Summary
Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines dreidimensionalen (3-D) -Systems aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs), dem so genannten serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell kann wie eine organotypische Scheibenkultur verwendet werden, um die menschliche kortikale Entwicklung zu modellieren und für die physiologische Abfrage der Entwicklung von neuronalen Schaltungen.
Abstract
Obwohl eine Reihe von In-vitro- Erkrankungsmodellen unter Verwendung von hiPSCs entwickelt worden ist, ist eine Einschränkung, dass diese zweidimensionalen (2-D) -Systeme nicht die zugrunde liegende zytoarchitektonische und funktionelle Komplexität der betroffenen Individuen darstellen, die vermutete Krankheitsvarianten tragen. Konventionelle 2-D-Modelle bleiben unvollständige Darstellungen von in vivo- artigen Strukturen und erfassen die Komplexität des Gehirns nicht adäquat. So gibt es einen neuen Bedarf an mehr 3-D-hiPSC-basierten Modellen, die die zellulären Wechselwirkungen und Funktionen, die in einem In-vivo- System gesehen werden, besser rekapitulieren können.
Hier berichten wir über ein Protokoll zur Entwicklung eines 3-D-Systems aus undifferenzierten HIPSCs basierend auf dem serumfreien Embryoidkörper (SFEB). Dieses 3-D-Modell spiegelt Aspekte eines sich entwickelnden ventralisierten Neocortex und ermöglicht Studien in Funktionen integraler Bestandteil der lebenden neuronalen Zellen und intakten Gewebe wie Migration, Konnektivität, Kommunikation und MatteUration Speziell zeigen wir, dass die SFEBs, die unser Protokoll verwenden, unter Verwendung physiologisch relevanter und hochinhaltszellbasierter Assays wie Calcium-Imaging und Multi-Elektroden-Array (MEA) -Aufzeichnungen ohne Kryoschaltung abgefragt werden können. Im Fall von MEA-Aufnahmen zeigen wir, dass SFEBs während der langfristigen Kultivierung sowohl die Spike-Aktivität als auch die auf Wachstumsebene beruhigende Aktivität erhöhen. Dieses SFEB-Protokoll bietet ein robustes und skalierbares System für die Untersuchung der Entwicklung der Netzwerkbildung in einem 3-D-Modell, das Aspekte der frühen kortikalen Entwicklung erfasst.
Introduction
Wir haben bereits ein 3-D-Modellsystem gemeldet, das aus patientenorientierten humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) erzeugt wurde, die einige Aspekte der frühen kortikalen Netzwerkentwicklung zusammenfassen 1 . Dieses 3-D-Modell, ein serumfreier Embryoidkörper (SFEB), verbessert die bisherigen einfachen Aggregations-HIPSC-Modelle 2 , 3 . Ein wachsender Körper der Arbeit zeigt, dass 3-D-Strukturen wie unsere SFEBs, ungefähre Aspekte der neuralen Entwicklung, die in vivo und zu einem früheren Zeitpunkt beobachtet werden, als in den zweidimensionalen (2-D) / Monolayer-hiPSC-Modellen 4 , 5 beobachtet wurden . Die anfänglichen Studien konzentrierten sich auf die selbstorganisierende Komplexität von 3-D-Körpern, ohne ihre physiologische Komplexität zu demonstrieren 2 .
Das hier beschriebene Protokoll wurde auf undifferenzierten HiPSCs aus Fibroblasten und Peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs). Diese Zellen werden auf γ-bestrahlten Maus-Embryonal-Feedern (MEFs) gehalten. Diese hiPSC-Kolonien werden manuell von spontan differenzierten Zellen gereinigt, enzymatisch geerntet und in Medium, das den Rho-Kinase-Inhibitor Y-27632 (ROCKi) enthält, resuspendiert. Undifferenzierte hiPSCs werden einer Dissoziation und Zentrifugation unterworfen, bevor sie auf 96-Well-Niedrigadhäsions-V-Bodenplatten übertragen werden. Nach dem Plattieren wird die neuronale Induktion mittels Dual-SMAD-Hemmung (SB431542 und LDN193189 zusammen mit dickkopf 1 (DKK-1)) initiiert, um eine anterior-frontale Vorderhirn-Neuronal-Schicksalslinie 6 zu treiben. Nach 14 Tagen werden die SFEBs in Zellkultureinsätze in eine 6-Well-Platte überführt. Einmal übertragen, beginnen die runden SFEBs zu verbreiten und zu dünn, während die Aufrechterhaltung lokaler Netzwerkverbindungen, wie es häufig in hippocampalen organotypischen Scheibenkulturpräparaten unter Verwendung ähnlicher Zellkultureinsätze 1 ,Ss = "xref"> 7
Die Verwendung einer SFEB-basierten 3-D-Plattform in diesem Format ist der effizienten Herstellung von kortikalen Netzwerken zugänglich, die unter Verwendung von zellbasierten physiologischen Assays wie z. B. Calcium-Imaging oder elektrophysiologische Assays wie Einzelzell-Aufnahmen oder Multi-Elektroden-Array (MEA) abgefragt werden können ) 1 . Obwohl 3-D-Systeme die Marker der frühen kortikalen Entwicklung tragen, haben andere Studien gezeigt, dass diese 3-D-Körper längere Inkubationszeiten benötigen, um das inhärent langsamere Tempo der Entwicklung des menschlichen Gewebes zu ermöglichen 8 . Dieses SFEB-Protokoll generiert erfolgreich 3-D-SFEBs aus undifferenzierten hiPSCs, die Aspekte der frühen Entwicklung der Kortex erfassen.
Das Potenzial von SFEBs, Netzwerk-Aberrationen bei neurologischen Störungen zu modellieren, ist eine Stärke dieses Systems. Die aus dem Patientengewebe gewonnenen hiPSCs können in Zellen des Nervensystems gezüchtet werden, die dem Arsch unterworfen sindAys in Bezug auf die Zellbiologie sowie die gleichzeitige Genexpression. Human-iPSCs werden verwendet, um das genetische Profil von großen Gruppen von Individuen mit unterschiedlichen neurologischen Störungen mit komplexen Ätiologien wie Autismus-Spektrum-Störung (ASD), Schizophrenie 9 , Rett-Syndrom 10 und Alzheimer-Krankheit 11 , 12 zu ermitteln . Bis vor kurzem waren iPSC-Modelle typischerweise Monolayer-Präparate, die bei der Bewertung molekularer Wechselwirkungen bei der Entschlüsselung der in vivo beobachteten komplexen zellulären Wechselwirkungen unzureichend waren. Tiermodelle sind der Standard-Ersatz für die Wiederherstellung der Ganz-Organ-Plattform. Diese Tiermodelle werden von einer schlechten Übersetzung der Befunde geplagt und haben eine begrenzte Fähigkeit, menschliche genetische Profile zu replizieren, die durch große genetische Screening-Studien identifiziert wurden. So fügt die Entwicklung von 3-D-Systemen von iPSCs eine erforderliche Schicht von Komplexität in menschlichen hinzuKrankheitsmodellierung 13 , 14 . Der nächste Schritt für 3D-hiPSC-Plattformen ist es, den großtechnischen Anforderungen des Hochdurchsatz-Screenings unter Verwendung von zellbasierten Assays 15 Rechnung zu tragen.
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Protocol
1. Erzeugung von neuronalen Progenitorzellen
- HIPSCs, die von Fibroblasten und PBMCs in 6-Well-Platten auf einer γ-bestrahlten Maus-Embryonal-Feeder (MEF) -Zellschicht in menschlichem iPSC-Medium, ergänzt mit kleinen Molekülen (siehe Materialtabelle), abgeleitet sind.
HINWEIS: Die tägliche Wartung ist eine modifizierte Version der zuvor gemeldeten Verfahren 1 , 16 .- Platte 6 x 10 5 MEFs auf jede Vertiefung einer 6-Well-Gewebekultur-Gradplatte in 300 μl / gut empfohlenem Medium (nach Herstellerprotokoll).
- Nach 48 h, ersetzen Sie MEFs Medium mit 300 μl / well hiPSC Medium für 1 h vor dem Hinzufügen von hiPSCs.
- Schnelles Aufhängen von hiPSCs in einem 37 ° C Wasserbad und langsam 1 mL hiPSC Medium tropfenweise hinzufügen. Übertragen Sie die HIPSCs und das Medium auf ein 15 ml konisches Röhrchen. Medium hinzufügen, um das Gesamtvolumen auf 5 ml zu bringen. 5 min bei 129 xg zentrifugieren, die supernata absaugenNt, das Pellet vorsichtig in 1 mL hiPSC-Medium mit ROCK-Inhibitor bei 1: 1000-Konzentration wieder suspendieren.
- Die Zellsuspension (typischerweise bei 300.000 Zellen / Vertiefung) auf die MEF-Zellschicht auftragen und bei 37 ° C, 5% CO 2 , 95% Feuchtigkeit inkubieren.
- Überwachen Sie die iPSC-Kultur mit einem Lichtmikroskop. Nach 48 h, entfernen Sie Kulturen, die unebene Kanten haben, sind gewachsen, um zystisch zu werden oder gelblich-braun unter dem Lichtmikroskop zu erscheinen, um die spontane Differenzierung zu minimieren.
ANMERKUNG: Nach 7 - 10 Tagen sollten sich hiPSC Kolonien bilden. Kolonien sollten rund, mit klar definierten Grenzen und einheitlichen Zelldichten und ohne lose gepackte ungleichförmige Zellen sein. - Manuell selektieren Sie runde hiPSC Kolonien, um die Kultur der spontan differenzierten Zellen zu löschen. Erweitern Sie die Kolonien, indem Sie sie auf frische MEF-Schichten legen. Erweitere 1: 3 alle 7 Tage, wenn Kulturen in der Nähe von Konfluenz und Einfrieren 1 , 16 .
- Nach der Expansion und dem Einfrieren von Zellen (für die Sicherung), wachsen hiPSC Kolonien auf Platten, bis sie 50 - 75% Konfluenz erreichen.
- Sieben-Tage-Nachplattierung, mild enzymatische Behandlung (5-10 min mit 300 μl Enzymlösung) und sanftes Triturieren (2-4 mal mit einer 1000 μl Pipette) zur Ernte und Herstellung von hiPSCs für die neuronale Vorläuferzelldifferenzierung.
- Die Zellsuspension bei 129 xg für 4 min zentrifugieren, den Überstand absaugen und das Pellet in 5 ml menschlichem iPSC-Medium resuspendieren. Übertragen Sie die Zellsuspension auf eine 0,1% ige Gelatine-beschichtete 5 cm Zellkulturschale für 1 h bei 37 ° C, um MEFs zu eliminieren und die hiPSC-Ausbeute zu maximieren. Übertragen Sie das Medium (mit nicht-adhärenten Zellen) auf eine weitere 5 cm Gelatine beschichtete Schale.
- Übertragen der nicht-adhärenten Zellen in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen unter Verwendung einer Transferpipette. Die Platten mit 3 mL Medium vorsichtig ausspülen und in die 15 ml Röhre geben.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 129 xg für 4 min, aspirieren Sie den SuperNatant, und sanft resuspend das Pellet in Medium. Bestimmen Sie die Zellenzählung mit einem automatisierten Zellenzähler. Platte 9.000 Zellen / Vertiefung in einer 96-Well-Niedrigadhäsions-V-Bodenplatte.
- Die Platte bei 163 xg für 3 min zentrifugieren. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C, 95% Feuchtigkeit und 5% CO 2 . Mit einer Pipette wechseln Sie 50% Medium jeden zweiten Tag, indem Sie die Hälfte des Mediums entfernen und es mit frischem, chemisch definiertem Differenzierungsmedium 1 (DM1, Abbildung 1 , Tabelle der Materialien) für 14 Tage ersetzen.
2. Serumfreier Embryoidkörper (SFEB) Induktion ( Abbildung 2 )
- Legen Sie 40 μm Zellkultureinsätze in 6-Well-Platten und fügen Sie 1 mL DM1-Medium mindestens 1 h vor der Zugabe von Aggregaten hinzu.
- Am Tag 14 werden die Aggregate mit 20 μl Medium unter Verwendung einer 200 μl breiten Mundspitze auf 40 μm Zellkultureinsätze transferiert und das Medium auf DM2 umgestellt.
7 , 17 , 18 verwendet .- Übertragen Sie 4-6 Aggregate auf einen Zellkultureinsatz und erlauben ausreichend Platz zwischen den Aggregaten. Mit einer feinen Pipettenspitze ( zB 200 μl Spitze) so viel überschüssige Lösung wie möglich entfernen.
HINWEIS: Es ist akzeptabel, das SFEB kurz zu stören, da sie sich auf dem Zellkultureinsatz bewegen werden, da die Lösung aus den SFEBs entfernt wird. - Pflegen Sie die Kulturen in 1 ml DM2 bei 37 ° C, 95% Feuchtigkeit und 5% CO 2 . Mit einer Pipette wechseln Sie 75%Medium jeden zweiten Tag durch die Beseitigung von drei Viertel des Mediums und ersetzt mit drei Vierteln frisches Medium. Zum Beispiel 750 μl Medium entfernen und 750 μl frisches Medium zugeben.
- Übertragen Sie 4-6 Aggregate auf einen Zellkultureinsatz und erlauben ausreichend Platz zwischen den Aggregaten. Mit einer feinen Pipettenspitze ( zB 200 μl Spitze) so viel überschüssige Lösung wie möglich entfernen.
- Nach 14 Tagen Kultur wechseln Sie zu DM3 Medium mit 75% mittlerer Veränderung jeden zweiten Tag und für weitere 16 Tage.
- Um die SFEBs auf Zellkultureinsätzen über 30 Tage zu halten, ändere das Medium jeden zweiten Tag für 60, 90 und 120 Tage.
HINWEIS: Die SFEBs wachsen auf etwa 1000 μm Durchmesser und sind typischerweise 100-150 μm dick 1 .
3. Bestimmung der SFEB-Zusammensetzung
- Lösen Sie die SFEBs aus dem Einsatz durch sanftes Pipettieren von Medium mit einer 200 μl breiten Mundpipettenspitze. Um die SFEBs zu transportieren, verwenden Sie eine breite Mundpipettenspitze, um die Körper vorsichtig in die Pipettenspitze zu saugen. Nach dem Beladen von SFEB in die Pipettenspitze, sanft auf 12-Well-Platten überführen und mit 300 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung waschen(PBS) pro Vertiefung
HINWEIS: SFEBs werden in den 12-Well-Platten in Lösung suspendiert. Dies ist wichtig, um die vollständige Penetration des Fixiermittels, der Blockierungslösung und der Antikörper zu ermöglichen. Bei Verwendung mehrerer SFEBs zur Färbung können bis zu 10 SFEBs pro Well einer 12-Well-Platte zugesetzt werden. Dadurch werden Lösungen und Antikörper konserviert. - Fixieren Sie SFEBs mit 300 μl pro Well 4% Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 30-45 min. Waschen Sie feste SFEBs zweimal mit 300 μL PBS, 3-5 min jede Waschung.
Achtung: Bei der Handhabung von Paraformaldehyd geeignete persönliche Schutzausrüstung tragen.
HINWEIS: Sonde für Immunreaktivität auf Marker zur Bestimmung der Reife, Zelltyp etc. Für die Markierung von Neuronen in dieser Studie wurde Huhn-Tuj1 bei 1: 500 verwendet, für zusätzliche Marker siehe Tabelle 2 und Referenzen 1 , 16 . - Permeabilisieren und blockieren mit 0,1% Triton-X100 in PBS und 10% normalem Eselserum (Blockierungslösung, 300 μL pro gut) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie die Blockierungslösung und behandeln Sie SFEBs mit 300 μl primären Antikörpern in Blockierungslösung. Inkubieren bei 4 ° C über Nacht. Waschen Sie SFEBs dreimal (3-5 min pro Waschgang) in 300 & mgr; l PBS, enthaltend 0,1% Triton-X.
- Sekundärantikörper 1: 1000 in Blockierungslösung vorbereiten. SFEBs für 1 h bei Raumtemperatur mit sekundären Antikörpern inkubieren. Wasche SFEBs mit 300 μL PBS, 3 mal für 3-5 min.
HINWEIS: In diesem Stadium können SFEBs für die Bildgebung vorbereitet werden. - Zum Bild pipettieren Sie SFEBs auf eine Glasrutsche mit einer breitlochigen Pipette. Entfernen Sie überschüssige Lösung um das SFEB mit sanfter Absaugung.
HINWEIS: Für ähnliche Färbebedingungen können mehrere SFEBs auf der gleichen Glasrutsche platziert werden. - Fügen Sie einen Tropfen Montagemedium auf die SFEBs, legen Sie ein Glas Deckglas, und drücken Sie vorsichtig, um sicherzustellen, dass es keine Luftblasen gibt. Lassen Sie das Montagemedium aushärten und gehen Sie zur Bildgebung und Quantifizierung vor (Schritt 3.8).
- Führen Sie die Zellquantifizierung durch, indem Sie mehrere Regionen von Interesse (ROI) über das SFEB nehmen und einen Z-Stack kombinieren mit einem maximalen Projektionsbild durch jeden ROI auf einem herkömmlichen konfokalen Mikroskop, wie in den Referenzen 1 , 16 beschrieben, kombiniert werden.
HINWEIS: Ganze SFEBs können mit bildbasierten Fliesen quantifiziert werden (siehe Referenzen 1 , 16 für Details). Da die SFEBs auf etwa 100 μm dünn sind, gibt es eine minimale Streuung von Licht im Gewebe und somit besteht keine Notwendigkeit für eine 2-Photonen-Mikroskopie. Frühere Verwendungen dieses Protokolls mit Fibroblasten-abgeleiteten iPSCs produzierten eine SFEB-Schicksalskarte, die komplexe und vielfältige Struktur mit Subpopulationen von Interneuronen mit Transkriptionsidentitäten zeigte, die CGE und anterioren Vorderhirnschicksalen 1 , 16 ähnelten .
4. Neuronale Aktivität in SFEBs mit MEAs aufnehmen
- Bereiten Sie 12-Well-MEA-Platten gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
- Waschen Sie die MEA Platten 3 mal für 5 min mit sterilem H 2 O unter aseptischen Bedingungen zu reinigen. 5 min mit 75% igem Ethanol und dann mit 100% igem Ethanol zum Sterilisieren der Platte waschen.
- Die Platte in einem Ofen für 4-5 h bei 50 ° C umkehren, um den Sterilisationsvorgang abzuschließen.
- Füge 500 μl 0,2% Polyethyleniminlösung (PEI) zu jeder Vertiefung hinzu und inkubiere 1 h bei Raumtemperatur. Pflegen Sie PEI und waschen Sie die Wells 4x mit sterilem destilliertem H 2 O. Luft trocknen in der Kapuze über Nacht.
- Eine 20 & mgr; l / ml Lösung von Laminin in L15-Medium vorbereiten und 10 & mgr; l Laminin in die Mitte jeder Vertiefung geben.
HINWEIS: Die umgebenden Referenz- und Erdungselektroden nicht beschichten. - Fügen Sie sterile dH 2 O zu den umgebenden Reservoirs hinzu, um eine mediale oder Lamininverdampfung zu verhindern.Die Platte 1 h bei 37 ° C inkubieren.
- Fügen Sie SFEBs (siehe Abschnitte 1 und 2) zu den lamininbeschichteten MEA-Platten hinzu, indem Sie sie sanft in eine breite Mundpipettenspitze absaugen und übertragen. 200 μl DM2-Medium in jede Vertiefung geben und über Nacht bei 37 ° C, 95% Feuchtigkeit und 5% CO 2 inkubieren.
- Nach 24 h zusätzliches 200 μl Medium zugeben und 30 Minuten bei 37 ° C, 95% Feuchtigkeit, 5% CO 2 vor dem Messvorgang abkühlen lassen.
- Legen Sie die MEA-Platte in den Plattenleser (vorgewärmt auf 37 ° C), um neuronale Aktivität aufzuzeichnen. Rekordaktivität für 10 min mit der zugehörigen MEA-Aufnahmesoftware. Siehe Referenz 19 für Details.
- Generieren Sie rohe Daten-kontinuierliche Ströme und Rasterplots der neuronalen Aktivität mit Hilfe der statistischen Analyse-Software 19 .
HINWEIS: MEA-Aufnahmen werden 7 Tage nach SFEB-Beschichtung genommen. Für diese Studie wurden Aufzeichnungen für 10 min genommen, um Netzwerk-Burst-Aktivität zu erkennen, conKontinuierliche Spur und Rasterplots. SFEBs können langfristig auf MEA-Platten gehalten werden und können über längere Zeit mit umweltgerechten Bedingungen aufgezeichnet werden ( Abbildung 6 ).
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Representative Results
SFEBs, die mit unserer Technik gezüchtet wurden, lieferten Gewebe mit morphologischen Merkmalen, die einer frühen entwickelnden kortikalen subventrikulären Zone ähneln, die mit umfangreichen Tuj1-positiven Neuronen sowie neuronalen Vorläufern voll ist ( Abbildung 3A ). Zahlreiche sich entwickelnde kortikale Rosetten wurden in den äußeren Schichten und inneren Schichten des SFEB beobachtet ( Fig. 3B ). Die äußere Kante des SFEB ähnelt einer sich entwickelnden kortikalen Platte, die postmitotische Neuronen enthält. Dies wird durch die Expression von Brn2, einem Marker für neuronale Vorläufer in den am weitesten ventralisierten äußeren kortikalen Schichten, unterstützt. Reelin-positive Zellen, die Cajal-Retzius-Zellen oder ihre Vorläufer sein können, die in den äußeren Schichten des sich entwickelnden Kortex exprimiert werden, werden auch in SFEBs beobachtet ( Fig. 3C ). SFEBs, die mit diesem Protokoll Express-Marker im Einklang mit einem gemischten Caudal (CGE) und medialen Ganglio gewachsenNic eminenz (MGE) Herkunft. Zellen, die den CGE-Marker Couptf2 und andere Zellen exprimieren, die den MGE-Marker Nkx2.1 exprimieren, können in den Kulturen beobachtet werden ( Abbildung 3D ). Dies kann durch die Verwendung von DKK-1 in teilweise in dem Protokoll, das 20 medial Schicksal zu verbessern gezeigt worden ist.
SFEBs, die mit diesem Protokoll hergestellt wurden, liefern sowohl Calretinin- als auch Calbindin-positive Interneurone ( Abbildung 4A ) sowie VGLUT positive exzitatorische Neuronen und Tbr1-positive glutamaterne neuronale Progenitoren ( Abbildung 4B ). Im Durchschnitt haben wir beobachtet, dass 61% der Gesamtzellen in SFEBs VGLUT-positiv sind und 43% Tbr1-positiv sind ( Abbildung 4C ). Dies steht im Einklang mit anderen Berichten mit ähnlichen Protokollen 21 . Zusätzlich können SFEBs physiologischen Assays unterworfen werden, wie z. B. lebenszellige Calcium-Bildgebung unter Verwendung vonMarker wie Fluo-4, um die neuronale Netzwerkfunktion in einer physiologisch relevanten Umgebung zu beobachten ( Abbildung 5 ). SFEBs können MEA-Aufnahmen für lange Zeiträume unterzogen werden und zeigen die Entwicklung von kortikalen Netzwerk-Level-Bursting ( Abbildung 6 ).
Abbildung 1: Schematische Darstellung der frühen Schritte bei der Vorbereitung von SFEBs. Nachdem iPSCs unter Verwendung einer enzymatischen Dissoziation geerntet worden sind, werden sie in Platten mit 96 Vertiefungen plattiert und bei 163 xg für 3 min zentrifugiert, um eine schnelle Aggregation zu induzieren. Nach 14 Tagen in vitro (DIV) können Zellaggregate von 96-Well-Platten über Weitloch-Pipetten auf Zellkultur-Insert-haltige 6-Well-Platten übertragen werden. Bitte hier klicken um viEw eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Zeitlinie der mittleren Änderungen und Phasen während des SFEB-Wachstums und der Erweiterung. Nachdem SFEBs auf Einsätze übertragen worden sind, gehen sie zwei mittlere Veränderungen an 14 und 28 Tagen in vitro (DIV). Sie werden typischerweise für Experimente bei DIV 30, 60 und 90 geerntet. Obere Einsätze zeigen dabei unterschiedliche Phasen. Maßstäbe = 1.000 μm (ganz links); 1000 μm (DIV 20); 600 μm (DIV 30); 300 μm (einzelnes SFEB). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Allgemeine morphologische CharaktereTics von SFEBs, die mit diesem Protokoll gewachsen sind. ( A ) Typische äußere Kante eines SFEB, der den Vorläufer Marker Nestin (grün), den post-mitotischen neuronalen Marker Tuj1 (rot) und den nuklearen Fleck (blau) ausdrückt. ( B ) SFEBs zeigen charakteristische kortikale Rosetten sowohl in den äußeren Schichten (linkes Bild) als auch in den inneren Schichten (rechts). Sie exprimieren sowohl Vorläufer als auch reife neuronale Marker. ( C ) Eine repräsentative äußere Kante eines SFEB, die den äußeren Schicht / kortikalen Plattenmarker Brn2 (grün) und den sich entwickelnden CGE-Marker Couptf2 (rot) ausdrückt. ( D ) SFEBs, die unter Verwendung dieses Protokolls hergestellt wurden, repräsentieren ventrale neokortikale Strukturen, wie sie durch Pax6 (rote) Färbung und Expressmarker gesehen werden, die mit einigen MGE-Ursprüngen wie Nxk2.1 (rot) übereinstimmen. Maßstab = 40 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Bilder von größeren neuronalen Zelltypen in SFEBs. ( A ) Einige Neuronen in SFEBs markieren Marker, die mit kortikalen Interneuronen wie Calbindin (grün, linkes Bild) und Calretinin (grünes, rechtes Bild) übereinstimmen. ( B ) SFEBs zeigen VGLUT-1 positive glutamaterne Neuronen (rotes, linkes Bild) und glutamatergische Vorläufer, die Tbr1 (rotes, rechtes Bild) ausdrücken. Maßstab = 40 μm. ( C ) Typische Erträge von exzitatorischen Neuronen, die entweder VGLUT-1 oder Tbr1 (Fehlerstab = SEM) exprimieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Live-Zell-Calcium-Aufnahmen </ Stark> (linkes Bild) Repräsentative äußere Kante SFEB behandelt mit Fluo-4, ein neuronaler Kalziumindikator. Die Zellen sind für die Messung von spontanen Calcium-Transienten (sortierte Farbfelder) markiert. (Rechtes Bild) Ausgewählte Zellen zeigen spontane Kalzium-Transienten, die durch rote Kästen (obere Spuren) oder grüne Kästen (untere Spuren) markiert sind. Maßstab = 40 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Multi-Elektroden-Array-Aufnahmen von SFEBs. (Oben) Repräsentatives Bild von SFEB, das an einer MEA-Platte befestigt ist (Maßstab = 100 μm). (Mitte und Boden) SFEBs können auf MEAs über lange Zeiträume aufgezeichnet werden und zeigen Reifung. (Mitte und unten, links) Eine gut breite Platzenkarte von 3 SFEBs, die auf 3 Vertiefungen einer 1 plattiert wurden2-Well-MEA-Platte, dunklere Farben stellen eine höhere Gesamtspitzenaktivität dar, die zwischen Tag 30 und Tag 90 ansteigt. (Mittlerer und unterer Einschnitt) Die kumulative Aktivitätskarte zeigt eine Zunahme der Spike-Dichte und des Bereichs von Spikes innerhalb kortikaler Netzwerke in SFEBs zwischen Tag 30 und Tag 90. (Mitte und unten, rechts) Raw Spuren (obere) und ganz-well Rasterplots (unten) zeigen eine Erhöhung der Anzahl der Spikes und die Anzahl der Bursts im Laufe der Zeit; Anzeichen für eine stärkere Netzwerkbildung in SFEBs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Antikörper | Verdünnung | Spezies |
| Nestin | 0,111111111 | Maus |
| Brn-2 | 0,388888889 | Hase |
| VGLUT1 | 0,111111111 | Hase |
| Pax6 | 0,25 | Hase |
| Calretinin | 0,180555556 | Hase |
| Calbindin | 0,319444444 | Hase |
| CoupTFII | 0,180555556 | Maus |
| Nkx 2.1 | 0,180555556 | Hase |
| Tuj1 | 0.388888889 | Hähnchen |
| Reelin | 0.388888889 | Maus |
| Tbr1 | 0,180555556 | Hähnchen |
| NFH | 0,25 | Maus |
Tabelle 1: In dieser Studie verwendete Antikörper.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll liefert die Bedingungen für die Differenzierung einer HiFi-Quelle in eine 3-D-Struktur, die eine frühe Entwicklungsstufe des frontalen Kortex rekapituliert. Diese Prozedur liefert Strukturen, die für die Elektrophysiologie abgefragt werden können, während sie auch der Mikroskopie zugänglich sind. Die endgültige Morphologie des SFEB ähnelt der von organotypischen Hirnscheibenkulturen und ermöglicht eine qualitativ hochwertige, konfokale Bildgebung. Dieses Protokoll kann erfolgreich SFEBs aus beiden Fibroblasten und Peripheral-Blut-mononuklearen Zelle-abgeleiteten hiPSCs erzeugen. SFEBs, die aus peripheren Blutmononuklearen Zellen-abgeleiteten hiPSCs hergestellt wurden, zeigen ähnliche morphologische Eigenschaften wie jene, die aus Fibroblasten-abgeleiteten hiPSCs hergestellt wurden.
Dieser Prozess, wie andere 3-D-Schemata, nutzt kleine Moleküle extrazelluläre Stichwörter, um Zellschicksal Entscheidungen zu führen. Dies wird mit den intrinsischen Eigenschaften des Zell-zu-Zell-Kontakts kombiniert, die eine realistischere Umgebung für net schaffenArbeitsbildung und neuronale Funktion. Andere Berichte haben gezeigt, dass die geeignete Kombination der extrazellulären Signale des kleinen Moleküls für solche Schicksalsentscheidungen wie Mittelhirn-dopaminergen 8 , 22 und kortikalen Interneuronen 8 , 16 , 23 ausreicht. Jedoch zeigen 3-D-Systeme eine beschleunigte Reifungszeit im Vergleich zu 2-D-Äquivalenten 5 . Bei gegebener Zeit haben die 3-D-Kulturen eine erhöhte Reife gezeigt. Solche Qualitäten machen starke Argumente für die Nützlichkeit der 3-D-Plattformen wie der SFEB. Der zusätzliche Vorteil der Live- und Hochqualitätsmikroskopie, zusammen mit der Flexibilität des Quellmaterials, macht überzeugende Argumente für dieses Protokoll.
Darüber hinaus SFEBs gemacht mit diesem Protokoll teilen eine Reihe von Gemeinsamkeiten mit anderen berichteten Studien 13 , 24 In Bezug auf Bezugszeichen 24 ist dieses Protokoll und die physiologische Validierung der Neuronen vorbestimmt. Zum Beispiel verwenden die in den Literaturstellen 13 , 24 gemeldeten Studien ähnliche Versionen von Dual-SMAD-Hemmungen, um kortikale wie Neuronen herzuleiten und einen ähnlichen Anteil an glutamatergen Neuronen und Progenitoren (~ 50%) zu erhalten. Darüber hinaus haben Mariani, J. et al. (Referenz 13 ) berichten über eine ähnliche Pax6- und Nestin-Färbung als dieses Protokoll bei 25-30 Tagen Zeitpunkten. Qualitativ sind die Färbungsmuster für Brn2 sowie die Expression von GFAP-positiven Astrozyten ähnlich wie in Referenz 24 beschrieben . Allerdings hat dieses Protokoll eine Reihe von Vorteilen gegenüber den beiden häufig verwendeten Organoid-Methoden. Erstens haben Mariani, J. et al. 13 berichten über die Entwicklung von Dlx-positiven Interneuronen am Tag 50 undNur durch Immunfärbung Methoden bestärkt. Unter Verwendung dieses Protokolls werden Dlx-positive Interneurone am Tag 30 produziert. Diese Interneurone wurden als funktionell durch einzellige Elektrophysiologie und einmalige pharmakologische Anwendung von GABA 16 bestätigt . Darüber hinaus behaupten die Autoren von 13 die funktionelle Konnektivität von Neuronen, aber sie wurde nur unter Verwendung von Färbung bestimmt. SFEBs, die mit diesem Protokoll hergestellt wurden, wurden einer Netzwerk-Einzelelektroden-Stimulation und einer Calcium-Bildgebung unterworfen, um zu zeigen, dass die Entwicklung von kortikalen Netzwerken verbunden und funktional ist. Pasca et al. 24 die Aggregate unter Verwendung eines Kryostaten, um Aufnahmen von organoidähnlichen Strukturen zu erhalten. SFEBs, die dieses Protokoll verwendet haben, brauchen keine Abschnitte und können direkt in den Einsätzen aufgezeichnet werden 1 . Neuronen, die aus nicht-saldierten SFEBs aufgezeichnet wurden, haben gezeigt, dass sie Potenziale und inhibitorische post-synaptische Potentiale nach sortin habenG 1 , 16
SFEBs können sowohl mit Fibroblasten als auch mit PBMCs als Ausgangsmaterial hergestellt werden. Es ist auch möglich, andere Gewebetypen zu verwenden, die zu hiPSCs (z. B. Zahnpasta, Vorhaut, Urin) 25 , 26 , 27 führen , obwohl einige der kleinen Moleküle möglicherweise verändert werden müssen, um ähnliche Ergebnisse zu erzielen. Für dieses Protokoll ist die Verwendung von DKK-1 wichtig, um das SFEB zu einem ventralisierten Schicksal zu treiben 28 . Diese Ventralisierung ist teilweise verantwortlich für die Differenzierung von Interneuronen mit CGE-artigen Ursprüngen 16 . DKK-1 ist ein teures kleines Molekül und somit können hohe Konzentrationen von Schall-Igel verwendet werden, um DKK-1 in diesem Protokoll zu ergänzen. Allerdings müssen die Konzentrationen für die Wnt-Hemmung über DKK-1 empirisch vom Endbenutzer bestimmt werden. Zusätzlich, XAV939, ein anderes Wnt inhibitoR, kann verwendet werden, um die Differenzierung zu einem ventralisierten Schicksal zu unterstützen, obwohl die Verwendung dieses Inhibitors Gewebe ergibt, das Transkriptionsidentitäten mit dem MGE 23 teilt.
Bei der Entwicklung von 3D-hiPSC-Kultursystemen wie den in diesem Protokoll beschriebenen SFEBs ist es wichtig zu beachten, dass diese Strukturen eine moderate Heterogenität von Kultur zu Kultur ergeben. Dies ist teilweise auf die stochastische Natur der neuronalen Differenzierung von iPSCs zurückzuführen und aufgrund der Zell-Zell-Kontaktinitiierung im SFEB, was zu einer spontanen intrinsischen Selbstorganisation führt 29 , 30 . Daher ist es wichtig, die Nützlichkeit dieser Technik im Kontext der Heterogenität zu interpretieren. Wege zur Minimierung der Auswirkungen der Heterogenität in diesem System sind die Schaffung einer großen Anzahl von SFEBs, so dass sie eine natürliche Veränderung im System darstellen, die sich streng an die Konzentration vonReagenzien und die Anzahl der Zellen, die zu Beginn jedes Produktionslaufs ausgesät wurden. Es ist entscheidend, mit sauberen iPSC-Kolonien zu beginnen und eine minimale Verreibung während des enzymatischen Dissoziationsschrittes während der iPSC-Dissoziation anzuwenden, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu erhöhen. Die Lebensfähigkeit der Zelle nach der Verreibung ist ein wichtiger Faktor für qualitativ hochwertige, konsistente SFEBs. Als alternativer Schritt zur Fehlerbehebung kann die Lebensfähigkeit nach der Dissoziation und vor den Zentrifugationsschritten mit Trypanblau überprüft werden, falls erforderlich. Lebensfähigkeit und spontane Differenzierung können auch beeinträchtigt werden, wenn ROCKi während der frühen Dissoziations- und Differenzierungsschritte nicht richtig verwendet wird. Die Verwendung von ROCKi und seine schrittweise Abnahme während der 50% -Futtermittel über die ersten 7-10 Tage ist entscheidend für gleichbleibende, qualitativ hochwertige SFEBs.
Darüber hinaus ist es oft als Validierungsschritt nützlich, um die Ergebnisse in 3D-SFEBs mit denen zu untersuchen, die in denselben Zelllinien beobachtet wurden, die unter Verwendung einer Monolayer-Präparation hergestellt wurden. UnderstaWie die beiden Systeme in jeder experimentellen Kohorte verglichen werden, ist äußerst nützlich, um die Komplexität eines gegebenen Krankheitsmodells zu verstehen. Schließlich kann SFEBs verwendet werden Zellpopulationen unter Verwendung von Fluoreszenz - aktivierter Zell für die weitere Untersuchung in einem homogeneren 2D einschichtigen System zu sortieren und zu reinigen Sortier 16.
Dennoch sind SFEBs, die mit diesem Protokoll erstellt wurden, nützlich für das Studium von kleinen Entwicklungskortikalen Schaltungen. Zukünftige Anwendungen dieser Technik beinhalten das Multiplexen von elektrophysiologischen Aufnahmen mit hochauflösenden Ansätzen. Tatsächlich werden Zellenkammereinsätze für den Einsatz im 96-Well-Plattenformat hergestellt. Diese Einsätze können mit dem hier beschriebenen SFEB-Protokoll anstelle der 6-Well-Einsätze verwendet werden. Um Skalierbarkeit mit dieser Methode zu zeigen, müssen SFEBs unter Verwendung mehrerer Zeilen und Klone innerhalb einer gegebenen Kohorte erstellt werden und müssen über einen Satz von robusten zellbasierten Assays gescreent werden, um nach Konsistenz wi zu suchenDünne Kulturen. Zum Beispiel können neuronale Zahlen, Morphologie und Schichtentwicklung unter Verwendung eines 96-Well-Formats untersucht werden. Idealerweise sollten zellbasierte Assays mit einem hochauflösenden elektrophysiologischen Assay wie dem MEA kombiniert werden, das auch auf 96-Well-Platten skalierbar ist.
Diese SFEB-Plattform hat Versprechen, die Rolle der frühen kortikalen Netzwerkentwicklung bei neurologischen Störungen zu entschlüsseln, insbesondere in Fällen, in denen es eine mögliche Wechselwirkung zwischen Genetik und frühen neuronalen Entwicklung gibt. Wir haben gezeigt, dass es viel wie eine Scheibenkultur behandelt werden kann, wie in Ratten- und Maus-Studien gezeigt. Nützliche Zukunftsstudien, die dieses System nutzen, sollten sich auf die entwicklungsvergleichliche Anatomie und Physiologie zwischen in vivo Strukturen der Maus und der SFEB konzentrieren. Diese Vergleichsdaten wären sehr mächtig bei der Entwicklung eines wirklich translationalen Systems für die Wirkstoffforschung und die Grundlagenforschung.
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Disclosures
Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Wir danken Elizabeth Benevides für den Korrekturlesen des Artikels. Wir danken Drs. John Hussman und Gene Blatt für ihre hilfreichen Diskussionen und Kommentare.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
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