Summary
Her rapporterer vi en protokoll for å utvikle et tredimensjonalt (3-D) system fra humane induserte pluripotente stamceller (hiPSCs) som kalles serumfri embryoidlegemet (SFEB). Denne 3-D modellen kan brukes som en organotypisk skivekultur for å modellere human kortikal utvikling og for fysiologisk undersøkelse av utvikling av nevrale kretser.
Abstract
Selv om en rekke in vitro sykdomsmodeller har blitt utviklet ved hjelp av hiPSCs, er en begrensning at disse todimensjonale (2-D) systemene ikke representerer den underliggende cytoarkitektur og funksjonelle kompleksitet av de berørte individer som bærer mistenkte sykdomsvarianter. Konvensjonelle 2-D-modeller forblir ufullstendige representasjoner av in vivo- lignende strukturer og tar ikke tilstrekkelig fange av hjernens kompleksitet. Dermed er det et voksende behov for flere 3-D hiPSC-baserte modeller som bedre kan rekapitulere de cellulære interaksjonene og funksjonene sett i et in vivo system.
Her rapporterer vi en protokoll for å utvikle et 3-D system fra utifferentierte hiPSCs basert på serumfri embryoid kroppen (SFEB). Denne 3-D modellen speiler aspekter av en utviklende ventralisert neocortex og tillater studier i funksjoner integrert i levende neurale celler og intakt vev som migrasjon, tilkobling, kommunikasjon og matteuration. Nærmere bestemt demonstrerer vi at SFEBene som bruker protokollen vår kan bli forhørt ved hjelp av fysiologisk relevante og høyinnholdige cellebaserte analyser som kalsiumbilding og multi-elektrode array (MEA) opptak uten krysoseksjonering. I tilfelle MEA-opptak viser vi at SFEBer øker både spikeaktivitet og nettverksnivåbarbaring under langvarig dyrking. Denne SFEB-protokollen gir et robust og skalerbart system for studier av utvikling av nettverksdannelse i en 3-D-modell som fanger aspekter av tidlig kortikal utvikling.
Introduction
Vi har tidligere rapportert et 3-D-modellsystem, generert fra pasient-avledede, menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) som rekapitulerer noen aspekter av tidlig cortical network development 1 . Denne 3-D-modellen, en serumfri embryoidkropp (SFEB), forbedrer seg på tidligere enkle aggregering hiPSC-modeller 2 , 3 . En voksende arbeidsgruppe avslører at 3-D-strukturer som våre SFEBer, omtrentlige aspekter ved nevral utvikling som vanligvis observeres in vivo og på et tidligere tidspunkt enn observert i 2-D-dimensjonale (2-D) / monolayer hiPSC-modeller 4 , 5 . Første studier har vært fokusert på den selvorganiserende kompleksiteten til 3-D-legemer uten å demonstrere deres fysiologiske kompleksitet 2 .
Protokollen beskrevet her er blitt brukt på utifferentierte hiPSCer avledet fra fibroblaster og Peronale blodmononukleære celler (PBMCs). Disse cellene opprettholdes på y-bestrålede musembryonmatere (MEFer). Disse hiPSC koloniene rengjøres manuelt av spontant differentierte celler, enzymatisk høstet og resuspendert i medium inneholdende Rho-Kinase inhibitor Y-27632 (ROCKi). Uifferensierte hiPSCs blir utsatt for dissosiasjon og sentrifugering før de overføres til V-bunnplater med 96 brønner med lav vedheft. Etter plating, initieres nerveinduksjon ved bruk av dobbel SMAD-hemning (SB431542 og LDN193189 sammen med dickkopf 1 (DKK-1)) for å drive en anterior-frontal forebrain neuronal-fate lineage 6 . Etter 14 dager overføres SFEBene til cellekulturinnsatser i en 6-brønnplate. Når de overføres, begynner de runde SFEBene å spre og tynne, samtidig som de opprettholder lokale nettverksforbindelser som ofte observeres i hippocampale organotypiske skivekulturpreparater ved bruk av lignende cellekulturinnsatser 1 ,Ss = "xref"> 7.
Bruken av en SFEB-basert 3-D-plattform i dette formatet er egnet til effektiv produksjon av kortikale nettverk som kan bli forhørt ved bruk av cellebaserte fysiologiske analyser som kalsiumbilleddannelse eller elektrofysiologiske analyser som enkeltcelleopptak eller multielektrodearray (MEA ) 1 . Selv om 3-D-systemer bærer markørene for tidlig kortikal utvikling, har andre studier vist at disse 3-D-legemene kan kreve lengre inkubasjonstider for å tillate det iboende langsommere tempoet i menneskelig vevsutvikling 8 . Denne SFEB-protokollen genererer med held 3-D SFEBer fra utifferentierte hiPSCs som fanger aspekter av tidlig utvikling av cortex.
SFEBs mulighet til å modellere nettverksavvik i nevrologiske lidelser er en styrke i dette systemet. HiPSCene avledet fra pasientvev kan dyrkes til celler i nervesystemet som er utsatt for rumpaAys relatert til cellebiologi så vel som samtidig genuttrykk. Humane iPSCs blir brukt til å fastslå den genetiske profilen til store grupper av individer med varierende nevrologiske lidelser med komplekse etiologier som autismespektrumforstyrrelse (ASD), schizofreni 9 , Rett syndrom 10 og Alzheimers sykdom 11 , 12 . Inntil nylig var iPSC-modeller typisk monolagspreparater som, mens de var dyktige i evaluering av molekylære interaksjoner, var utilstrekkelige i dechifrering av de komplekse cellulære interaksjonene som ble sett in vivo . Dyrmodeller har vært standard erstatning for å gjenskape hele orgelplattformen. Disse dyremodellene plages av dårlig oversettelse av funn og har begrenset evne til å kopiere menneskelige genetiske profiler identifisert ved store genetiske screeningsstudier. Dermed legger utviklingen av 3-D-systemer fra iPSCs til et nødvendig lag av kompleksitet hos menneskerSykdomsmodellering 13 , 14 . Det neste trinnet for 3D hiPSC-plattformer er å imøtekomme kravene til stor skala ved høy gjennomputs screening ved hjelp av cellebaserte analyser 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generering av neurale progenitorceller
- Opprettholde hiPSCer avledet fra fibroblaster og PBMC i 6-brønnplater på et y-bestrålet musfosterfôr (MEF) cellelag i humant iPSC medium tilsatt små molekyler (se Materialebordet).
MERK: Daglig vedlikehold er en modifisert versjon av tidligere rapporterte prosedyrer 1 , 16 .- Plate 6 x 10 5 MEFer på hver brønn i en 6-brønn vevskulturkvalitetsplate i 300 μl / brønn anbefalt medium (etter produsentens protokoll).
- Etter 48 timer, bytt MEFs medium med 300 μL / brønn hiPSC medium i 1 time før du legger til hiPSCs.
- Tørk hiPSCs raskt i et 37 ° C vannbad og legg sakte til 1 mL hiPSC medium dråpevis. Overfør hiPSC og medium til et 15 ml konisk rør. Tilsett medium for å bringe totalvolumet til 5 ml. Sentrifuge i 4 min ved 129 xg, aspirere supernataNt, suspender forsiktig pelleten i 1 mL hiPSC medium med ROCK inhibitor ved 1: 1000 konsentrasjon.
- Plate cellesuspensjonen (typisk sådd med 300.000 celler / brønn) på MEF cellelaget og inkuber ved 37 ° C, 5% CO2, 95% luftfuktighet.
- Overvåk iPSC-kulturen nøye ved hjelp av et lysmikroskop. Etter 48 timer fjerner du kulturer som har ujevne kanter, har vokst til å bli kystlignende eller vises gulbrun under lysmikroskopet for å minimere spontan differensiering.
MERK: Etter 7 - 10 dager skal hiPSC kolonier danne seg. Kolonier bør være runde, med klart definerte grenser og ensartede celledensiteter og uten løst pakket, ujevne celler. - Velg manuelt runde hiPSC kolonier for å fjerne kulturen av spontant differentierte celler. Utvid koloniene ved å plassere dem på friske MEF-lag. Utvid 1: 3 hver 7. dag når kulturer nær konfluens og frys 1 , 16 .
- Etter ekspansjon og fryseceller (for sikkerhetskopiering), vokser hiPSC kolonier på platene til de når 50 - 75% sammenløp.
- Syv dager etter plating, bruk mild enzymatisk behandling (5-10 min med 300 μL enzymoppløsning) og forsiktig triturering (2-4 ganger med 1000 μL pipett) for å høste og forberede hiPSCs for neural forløpercelledifferensiering.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 129 xg i 4 minutter, aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 5 ml humant iPSC-medium. Overfør cellesuspensjonen til en 0,1% gelatinbelagt 5 cm cellekulturskål i 1 time ved 37 ° C for å eliminere MEF og for å maksimere hiPSC-utbyttet. Overfør mediet (med ikke-vedhengende celler) til en annen 5 cm gelatinbelagt parabolen.
- Overfør de ikke-adherente cellene til et 15 ml sentrifugerør ved hjelp av en overføringspipette. Skyll forsiktig platene med 3 ml medium og legg det til 15 ml røret.
- Sentrifuger cellesuspensjonen ved 129 xg i 4 minutter, aspirer superetNatant, og forsiktig resuspendere pelleten i medium. Bestem celletallet ved hjelp av en automatisert celleteller. Plate 9000 celler / brønn i en 96-brønn V-bunnplate med lav vedheft.
- Sentrifuger platen ved 163 xg i 3 min. Inkuber platen ved 37 ° C, 95% luftfuktighet og 5% CO2. Bruk en pipette, bytt 50% medium hver annen dag ved å fjerne halvparten av mediet og erstatte det med fersk, kjemisk definert differensieringsmedium 1 (DM1, figur 1 , tabell over materialer) i 14 dager.
2. Induksjon av serumfri embryoidkropp (SFEB) ( figur 2 )
- Plasser 40 μm cellekulturinnsatser i 6-brønnsplater og tilsett 1 ml DM1-medium minst 1 time før tilsetning av aggregater.
- På dag 14 overfører aggregatene med 20 μl medium ved hjelp av en 200 μl bred munnspiss på 40 μm cellekulturinnsatser og bytt medium til DM2.
7 , 17 , 18 .- Overfør 4-6 aggregater til en cellekulturinnsats og la tilstrekkelig plass mellom aggregatene. Fjern så mye overflødig løsning som mulig ved hjelp av en fin pipettespiss ( f.eks. 200 μL spiss).
MERK: Det er akseptabelt å kort forstyrre SFEB da de vil bevege seg på cellekulturinnsatsen som løsningen i fjernet fra rundt SFEBene. - Opprett kulturene i 1 ml DM2 ved 37 ° C, 95% luftfuktighet og 5% CO2. Bruk en pipette, bytt 75%Middels hver annen dag ved å fjerne tre fjerdedeler av mediet og erstatte med tre fjerdedeler ferskt medium. Fjern for eksempel 750 μl medium og tilsett 750 μL frisk medium.
- Overfør 4-6 aggregater til en cellekulturinnsats og la tilstrekkelig plass mellom aggregatene. Fjern så mye overflødig løsning som mulig ved hjelp av en fin pipettespiss ( f.eks. 200 μL spiss).
- Etter 14 dager med kultur, bytt til DM3 medium med 75% medium endring annenhver dag og i ytterligere 16 dager.
- For å opprettholde SFEBene på cellekulturinnlegg etter 30 dager, bytt mediet annenhver dag i 60, 90 og 120 dager.
MERK: SFEBene vil vokse til ca. 1000 μm i diameter og er typisk 100-150 μm tykke 1 .
3. Bestemme SFEB-sammensetning
- Løsne SFEBene fra innsatsen ved forsiktig pipetteringsmedium ved hjelp av en 200 μl bred munnpipettespiss. For å overføre SFEBene, bruk en bred munnpipettespiss for å forsiktig suge legemene inn i pipettespissen. Etter at du har lagt SFEB i pipettespissen, overfør forsiktig til 12-brønnsplater og vask med 300 μl fosfatbuffert saltvann(PBS) per brønn.
MERK: SFEBer vil bli suspendert i løsningen i 12-brønnplatene. Dette er viktig for å tillate full gjennomtrenging av fikseringsmiddelet, blokkeringsløsningen og antistoffer. Hvis du bruker flere SFEBer for farging, kan det legges opp til 10 SFEBer per brønn på en brønn med 12 brønner. Dette vil spare løsninger og antistoffer. - Fest SFEB med 300 μL per brønn 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 30-45 min. Vask faste SFEBer to ganger med 300 μL PBS, 3-5 min hver vask.
Forsiktig: Bruk egnet personlig verneutstyr ved håndtering av paraformaldehyd.
MERK: Probe for immunoreaktivitet til markører for å bestemme modenhet, celletype etc. For merking av nevroner i denne studien ble kylling-Tuj1 brukt ved 1: 500, for ytterligere markører, se tabell 2 og referanser 1 , 16 . - Permeabiliser og blokkere med 0,1% Triton-X100 i PBS og 10% normalt eselserum (blokkering, 300 μm; L per brønn) i 1 time ved romtemperatur.
- Fjern blokkeringsløsningen og behandle SFEB med 300 μL primære antistoffer i blokkeringsløsning. Inkuber ved 4 ° C over natten. Vask SFEBs tre ganger (3-5 min per vask) i 300 μl PBS som inneholder 0,1% Triton-X.
- Forbered sekundære antistoffer 1: 1000 i blokkeringsløsning. Inkubér SFEB i 1 time ved romtemperatur med sekundære antistoffer. Vask SFEB med 300 μL PBS, 3 ganger i 3-5 minutter hver.
MERK: På dette stadiet kan SFEBs forberedes for bildebehandling. - Til bilde, pipetter SFEBer på en glidelås med en pipette med bred boring. Fjern overflødig oppløsning rundt SFEB ved bruk av mild suging.
MERK: For lignende fargevilkår kan flere SFEBer plasseres på samme glassdia. - Legg en dråpe monteringsmedium på SFEBene, sett et glassdeksel, og trykk forsiktig for å sikre at det ikke er luftbobler. La monteringsmediet herdes og fortsett til avbildning og kvantifisering (trinn 3.8).
- Utfør cellekvantifisering ved å ta flere interessepunkter (ROI) over SFEB og bruke en z-stack kombinert med et maksimalt projeksjonsbilde gjennom hvert avkastning på et standard konfokalmikroskop som beskrevet i referanser 1 , 16 .
MERK: Hele SFEBer kan kvantifiseres ved hjelp av bildebasert flislegging (se referanser 1 , 16 for detaljer). Siden SFEBene er tynne til ca. 100 μm, er det minimal spredning av lys i vevet og dermed er det ikke behov for 2-foton mikroskopi. Tidligere bruk av denne protokollen med fibroblast-avledede iPSCs produserte et SFEB skjebne kart som avslørte komplekse og mangfoldige struktur med subpopulasjoner av interneuroner med transkripsjonelle identiteter som lignet CGE og fremre forebyggelsesfasene 1 , 16.
4. Registrering av neuronal aktivitet i SFEBer ved hjelp av MEA
- Klargjør 12-brønn MEA-plater i henhold til produsentens anvisninger.
- Vask MEA platene 3 ganger i 5 minutter med sterilt H2O under aseptiske betingelser for å rengjøre. Vask i 5 minutter med 75% etanol og deretter med 100% etanol for å sterilisere platen.
- Bake platen omvendt i en ovn i 4-5 timer ved 50 ° C for å fullføre steriliseringsprosessen.
- Tilsett 500 lL 0,2% polyetyleniminoppløsning (PEI) til hver brønn og inkuber 1 time ved romtemperatur. Aspirer PEI og vaske brønnene 4 ganger med sterilt destillert H2O Lufttørr i hetten over natten.
- Lag en 20 μl / ml løsning av laminin i L15 medium og tilsett 10 μL laminin til midten av hver brønn.
MERK: Ikke dekk de omgivende referanse- og jordingselektroder. - Legg sterilt dH 2 O til omkringliggende reservoar for å forhindre medium eller laminin fordampning.Inkuber platen i 1 time ved 37 ° C.
- Legg SFEB (se avsnitt 1 og 2) på lamininbelagte MEA-plater ved forsiktig å suge dem inn i en bred munnpipettespiss og overfør dem. Tilsett 200 ul DM2 medium til hver brønn og inkuber over natten ved 37 ° C, 95% luftfuktighet og 5% CO2.
- Tilsett ytterligere 200 μl medium etter 24 timer og la det gjenopprette i 30 minutter ved 37 ° C, 95% fuktighet, 5% CO 2 før du leser platen.
- Plasser MEA-platen i plateavleseren (forvarmet til 37 ° C) for å registrere neuronal aktivitet. Opptaksaktivitet i 10 minutter med tilhørende MEA-opptaksprogramvare. Se referanse 19 for detaljer.
- Generer rå data-kontinuerlige strømmer og raster-plott av nevronaktivitet ved hjelp av statistisk analyse-programvare 19 .
MERK: MEA-opptak tas 7 dager etter SFEB-plating. For denne studien ble opptak tatt i 10 minutter for å oppdage nettverksbruddaktivitet, conTinuous spor og raster tomter. SFEBer kan opprettholdes langsiktig på MEA-plater og kan registreres over lengre tidsperioder ved bruk av miljøstyrte forhold ( figur 6 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SFEBer vokst ved hjelp av vår teknikk ga vev med morfologiske egenskaper som ligner en tidlig utviklende cortical subventricular zone fylt med omfattende Tuj1-positive nevroner, samt nevrale progenitorer ( Figur 3A ). Tallrike utviklede kortikale rosetter ble observert i ytre lag og indre lag av SFEB ( Figur 3B ). Den ytre kanten av SFEB ligner en utviklende kortikalplate som inneholder postmitotiske nevroner. Dette støttes av uttrykket av Brn2, en markør for nevrale progenitorer i de mest ventraliserte ytre kortikale lagene. Reelin-positive celler som kan være Cajal-Retzius-celler eller deres stamceller, som uttrykkes i de ytre lagene i den utviklende cortex, observeres også i SFEBer ( figur 3C ). SFEBer som vokser ved hjelp av denne protokollens eksakte markører stemmer overens med en blandet caudal (CGE) og medial ganglioNic eminence (MGE) opprinnelse. Celler som uttrykker CGE-markøren Couptf2 og andre celler som uttrykker MGE-markør Nkx2.1, kan observeres i kulturen ( Figur 3D ). Dette kan til dels skyldes bruk av DKK-1 i protokollen, som har vist seg å øke mediale skjebner 20 .
SFEBer laget ved hjelp av denne protokollen gir både kalretinin- og kalbindin-positive interneuroner ( figur 4A ) samt VGLUT-positive excitatoriske neuroner og Tbr1-positive glutamatergiske nevrale progenitorer ( figur 4B ). I gjennomsnitt har vi observert at 61% av de totale cellene i SFEB er VGLUT positive og 43% er Tbr1-positive ( figur 4C ). Dette stemmer overens med andre rapporter ved hjelp av lignende protokoller 21 . I tillegg kan SFEBs bli underlagt fysiologiske analyser som levende kalsium-bildebehandling ved brukMarkører som Fluo-4, for å observere neurale nettverksfunksjon i et mer fysiologisk relevant miljø ( figur 5 ). SFEB-er kan bli utsatt for MEA-opptak i lange perioder og viser utvikling av kortisk nettverksnivåbarning ( figur 6 ).
Figur 1: Skjematisk skissere de første trinnene i å forberede SFEBer. Etter at iPSC har blitt høstet ved hjelp av en enzymatisk dissosiasjon, plateres de i 96-brønnsplater og sentrifugeres ved 163 xg i 3 minutter for å indusere rask aggregering. Etter 14 dager in vitro (DIV) kan celleaggregater overføres fra 96-brønnsplater via brønnboringspipetter til 6-brønnplater med cellekulturinnsats. Vennligst klikk her til viEw en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tidslinje for mellomstore endringer og faser under SFEB Vekst og utvidelse. Etter at SFEB er blitt overført til innsatser, de undergår to mellomstore endringer 14 og 28 dager in vitro (DIV). De høstes vanligvis for eksperimenter ved DIV 30, 60 og 90. Øvre innlegg viser forskjellige faser i denne prosessen. Skalestenger = 1000 μm (langt til venstre); 1000 μm (DIV 20); 600 μm (DIV 30); 300 μm (singel SFEB). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Generell morfologisk karakteristikkTics of SFEBs vokst ved hjelp av denne protokollen. ( A ) Typisk ytre kanten av en SFEB som uttrykker progenitormarkøren nestin (grønn), den postmittotiske nevrale markøren Tuj1 (rød) og den nukleare flekken (blå). ( B ) SFEB viser karakteristiske kortikale rosetter i både ytre lag (venstre bilde) og indre lag (høyre). De uttrykker både stamfødte og modne neuronmarkører. ( C ) En representativ ytterkant av en SFEB som uttrykker den ytre lag / kortikale plate markør Brn2 (grønn) og den utviklende CGE markøren Couptf2 (rød). ( D ) SFEBer laget ved hjelp av denne protokollen representerer ventraliserte neokortiske strukturer som sett av Pax6 (rød) farging og ekspresmarkører i samsvar med noen MGE-opprinnelser som Nxk2.1 (rød). Skalbjelke = 40 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bilder av store neuronale celletyper i SFEBer. ( A ) Noen neuroner i SFEBs uttrykker markører i samsvar med kortikale interneuroner som kalbindin (grønn, venstre bilde) og kalretinin (grønt, høyre bilde). ( B ) SFEB viser VGLUT-1 positive glutamatergiske nevroner (rødt, venstre bilde) og glutamatergiske stamceller som uttrykker Tbr1 (rødt, høyre bilde). Skalbjelke = 40 μm. ( C ) Typiske utbytter av excitatoriske nevroner som uttrykker enten VGLUT-1 eller Tbr1 (feilstang = SEM). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Opptak av levendecellekalsium. </ Strong> (Venstre bilde) Representativ ytre kant SFEB behandlet med Fluo-4, en nervekalsiumindikator. Celler er merket for måling av spontane kalsiumtransienter (forskjellige fargekasser). (Høyre bilde) Utvalgte celler som demonstrerer spontane kalsiumtransienter som er merket med røde bokser (øvre spor) eller grønne bokser (lavere spor). Skalbjelke = 40 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Multi-elektrode Array Opptak av SFEBer. (Top) Representativt bilde av SFEB festet til en MEA plate (Skala bar = 100 μm). (Mellom og nederst) SFEBer kan registreres på MEA over lange perioder og vise modning. (Midt og bunn; venstre) Et godt bristekart av 3 SFEBer utplattet på 3 brønner med en 12-brønn MEA-plate, mørkere farger representerer høyere samlet spikeaktivitet som øker mellom dag 30 og dag 90. (Mellom og bunn; innspill) Kumulativ aktivitetskart viser en økning i toppdensiteten og spikesarealet i kortikale nettverk i SFEBer mellom Dag 30 og dag 90. (Midt og nederst, høyre) Råspor (øvre) og helbrønn-rasterplott (lavere) viser en økning i antall toppene og antall sprekker over tid; Indikativ for sterkere nettverksdannelse i SFEBer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| antistoff | fortynning | Arter |
| Nestinmarkøren | 0,111111111 | Mus |
| Brn-2 | 0,388888889 | Kanin |
| VGLUT1 | 0,111111111 | Kanin |
| Pax6 | 0.25 | Kanin |
| calretinin | 0,180555556 | Kanin |
| Calbindin | 0,319444444 | Kanin |
| CoupTFII | 0,180555556 | Mus |
| Nkx 2.1 | 0,180555556 | Kanin |
| Tuj1 | 0,388888889 | Kylling |
| Reelin | 0,388888889 | Mus |
| Tbr1 | 0,180555556 | Kylling |
| NFH | 0.25 | Mus |
Tabell 1: Antistoffer anvendt i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her gir betingelsene for å differensiere en hiPSC-kilde til en 3-D-struktur som rekapitulerer et tidlig utviklingsstadium av den frontale cortex. Denne prosedyren gir strukturer som kan bli forhørt for elektrofysiologi mens de også er mottagelige for mikroskopi. Den endelige morfologien til SFEB ligner den av organotype hjerneskivekulturer og gir høy kvalitet detaljert konfokal bildebehandling. Denne protokollen kan vellykket generere SFEBer fra både fibroblast og perifert blodmononukleært celle-avledet hiPSCs. SFEBer laget av perifert blodmononukleære celle-avledede hiPSC'er utviser lignende morfologiske karakteristika som de fremstilt fra fibroblast-avledede hiPSCs.
Denne prosessen, som andre 3-D-ordninger, benytter småmolekylære ekstracellulære signaler for å veilede beslutningene om celleflyt. Dette kombineres med de inneboende egenskapene til celle-til-celle kontakt, som skaper et mer realistisk miljø for nettArbeidsdannelse og nevronfunksjon. Andre rapporter har vist at den passende kombinasjonen av de småcellulære ekstracellulære signaler er tilstrekkelig for slike cellefellebeslutninger som dopaminerge 8 , 22 og kortikale interneuroner 8 , 16 , 23 i midten. Imidlertid utviser 3-D-systemer en akselerert modningstid sammenlignet med 2-D ekvivalenter 5 . Når gitt tilstrekkelig tid, har 3-D kulturer vist økt modenhet. Slike kvaliteter gir sterke argumenter for bruken av 3-D plattformene som SFEB. Den ekstra fordelen av levende og høy kvalitet mikroskopi, sammen med fleksibiliteten til kildematerialet, gir overbevisende argumenter for denne protokollen.
I tillegg har SFEBer laget ved hjelp av denne protokollen dele en rekke likheter med andre rapporterte studier 13 , 24 . Med hensyn til referanse 24 , forutsetter denne protokollen og den fysiologiske validering av nevronene den. For eksempel bruker studier som er rapportert i referanser 13 , 24 , lignende versjoner av dobbelt SMAD-hemming for å utlede kortikale som nevroner og oppnådde en tilsvarende andel av glutamatergiske neuroner og stamceller (~ 50%). I tillegg er Mariani, J. et al. (Referanse 13 ) rapporterer lignende Pax6- og Nestin-flekker som denne protokollen på 25-30 dagers tidspunkter. Kvalitativt er fargemønstrene for Brn2 samt uttrykket for GFAP-positive astrocytter likt det som er rapportert i referanse 24 . Imidlertid har denne protokollen en rekke fordeler i forhold til de to vanligste organo-metoden. For det første, Mariani, J. et al. 13 rapporterer utviklingen av Dlx positive interneuroner på dag 50 og conStyrket bare ved immunostaining-metoder. Ved bruk av denne protokollen produseres Dlx positive interneuroner på dag 30. Disse interneuronene ble bekreftet som funksjonelle ved en-cellelektrofi-sologi og enkeltcellet farmakologisk anvendelse av GABA 16 . I tillegg hevder forfatterne av 13 funksjonell tilkobling av nevroner, men det ble bestemt bare ved å bruke farging. SFEBer som er laget ved hjelp av denne protokollen, har blitt utsatt for nettverks-elektrode-stimulering og kalsiumbilding for å vise at utvikling av kortikale nettverk er koblet og funksjonelt. Pasca et al. 24 deler aggregatene ved hjelp av en kryostat for å skaffe opptak fra organoidlignende strukturer. SFEBer som er laget ved hjelp av denne protokollen, trenger ikke snitt og kan registreres direkte mens de er i innleggene 1 . Neuroner registrert fra ikke-seksjonerte SFEBer har vist seg å ha tiltakspotensialer og hemmende postsynaptiske potensialer etter sorteringG 1 , 16 .
SFEBer kan fremstilles ved bruk av både fibroblaster og PBMC som utgangsmateriale. Det er også mulig å bruke andre vevtyper som resulterer i hiPSCs (f.eks. Dentalmasse, forhuden, urin) 25 , 26 , 27 , selv om noen av de små molekylene må endres for å oppnå lignende resultater. For denne protokollen er bruk av DKK-1 viktig når man kjører SFEB mot en ventralisert skjebne 28 . Denne ventraliseringen er delvis ansvarlig for differensiering av interneuroner med CGE-lignende opprinnelse 16 . DKK-1 er et dyrt lite molekyl og dermed kan høye konsentrasjoner av sonisk hedgehog brukes til å supplere DKK-1 i denne protokollen. Konsentrasjonene for Wnt-inhibering via DKK-1 må imidlertid bestemmes empirisk av sluttbrukeren. I tillegg XAV939, en annen Wnt inhibitoR, kan brukes til å bidra til å drive differensiering mot en ventralisert skjebne, selv om bruken av denne inhibitoren vil gi vev som deler transkripsjonelle identiteter med MGE 23 .
Når du utvikler 3D hiPSC kultursystemer som SFEBene beskrevet i denne protokollen, er det viktig å huske på at disse strukturene gir en moderat mengde heterogenitet fra kultur til kultur. Dette skyldes delvis den stokastiske karakteren av nevrononal differensiering fra iPSCs, og på grunn av celletilkoblingsinitiering i SFEB som resulterer i spontan egen selvorganisasjon 29 , 30 . Derfor er det viktig å tolke nytten av denne teknikken i sammenheng med heterogenitet. Måter å minimere virkningen av heterogenitet i dette systemet inkluderer å skape et stort antall SFEBer slik at de representerer naturlig variasjon i systemet, og overholder konsentrasjonen avReagenser og antall celler sådd i begynnelsen av hver produksjonsperiode. Det er kritisk å starte med rene iPSC-kolonier og å anvende minimal triturering under det enzymatiske dissosiasjonstrinnet under iPSC-dissosiasjon for å øke celle-levedyktigheten. Cell levedyktighet etter triturering er en viktig faktor for å få høy kvalitet, konsistente SFEBer. Som et alternativt feilsøkingstrinn kan levedyktigheten kontrolleres etter dissosiasjonen og før sentrifugeringstrinnene ved hjelp av trypanblått, om nødvendig. Viabilitet og spontan differensiering kan også bli påvirket dersom ROCKi ikke brukes riktig under de tidlige dissociation og differensieringstrinnene. Bruken av ROCKi og dens trinnvise reduksjon under 50% strømmer i løpet av de første 7-10 dagene er avgjørende for konsekvente SFEBer av høy kvalitet.
I tillegg er det ofte nyttig som et valideringstrinn for å sjekke resultater i 3D SFEBer med de som observeres i samme cellelinjer opprettet ved hjelp av en monolagspreparasjon. UnderstaNding hvordan de to systemene kryss-sammenligner innenfor hver eksperimentell kohorte er ekstremt nyttig for å forstå kompleksiteten til en gitt sykdomsmodell. Til slutt kan SFEBs brukes til å sortere og rense cellepopulasjoner ved hjelp av fluorescerende aktivert celle sortering for videre studier i et mer homogent 2D monosjikt system 16 .
Ikke desto mindre er SFEBer opprettet ved hjelp av denne protokollen nyttige for å studere små utviklingskortiske kretser. Fremtidige bruksområder av denne teknikken involverer multiplexing elektrofysiologiske opptak med høyinnholdstilnærminger. Faktisk er cellekammerinnsatser produsert for bruk i 96-brønn plateformat. Disse innleggene kan brukes med SFEB-protokollen beskrevet her i stedet for 6-brønninnsatsene. For å vise skalerbarhet ved hjelp av denne metoden, må SFEBer opprettes ved hjelp av flere linjer og kloner i en gitt kohort og må screenes på tvers av et sett robuste cellebaserte analyser for å lete etter konsistens wiTynne kulturer. For eksempel kan neuronale tall, morfologi og lagutvikling kan bli analysert ved bruk av et 96-brønnsformat. Ideelt sett bør cellebaserte analyser kombineres med et høyt innholds-elektrofysiologisk analys som MEA, som også skaleres til 96-brønnsplater.
Denne SFEB-plattformen har et løfte om å dechiffrere rollen som tidlig cortical nettverksutvikling i nevrologiske lidelser, særlig i tilfeller der det er mulig interaksjon mellom genetikk og tidlig nevrale utvikling. Vi har vist at det kan behandles mye som en skivekultur som vist i rotte- og musestudier. Nyttige fremtidige studier ved hjelp av dette systemet bør sitte på utviklingsrelatert komparativ anatomi og fysiologi mellom in vivo strukturer av mus og SFEB. Denne komparative data ville være svært kraftig i å utvikle et virkelig translationssystem for narkotikaforskning og grunnforskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Vi takker Elizabeth Benevides for korrekturlesing av artikkelen. Vi takker Drs. John Hussman og Gene Blatt for deres nyttige diskusjoner og kommentarer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
