蛍光結晶23の検出の伝染) 顕微鏡の下で最適な照明のレンズ効果があります。
カスタム シール (図 5) は、ハンギング ドロップ結晶化実験ナノリッター ディスペンサー (示されていないプロトコル) を使用して板の両方のタイプを設定できます。最後に、MRC 版は両方とも同じ外形寸法と縁があります。縁は、手動で配置する/削除するためシーリング テープ液体を飛散することがなく使用されている私たちの特注プレート ホルダー (図 5) の溝に収まります。
図 5:、MRC 結晶化プレートと関連デバイス開発、LMB 。(A) A1-96 ウェル プレートのコーナー。(長方形) のリザーバーが結晶化だけでなく、右側の 2 つの球面上井戸の左側にあります。寸法は、ミリメートルにあります。(B) A1-48 ウェル プレートのコーナー。貯水池は、(まあ 1 大上 - のみ) の右側です。(C) MRC 掛かるドロップ シール。(D) 社内のカスタム プレート ホルダーです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
6. タンパク質結晶
図 6は、私達の自動化されたプロトコルで得られた有用な結晶の例を示します。
図 6: 次のプロトコルの自動得られた結晶をもつ微小水滴の顕微鏡の光します。(A, B)板状の 2 完全 OmpF の MreB 最初の画面から結晶自動システム (プロトコルセクション 1.1 および 1.2 の条件を参照してください: LMB07 も A4 と LMB20 よく D12、それぞれ、液滴のサイズは、100 nL タンパク質 + 100 nL 条件の仕事アンジェイ Szewczak、LMB)24。(C、 D)バー ドメイン結晶初期条件の最適化前に、と後 4 コーナー方法 (手順 2.1、LMB02 B6 1,000 nL + 1,000 nL、未発表の作品、LMB のレオナルド アルメイダ サザ)。(E, F)人間のダイニン 1 N 末端ドメイン結晶 4 コーナー方法と初期条件の最適化前に、と後の重鎖 (LMB20 E6、200 nL + 200、500 nL nL + 500 nL、未発表の作品、LMB のエドガー ・ モラレス リオス)。(G, H)添加剤のスクリーニング条件の最適化前に、と後の D 因子の結晶を補完する (手順 2.2、社内カスタム スクリーン、200 から初期条件 nL + 200 nL 96 条件追加画面から添加剤 D6 未発表のマティアス バウアーの作品LMB)。(私、 J)ウイルスの封筒の糖蛋白質25結晶添加剤スクリーニング条件の最適化前に、と後 (ステップ 2.3、LMB20 A2 150 nL + 150、200 nL nL + 200nL + 100 nL 添加剤 96 条件追加画面から E5 未発表のプレミアの作品ケンブリッジ大学、英国 Modis)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
1-準備と板に格納されている最初のスクリーンの使用
スクリーニング キットは、貯蔵中にいくつかのチューブで光沈殿や相分離が発生するため、プレートに調剤されて前に混合する必要があります。画面が 2 つのキット (2 x 48 管) で構成される 2 番目のキットの最初の管は冷却のキャリアの E1 の場所に配置されます。画面 4 キット (4 x 24 管) で構成される場合、2 番目のキットの最初のチューブ、C1 の場所に配置されます、3 番目のキットの最初の管の挿入位置が E1、4 キットの最初の管場所 G1 に配置されます。その冷却のキャリアでチューブを挿入中、蓋は、次の標準的な 96 ウェル風景レイアウト トレイに配置されます。よく番号が蓋の上に製造業者によって示され、以来、これはすべての管は、正しい順序で配置されている場合をクロス チェックできます。これはまた板の減らされた数を入力するときにチューブに正しい蓋を置き換えるのに役立ちます。
あらかじめ入力されているプレートは 10 ° C、フリーズおよびシールの劣化状況と問題を引き起こす可能性のある 4 ° c の記憶を避けるために妥協に格納します。プレート保存通常顕著な結露内側の面のシールの数ヶ月まで。これは、これらは比較的高濃度の揮発性試薬 (表 1) の条件を含んでいる LMB05、LMB06、LMB09、LMB10 プレートのより少なく本当です。シールの内側に結露の量が少ないシール効率が低下し、プレートを封印しながら井戸間の交差汚染を引き起こすことができます。初期冷房時の結露を防止し、一晩 4 ° C の冷たい部屋に格納されている、断熱ピクニック クーラーにカルーセルからプレートを最初に転送できます。非常に遅い冷却シール ウエル内で温度勾配の開発を最小限に抑え、結露を減少し、したがって全体15。さらに、プレートが 10 の ° C の定温器に保存されている社内カスタム SBS ポリスチレン蓋 (図示せず) 各スタックの上部プレートに配置されます。
あらかじめ入力されたお皿のセット全体は、小説、水溶性、蛋白質のサンプルに対して大規模な初期画面として使用できます。また、少ない板は特定の要件に合わせて選択できます。たとえば、LMB15 および LMB19 は、膜タンパク質サンプル26,27の具体的策定の画面または LMB20 回折データ28の実験段階を容易にする重い原子を配合した画面 (また見なさい:モーフィアス蛋白質結晶化画面の定式化)。
2. 結晶化液滴を設定
2 システムを使用している場合最初スクリーニング大量の揮発性試薬キットを処理する必要があります。これは SBS の蓋は、蓋処理とプレート シールに影響を与えることができるゴムの結露を防ぎます。SBS 蓋に、彼らは最初に配置する必要があります理由は、プレートの上部にある隙間のビットは、(プロトコル1.2.6 の手順を参照してください)。PCR プレートの井戸の中の蛋白質のデッド ボリュームが比較的寛大な (0.8 μ L、表 2を参照してください伝説)。8 よくストリップ (表 4) でタンパク質を個別にナノリッター ディスペンサーを使用するとき寛大なデッド ボリュームも同様に、採用に注意してください。小さいのデッド ボリュームが動作可能性があります、ただし、いくつかのサンプルは、ヒントに従う、ロボットのキャリブレーションが少し不正確になる可能性があります、部屋は通常、等より暖かいかもしれません。すべてサンプル損失をアプローチを統合するために寛大なデッド ボリューム カバーに します。
さらに実験の小型化に有効に最近の動向と、それゆえ結晶化条件スクリーニングに必要なサンプル量を削減できる、対応する技術29,30 を統合することにより.しかし、更なる小型のいくつかの側面には、31液滴の蒸発および微結晶32の操作など、慎重に検討が必要があります。
最後に、(球面上井戸) の結晶化液滴を設定するとき遠心 (2,000 rpm、1 分) プレートをルーチンの最後のステップとして統合されること。一貫性のあるサイズと遠心分離に起因する液滴の形状再現性の問題33,34を減らすことができます。確かに、中心の滴は全体のプレートのようになります必要な焦点距離として顕微鏡を用いた実験の後で評価を緩和します。
3. 4 コーナー方法の利点
4 コーナー方法の最も重要な利点は、そのシンプルさ、エラーを最小限に抑え、容易に簡単な自動化されたプロトコルです。たとえば、4 コーナー ソリューションは、次の同じレイアウト液体ハンドラーのデッキに常に配置されます。また、すべてのプログラムは、固定比率は、ソリューション (図 3) に基づいています。
高濃度で高粘度にすることができますソリューションの自動処理に 4 コーナー ソリューションの手動準備お勧めします。ほとんど液体クラスの最適化のための最小要件と液体ハンドラーの型で可能な比較的迅速かつ正確な調剤/吸引できます。それにもかかわらず、いくつかのコーナーのソリューションはすぎる粘性液体システムが効率的に動作する搭載ロボットの可能性があります。これは、我々 は肯定的な変位 (図 3 b) と液体ハンドラーを選んだ理由です。
濃度の 2 の線形グラデーションに加えて便利な方法で、一定濃度の 3 番目のコンポーネント (つまりバッファー/添加剤のセット) をテストできます。このため、比較的大量に変化する成分を除く適切に高い濃度でコーナー ソリューションのコア セットの最初に準備します。その後、この成分を含む溶液が最終濃度を調整する追加されます。たとえば、一連の 4 コーナー ソリューションの 50 mL は、当初よりも 10% 高い濃度で用意しています。このコア セットし、4 の 5 の小さなサブセットに分割されます。最後に、サブセットごとに、異なるバッファー pH 液量の 10% が追加されます。
4 フォーマットおよび添加物スクリーンの種類
画面は、彼らが定期的に使用されていないので-20 ° C (図 4) で通常格納され、揮発性/不安定な化合物を含みます。ディープ ウェル ブロック (井戸で 1 mL) に格納されている冷凍添加物スクリーンを使用は、完全に室温で解凍するすべての添加剤溶液の 12 〜 24 時間かかるので早く計画されなければなりません。また、利用者が多数の交差汚染の問題を引き起こし、同じ添加物画面を共有します。最後に、ディープ ウェル ブロックの高さ、それら不適当ほとんどナノリットル ディスペンサー。これらの問題を回避する便利なソリューションとして画面に転勤させるディープ ウェル ブロックからロープロファイル プレート (図 4)。
歴史的には、さまざまな (単一濃度) と 1 つの試薬を含む添加剤の画面は、非常に人気のある35,36をされています。ただし、添加物37または単一添加剤濃度の異なる38で発見の数が減少のミックスを統合する添加物スクリーンの他のタイプを開発されています。最後に、補完的なアプローチは、結晶化39,40前にサンプルに添加剤の効果を調べるためです。
5 その他の考慮事項
をお勧め:ほとんどの画面にはあるいは有毒有害物質が含まれておよびプロトコル中にそれ故に十分な個人的な保護を用いなければなりません。同様に、ロボットの可動と、(ロボットのほとんどは、緊急停止ボタン/システムを持っている) が、プログラムの実行中に手動で干渉しようときに特にに、怪我につながる可能性があります。関与する、正規の技術的な複雑さのためチェック ロボット、画面とプログラムの以前の特徴テスト サンプルは、再現性の高いレベルで継続のために重要。
スループット:指示として 4,000 に 8,000 LMB のプレートが生産システム 1 年間 (および最初のスクリーニングのためのユーザーによってその後採用)。悪化し蒸発開始されます予想売り上げ高が 4-5 ヶ月後、いくつかの条件として、はるかに低い 10 の ° C であらかじめ入力された板の大量在庫に合わせられない。小-中規模の所41オートメーション プロトコルへの異なるアプローチを実施しています。
の格納と実験を評価する:水滴の準備ができたら、プレート、ルーム 4 または 18 ° C (± 0.5 ° C の最大偏差) 厳しく制御された温度で低振動の棚に格納されます。実験は、冷や光の源の顕微鏡を使用して評価されます。様々 な自動イメージング システムのすべての側面を慎重に検討する必要があります 1 つしかし、市販されている: プレートをスキャンするために必要な速度が高いスループットを十分でしょうか?結晶以外のオブジェクトはオート フォーカスを妨げるか。結果として得られる画像の品質は (特に水滴の周囲) のスポットの非常に小さい結晶に十分でしょうか。42,43,44
結晶化条件の比較:当初得られた結晶の性質について注意深い調査の後の傾向と類似点LMB 画面データベースまたは45C6 Web ツールを使用して、条件間で分析ができます。
Disclosures
LifeArc は、次の項目を製品化したので、我々 はここに、競合する商業的な関心を状態: 96 ~ と 48 ウェルの MRC プレート、MRC 掛かるドロップ シール、モーフィアス、Pi、オングストローム、LMB の結晶化画面。
Acknowledgments
MRC LMB 結晶化設備は、医学研究議会 (イギリス) によってサポートされている親切です。我々 は彼らのサポートの LMB のメンバーに感謝: オルガ Perisic (PNAC)、トニー · ウォーン、Fusinita ・ ヴァン ・ デン耳鼻咽喉科とパット ・ エドワーズ (構造学)、スティーブ ・ Scotcher と他のメンバー機械研修会のニール グラントそしてジョー ウェストモーランド (視覚効果)、ポール ・ ハートとトム(IT) プラット。我々 はまたステファンズにジョージとドナルド Ogg (Alphabiotech、スティーブ ・ エリオット (Tecan、英国)、ミッチェル スチュアートとヘザー Ringrose (ハミルトン ロボット、イギリス)、ポール雪解け、ロバート ・ ルイスと Joby ジェンキンス (TTP Labtech、英国)、ポール · リアドン (Swissci AG、スイス連邦共和国) に感謝したいと思います英国)、ニール ・ ウィリアムズ (Markem Imaje、英国)、グラハム ・ ハリス (クリーブランド庁) 技術的なヘルプ。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Robots | |||
| Freedom EVO® | Tecan | n/a | Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. |
| Microlab® STAR™ | Hamilton | n/a | Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface. |
| Mosquito® | TTP Labtech | n/a | Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. |
| Dragonfly® | TTP Labtech | n/a | Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. |
| Adhesive plate sealer | Brandel | n/a | Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot). |
| Inkjet printer 9232 | Markem-Imaje | n/a | Integrated to System 1. Touchscreen interface. |
| Crystallization screens | |||
| Crystal Screen™ 1 | Hampton Research | HR2-110 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Crystal Screen 2™ | Hampton Research | HR2-112 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01 |
| Wizard™ Classic 1 | Rigaku | 1009530 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Wizard™ Classic 2 | Rigaku | 1009531 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02 |
| Grid Screen™ Ammonium Sulfate | Hampton Research | HR2-211 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG/LiCl | Hampton Research | HR2-217 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Quick Screen™ | Hampton Research | HR2-221 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ Sodium Chloride | Hampton Research | HR2-219 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03 |
| Grid Screen™ PEG 6000 | Hampton Research | HR2-213 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| Grid Screen™ MPD | Hampton Research | HR2-215 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| MemFac™ | Hampton Research | HR2-114 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04 |
| PEG/Ion™ | Hampton Research | HR2-126 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Natrix™ | Hampton Research | HR2-116 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05 |
| Crystal Screen Lite™ | Hampton Research | HR2-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Custom Lite screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06 |
| Wizard™ Cryo 1 | Rigaku | 1009536 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| Wizard™ Cryo 2 | Rigaku | 1009537 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07 |
| JBS1 | JenaBioScience | CS-101L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS2 | JenaBioScience | CS-102L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS3 | JenaBioScience | CS-103L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS4 | JenaBioScience | CS-104L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08 |
| JBS5 | JenaBioScience | CS-105L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS6 | JenaBioScience | CS-106L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS7 | JenaBioScience | CS-107L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS8 | JenaBioScience | CS-108L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09 |
| JBS9 | JenaBioScience | CS-109L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| JBS10 | JenaBioScience | CS-110L | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 | Molecular Dimensions Ltd | MD1-16LMB | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12 |
| Index™ | Hampton Research | HR2-144 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13 |
| SaltRX™ 1 | Hampton Research | HR2-107 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| SaltRX™ 2 | Hampton Research | HR2-109 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14 |
| MemStar™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-21 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| MemSys™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-25 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15 |
| JCSG-plus™ Suite | Qiagen | 130720 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16 |
| MORPHEUS® screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-46 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17 |
| Pi minimal screen | JenaBioScience | CS-127 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18 |
| Pi-PEG screen | JenaBioScience | CS-128 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19 |
| MORPHEUS® II screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-91 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20 |
| LMB crystallization screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-98 | Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21 |
| Additive screens | |||
| HT additive screen | Hampton Research | HR2-138 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93-500 | Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100 | Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well). |
| MORPHEUS® additive screen | Molecular Dimensions Ltd | MD1-93 | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well). |
| ANGSTROM additive screen™ | Molecular Dimensions Ltd | MD1-100-FX | Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well). |
| HIPPOCRATES additive screen | Molecular Dimensions Ltd | n/a | 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III). |
| Other consumables | |||
| 96-well MRC 2-drop plate | Swissci | MRC 96T-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80 µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible. |
| 48-well MRC 1-drop plate ('MAXI plate') | Swissci | MMX01-UVP | Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200 µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible. |
| MRC hanging drop seal | Swissci | n/a | Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible. |
| Adhesive sealing tape | Hampton Research | HR4-50 | 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing. |
| Adhesive aluminium sheet | Beckman Coulter | 538619 | Used to reseal additive screens. |
| Ink cartridge | Markem-Imaje | 9651 | System 1 (inkjet printer). |
| Solvent cartridge | Markem-Imaje | 8652 | System 1 (inkjet printer). |
| 50 µL tips | Hamilton | 235947 | System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks. |
| Reagent container | Hamilton | 194052 | Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. |
| PCR plate | Thermo Scientific™ | AB-2150 | System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells. |
| microsyringes | TTP Labtech | 4150-03020 | Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing). |
| strip-holder block | TTP Labtech | 3019-05013 | SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'. |
| 2 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03110 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL. |
| 5 µL 8-well strip | TTP Labtech | 4150-03100 | Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL. |
| 5 mL syringes | TTP Labtech | 4150-07100 | Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100. |
| Troughs/Reservoirs | TTP Labtech | 4150-07103 | Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50. |
| Orbital microplate shaker | CamLab Limited | n/a | Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm). |
| Microplate mixer | TTP Labtech | 3121-01015 | MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins. |
References
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