Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية

Published: January 24, 2018 doi: 10.3791/55790
Automatic Translation
1, 1
1Laboratory of Molecular Biology, Medical Research Council

Summary

نظم التشغيل الآلي والبروتوكولات لإعداد عدد كبير من الشاشات الاعتيادية ونانولتر بلورة قطرات البخار نشر التجارب موصوفة ومناقشتها.

Abstract

عندما يتم الحصول على بلورات ذات جودة عالية التي ديفراكت الأشعة السينية، يمكن حلها بنية بلورية في القرب من القرار الذري. الشروط اللازمة لبلورة البروتينات والسلطات الوطنية المعينة، والكشف، وهذه المجمعات ولكن لا يمكن توقع. تستخدم مجموعة متنوعة واسعة من الظروف وسيلة لزيادة عائد بلورات حيود الجودة. وقد وضعت اثنين من أنظمة مؤتمتة بالكامل في "لجنة نهر الميكونج مختبر للبيولوجيا الجزيئية" (كامبريدج، إنكلترا، لجنة نهر الميكونج-LMB) التي تسهل فحص تبلور ضد الظروف الأولية 1,920 بنشر بخار في قطرات نانولتر. كما وضعت بروتوكولات شبه الآلي لتحسين الظروف بتغيير تركيزات الكواشف، درجة الحموضة، أو عن طريق إدخال الإضافات التي يحتمل أن تعزز خصائص البلورات الناتجة عن ذلك. سيتم وصف تفصيلي لكافة البروتوكولات المقابلة ومناقشتها بإيجاز. مجتمعة، فإنها تمكن بلورة الجزيئات ملائمة وذات كفاءة عالية في مرفق متعدد المستخدمين، بينما يعطي المستخدمين السيطرة على المعالم الرئيسية لهذه التجارب.

Introduction

يتم تطبيق علم البلورات بالأشعة السينية على نطاق واسع لزيادة تعزيز فهمنا للآليات البيولوجية والأمراض على المستوى الذري ومساعدة بعد ذلك النهج العقلاني ل اكتشاف المخدرات1. ولهذا الغرض، تنقية وعينات الجزيئات مركزة (2-50 مغ/مل) من البروتين والحمض النووي والجيش الملكي النيبالي، وغيرها يغاندس وهذه المجمعات تجربته لميلها إلى نموذج أمر المشابك ثلاثية الأبعاد من خلال بلورة2،3 ،4. عندما يتم الحصول على بلورات ذات جودة عالية التي ديفراكت الأشعة السينية، يمكن حلها بنية بلورية في القرب من القرار الذري5،6. من الأهمية بمكان لا يمكن التنبؤ بالظروف المؤاتية لبلورة نموذج رواية وعائد بلورات ذات جودة عالية عادة ما تكون منخفضة جداً. هو أحد الأسباب الكامنة وراء أن العديد من عينات من الفائدة الخصائص البيوكيميائية صعبة، مما يجعلها غير مستقرة في مقياس الوقت المطابق لبلورة (عادة بضعة أيام). وأخيراً، تتفاقم العملية الوقت المطلوب لإنتاج عينات ونماذج المتغيرات، والأمثل على تنقية وبلورة7،8.

شرط بلورة حل مع مرسب الذي يقلل من قابلية الذوبان في العينة، وتحتوي على شروط غالباً أيضا المخازن المؤقتة والمواد المضافة. مئات من هذه الكواشف هي ملائمة تماما لتغيير معلمات التجارب تبلور لديهم ميل منخفضة لتتداخل مع سلامة العينة (مثل البروتين أو تتكشف الحمض النووي). في حين اختبار الملايين من مجموعات من الكواشف تبلور ليس ممكناً، اختبار عدة للعديد من مجموعات الفحص-صيغت مع مختلف الاستراتيجيات9،10 -ممكن مع المحاكمات المنمنمة والبروتوكولات الآلي. من هذا المنظور، الأسلوب الأكثر قابلية على الأرجح نشر بخار مع 100-200 nL قطرات يجلس على بئر صغيرة فوق خزان يحتوي على بلورة الشرط (25-250 ميليلتر)، نفذت في بلورة المتخصصة لوحات11 , 12-العينة البروتين والشرط غالباً ما يقترن بنسبة 1:1 لإجمالي حجم 200 nL عند إعداد القطرات في العلوي-الآبار. تبلور البروتينات نانولتر الروبوتية يمكن تنفيذها بتقنيات بديلة ولوحات مثل دفعة النفط وكيل13 و المرحلة مكعب Lipidic14 (آخر واحد يجري تطبيقها على بروتينات الغشاء ترانس التي على وجه التحديد ضعيف جداً للذوبان في الماء).

مرفق تبلور في لجنة نهر الميكونج-LMB وقد بدأ في وقت مبكر 2000s، وقدم موجز مبكر لدينا بروتوكولات الآلي في 200515. وقدم مقدمة تاريخية لبلورة البروتينات وأيضا نهج مخطط تفصيلي لمزايا نانولتر الروبوتية (ثم نهجاً جديداً للتجريب الروتينية). منذ تبلور الجزيئات هو أساسا عملية عشوائية مع المعلومات السابقة مفيدة جداً قليلاً أو لا، توظيف مجموعة متنوعة واسعة من الظروف الأولية (مناسبة) زيادة العائد من نوعية حيود بلورات16. وإلى جانب ذلك، ميزة كثيرا ما يغفل من شاشة أولية كبيرة التقليل من الحاجة إلى التحسين من عينات والبلورات في كثير من الحالات. وبطبيعة الحال، واحدة قد لا تزال بحاجة إلى المضي قدما في الاستغلال الأمثل لبعض الشروط الأولية في وقت لاحق. عادة، ثم يجري التحقيق تركز الكواشف ودرجة الحموضة بشكل منهجي. يمكن أيضا إدخال الكواشف أكثر إلى الشروط الأمثل لتغيير المعلمات لبلورة المزيد. ومن المؤكد أن واحدة ينبغي محاولة بلورة مع عينة طازج، ومن ثم البروتوكولات المقابلة يجب أن تكون واضحة ومتاحة أي وقت.

وهنا اثنين مؤتمتة بالكامل النظم المصممة في لجنة نهر الميكونج-LMB (نظم 1 و 2) والبروتوكولات المناظرة ويرد وصف كامل. التطبيق الرئيسي لهذين النظامين الأولى الفحص قبل نشر بخار في الجلوس لوحات تبلور قطره. يدمج النظام 1 معالج سائل ودائري الآلي لوحات الأسهم، طابعة النافثة لحبر للوحة العلامات والسدادة لوحة لاصقة. على نظام 1, 72 96-جيدا لوحات مليئة بمستلزمات الفرز المتوفرة تجارياً (80 ميليلتر من شرط نقل إلى الخزان من حجم ابتداء من 10 مل في أنابيب الاختبار)، والمسمى ومختومة. ثم يتم تخزين اللوحات في حاضنة 10 درجة مئوية حيث أنها تكون متوفرة للمستخدمين في أي وقت (كشاشات الأولى دعا 'لوحات LMB').

يتكامل نظام 2 معالج سائل وموزع نانولتر السدادة لوحة لاصقة. على النظام تنتج 2، يجلس قطرات (100-1,000 nL) لبخار نشر التجارب عن طريق الجمع بين الظروف والعينة في العلوي-آبار 20 48-96 جيدا أو لوحات المملوء مسبقاً مع الظروف. وهذا يعني 1,920 الفحص الأولى شروط تجربته عند استخدام لوحات LMB 20 على نظام 2.

الروبوتات تستخدم أيضا على حدة للاستفادة المثلى الشروط المحددة، ويرد أيضا وصف للبروتوكولات شبه الآلي المقابلة. ويستخدم الأسلوب 4-ركن17 بشكل روتيني لإنتاج شاشات الأمثل. ويتطلب البروتوكول الملحق أولاً إعداد دليل لحلول 4 ('أ، ب، ج، ود'). ثم يتم تلقائياً إنشاء التدرجات الخطية اثنين من تركيزات (لاثنين من عملاء تبلور الرئيسي) مباشرة إلى الخزانات من صفيحة التبلور. ولهذا الغرض، يوزع معالج سائل على أساس حقنه الحلول الركن 4 في نسب مختلفة.

لمواصلة تحسين شرط، واحد يمكن أن تستخدم شاشات المضافة التي يحتمل أن تعزز خصائص البلورات الناتجة عن18. النهجين متاحة للفحص المضافة: بروتوكول بدءاً من المواد المضافة إلى الاستغناء عن إلى خزانات لوحات تبلور قبل إعداد القطرات (بروتوكول 1) وبروتوكول آخر حيث يتم الاستغناء عن الشاشة المضافة مباشرة على القطرات (2 من البروتوكول).

وترد أيضا التطورات المفيدة الأخرى التي كانت قد بدأت في لجنة نهر الميكونج-LMB لتيسير بلورة الجزيئات الآلي،. أساسا، تبلور اللوحات والأجهزة المرتبطة بها مثل غطاء تكويم المجتمع من الجزيئية البيولوجية الفحص (SBS) أن يقلل تبخر شروط عند استخدام نظام 2.

للإيجاز، فمن المفترض أن المستخدمين على دراية بالوظائف الأساسية وصيانة موزع نانولتر والطابعة النافثة للحبر والسدادة لوحة لاصقة. ما لم ينص على خلاف ذلك، يتم وضع لوحات على ظهر السفينة الروبوتات أن A1 جيدا ('A1-الزاوية') نحو الركن الأيمن الخلفي حاملة لوحة.

Protocol

1-اثنين مؤتمتة بالكامل نظم (الفحص الأولى)

  1. النظام 1: إعداد 72 تبلور 96-جيدا لوحات مليئة بفرز مجموعات (لوحات LMB)
    1. قبل تنفيذ هذا الإجراء، ضمان أن يتم تهيئة الروبوتات الخاصة بالنظام والبرامج الخاصة بهم المسيطر مفتوح. تشغيل المبردات لتبريد الأنبوب الناقل حوالي 30 دقيقة قبل أن يتم تشغيل البرنامج الرئيسي.
    2. ضع لوحة اختبار الناقل SBS يجهز من السدادة لوحة. تشغيل السدادة لوحة والتحقق من أن الفيلم يتم تطبيقها بشكل صحيح. كرر هذا الاختبار مرتين أكثر للتحقق من أن السدادة لوحة جاهزة.
    3. ثم إضافة 20 لتر مياه إلى الحاوية الرئيسية معالج السائل. قطع إدراجات اقتران الحاوية الصغيرة (20% إيثانول الشطف الحل) وتتصل إدراج الحاوية الرئيسية.
    4. أدخل اسم الشاشة المناسبة (الجدول 1) على لمس الطابعة النافثة للحبر. ثم فتح وإغلاق باب دائري لتحريك دوران دائري. فتح الباب عند المكدس الأولى يطرح نفسه.
    5. تحميل الكامل المكدس الأولى مع 22 تبلور لوحات، بعضها مع العمود 1 التي تواجه بها. تحميل الكامل مكدسات اثنين التالية بنفس الطريقة.
    6. تحميل لوحات 6 المتبقية في مناصب أعلى المكدس الرابعة. ثم، قم بإغلاق باب دائري.
    7. تحقق من أن عرض المبردات يشير إلى 14 درجة مئوية. بلطف وبشكل متكرر عكس مجموعات الفرز المحدد لمدة 1 دقيقة. ثم افتح اللوحة الأمامية لمعالج السائل.
    8. فتح الأنابيب ووضعها في الناقل التبريد وفقا لتخطيط 96-جيدا القياسية (A1، A2، إلخ.). عند وضع كل أنبوبة في الناقل، وضع لها غطاء على صينية في نفس التخطيط 96-جيدا.
    9. تدقيق الأنبوب المواقف والتأكد من أن جميع الأنابيب الصعيد واستقروا في الناقل. ثم أغلق اللوحة الأمامية.
    10. في إطار 'بدء التشغيل' من البرنامج معالج السائل، حدد 'تشغيل صيانة' وفتح برنامج التنظيف. قم بتشغيل برنامج لمسح الإيثانول 20% من النظام ويغسل السطح الخارجي لنصائح الاستغناء عن سائل.
    11. عند اكتمال المسح، انقر فوق 'إلغاء الأمر' للعودة إلى 'بدء التشغيل'. حدد 'تشغيل عملية القائمة' وانقر فوق 'ابدأ التحديد الخاص بك'. افتح برنامج 'لجنة نهر الميكونج الاستغناء عن مجموعة'. في '18' ملء الشاشة 'الحالات' في التكوين وتشغيل البرنامج.
    12. مراقب النظام كما وصفت اللوحات الأربع الأولى، شغل، ومختومة.
    13. مرة واحدة وقد أعدت جميع لوحات 72 ووضع مرة أخرى في دائري، التبديل إدراج اقتران من الحاوية الرئيسية إلى حاوية صغيرة. قم بتشغيل برنامج 'بدء تدفق' (راجع الخطوة 1.1.10).
    14. إيقاف تشغيل في المبردات وتجاهل إفراغ فرز أنابيب كيت. بعناية إزالة لوحات استعداد 72 من دائري. تجاهل لوحات مملوءة بشكل غير صحيح أو مختومة. تخزين لوحات جاهزة للاستخدام عند 10 درجة مئوية.
  2. نظام 2: إعداد قطرات تبلور (100 nL البروتين + 100 nL شرط) من عينة واحدة في لوحات LMB 20
    1. أولاً، ضمان الروبوتات للنظام في، يتم تهيئة موزع نانولتر البرمجيات المفتوحة، وأسلوب إدارة معالج السائل في مفتوح. تشغيل الناقل microtube والتبريد حوالي 15 دقيقة قبل أن يتم تشغيل البرنامج الرئيسي.
    2. ضع لوحة اختبار الناقل SBS يجهز من السدادة لوحة. تشغيل السدادة اللوحة، وتأكد من أن اللوحة مختومة بشكل صحيح. اختبار السدادة لوحة ثلاث مرات.
    3. ثم قم بتشغيل موزع نانولتر لتعيين 100-nL قطرات من اختبار حل في لوحة اختبار. الاختيار تحت مجهر أن القطرات تم تعيينها بشكل صحيح. قم بإغلاق البرنامج موزع نانولتر وإزالة الحظر قطاع-حامل من على سطح السفينة.
    4. المقبل، أدخل في حامل لوحة مصممة خصيصا (انظر نتائج الممثل: "تبلور الأجهزة المتقدمة" في LMB) لوحة LMB مع الكمية النسبية أعلى من الكواشف متقلبة في شروطه (الجدول 1). إزالة الفيلم لاصقة من اللوحة.
    5. افتح معالج السائل اللوحة الأمامية ووضع لوحة تفض على سطح السفينة، في الجزء الخلفي من أول ناقل انزلاق (انزلاق الناقلين قد سحب لسهولة الوصول إليها).
    6. وتغطي اللوحة مع غطاء ألومنيوم SBS. تسوية الغطاء نحو الركن الأيسر الخلفي من الناقل بتطبيق ضغط لطيف على الركن المقابل من الغطاء.
    7. فتح وتحميل الناقلين انزلاق، وتغطي لوحات 19 المتبقية بنفس الطريقة، يعمل من أكثر الأوضاع المتقلبة على الأقل. مجرد الناقل microtube والتبريد عند 4 درجة مئوية، كما يتبين من ضوء الأخضر، إزالة غلافه.
    8. قطع غطاء microtube التي تحتوي على ميليلتر (على الأقل) 440 من البروتين العينة (الجدول 2). ضمان أن العينة قد لا رغوة أعلاه غضروف، وهذا سوف تتداخل مع نظام كشف السائل. ضع الأنبوبة في 1 موقف الناقل microtube والتبريد.
    9. ضع لوحة بكر على سطح سائل معالج أمام نقل لوحة محول الناقل. ثم أغلق اللوحة الأمامية.
    10. بعد تحميل سطح السفينة، ضمان أن السفينة موزع نانولتر واضح كتلة قطاع-حامل وأن الناقلين في الجزء الخلفي من الكدسات نصيحة 50 ميليلتر واضحة من الأغطية SBS الألومنيوم.
    11. في سائل معالج واجهة '"أسلوب إدارة"'، وحدد 'إعداد لوحات'. رصد التهيئة لكلا النظامين، وملء في معلمات التشغيل. اتبع المبادئ التوجيهية "إدارة أسلوب" الواجهة (المطالبات والأرقام ونظام إدارة تلميح تعليمات بإعداد).
    12. التحقق من أن كافة المطلوبة مكونات مستعدون، ثم قم بتشغيل العملية.
    13. مراقبة النظام كما يعين الصيدلي نانولتر القطرات في اللوحة الأولى والأختام السدادة لوحة بعد اللوحة.
    14. متى أعدت مع قطرات تبلور جميع لوحات 20 وعاد تلقائياً إلى الناقلين انزلاق، فتح اللوحة الأمامية وإزالة اللوحات بلطف. تحقق من أن اللوحات مختومة بشكل صحيح قبل تخزينها للتبلور.
    15. تنظيف الأغطية SBS مع حل إيثانول 20% قبل التراص لهم على الجانب الأيسر من معالج السائل للتخزين. تجاهل لوحة بكر و microtube.
    16. إيقاف الناقل microtube والتبريد ومسح بعيداً من التكثيف. اترك منشفة ورقية فوق السطح برودة لاستيعاب مزيد من التكثيف. استبدال الغطاء الناقل ثم أغلق اللوحة الأمامية.

2-الاستغلال الأمثل للظروف

  1. معالج السائل على أساس حقنه: إنتاج التدرجات الخطية اثنين من تركيزات في الخزانات من صفيحة تبلور (الأسلوب 4-ركن).
    1. أولاً، ضمان على معالج السائل وتهيئة البرمجيات المفتوحة.
    2. في 'التدرج' التبويب: فتح البرنامج المطلوب، حدد نوع لوحة تبلور ووحدة التخزين النهائي في الخزانات المائية (الجدول 3). ينبغي خفض الإعداد المتقدمة من أجل 'ماكس المجلد النار' من 6000 إلى 3000 عند استخدام الحلول التي تحتوي على [كحولالايسوبروبيل] > 10% v/v و [MPD] > 20% v/ف.
    3. التحضير الحقن. ضع مكبس في كل حقنه (ينتهي أشار إلى أسفل) وإدراج الجزء الخلفي المحاقن الأخاديد المعين تحت رأس الروبوت. تطور حقنه عقارب الساعة تأمينه في موقف (سيتم تشغيل البرنامج فقط مع جميع المحاقن المطلوبة مرفقة بشكل صحيح).
    4. إعداد في أحواض. إزالة الإطار الفولاذ المقاوم للصدأ، وإدراج في أحواض. وتتوافق مع مواقف 4 على اليسار زوايا 4 أ، ب، ج، "د التبديل" إلى التبويب '"إعداد"' الذي يعرض وحدات التخزين للحلول المطلوبة في كل حقنه (في الجدول 3، 0.5 مل حجم القتلى تمت إضافة إلى وحدات التخزين عرض). صب الحلول الزاوية في أحواض بها كل منهما ووضع الإطار مرة أخرى على سطح السفينة (الإطار يحمل في الموقف مع 2 مغناطيس صغيرة تقع في الجزء الأمامي السفينة). طريقة بديلة للمضي قدما في هذه الخطوة صب الحلول أحواض عند سبق وضعها على سطح السفينة-
    5. ضع لوحة تبلور على الناقل SBS يجهز.
    6. انقر فوق 'نضح' والانتظار لهذه الخطوة أن يكتمل (عند توقف بيستونز في طريقهم حتى).
    7. قم بالتبديل إلى علامة التبويب 'تشغيل'، وتشغيل البرنامج.
    8. عند انتهاء البرنامج، العودة إلى علامة التبويب إعداد ثم انقر فوق 'إزالة': النظام التطهير الحقن من بقايا الحلول، وثم كل وسيلة يرفع بيستونز. يمكن طلب 'تطهير' بدلاً من 'إزالة'؛ وهذا سوف يغادر بيستونز في الموضع السفلي، استعداد لنضح حلول أكثر مع المحاقن نفسه.
    9. إزالة المحاقن بالتواء لهم الفيلتر.
    10. تجاهل المحاقن وأحواض في بن المناسبة (أو شطف لهم مع المياه ومن ثم 20% v/v الإيثانول الحل لإعادة الاستخدام).
    11. ختم اللوحة ووضعه على خلاط ميكروسكوبية دقيقة 3 1,000 لفة في الدقيقة أو 10 دقيقة عند اختلاط الحلول عالية اللزوجة. اللوحة على استعداد لتشكيل قطرات تبلور على موزع نانولتر.
  2. مضافة فحص بروتوكول 1 (إعداد قطرات تبلور في صفيحة تبلور 96-جيدا قبل مليئة بالشاشة المضافة)
    1. أولاً، إعداد الشرط مع التركيزات المبدئية من الكواشف التي زادت بنسبة 10% (المجلد الحد الأدنى 15 مل عند نقل الشرط من حاوية على الشاشة المضافة مع معالج السائلة).
    2. التأكد من أن المعالج السائل على استعداد للعمل. افتح برنامج 'شاشة إضافة إلى المواد المضافة' لوحة واحدة (إدخال وحدة التخزين في المستودعات المائية: '72 ميليلتر'). يطالبك، الأرقام ومساعدة (12 × 1,000 ميليلتر نصائح اللازمة) نظام إدارة تلميح مع التأكد من الروبوت على استعداد للعمل وفقا للتحديدات.
    3. استرداد الشاشة المضافة من الحاضنة-20 درجة مئوية وإزالة الختم الألومنيوم به فورا (استخدام حامل لوحة)، ثم ضع اللوحة على سطح السائل المعالج. البرنامج يعمل وفقا لتخطيط عمودي (يتم وضع اللوحة مع A1-الزاوية الموجود في الجزء الأيمن الأمامي من الناقل). كما وضع أيضا حاوية مليئة بالشرط. قم بتشغيل البرنامج.
    4. مرة واحدة قد ملئت خزانات اللوحة، وضعه على شاكر الميكروسكوبية وتشغيل البرنامج. شطف الحاوية للشرط مع الإيثانول منزوع الماء ونسبة 20% لإعادة استخدامها.
    5. إعداد القطرات على موزع نانولتر. أولاً، فتح لوحة تبلور (استخدام حامل اللوحة). ثم، مكان اللوحة والبروتين 8-جيدا قطاع في المرتبة الأولى من كتلة قطاع-حامل. تعرض علامة التبويب 'الإعداد' على البرمجيات مراقبة المواقف الفعلية لكل مكون على سطح السفينة. تحميل كل جيدا للقطاع بعينه البروتين وفقا لحجم قطره المطلوبة (الجدول 4). قم بتشغيل برنامج إعداد قطرات.
    6. عند انتهاء البرنامج، إزالة اللوحة من على سطح السفينة وختم ذلك فورا (استخدام لوحة السدادة، شريط لاصق عريضة 3 بوصة). تجاهل في القطاع في حاوية المناسبة.
    7. تقدير الحجم والشكل، وتوسيط من قطرات تحت المجهر قبل التخزين.
  3. مضافة فحص بروتوكول 2 (إعداد قطرات تبلور في صفيحة تبلور 96-جيدا مع شاشة مضافة القابلة لإعادة الاستخدام)
    1. أولاً، إعداد الشاشة المضافة: ترك لوحة الثقافة المجمدة 96-جيدا الخلية المقابلة لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة لمدة 40 دقيقة. ثم الطرد المركزي الشاشة المضافة في 1,000 غ س ل 2 دقيقة.
    2. إعداد الشرط (المجلد الحد الأدنى 15 مل عند نقل الشرط من حاوية على الشاشة المضافة مع معالج السائلة).
    3. ملء الخزانات من صفيحة تبلور 96-جيدا مع الشرط. في معالج السائل، المضي قدما بنفس الطريقة كبروتوكول 1، الخطوة 2.2.2، ولكن إدخال '80 ميليلتر' لوحدة التخزين في المستودعات.
    4. إعداد القطرات على موزع نانولتر مع 3 عناصر على سطح السفينة (لوحة تحتوي على الشاشة المضافة، جنبا إلى جنب مع لوحة تبلور وقطاع البروتين 8-جيدا في المركز الأول من كتلة قطاع-حامل، الجدول 4).
    5. إغلاق لوحة الثقافة الخلية التي تحتوي على الشاشة مع ورقة ألومنيوم ووضعه مرة أخرى في الحاضنة-20 درجة مئوية.
    6. تقدير الحجم والشكل، وتوسيط من قطرات تحت المجهر قبل التخزين.

Representative Results

1-النظام 1 ولوحات LMB

ويبين الشكل 1A النظام 1 يستند إلى معالج سائلة تعمل مع نظام سائل (ماء ديونيسيد). يتألف السائل-النظام حاوية، مضخة، الأنابيب، والمحاقن 8 مجهزة بصمامات ونصائح ثابتة 8. إعدادات الطبقة السائلة هي الأمثل ل aspirate/الاستغناء عن مجموعة واسعة من الحلول ومتعدد-الاستغناء عن إلى 4 لوحات (multi-الاستغناء عن يتطلب فائض كبير نسبيا من حجم يستنشق). حاوية مياه ل 22 وحاوية صغيرة (5 لتر) مع 20% v/v الإيثانول مخزنة تحت نظام تغذية النظام السائل. كل حاوية مزودة بإدراج اقتران اثنين. إدراج واحد (اللون الأزرق) يغذي النظام مع السائل، والآخر (أحمر) إعادة تدفق للحد من الضغط الزائد. بعد الاستخدام، شطف مع الماء ومن ثم 20% v/v الإيثانول حل يمنع النمو الجرثومي. وحدة تبريد (يقع أيضا تحت النظام) متصل بالمواصفات تبريد الأنبوب ناقل. نظام 1 ملم 2050 على نطاق واسع، بما في ذلك دائري وعميق 760 ملم وارتفاع 88 مم. 550 مم إضافية مطلوب في جبهة worktable يحتوي على وحدة تحكم الطابعة النافثة للحبر والسدادة لوحة لاصقة. مطلوب أيضا مساحة إضافية إلى جانب النظام للكمبيوتر المسيطر. برنامج لإنتاج ألواح شغلها قبل 72 (أي 18 طلقة من لوحات 4) يأخذ 3 ساعات و 50 دقيقة.

هو الشكل 1B عن قرب من على سطح السفينة الرئيسية التي هي مجهزة 8 ثابت نصائح (الشكل 1) التي شنت على ذراع بيبيتينج الآلي، وذراع ثاني مع القابض، محطة غسيل نصيحة، 2 × 4-موقف حاملات لوحات SBS وتبريد الأنبوب الناقل. عمليات البرنامج الرئيسي 4 لوحات في وقت التي أخرجت تلقائياً من دائري ووضعها على ظهر السفينة حيث أنها مليئة ببلورة شروط (80 ميليلتر في الخزانات، الشكل 1). يتم تلقائياً الكشف عن مستويات السائل كما موصلة النصائح. بينما يوزع معالج السائلة الشروط إلى مجموعة من لوحات، مجموعة أخرى من لوحات فارغة هو أخرجت من دائري والمسمى ووضعها على سطح السفينة الرئيسية. يلزم حامل المواصفات صغيرة ونافذة في اللوحة الخلفية لمعالج السائل بموقف رئيس الطابعة والاستشعار في الجزء الخلفي من سطح السفينة الرئيسية. مسح 8 نصائح وغسلها بالماء من الحاوية الرئيسية بعد كل خطوة الاستغناء عن التي تتكون من 4 مختبرين في الأعمدة المقابلة للخزانات. بعد وقد تم شغل 4 لوحات، فهي تلقائياً مختومة ووضع مرة أخرى في موضعها الأصلي في دائري. السدادة لوحة يتم تشغيلها بواسطة برنامج تشغيل معين (يسمى بالبرنامج المسيطر). يستخدم السدادة لفة شريط اللاصق عريضة 3 بوصة التي يتم تطبيقها على صفيحة مع كرات تحت الضغط الميكانيكي. عند انتهاء البرنامج، إزالتها يدوياً من الكدسات دائري لوحات معبأ مسبقاً والمخزنة في حاضنة 10 ° ج يقع داخل المرفق.

Figure 1
الشكل 1 : ملء الخزانات مع مجموعات الفرز الأولية. (أ) نظرة عامة على نظام مؤتمتة بالكامل 1. دائري وحدة الآلي منفصلة مع المكدسات اللوحة، وأنه يقع في بئر مصنوعة من ألواح اﻷكريليك واضحة في الجانب الأيسر على سطح السفينة الرئيسية. (ب) على سطح السفينة الرئيسية لمعالج السائل في العملية مع () تبريد الأنبوب الناقل (متصلة بوحدة تقشعر لها اﻷبدان تحتها، لم تظهر)، (ب) السريع يغسل محطة (متصلة بالصرف، ولم تظهر)، (ج) الذراع بيبيتينج ملء الخزانات 8 من لوحة تبلور 96، حسنا، (د) ذراع القابض جلب صفيحة شغلها على (ه) الناقل SBS يجهز من السدادة لوحة. في الجزء الخلفي من سطح السفينة الرأس (و) الطباعة للطابعة النافثة للحبر متصلاً (ز) وحدة التحكم النافثة للحبر تحت السدادة. (ج) المسمى لوحة (اسم الشاشة) وتاريخ الإنتاج يجري يشغلها 8 موصل ثابت نصائح مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ مطلية تترافلوروايثيلين مع ظروف التبلور. (د) عينة ممثلة لبلورة مختومة جيدا. ويتضمن الخزان ميليلتر 80 حالة تبلور (بينما العلوي جيد فارغ). الخزان ومواصفات عمق البئر العلوية من ملليمتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويبين الجدول 1 صيغ مختلفة لمجموعات الفرز المتوفرة تجارياً في أنابيب الاختبار. وتستخدم المجموعات لملء الخزانات من بلورة 96-جيدا لوحات (LMB01-LMB22) على أساس منتظم مع النظام 1.

اسم اللوحة اسم المجموعة المورد رقم الكتالوج أنابيب وصف أساسي
LMB01 شاشة كريستال 1 البحوث هامبتون HR2-110 48 مصفوفة متناثرة (pH 4.6-8.5)
شاشة كريستال 2 البحوث هامبتون HR2-112 48 أخذ العينات العشوائية (pH 4.6-9.0)
LMB02 معالج 1 ريجاكو 1009530 48 أخذ العينات العشوائية (pH 4.5-10.5)
معالج 2 ريجاكو 1009531 48 أخذ العينات العشوائية (pH 4.5-10.5)
LMB03 شبكة الشاشة كبريتات الأمونيوم البحوث هامبتون HR2-211 24 شبكة الشاشة، [هيئة علماء المسلمين] = 0.8-3.2 م ومخازن pH 4.0-9.0
شبكة الشاشة الوتد/ليكل البحوث هامبتون HR2-217 24 شبكة الشاشة، [ربط 6000] = 0-30% w/v، الأسفلت ليكل = 1.0 متر ومخازن pH 4.0-9.0
الشاشة سريعة البحوث هامبتون HR2-221 24 شبكة الشاشة، [NaKPO4] = 0.8-1.8 م في درجة الحموضة 5.0-8.2
شبكة الشاشة كلوريد الصوديوم البحوث هامبتون HR2-219 24 شبكة الشاشة، [كلوريد الصوديوم] = 1.0-4.0 م ومخازن pH 4.0-9.0
LMB04 شاشة شبكة ربط 6000 البحوث هامبتون HR2-213 24 شبكة الشاشة، [ربط 6000] = 5-30 %w/v والمخازن المؤقتة pH 4.0-9.0
شاشة شبكة MPD البحوث هامبتون HR2-215 24 شاشة شبكة [MPD] = 10-65 %w/v والمخازن المؤقتة pH 4.0-9.0
ميمفاك البحوث هامبتون HR2-114 48 مصفوفة متناثرة لبروتينات الغشاء (pH 4.6-8.5)
LMB05 شماعة أيون البحوث هامبتون HR2-126 48 شبكة الشاشة، [ربط 3350] = 20 %w/v والأملاح المختلفة في 0.2 متر (أي مخازن مؤقتة)
ناتريكس البحوث هامبتون HR2-116 48 مضروب ناقصة (pH 5.6 8.5)
LMB06 شاشة كريستال لايت البحوث هامبتون HR2-128 48 1 شاشة كريستال مع نصف تركيزات مرسب الأصلي
مخصص الشاشة لايت الأبعاد الجزيئية n/a 48 شروط إضافية مع تركيزات منخفضة مرسب
LMB07 معالج البرد 1 ريجاكو 1009536 48 أخذ العينات العشوائية مع ظروف كريوبروتيكتيد باستخدام أوتاد ميغاواط منخفضة (pH 4.5-9.4)
معالج Cryo 2 ريجاكو 1009537 48 أخذ العينات العشوائية مع ظروف كريوبروتيكتيد باستخدام أوتاد ميغاواط منخفضة (pH 4.5-10.1)
LMB08 تحرير جينابيوسسينسي CS-101L 24 مضروب ناقصة استناداً إلى أوتاد مختلفة (pH 4.6-9.0)
JBS2 جينابيوسسينسي CS-102L 24 مضروب ناقصة استناداً إلى ربط 4000 (pH 4.6-8.5)
JBS3 جينابيوسسينسي CS-103L 24 مضروب ناقصة استناداً إلى ربط 4000 (pH 4.6-8.5)
JBS4 جينابيوسسينسي CS-104L 24 مضروب ناقصة استناداً إلى متوسطة أوتاد ميغاواط (pH 6.5-8.5)
LMB09 JBS5 جينابيوسسينسي CS-105L 24 مضروب ناقصة استناداً إلى أوتاد ميغاواط الثقيلة (pH 6.5-9.5)
JBS6 جينابيوسسينسي CS-106L 24 مضروب ناقصة استناداً إلى مقياس الدعم الكلي (pH 4.6-8.5)
JBS7 جينابيوسسينسي CS-107L 24 مضروب ناقصة استناداً إلى MPD (pH 4.6-8.5)
JBS8 جينابيوسسينسي CS-108L 24 مضروب غير مكتملة على أساس MPD والايثانول (pH 4.6-8.5)
LMB10 JBS9 جينابيوسسينسي CS-109L 24 مضروب ناقصة استناداً إلى أملاح المشتركة و 2-بروبانول (pH 4.6-8.5)
JBS10 جينابيوسسينسي CS-110 ل 24 مضروب ناقصة استناداً إلى أملاح المشتركة (pH 4.6-8.5)
1 شاشة استراتيجية واضحة pH 4.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
1 شاشة استراتيجية واضحة pH 5.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
LMB11 مسح استراتيجية الشاشة 1 درجة الحموضة 6.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
مسح استراتيجية الشاشة 1 درجة الحموضة 7.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
1 شاشة استراتيجية واضحة pH 8.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
2 شاشة استراتيجية واضحة pH 4.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
LMB12 2 شاشة استراتيجية واضحة pH 5.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
مسح استراتيجية الشاشة 2 درجة الحموضة 6.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
مسح استراتيجية الشاشة 2 درجة الحموضة 7.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
2 شاشة استراتيجية واضحة pH 8.5 الأبعاد الجزيئية MD1 16LMB 24 شاشة الشبكة مع أوتاد مختلفة
LMB13 فهرس البحوث هامبتون HR2-144 96 الصغيرة شاشات المصفوفة والشبكة متفرق (pH 3.0 9.0)
LMB14 1 سالتر البحوث هامبتون HR2-107 48 شاشة الشبكة بما في ذلك 22 فريدة الأملاح مقابل تركيز الملح والحموضة (4.1-9.0)
2 سالتركس البحوث هامبتون HR2-109 48 شاشة الشبكة بما في ذلك 22 فريدة الأملاح مقابل تركيز الملح والحموضة (4.1-9.0)
LMB15 ميمستارت الأبعاد الجزيئية MD1-21 48 مصفوفة متناثرة لبروتينات الغشاء (pH 4.0-10.0)
ميمسيس الأبعاد الجزيئية MD1 25 48 شاشة شبكة لبروتينات الغشاء (معظمها أوتاد، pH 3.5-9.5)
LMB16 جكسج + Qiagen 130720 96 مصفوفة متناثرة (pH 4.0-10.0)
LMB17 شاشة MORPHEUS الأبعاد الجزيئية MD1-46 96 شاشة الشبكة بما في ذلك مزيج من المواد المضافة والشروط كريوبروتيكتيد (الرقم الهيدروجيني 6.5-8.5)
LMB18 الشاشة الحد الأدنى pi جينابيوسسينسي CS-127 96 مضروب ناقصة (pH 4.0-9.5)
LMB19 شاشة شماعة pi جينابيوسسينسي CS-128 96 مضروب العدد غير مكتمل للبروتينات الغشاء (pH 4.8-8.8)
LMB20 الشاشة الثانية MORPHEUS الأبعاد الجزيئية MD1-91 96 شاشة الشبكة بما في ذلك مزيج من المواد المضافة (الذرات الثقيلة) وشروط كريوبروتيكتيد (الرقم الهيدروجيني 6.5-8.5)
LMB21 شاشة البلورة LMB الأبعاد الجزيئية MD1-98 96 مصفوفة متناثرة بما في ذلك الشروط المحددة من المنشورات LMB
LMB22 ثالثا MORPHEUS الشاشة الأبعاد الجزيئية n/a 96 شاشة الشبكة بما في ذلك يمزج المضافات (مركبات العقاقير) وشروط كريوبروتيكتيد (الرقم الهيدروجيني 6.5-8.5)

الجدول 1: تركيبات أطقم وجدت في لوحات LMB. كل طقم الفحص التجاري يتكون من شروط 24/48/96 في البداية في أنابيب الاختبار. لوحات LMB تخزن في 10 درجة مئوية حاضنات الأعمال تقع ضمن مرفق حيث تكون متوفرة للمستخدمين في أي وقت.

2-2 نظام ومتطلبات إعداد قطرات

ويبين الشكل 2A النظام 2 استناداً إلى معالج سائل19 تعمل مع الإزاحة الموجبة ونصائح المتاح. يتم توفير نصائح المتاح في تكويم رفوف مناسبة للمناولة الآلية. تم إدماج موزع نانولتر سطح 3-موقف20 على الجانب الأيسر من هذا النظام. أسبيراتي/الاستغناء عن موزع نانولتر تعمل أيضا مع الإزاحة الموجبة باستخدام المتاح ميكروسيرينجيس (المتوفرة في البكرات الكبيرة). روبوت مستقل، هو استخدام كتلة قطاع-حامل قابل للإزالة لتحميل sample(s) البروتين. لعملية مؤتمتة بالكامل، ويستبدل لوحة بكر 384-جيدا قطاع صاحب. مماثلة تم إدماج السدادة لوحة لاصقة للنظام 1 على الجانب الأيسر. السدادة وموزع نانولتر الوقوف على worktables مبنية خصيصا، والتي أثيرت في الترتيب القابض الرئيسي للوصول إلى لوحة حاملي هذه الروبوتات المتكاملة اثنين (نافذة كان لا بد من تخفيض في الألواح الجانبية كلا من معالج التثبيت الوصول خارج السائل سطح السفينة الرئيسية). البرنامج الرئيسي وتدعو السائقين محددة للمشغل نانولتر الاستغناء عن البرامج وصائد الفقمة في الوقت المناسب الوقت. نظام 2 2,850 مم، 800 مم العميقة وارتفاع 800 مم. هناك حاجة إلى مساحة إضافية بجوار الروبوت لعرض الكمبيوتر المسيطر. صناديق النفايات اثنين تقع تحت نظام نصائح وميكروسيرينجيس تجاهل أثناء العملية (كما يتم تخزين جهاز الكمبيوتر التحكم تحت). سمة هامة للنظام 2 هو التخطيط الشامل، الذي يحتفظ بالوصول بسهولة إلى الروبوتات الثلاثة حيث أنه يمكن استخدامها منفردة للبروتوكولات الأمثل الموصوفة سابقا، أو البروتوكولات الأخرى المذكورة في أماكن أخرى مثل بلورة غشاء البروتينات في ميسوفاسيس ليبيديك21 ومصفوفة عشوائية ميكروسد فحص22.

هو الشكل 2B عن قرب من على سطح مجهز ذراع إليه واحدة. الذراع يدمج 12 المسابير بيبيتينج المستقلة والقابض الرئيسي. يمكن التحكم مواقف التحقيقات منفردة في اتجاه واحد من أجل الوصول إلى مواقع مختلفة على طول المحور بين تحقيقات أو أنابيب حتى واحد. المسابير يمكن التقاط نصائح المتاح (1-12) أو زوج من تحريك لوحة محولات. في البداية يتم تحميلها مجموعتين من مداخن 4 تحتوي على 50 ميليلتر نصائح المتاح. يتم تلقائياً الكشف عن مستويات السائل كما موصلة النصائح. يتم تصميم محولات نقل لوحة 2 دبابيس حادة في الداخل التي تشكل القابض اختياري عند الحاجة. على سطح السفينة الرئيسي هو الموقع microtube 24-الموقف التبريد الناقل للعينة، على الرغم من أن يتم استخدامها فقط 1-2 المواقف هنا. وبالإضافة إلى ذلك، هناك حاملة للوحة بكر وأيضا 2 ناقلات تخزين للمواصفات، وتكويم SBS الجفن (الشكل 2). وأخيراً، هناك 4 ناقلات انزلاق، كل منها 5 مواقع لبلورة لوحات (4 × 5 = 20 لوحات).

Figure 2
الشكل 2 : إعداد قطرات البخار نشر التجارب. (أ) نظرة عامة على نظام مؤتمتة بالكامل 2- (ب) على سطح السفينة الرئيسية لمعالج السائل في العملية مع () التخزين الناقلين لرزمة من أغطية SBS، (ب) تكويم نصائح، الناقل (ج) التبريد-الناقل بعينه في microtube، (د) 2-نقل لوحة محولات، (ه) لوحة بكر لنقل البروتين إلى نانولتر المناولة الروبوت، (و) 9 مختومة اللوحات التي تم وضعها في مواقعها الأولى، (ز) القابض اختياري إزالة غطاء SBS 10th لوحة عن نقلها على سطح السفينة معالج السائل، لوحات (ح) 10 المقبل سيجري إعدادها مع أغطية SBS في الأعلى، (أنا) القابض الرئيسي الذي يستخدم لنقل لوحات بكر والتبلور، (ي) الرئيسي الآلي ذراع دمج 12 بيبيتينج المسابر (2 تستخدم لتعمل كالقابض اختياري) والقابض الرئيسي و (k) على سطح السفينة موزع نانولتر. أغطية SBS مخصصة داخلية (ج) مصنوعة من الألومنيوم. الأغطية دمج ورقة مطاط لتجنب تبخر الشروط واثنين من الثقوب الصغيرة لتكون دقة التقطت المتابعة من قبل القابض اختياري. (د) عينة ممثلة لبلورة مختومة جيدا حيث يتم ملء الخزان بشرط والعلوي-البئر يحتوي على معالجة تجميعية تتألف من العينة البروتين والشرط. سبب مرسب في الحبرية أقل تركيزاً من الشرط، المياه تركيزات جميع المكونات في القطرة يرتفع من خلال فقدان أثناء عملية الموازنة بنشر بخار (يمثله جداً تخطيطياً سهم). (ﻫ) ميكروجرافس الخفيفة من 100 nL و (و) 200 قطرات nL تنتجها موزع نانولتر مع حل اختبار (20% v/v البولي إيثيلين جليكول 400، 0.001% w/v Safranin كصبغ أحمر). قد تختلف الحجم والشكل من القطرات وفقا لخصائص تشيميكوفيسيكال للشرط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

بدء تشغيل البرنامج الرئيسي مع القابض اختياري إزالة غطاء SBS من لوحة تبلور أول. بعد أن نقلت الغطاء للناقل التخزين المطابقة، يتم نقل لوحة تبلور على سطح السفينة موزع نانولتر. ثم نقل الذراع بيبيتينج كمية العينة المطلوبة لإعداد قطرات من microtube برود عادة إلى العمود الأول من لوحة PCR. وفي وقت لاحق، يتحرك القابض الرئيسي لوحة بكر على سطح السفينة موزع نانولتر التي ستعد قطرات بعد الخيارات المحددة من قبل المستخدم في البداية (مثلاً. حجم قطره). لهذا، أولاً يتم الاستغناء عن العينة البروتين إلى الأعلى-الآبار (باستخدام واحد مجموعة من ميكروسيرينجيس 8 والاستغناء عن متعددة)، ثم يتم الاستغناء عن ظروف التبلور على قطرات البروتين (كل صف الآن يتطلب 8 ميكروسيرينجيس جديدة لتجنب التلوث عبر). عند انتهاء البرنامج إعداد قطرات، القابض الرئيسي ينقل اللوحة المقابلة السدادة اللوحة، ثم يضع لوحة PCR مرة أخرى في موضعه الأصلي (المزيد من البروتين سوف يكون الاستغناء عن في العمود التالي من لوحة PCR للوحة التالية ). وأخيراً، نقل لوحة مختومة تبلور مرة أخرى إلى موضعه الأصلي على سطح السفينة: بخار نشر التجارب قد بدأت بالفعل في هذه اللوحة (الشكل 2D). وتتكرر هذه الدورة وفقا لعدد اللوحات. عند الحاجة، يزيل القابض الاختياري رف تلميح فارغ السماح للذراع بيبيتينج الحصول على المزيد من النصائح. البرنامج يأخذ 2 ساعة و 20 دقيقة و 440 ميكروليتر من عينة تحضير قطرات واحدة في لوحات 20 باستخدام عينة nL 100 + 100 حالة nL (الشكل 2E و 2F).

عند استخدام موزع نانولتر روبوت تقف وحدها لاثنين من لوحات إضافية (انظر البروتوكول، خطوة 1.2.3)، يمكن إعداد مجموعة كاملة من لوحات الفرز الأولية المتاحة في الحاضنة 10 درجة مئوية (LMB 22 لوحات x 96 الظروف = شروط 2,112).

ويبين الجدول 2 متطلبات البرنامج الرئيسي وفقا لتحديدات المستخدم في النظام 2.

لوحات حجم قطره (nL) Sample(s) تلميح المتطلبات المدة
عدد نوع المجلد 1 (ميليلتر) المجلد 2 (ميليلتر) 50 ميليلتر نصائح ميكروسيرينجيس
10 96-جيدا 100 240 0 80 1040 1 ساعة و 12 دقيقة
20 96-جيدا 100 440 0 160 2080 2 ساعة و 20 دقيقة
10 96-جيدا 100 240 240 160 2080 1 ساعة و 45 دقيقة
20 96-جيدا 100 440 440 320 4160 3 ح 05 دقيقة
10 48-جيدا 1000 624 0 80 560 1 ساعة و 10 دقيقة
20 48-جيدا 1000 1208 0 160 1120 2 ساعة و 16 دقيقة

الجدول 2: أمثلة على خيارات البرنامج الرئيسية المتاحة في النظام 2 لتشكيل قطرات تبلور. المبلغ اللازم من عينة البروتين ونصائح وميكروسيرينجيس تختلف وفقا للبرنامج. وحدات تخزين عينة 'vol. 1' (قطره 1) و 'المجلد 2' (قطره 2) وتحسب كما يلي: (نصائح 8 x يتطلب حجم كل من لوحة بكر + 4 ميليلتر جيدا فقدت وحدة التخزين) x عدد لوحات تبلور + 40 وحدة التخزين الميت ميليلتر في microtube. وحدة التخزين المطلوب كل من لوحة PCR لقطرات nL 100 في لوحة تبلور 96-جيدا جيدا هو 2 ميليلتر بينما ميليلتر 6.8 مطلوب لقطرات nL 1,000 في لوحة 48-جيدا (حجم القتلى في الآبار لصفيحة PCR: 0.8 ميليلتر). زيادة إضافية في حجم العينة مأخوذ في الاعتبار ('فقدت وحدة التخزين') بسبب التبخر من microtube والخسائر الأخرى (مثل عينة الشائكة على نصائح). على سبيل المثال، على 20 لجنة نهر الميكونج لوحات، 100 nL، البروتوكول 1 قطره، وحجم العينة المطلوب: (8 x 2 + 4) × 20 + 40 = 440 ميليلتر (أي، أي ما يعادل 22 ميليلتر للوحة الواحدة). ثمانية المتاح 50 ميليلتر نصائح مطلوبة من أجل كل لوحة وكل عينة. على سبيل المثال، لوحات 10, 2-انخفاض البروتوكول، عدد النصائح اللازمة هي 8 × 10 × 2 = 160 نصائح. ويحسب عدد ميكروسيرينجيس كما يلي: (8 + عدد من الشروط للوحة الواحدة) x عدد العينات x عدد لوحات. على سبيل المثال، لوحات 10 × 48، حسنا، عدد النصائح معالج السائل المطلوب: (8 + 48) × 1 × 10 = 560 نصائح.

3-صياغة وإعداد والتعامل مع حلول 4-الزاوية

كلا صيغ الحلول الركن 4 ('أ، ب، ج ود') والشاشة الأمثل المقابلة (الشكل 3A) يتم إنشاؤها تلقائياً ببيانات جدول بيانات Excel. هناك جداول مختلفة لإعداد مختلفة من الظروف – أساسا 24 و 48 و 96 الشروط – وأيضا جداول البيانات لإعداد شاشتين الأمثل مختلفة في لوحة واحدة. واحدة تعد عادة مجموعة من 4 × 10 مل الحلول الزاوية في أنابيب الاختبار من 2 – 3 شاشات التحسين التي يمكن إعدادها، اعتماداً على عدد وحجم للشروط المطلوبة. يتم سكب الحلول في أحواض التي هي يستنشق بمعالج سائل على أساس المحاقن والاستغناء عن بعد مباشرة في لوحات (الشكل 3B). التدرجات الخطية اثنين من تركيزات نتيجة خلط أ، ب، ج، ود في نسب متفاوتة بشكل منتظم (الشكل 3).

Figure 3
الشكل 3: الأسلوب 4-ركن لإعداد شاشات الأمثل. (أ) تمثيل للتدرجات اثنين من تركيزات عبر تخطيط لوحة 96-جيدا. (ب) المستندة إلى حقنه سائل معالج جاهزة لإعداد شاشة مع المحاقن 4 إدراج رأس الروبوت. لوحة تبلور يجلس في الناقل SBS مزودة بمحركات و 4 ابتداء من حلول (ألف، باء، جيم ودال) قد تم الاستغناء عن الفعل في أحواض كل منهما على (الحلول كان اللون الأحمر لأغراض العرض التوضيحي فقط). (ج) نسب الحلول أ، ب، ج ود عبر الخزانات 96. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

ويبين الجدول 3 الاحتياجات من البرامج المتاحة للمستخدمين في معالج المستندة إلى الحقن السائل.

نوع اللوحة لا. من الشروط المجلد في لوحة (الخزانات، ميليلتر) المجلد في الحوض الصغير (mL) المدة
96-جيدا 48 80 1.6 2 دقيقة 5 ثانية
96-جيدا 96 80 2.5 3 دقيقة 50 ثانية
96-جيدا 2 × 48 80 1.6 2 دقيقة 50 ثانية
48-جيدا 24 200 1.8 2 دقيقة 25 ثانية
48-جيدا 48 200 3 4 دقيقة 20 ثانية

الجدول 3: البرامج المتوفرة في معالج السائل على أساس حقنه لإعداد شاشات الأمثل وفقا للأسلوب 4-ركن- ويمكن استخدام لوحة 96-جيدا لإعداد الشاشة الأمثل 96 أو 48 حالة (عندما يتم إعداد 48-شرط شاشتين في وقت واحد، الروبوت يجب أن تكون مجهزة بالحقن 8 وأحواض 8). تمكين برامج أخرى استخدام لوحات 48-جيدا. وحدات التخزين المدرجة في أحواض تضمين وحدة التخزين الميت المطلوبة (0.5 مل).

4-المضافة الفرز

يبين الشكل 4 الخطوات اللازمة لإجراء الفحص المضافة ابتداء أما مع الحلول المضافة 96 فعلا في الخزانات لصفيحة تبلور (البروتوكول الأول)، أو في آبار عن الأنظار الخلية لوحة الثقافة المستخدمة (شاشة مضافة القابلة لإعادة الاستخدام بروتوكول 2). 4 جدول يسرد البرامج المتاحة على موزع نانولتر وفقا لهذين النوعين من البروتوكولات.

Figure 4
الشكل 4: النوعين من البروتوكولات للفحص المضافة. يتم تخزينها على شاشات 96-مضافة عند-20 درجة مئوية. بعد البروتوكول 1، الشاشة المضافة المضافة في البداية إلى خزانات ألواح تبلور (ومثالي مجهز بهذه الطريقة). يستخدم على معالج السائل أو مولتيبيبيتي للاستغناء عن الشرط في الخزانات التي تحتوي على حلول المضافة (حجم الشاشة المضافة تمثل 10% الحجم النهائي في الخزانات: 8 ميليلتر للحجم النهائي ميليلتر 80). بعد خلط الظروف على خلاط ميكروسكوبية (غير معروضة)، يتم استخدام موزع على أساس ميكروسيرينجي نانولتر تشكيل القطرات (الجدول 4). في أعقاب البروتوكول 2، يتم إضافة الشاشة المضافة إلا في وقت لاحق أثناء إعداد قطرات التبلور. هذه المرة يعمل الصيدلي نانولتر تحضير قطرات مع عنصر إضافي على سطح السفينة في (خلية قابلة لإعادة الاستخدام الثقافة اللوحة التي تحتوي على الشاشة قابلة للإضافة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

بروتوكول حجم قطره (nL) نوع قطاع المجلد عينة (ميليلتر) لا. من ميكروسيرينجيس المدة
نوع مصدر للمواد المضافة البروتين الشرط المواد المضافة في كل بئر (قطاع) المجموع
1 لوحة تبلور 96-جيدا 100 100 0 2 ميليلتر 2 16 104 2 دقيقة
1 لوحة تبلور 96-جيدا 200 200 0 5 ميليلتر 3.8 31 104 2 دقيقة 10 ثانية
2 96-جيدا خلية ثقافة لوحة 200 200 100 5 ميليلتر 3.8 31 200 3 دقيقة و 45 ثانية
2 96-جيدا خلية ثقافة لوحة 500 500 100 5 ميليلتر 7.4 60 200 4 دقيقة 15 ثانية

الجدول 4: البرامج المتاحة على موزع على أساس ميكروسيرينجي نانولتر لفحص المواد المضافة. يتم حساب حجم العينة في كل من قطاع غزة 8-جيدا جيدا المطلوبة كما يلي: حجم القتلى + 12 x انخفاض الحجم. وهناك نوعين من الشرائط (ميليلتر 2 و 5 ميليلتر). وحدات التخزين الميت هي 0.8 ميليلتر للآبار 2 ميليلتر (التي يمكن أن تتضمن فعلا 3.2 ميليلتر كحد أقصى) و 1.4 ميليلتر للآبار 5 ميليلتر (max 7.5 ميليلتر.). الحجم الإجمالي للبروتين المطلوبة: حجم 8 س بشكل جيد في قطاع (قيمة مجمله). وحدة التخزين الميت من الآبار على شكل V من لوحة الثقافة خلية 96-جيدا هو 2.5 ميليلتر. ويختلف العدد المطلوب من ميكروسيرينجيس وفقا للبرنامج المحدد (8 + 96 = 104؛ أو 8 + 2 × 96 = 200).

بسبب تخفيف الشرط مع المواد المضافة إلى الأغذية أثناء البروتوكول 1، يحتاج الشرط أن تكون مستعدة بتركيز أعلى نسبيا من البداية. ويتحقق الزيادة في تركيزات النهائي الأكثر سهولة بالحد النهائي إضافة المياه إلى وحدة التخزين النهائي محسوب. بعد ذلك، واحدة ببساطة العائدات مع مجموعة طبيعية حتى قطرات مزيج الشرط وعينه (مثلاً، 100 nL البروتين + 100 nL شرط الفعل مختلطة مع إضافات). بروتوكول 2 (مثلاً، 200 nL البروتين 200 nL الشرط + + 100 nL مضافة) يسهل الفرز بتركيزات مختلفة من الإضافات ببساطة اختلاف حجم الشاشة المضافة إضافة. بروتوكول 2 يعني أكثر أو أقل تمييع القطرات (التي قد تغير من التبلور).

يمكن استخدام معالج السائل من نظام 2 نضح ما يكفي شرط في 12 نصائح والاستغناء عن مختبرين 8 في الخزانات من صفيحة 96-جيدا (انظر البروتوكول، خطوة 2.2.2)، على الرغم من أن هذه الخطوة يمكن طبعا أن يتم يدوياً مع ماصة متعددة القنوات ( 4 الشكل). يمكن أن تملأ عدة لوحات في وقت واحد مع نفس الشرط عند استخدام معالج السائل (لاختبار مختلف الشاشات المضافة لاحقاً). عند إعداد لوحات 2، تعبئة الحاوية الكاشف مع 23 مل على الأقل. عند إعداد لوحات 3، تعبئة الحاوية الكاشف مع 31 مل على الأقل.

5-بلورة لوحات والأجهزة المرتبطة بها

يوفر تصميم كلا MRC بخار الإفلات الجلوس نشر تبلور لوحات (96-بئر قطره 2 و 48-جيدا 1 الإفلات، الشكل 5A و 5B الشكل) الخصائص التي تمكن التجارب تبلور إليه موثوقة وفعالة، مع لا سيما كروية الشكل العلوي-الآبار وشكل الخامس طفيفة من الخزانات التي تسهل الاستغناء عن دقيقة وأيضا الطرد المركزي عند توسيط من القطرات مطلوب. وبالإضافة إلى ذلك، قد العلوي-الآبار تأثير عدسة للإضاءة الأمثل تحت ستيريوميكروسكوبي (البوليمر هو الأشعة فوق البنفسجية المعدية للكشف عن بلورات امتصاص الأشعة فوق البنفسجية أو الفلورسنت23).

ختم مخصص (الشكل 5) يتيح إعداد معلقة إسقاط بلورة التجارب داخل كلا النوعين من لوحات باستخدام موزع نانولتر (البروتوكولات لا تظهر). وأخيراً، قد كلا لوحات MRC نفس الأبعاد الخارجية وريم. ريم تناسبها في الأخاديد لدينا حامل لوحة المواصفات (الشكل 5)، الذي يستخدم يدوياً إدراج/إزالة الشريط الختم دون الرش السوائل.

Figure 5
الرقم 5: وضع لوحات تبلور "في لجنة نهر الميكونج" والأجهزة المرتبطة بها في LMB. (أ) A1-ركن لصفيحة 96-جيدا. الخزان (مستطيل) على الجانب الأيسر من البئر التبلور، كروية اثنين العلوي-الآبار على اليمين. أبعاد في ملليمتر. (ب) A1-ركن لوحة 48-جيدا. الخزان على الجانب الأيسر من البئر (1 كبيرة العلوي-جيد فقط). (ج) لجنة نهر الميكونج ختم قطره معلقة. (د) لوحة مخصصة داخل حامل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

6-البروتين البلورات

ويبين الشكل 6 أمثلة مفيدة البلورات التي تم الحصول عليها مع البروتوكولات الآلي لدينا.

Figure 6
رقم 6: الضوء ميكروجرافس قطرات تحتوي على بلورات الحصول عليها عقب البروتوكولات الآلي. (أ، ب) نظم إليه لبلورات من الشاشة الأولى من الشرعي ومريب في لوحات أعد مع 2 تماما (راجع المقاطع بروتوكول 1.1 و 1.2، الشروط: A4 جيدا LMB07 و LMB20 جيدا D12، على التوالي، وهو حجم قطرات 100 nL البروتين + 100 nL الشرط، والعمل من أندريه سزيوكزاك، LMB)24. (ج، د) شريط بلورات المجال قبل وبعد التحسين من الظروف الأولية مع الأسلوب 4-ركن (الخطوة 2-1، LMB02 B6، 1,000 nL + 1,000 nL، لم ينشر عمل ليوناردو ألميدا سوزا، LMB). (ه، و) سلسلة ثقيلة من بلورات المجال الطرفي ن دينين البشرية 1 قبل وبعد التحسين من الظروف الأولية مع الأسلوب 4-ركن (LMB20 E6، 200 nL + 200 nL، ثم 500 nL + 500 nL، لم تنشر أعمال إدغار موراليس-ريوس، LMB). (ز، ح) تكمل بلورات عامل د قبل وبعد التحسين من الشرط مع الفحص المضافة (خطوة 2.2، شرط أولى من شاشة مخصصة داخل المنظمة، 200 nL + 200 nL، D6 المضافة من شاشة 96-شرط المضافة، عمل باور ماتياس، غير منشورة LMB). (أنا, J) المغلف الفيروسي بروتين سكري25 بلورات قبل وبعد التحسين من الشرط مع الفحص المضافة (الخطوة 2-3، LMB20 A2، 150 nL + 150 nL، ثم 200 nL + 200nL + 100 nL مضافة E5 من شاشة 96-شرط المضافة، لم ينشر عمل يورغو Modis، جامعة كامبريدج، المملكة المتحدة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

1-إعداد واستخدام شاشات الأولى المخزنة في لوحات

ينبغي أن تكون مختلطة فرز مجموعات قبل يجري الاستغناء عن إلى لوحات لفصل هطول الأمطار أو المرحلة الخفيفة يحدث في بعض الأنابيب أثناء التخزين. عند شاشة يتكون من اثنين من مجموعات (أنابيب 2 × 48)، يوضع في الأنبوب الأول من المجموعة الثانية في موقع E1 الناقل التبريد. عند شاشة تتألف من 4 مجموعات (أنابيب 4 × 24)، ويوضع في الأنبوب الأول من المجموعة الثانية في موقع C1 وتوضع الأنبوبة الأولى من المجموعة الثالثة في موقع E1 وتوضع الأنبوبة الأولى من المجموعة الرابعة في موقع G1. أثناء إدخال الأنابيب في الناقل التبريد، وأغطية توضع على صينية بعد تخطيط قياسي 96-جيدا المشهد. حيث ترد أعدادا جيدا على رأس الأغطية حسب الشركات المصنعة، وهذا يتيح التدقيق إذا وضعت جميع الأنابيب في الترتيب الصحيح. وهذا يساعد أيضا على استبدال الأغطية الصحيحة في الأنابيب عند ملء عدد مخفض من لوحات.

نقوم بتخزين لوحات معبأ مسبقاً في 10 درجة مئوية، إلى حل وسط لتجنب تجميد وتخزين عند 4 درجة مئوية التي قد تتسبب في تدهور الأوضاع والقضايا مع الختم. يتم تخزين لوحات لتصل إلى عدة أشهر مع عادة لا التكثيف ملحوظ على الوجه الداخلي للختم. وهذا صحيح أقل للوحات LMB05، LMB06، LMB09، و LMB10 كما تتضمن هذه الشروط مع تركيزات عالية نسبيا من الكواشف المتقلبة (الجدول 1). كمية صغيرة من التكثيف على الجانب الداخلي من الختم يقلل من كفاءة الختم، ويمكن أن يسبب التلوث المتبادل بين الآبار أثناء إعلان اللوحات. للمساعدة في منع التكثيف أثناء التبريد الأولية، يمكن نقل لوحات أولاً من دائري إلى نزهة معزول برودة التي يتم تخزينها في غرفة باردة 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. تبريد بطيئة جداً يقلل من وضع تدرجات حرارة داخل الآبار مختومة ومن ثم يقلل التكثيف الإجمالية15. وباﻹضافة إلى ذلك، حالما يتم تخزين اللوحات في الحاضنة 10 درجة مئوية، يوضع غطاء البوليستيرين SBS مخصصة داخلية على اللوحة في الجزء العلوي من كل مكدس (غير معروضة).

يمكن استخدام مجموعة كاملة من ألواح معبأ مسبقاً كشاشة أولية كبيرة ضد عينة بروتين رواية، للذوبان في الماء،. وبدلاً من ذلك، يمكن تحديد لوحات أقل بحيث تتطابق مع المتطلبات المحددة. على سبيل المثال، LMB15 و LMB19 هي الشاشات التي وضعت خصيصا لغشاء بروتين العينات26،27، أو LMB20 شاشة وضعت مع الذرات الثقيلة لتسهيل تجريبي على مراحل حيود البيانات28 (انظر أيضا : وضع الشاشات تبلور البروتينات MORPHEUS).

2-إعداد قطرات تبلور

عند استخدام نظام 2، فحص مجموعات مع كميات كبيرة من الكواشف متقلبة ينبغي معالجتها أولاً. تجنب هذا التكثيف تشكيل على مطاط الأغطية SBS، التي يمكن أن تؤثر على التعامل مع غطاء وختم اللوحة. غطاء SBS قد قليلاً من إزالة الألغام عند أعلى لوحة، الذي السبب في أنها تحتاج إلى أن يكون الانحياز في البداية (انظر البروتوكول، خطوة 1.2.6). وحدات التخزين الميت البروتين في الآبار التي بليت PCR هي سخية نسبيا (ميليلتر 0.8، أسطورة انظر الجدول 2). لاحظ أن يعمل وحدات التخزين الميت سخية على قدم المساواة عند استخدام موزع نانولتر فردياً مع البروتين في شرائط 8-جيدا (الجدول 4). قد تعمل وحدات التخزين الميت أصغر، لكن بعض العينات التقيد بالنصائح، معايرة الروبوت قد يصبح غير دقيق بعض الشيء، قد تكون الغرفة أكثر دفئا من المعتاد، إلخ. كل ما يؤدي إلى خسائر العينة المشمولة بوحدات التخزين الميت السخية من أجل ترسيخ النهج.

التطورات الأخيرة مكنت زيادة تصغير تجارب و وبالتالي يمكن تخفيض حجم العينة المطلوبة لفحص ظروف تبلور إلى حد كبير بإدماج المقابلة التكنولوجيا29،30 . ومع ذلك، بعض الجوانب لمزيد من التصغير تحتاج إلى دراسة متأنية، مثل تبخر قطرات31 والتلاعب في ميكروكريستالس32.

وأخيراً، يمكن إدماج الطرد المركزي اللوحة (2,000 لفة في الدقيقة، 1 دقيقة) كخطوة أخيرة روتينية عند إعداد قطرات تبلور (في الآبار العلوي كروية). قد يقلل حجم وشكل قطرات الناتجة عن الطرد المركزي أكثر اتساقا إمكانية تكرار نتائج القضايا33،34. ومن المؤكد أن سيخفف قطرات متوسط تقييم لاحق لتجارب باستخدام مجهر البؤري المطلوب سوف تكون مماثلة عبر لوحة كاملة.

3-مزايا الأسلوب 4-الزاوية

أهم ميزة الأسلوب 4-ركن هو بساطته، الأمر الذي يقلل من الأخطاء ويسهل البروتوكولات الآلي مباشرة. على سبيل المثال، سيتم وضع الحلول الركن 4 دائماً على سطح سائل معالج بعد نفس التخطيط. أيضا، كافة البرامج على أساس نسب ثابتة بين الحلول (الشكل 3).
إعداد دليل للحلول الركن 4 المفضل لمعالجة الآلي للحلول في التركيزات العالية التي يمكن أن تكون عالية اللزوجة. ثم سريعة ودقيقة نسبيا تطلع/الاستغناء عن الممكن في معظم أنواع معالجات سائلة مع الحد الأدنى من المتطلبات لتحسين الطبقات السائلة. ومع ذلك، قد تكون بعض الحلول ركن لزج جداً لروبوت العاملة مع نظام سائل تعمل بكفاءة. وهذا السبب اخترنا معالج سائلة العاملة مع الإزاحة الموجبة (الشكل 3B).

بالإضافة إلى التدرجات الخطية 2 تركيزات، يمكن اختبار مكون ثالث (أي، مجموعة من المخازن المؤقتة/المواد المضافة) بتركيز مستمر بطريقة مريحة. ولهذا الغرض، أعد كمية كبيرة نسبيا من مجموعة أساسية من زاوية الحلول بتركيز أعلى تأهيلاً مناسباً، باستثناء المكون لتكون متنوعة، أولاً. ثم، يتم إضافة الأسهم الحلول بما في ذلك هذا المكون لضبط تركيزات النهائي. على سبيل المثال، يتم إعداد 50 مل مجموعة من 4 ركن الحلول في تركيزات أعلى 10% من البداية. ثم يتم تقسيم هذه المجموعة الأساسية إلى 5 مجموعات فرعية أصغر من 4. أخيرا، يتم إضافة 10% في حجم الحموضة العازلة مختلف الحلول لكل مجموعة فرعية.

4-أشكال وأنواع من الشاشات المضافة

يتم عادة تخزين في-20 درجة مئوية (الشكل 4) نظراً لأنها لا تستخدم بانتظام على شاشات وتحتوي على المركبات المتطايرة/غير المستقرة. يجب أن يخطط له استخدام شاشة المضافة المجمدة مخزنة في كتلة عميق جيدا (1 مل في الآبار) مبكرا لأنه سوف يستغرق 12-24 ساعة لجميع الحلول المضافة ذوبان الجليد تماما في درجة حرارة الغرفة. أيضا، العديد من المستخدمين مشاركة نفس الشاشة المضافة، يحتمل أن يسبب مشاكل التلوث عبر. وأخيراً، ارتفاع كتل عميقة جيدا يجعلها غير مناسبة لمعظم نانولتر موزعات. كحل مناسب للالتفاف حول هذه القضايا، ينبغي نقل الشاشة من كتلة عميق جيدا إلى لوحات منخفضة المستوى (الشكل 4).

تاريخيا، كانت شاشات المضافة التي تشمل مجموعة متنوعة واسعة من الكواشف واحدة (مع تركيزات واحد) شعبية جداً35،36. ومع ذلك، تم وضع أنواع أخرى من شاشات المضافة التي تدمج يمزج المضافات37 أو تخفيض عدد المواد المضافة واحدة وجدت في تركيزات مختلفة38. وأخيراً، نهج تكميلي للتحقيق في تأثير المواد المضافة على العينات قبل تبلور39،40.

5-أكثر من الاعتبارات

الممارسة الجيدة: معظم الشاشات تحتوي على المواد الضارة أو السامة حتى و ومن ثم يجب أن تستخدم الحماية الشخصية المناسبة خلال البروتوكولات. على قدم المساواة، نقل أجزاء من الروبوتات قد يؤدي إلى وقوع إصابات، لا سيما عند محاولة التدخل يدوياً أثناء تشغيل برنامج (على الرغم من أن معظم الروبوتات بزر الإيقاف الطوارئ/نظام). بسبب التعقيدات التقنية المعنية، العادية التحقق من الروبوتات والشاشات والبرامج مع سابقا تتميز عينات اختبار هام لمستويات عالية مستديمة في إمكانية تكرار نتائج.

الإنتاجية: كمؤشر، بين 4,000 إلى 8,000 LMB لوحات يتم إنتاجها سنوياً مع نظام 1 (وتستخدمهم في وقت لاحق المستخدمين للفحص الأولى). هو لم تتكيف الأسهم كمية كبيرة من لوحات شغلها قبل الساعة 10 درجات مئوية عند الدوران المتوقع أقل بكثير، كبعد 4-5 أشهر، بعض الظروف سوف تبدأ في التدهور وتتبخر. تم تنفيذ نهوج مختلفة لبروتوكولات الأتمتة للمختبرات الصغيرة إلى المتوسطة الحجم41.

تخزين وتقييم تجارب: وبعد إعداد القطرات، يتم تخزين لوحات على الرفوف المنخفضة-الاهتزاز في غرفة في 4 أو 18 درجة مئوية مع درجة الحرارة التي تسيطر عليها أحكام (+/-0.5 درجة مئوية الحد الأقصى للانحراف). يتم تقييم تجارب باستخدام المجاهر مصدر الضوء الباردة. مختلف نظم التصوير الآلي متوفرة تجارياً، ولكن ينبغي النظر بعناية جميع جوانب: ستكون كافية لإنتاجية عالية السرعة المطلوبة لمسح لوحة؟ سوف تتداخل الكائنات عدا بلورات مع ضبط تلقائي للصورة؟ هل ستكون كافية لبقعة بلورات صغيرة جداً (لا سيما حول حافة القطرات) نوعية الصور الناتجة عن ذلك؟ 42 , 43 , 44

مقارنة بين تبلور الشروط: بعد تحقيقات دقيقة حول الطبيعة البلورات التي تم الحصول عليها في البداية، واحد تحليل الاتجاهات وأوجه التشابه عبر شروط استخدام LMB شاشة قاعدة البيانات أو C6 أداة ويب45.

Disclosures

نعلن بموجب هذا مصلحة تجارية متضاربة منذ ليفيارك تتاجر العناصر التالية: 96-و 48-البئر MRC اللوحات، ختم قطره معلقة MRC، شاشات تبلور MORPHEUS, Pi، انغستروم و LMB.

Acknowledgments

مرفق تبلور لجنة نهر الميكونج-LMB يرجى دعم من مجلس البحوث الطبية (المملكة المتحدة). ونشكر أعضاء LMB لدعمهم: أولغا بيريسيتش (PNAC) وتوني وارن، والأنف والحنجرة فإن دن فوسينيتا وبات إدواردز (دراسات الهيكلية)، ستيف سكوتشير والأعضاء الآخرين في "ورشة ميكانيكية"، نيل المنح وجو وستمورلاند (بصرية)، بول هارت وتوم برات (IT). نود أيضا أن نشكر ستيف إليوت (تيكان، المملكة المتحدة) وستيوارت ميتشل وهيذر رينغروس (الروبوتات هاملتون، المملكة المتحدة)، وبول ذوبان الجليد، وروبرت لويس وجوبي جنكينز (TTP لابتيتش، المملكة المتحدة)، بول ريردون (AG سويسسي، سويسرا)، دونالد Ogg (الفابيوتيتش، وجورج ستيفنس المملكة المتحدة)، نيل وليامز (ماركيم إيماجي، المملكة المتحدة) وغراهام هاريس (الوكالة كليفلاند) للحصول على مساعدة تقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Robots
Freedom EVO® Tecan n/a Liquid handler (System 1). Aspiration/Dispense based on system liquid. Integrates an automated carousel. EVOware plus controlling software v.2.4.12.0. 
Microlab® STAR™ Hamilton n/a Liquid handler (System 2). Aspiration/Dispense based on positive displacement (CO-RE™ technology). Hamilton STAR controlling software v.4.3.5.4785 with method management interface.
Mosquito® TTP Labtech n/a Microsyringe-based nanoliter dispenser used to set up droplets (System 2 and stand-alone), 3-position deck. Controlling software v.3.11.0.1422. 
Dragonfly® TTP Labtech n/a Syringe-based liquid handler used to produce optimization screens (4-corner method). Controlling software v.1.2.1.10196. 
Adhesive plate sealer Brandel n/a Integrated to Systems 1 and 2 (also used as stand-alone robot).
Inkjet printer 9232 Markem-Imaje n/a Integrated to System 1. Touchscreen interface.
Crystallization screens
Crystal Screen™ 1 Hampton Research HR2-110 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Crystal Screen 2™ Hampton Research HR2-112 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB01
Wizard™ Classic 1 Rigaku 1009530 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Wizard™ Classic 2 Rigaku 1009531 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB02
Grid Screen™ Ammonium Sulfate Hampton Research HR2-211 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG/LiCl Hampton Research HR2-217 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Quick Screen™ Hampton Research HR2-221 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ Sodium Chloride Hampton Research HR2-219 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB03
Grid Screen™ PEG 6000 Hampton Research HR2-213 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
Grid Screen™ MPD Hampton Research HR2-215 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
MemFac™ Hampton Research HR2-114 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB04
PEG/Ion™ Hampton Research HR2-126 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Natrix™ Hampton Research HR2-116 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB05
Crystal Screen Lite™ Hampton Research HR2-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Custom Lite screen Molecular Dimensions Ltd n/a Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB06
Wizard™ Cryo 1 Rigaku 1009536 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
Wizard™ Cryo 2 Rigaku 1009537 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB07
JBS1 JenaBioScience CS-101L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS2 JenaBioScience CS-102L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS3 JenaBioScience CS-103L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS4 JenaBioScience CS-104L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB08
JBS5 JenaBioScience CS-105L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS6 JenaBioScience CS-106L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS7 JenaBioScience CS-107L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS8 JenaBioScience CS-108L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB09
JBS9 JenaBioScience CS-109L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
JBS10 JenaBioScience CS-110L Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB10
Clear Strategy™ Screen 1 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 1 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 4.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB11
Clear Strategy™ Screen 2 pH 5.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 6.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 7.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Clear Strategy™ Screen 2 pH 8.5 Molecular Dimensions Ltd MD1-16LMB Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB12
Index™ Hampton Research HR2-144 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB13
SaltRX™ 1 Hampton Research HR2-107 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
SaltRX™ 2 Hampton Research HR2-109 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB14
MemStar™ Molecular Dimensions Ltd MD1-21 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
MemSys™ Molecular Dimensions Ltd MD1-25 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB15
JCSG-plus™ Suite Qiagen 130720 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB16
MORPHEUS® screen Molecular Dimensions Ltd MD1-46 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB17
Pi minimal screen JenaBioScience CS-127 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB18
Pi-PEG screen JenaBioScience CS-128 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB19
MORPHEUS® II screen Molecular Dimensions Ltd MD1-91 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB20
LMB crystallization screen™ Molecular Dimensions Ltd MD1-98 Crystallization kit (test tubes, 10mL per condition) used in LMB21
Additive screens
HT additive screen Hampton Research HR2-138 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93-500 Frozen in 96-well deepwell block (500 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100 Frozen in 96-well deepwell block (1 mL per well).
MORPHEUS® additive screen Molecular Dimensions Ltd MD1-93 Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped wells (100 µL per well).
ANGSTROM additive screen™  Molecular Dimensions Ltd MD1-100-FX Frozen in 96-well cell culture Costar® plate with V-shaped well (100 µL per well).
HIPPOCRATES additive screen Molecular Dimensions Ltd n/a 48 single additives (drug compounds found in MORPHEUS® III).
Other consumables
96-well MRC 2-drop plate Swissci MRC 96T-UVP Sitting-drop, vapor diffusion plate. Reservoir recommended volume: 80  µL. Range of useful droplet volumes: 10-1000 nL. UV transmissible.
48-well MRC 1-drop plate  ('MAXI plate') Swissci MMX01-UVP  Sitting-drop, vapor diffusion plate for scale-up/optimization. Reservoir recommended volume: 200  µL. Range of useful droplet volumes: 0.1-10 µL. UV transmissible.
MRC hanging drop seal Swissci n/a Hanging-drop, compatible with both MRC vapor diffusion plates (MRC 96T-UVP and MMX01-UVP ). UV and X-ray transmissible.
Adhesive sealing tape Hampton Research HR4-50 3-inch wide Duck® HD Clear™ for sealer and manual sealing.
Adhesive aluminium sheet Beckman Coulter 538619 Used to reseal additive screens.
Ink cartridge Markem-Imaje 9651 System 1 (inkjet printer).
Solvent cartridge Markem-Imaje 8652 System 1 (inkjet printer).
50 µL tips  Hamilton 235947 System 2 (STAR™ liquid handler). Box of 6 sets with 1920 x CO-RE™ tips in disposable stacks.
Reagent container Hamilton 194052 Used to dispense a condition into plate(s) during additive screening protocols. 
PCR plate Thermo Scientific™ AB-2150 System 2 (contains protein to be transfer to the Mosquito®). Abgene Diamond ultra, 384 V-shaped wells.
microsyringes TTP Labtech 4150-03020 Spool of 26,000 microsyringes for the Mosquito® nanoliter dispenser (9mm spacing).
strip-holder block TTP Labtech 3019-05013 SSB device for the Mosquito® strips, aka '4-way Reagent Holder'.
2 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03110 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 3.2 µL.
5 µL 8-well strip TTP Labtech 4150-03100 Contains protein on the deck of the Mosquito®. Box of 40 strips, max. vol. in well is 7.5 µL.
5 mL syringes TTP Labtech 4150-07100 Syringe body and piston for the Dragonfly® liquid handler. Pack of 100.
Troughs/Reservoirs TTP Labtech 4150-07103 Contains stock solutions on the deck of the Dragonfly®. Pack of 50.
Orbital microplate shaker CamLab Limited n/a Variomag® for mixing conditions in a single plate (0-2000 rpm).
Microplate mixer TTP Labtech 3121-01015 MxOne. Mixing condition in a single plate with 96 vibrating pins.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rupp, B. Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology. , Garland Science. (2010).
  2. McPherson, A. Introduction to protein crystallization. Methods. 34, 254-265 (2004).
  3. Bergfors, T. M. Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).
  4. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein Crystallization for X-ray Crystallography. J. Vis. Exp. (47), e2285 (2011).
  5. Crick, F. H. C. X-Ray Diffraction of Protein Crystals. Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).
  6. Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits. FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).
  7. Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events. Biophys. J. 95, 1-9 (2008).
  8. Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences. 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).
  9. Carter, C. W., Carter, C. W. Protein crystallization using incomplete factorial experiments. J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).
  10. Jancarik, J., Kim, S. H. Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins. J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).
  11. Stevens, R. C. High-throughput protein crystallization. Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).
  12. Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).
  13. Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules. J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).
  14. Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. Membrane protein structure determination-the next generation. Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).
  15. Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).
  16. Gorrec, F. The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled. J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).
  17. Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).
  18. Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).
  19. DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. Technological Advancements in Liquid Handling Robotics. JALA. 6, 36-40 (2001).
  20. Jenkins, J., Cook, M. Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology. JALA. 9, 257-261 (2004).
  21. Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases. J. Vis. Exp. (67), e4000 (2012).
  22. Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening. J. Vis. Exp. (78), e50548 (2013).
  23. Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).
  24. Szewczak, A. Structural studies of the bacterial MreBCD complex. , University of Cambridge, UK. (2016).
  25. Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion. J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).
  26. Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).
  27. Parker, J. L., Newstead, S. Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update. Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).
  28. Gorrec, F. The MORPHEUS II protein crystallization screen. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).
  29. Yin, X., et al. Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).
  30. Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography. JALA. 21, 97-106 (2015).
  31. Zipper, L. E., et al. A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids. Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).
  32. Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. Microcrystal manipulation with laser tweezers. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).
  33. Newman, J. Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).
  34. Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).
  35. McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins. J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).
  36. Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids. J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).
  37. McPherson, A., Cudney, B. Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules. J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).
  38. Gorrec, F. Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology. Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).
  39. Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).
  40. Chari, A., et al. ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space. Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).
  41. Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).
  42. Wilson, J. Automated Evaluation of Crystallisation Experiments. Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).
  43. Snell, E. H., et al. Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).
  44. Haupert, L. M., Simpson, G. J. Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC). Methods. 55, 379-386 (2011).
  45. Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions. Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).

Tags

الكيمياء الحيوية، 131 قضية، البلورات بالأشعة السينية، وتبلور البروتينات، الفرز، النظام الآلي بالكامل، قطرات نانولتر، نشر بخار، الشاشة الأولى، موزع نانولتر، معالج السائل، كريستال الأمثل، 4-ركن الفائق فحص الأسلوب، المضافات
الآلي البروتوكولات لبلورة الجزيئات في لجنة نهر الميكونج مختبر البيولوجيا الجزيئية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gorrec, F., Löwe, J. Automated… More

Gorrec, F., Löwe, J. Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology. J. Vis. Exp. (131), e55790, doi:10.3791/55790 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter