Summary
Hier rapporteren we een protocol voor het ontwikkelen van een driedimensionaal (3-D) systeem van humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs), het serumvrije embryoïde lichaam (SFEB) genoemd. Dit 3-D model kan gebruikt worden als een organotypische plakcultuur om menselijke corticale ontwikkeling te modelleren en voor de fysiologische ondervraging van neurale ontwikkelingen.
Abstract
Hoewel een aantal in vitro ziekte modellen is ontwikkeld met behulp van hiPSCs, is één beperking dat deze tweedimensionale (2-D) systemen niet de onderliggende cytoarchitectural en functionele complexiteit van de getroffen personen kunnen voorstellen die vermoedelijke ziektevarianten dragen. Conventionele 2-D modellen blijven onvolledige representaties van in vivo- achtige structuren en behalen de complexiteit van de hersenen niet voldoende. Zo is er een opkomende behoefte aan meer 3-D hiPSC-gebaseerde modellen die de cellulaire interacties en functies die in een in vivo systeem worden gezien, beter kunnen herkapituleren.
Hier rapporteren we een protocol om een 3-D systeem te ontwikkelen van ongedifferentieerde hiPSCs op basis van het serumvrije embryoidlichaam (SFEB). Dit 3-D model weerspiegelt aspecten van een ontwikkelde geventraliseerde neocortex en maakt het mogelijk om te onderzoeken naar functies die integreren in levende neurale cellen en intact weefsel zoals migratie, connectiviteit, communicatie en matUUR. Specifiek wijzen wij aan dat de SFEB's die ons protocol gebruiken kunnen worden ondervraagd met behulp van fysiologisch relevante en hoogwaardige cel gebaseerde assays, zoals calciumbeelden en multi-electrode array (MEA) opnames zonder cryosectie. In het geval van MEA-opnamen tonen we aan dat SFEB's zowel spijkeractiviteit als netwerkbreukactiviteit verhogen tijdens de lange termijn cultuur. Dit SFEB protocol biedt een robuust en schaalbaar systeem voor de studie van het ontwikkelen van netwerkvorming in een 3-D model dat aspecten van de vroege corticale ontwikkeling vastlegt.
Introduction
We hebben eerder een 3-D model systeem gemeld, geproduceerd door patiëntgerelateerde door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSCs) die sommige aspecten van de vroege corticale netwerkontwikkeling 1 herhaalt. Dit 3-D model, een serumvrij embryoidlichaam (SFEB), verbetert bij eerdere eenvoudige aggregatie hiPSC modellen 2 , 3 . Een groeiend werkstuk laat zien dat 3-D structuren zoals onze SFEB's, benaderende aspecten van neurale ontwikkeling die in vivo en op een vroeger tijdstip algemeen waargenomen worden, dan waargenomen in 2-D-dimensionale (2-D) / monolaag hiPSC modellen 4 , 5 . Initiële studies zijn gericht op de zelf-organiserende complexiteit van 3-D lichamen zonder hun fysiologische complexiteit 2 aan te tonen .
Het hier beschreven protocol is toegepast op ongedifferentieerde hiPSCs afgeleid van fibroblasten en Perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's). Deze cellen worden gehandhaafd op y-bestraalde muis embryonale voeders (MEF's). Deze hiPSC kolonies worden handmatig gereinigd van spontaan gedifferentieerde cellen, enzymatisch geoogst en geresuspendeerd in medium dat Rho-Kinase inhibitor Y-27632 (ROCKi) bevat. Niet-gedifferentieerde hiPSC's worden onderworpen aan dissociatie en centrifugatie voordat ze worden overgebracht naar 96-putjes met lage hechting V-bodemplaten. Na plating wordt neurale inductie ingeleid door gebruik te maken van dubbele SMAD remming (SB431542 en LDN193189, samen met dickkopf 1 (DKK-1)) om een neuronale-afwijking van anterior-frontale voorhoofd 6 te leiden . Na 14 dagen worden de SFEB's overgebracht naar celkweekinzetten in een 6-putjesplaat. Eenmaal overgebracht, beginnen de ronde SFEB's te verspreiden en dunken, terwijl lokale netwerkverbindingen worden gehandhaafd, zoals vaak wordt waargenomen in hippocampale organotypische plakcultuurpreparaten onder gebruikmaking van vergelijkbare celkweekinzetten 1 ,Ss = "xref"> 7.
Het gebruik van een SFEB-gebaseerd 3-D-platform in dit formaat is vatbaar voor de efficiënte productie van corticale netwerken die geïnterviewd kunnen worden met behulp van cel gebaseerde fysiologische analyses, zoals calciumbeeldvorming of elektrofysiologische analyses, zoals single-cell opnames of multi-electrode array (MEA ) 1 . Hoewel 3-D-systemen de markers van vroege corticale ontwikkeling dragen, hebben andere studies aangetoond dat deze 3-D-lichamen langer incubatietijden nodig hebben om het inherent langzamere tempo van de ontwikkeling van menselijk weefsel te kunnen veroorzaken 8 . Dit SFEB protocol genereert succesvol 3-D SFEB's van ongedifferentieerde hiPSCs die aspecten van de vroege ontwikkeling van de cortex vastleggen.
Het potentieel van SFEB's om netwerkafwijkingen in neurologische aandoeningen te modelleren is een kracht van dit systeem. De hiPSC's afgeleid van patiëntweefsel kunnen worden gekweekt in cellen van het zenuwstelsel dat onderworpen zijn aan ezelAys die betrekking hebben op celbiologie evenals gelijktijdige genexpressie. Menselijke iPSC's worden gebruikt om het genetische profiel van grote groepen individuen met verschillende neurologische aandoeningen te bepalen met complexe etiologieën zoals autisme spectrum stoornis (ASD), schizofrenie 9 , Rett syndroom 10 en de ziekte van Alzheimer 11 , 12 . Tot voor kort waren iPSC-modellen typisch monolaagpreparaten die, hoewel geschikt voor het evalueren van moleculaire interacties, onvoldoende waren in het ontcijferen van de complexe cellulaire interacties die in vivo werden gezien. Diermodellen zijn de standaardvervanger voor het herstellen van het hele orgelplatform. Deze diermodellen worden geplaagd door een slechte vertaling van bevindingen en hebben een beperkte mogelijkheid om menselijke genetische profielen te identificeren die zijn geïdentificeerd door grote genetische screeningsstudies. Zo voegt de ontwikkeling van 3-D systemen van iPSCs een vereiste laag van complexiteit in het menselijk toeZiekte modelleren 13 , 14 . De volgende stap voor 3D-hiPSC-platforms is om de grote schaalvereisten van high-throughput screening op te vangen met behulp van cel gebaseerde assays 15 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Generatie van neurale progenitorcellen
- Houd hiPSC's afkomstig van fibroblasten en PBMC's in 6-putjesplaten op een y-bestraalde membraanvoeder (MEF) cellaag in humaan iPSC-medium aangevuld met kleine moleculen (zie de Material Table).
OPMERKING: Dagelijks onderhoud is een gewijzigde versie van eerder gemelde procedures 1 , 16 .- Plaat 6 x 10 5 MEF's op elke putje van een 6-putje weefselkweekgraadplaat in 300 μl / well aanbevolen medium (volgens fabrikantprotocol).
- Na 48 uur vervang MEF's medium met 300 μL / well hiPSC medium gedurende 1 uur voordat u hiPSCs toevoegt.
- Droog de hiPSCs snel in een waterbad van 37 ° C en voeg druppelgewijs 1 ml hiPSC-medium langzaam toe. Plaats de hiPSCs en het medium in een 15 ml conische buis. Voeg medium toe om het totale volume tot 5 ml te brengen. Centrifugeer gedurende 4 minuten bij 129 xg, aspireer de supernataNt, zet de pellet voorzichtig op in 1 mL hiPSC medium met ROCK inhibitor bij 1: 1000 concentratie.
- Plaat de celsuspensie (meestal gezaaid met 300.000 cellen / putje) op de MEF cellaag en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2, 95% vochtigheid.
- Monitor de iPSC cultuur nauw met behulp van een lichtmicroscoop. Verwijder na 48 uur culturen die ongelijke randen hebben, zijn gegroeid tot cystisch of verschijnen geelbruin onder de lichtmicroscoop om spontane differentiatie te minimaliseren.
OPMERKING: Na 7 - 10 dagen zouden hiPSC kolonies moeten vormen. Kolonies zouden rond moeten zijn, met duidelijk gedefinieerde grenzen en uniforme celdichtheid en zonder losse, niet-uniforme cellen. - Selecteer handmatig ronde hiPSC kolonies om de cultuur van spontaan gedifferentieerde cellen te wissen. Vergroot de kolonies door ze op verse MEF-lagen te plaatsen. Vergroot 1: 3 elke 7 dagen wanneer culturen in de buurt van samenvloeiing en bevriezen 1 , 16 .
- Na uitbreiding en bevriezing van cellen (voor back-up), groei hiPSC kolonies op platen tot ze 50 tot 75% samenvloeiing bereiken.
- Zeven dagen postplating, gebruik een milde enzymatische behandeling (5-10 minuten met 300 μL enzymoplossing) en zachte trituratie (2-4 keer met een 1000 μL pipet) om hiPSC's te ophalen en voorbereiden op neurale precursorcel-differentiatie.
- Centrifugeer de cel suspensie bij 129 xg gedurende 4 minuten, aspirateer de supernatant en resuspendeer de pellet in 5 ml menselijk iPSC medium. Zet de celsuspensie over op een 0,1% gelatine beklede 5 cm celcultuurschotel gedurende 1 uur bij 37 ° C om MEF's te elimineren en de hiPSC-opbrengst te maximaliseren. Breng het medium (met niet-aanhechtende cellen) over op een andere 5 cm gelatine gecoate schotel.
- Breng de niet-aanhechtende cellen over op een 15 ml centrifugebuis met behulp van een transferpipet. Spoel de platen voorzichtig af met 3 ml medium en voeg deze toe aan de 15 ml buis.
- Centrifugeer de cel suspensie bij 129 xg gedurende 4 minuten, aspireren de superNatant, en verzacht de pellet zachtjes in medium. Bepaal de celtelling met behulp van een geautomatiseerde celteller. Platte 9.000 cellen / putje in een 96-putjes met lage hechting V-bodemplaat.
- Centrifugeer de plaat bij 163 xg gedurende 3 minuten. Incubeer de plaat bij 37 ° C, 95% vochtigheid en 5% CO2. Gebruik een pipet met 50% medium om de andere dag te veranderen door de helft van het medium te verwijderen en gedurende 14 dagen met vers chemisch gedefinieerd differentierend medium 1 (DM1, Figuur 1 , Tabel) te vervangen.
2. Inductie van de Serumvrije Embryoidlichaam (SFEB) ( Figuur 2 )
- Plaats 40 μm celkweekinzetten in 6-putjesplaten en voeg 1 ml DM1-medium tenminste 1 uur voorafgaand aan de toevoeging van aggregaten toe.
- Op dag 14 overdragen de aggregaten met 20 μl medium met behulp van een 200 μL brede mondpunt op 40 μm celkweekinzetten en verander het medium naar DM2.
7 , 17 , 18 .- Verplaats 4-6 aggregaten naar een celkweekinzet en laat voldoende ruimte tussen de aggregaten. Verwijder zoveel mogelijk overmaat oplossing met een fijne pipet tip ( bijv. 200 μL tip).
OPMERKING: Het is aanvaardbaar om de SFEB kortstondig te storen, aangezien ze op de celcultuurinzet zullen bewegen, aangezien de oplossing van de SFEB's verwijderd is. - Handhaaf de kweken in 1 ml DM2 bij 37 ° C, 95% vochtigheid en 5% CO2. Gebruik een pipet, verander 75%Middelmatig elke andere dag door drie kwartier van het medium te verwijderen en te vervangen door drie kwartier vers medium. Verwijder bijvoorbeeld 750 μl medium en voeg 750 μL vers medium toe.
- Verplaats 4-6 aggregaten naar een celkweekinzet en laat voldoende ruimte tussen de aggregaten. Verwijder zoveel mogelijk overmaat oplossing met een fijne pipet tip ( bijv. 200 μL tip).
- Na 14 dagen cultuur, overstappen naar DM3 medium met 75% gemiddelde verandering elke andere dag en nog eens 16 dagen.
- Om de SFEB's op celcultuurinzetten te handhaven na 30 dagen, verander het medium elke andere dag gedurende 60, 90 en 120 dagen.
OPMERKING: De SFEBs zullen groeien tot ongeveer 1000 μm in diameter en zijn typisch 100-150 μm dik 1 .
3. Bepaling van SFEB-samenstelling
- Verwijder de SFEB's uit het inzetstuk door zacht pipetterend medium met behulp van een 200 μL brede mondpipetpunt. Om de SFEB's over te brengen, gebruik een brede mondpipetpunt om de lichamen zachtjes in de pipetpunt te zuigen. Na het laden van SFEB in de pipettaart, zachtjes overbrengen naar platen met 12 putjes en wassen met 300 μL fosfaat gebufferde zoutoplossing(PBS) per putje.
OPMERKING: SFEB's worden opgeschort in oplossing in de 12-putjesplaten. Dit is belangrijk om de volledige penetratie van het fixatief, de blokkerende oplossing en antilichamen mogelijk te maken. Als u meerdere SFEB's gebruikt voor het vullen, kunnen maximaal 10 SFEB's per putje van een 12-putjesplaat worden toegevoegd. Dit bespaart oplossingen en antilichamen. - Fix SFEB's met 300 μL per putje 4% paraformaldehyde bij kamertemperatuur gedurende 30-45 min. Was SFEB's tweemaal met 300 μL PBS, 3-5 minuten per was.
Voorzichtigheid: Draag geschikte persoonlijke beschermende uitrusting bij het hanteren van paraformaldehyde.
OPMERKING: Probe voor immunoreactiviteit aan markers om volwassenheid, celtype, enz. Te bepalen. Voor het markeren van neuronen in deze studie werd kuik-Tuj1 gebruikt om 1: 500, voor extra markers zie tabel 2 en referenties 1 , 16 . - Permeabiliseren en blokkeren met 0,1% Triton-X100 in PBS en 10% normaal ezelserum (blokkerende oplossing; 300 μl; L per putje) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de blokkerende oplossing en behandel SFEB's met 300 μL primaire antilichamen in blokkerende oplossing. Incuberen bij 4 ° C overnacht. Was SFEB's driemaal (3-5 minuten per was) in 300 μL PBS die 0,1% Triton-X bevat.
- Bereid secundaire antilichamen 1: 1000 in blokkerende oplossing. Incubeer SFEB's gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met secundaire antilichamen. Was SFEB's met 300 μL PBS, 3 keer voor 3-5 minuten elk.
OPMERKING: SFEB's kunnen op dit moment worden voorbereid voor beeldvorming. - Naar beeld, pipet SFEB's op een glazen glijbaan met behulp van een brede boorpipet. Verwijder de overtollige oplossing rond de SFEB met behulp van zachte zuigkracht.
OPMERKING: Voor soortgelijke kleuringstoestanden kunnen meerdere SFEB's op dezelfde glazen glijbaan worden geplaatst. - Voeg een druppel montagemedium op de SFEBs toe, plaats een glazen deklip en druk voorzichtig om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen zijn. Laat het montagemedium verharden en ga verder naar beeldvorming en kwantificering (stap 3.8).
- Voer celkwantificatie uit door meerdere regio's van belangstelling (ROI) over de SFEB te nemen en gebruik een z-stapel gecombineerd met een maximale projectiebeeld via elke ROI op een standaard confocale microscoop zoals beschreven in referenties 1 , 16 .
OPMERKING: Hele SFEB's kunnen worden gekwantificeerd met behulp van beeldgebaseerde tegels (zie referenties 1 , 16 voor details). Aangezien de SFEB's dunne zijn tot ongeveer 100 μm, is er minimale verstrooiing van licht in het weefsel en dus is er geen behoefte aan 2-foton microscopie. Eerder gebruik van dit protocol met fibroblast-afgeleide iPSC's produceerde een SFEB-noodlotkaart dat complexe en uiteenlopende structuur met subpopulaties van interneuronen met transcriptie-identiteiten onthulde die lijken op CGE en anterior forebrain fates 1 , 16.
4. Neuronale activiteit opnemen in SFEB's met behulp van MEA's
- Bereid 12-putjes MEA borden volgens de instructies van de fabrikant.
- Was de MEA platen 3 maal gedurende 5 minuten met steriel H2O onder aseptische omstandigheden te reinigen. Was gedurende 5 minuten met 75% ethanol en dan met 100% ethanol om de plaat te steriliseren.
- Bak de plaat gedurende 4-5 uur bij 50 ° C in een oven om het sterilisatieproces te voltooien.
- Voeg 500 μL 0,2% polyethyleenimine oplossing (PEI) toe aan elke put en incubeer 1 uur bij kamertemperatuur. Aspireren PEI en was de putjes 4x met steriel gedestilleerd H2O droging in de zuurkast gedurende de nacht.
- Bereid een 20 μL / ml oplossing van laminine in L15 medium en voeg 10 μL laminine in het midden van elke put.
OPMERKING: Niet de omliggende referentie- en aardingselektroden bedekken. - Voeg steriele dH 2 O tot het omringende medium reservoirs of laminine verdamping te voorkomen.Incubeer de plaat gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Voeg SFEB's (zie rubrieken 1 en 2) toe aan de laminine-gecoate MEA-platen door ze zachtjes in een brede mondpipetpunt te zuigen en over te brengen. Voeg 200 ul DM2 medium aan elk putje en incubeer gedurende de nacht bij 37 ° C, 95% vochtigheid en 5% CO2.
- Voeg een extra 200 μl medium na 24 uur toe en laat het gedurende 30 minuten bij 37 ° C, 95% vochtigheid, 5% CO 2 herstellen alvorens de plaat te lezen.
- Plaats de MEA-plaat in de plaatlezer (voorverwarmd tot 37 ° C) om neuronale activiteit op te nemen. Record activiteit gedurende 10 minuten met de bijbehorende MEA opname software. Zie referentie 19 voor details.
- Genereer ruwe data-continue stromen en raster plots neuronale activiteit met behulp van statistische analyse software 19 .
OPMERKING: MEA opnames worden 7 dagen na SFEB plating genomen. Voor deze studie werden opnamen genomen gedurende 10 minuten om netwerkbreukactiviteit, conTrage trace en raster plots. SFEB's kunnen langdurig op MEA-platen worden gehandhaafd en kunnen over langere tijdsperioden worden opgeslagen met behulp van milieu-gecontroleerde omstandigheden ( Figuur 6 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SFEB's gegroeid met behulp van onze techniek, leverden weefsel met morfologische eigenschappen op, die lijken op een vroegtijdige ontwikkelende corticale subventriculaire zone vol met uitgebreide Tuj1-positieve neuronen, evenals neurale voorvaders ( Figuur 3A ). Tal van ontwikkelende corticale rozetten werden waargenomen in de buitenste lagen en binnenste lagen van het SFEB ( Figuur 3B ). De buitenste rand van het SFEB lijkt op een ontwikkelende corticale plaat die postmitotische neuronen bevat. Dit wordt ondersteund door de expressie van Brn2, een marker voor neurale voorvaders in de meest geventraliseerde buitenste corticale lagen. Reelin-positieve cellen die Cajal-Retzius-cellen of hun stamvogens kunnen zijn, die uitgedrukt worden in de buitenste lagen van de ontwikkelende cortex, worden ook waargenomen in SFEB's ( Figuur 3C ). SFEB's die worden gegroeid met behulp van deze protocol express markers consistent met een gemengde caudale (CGE) en mediale ganglioNic eminence (MGE) oorsprong. Cellen die de CGE-marker Couptf2 uitdrukken en andere cellen die MGE-merker Nkx2.1 uitdrukken, kunnen in de culturen waargenomen worden ( Figuur 3D ). Dit kan mede worden veroorzaakt door het gebruik van DKK-1 in het protocol, dat is gebleken om mediale fates te verbeteren 20 .
SFEB's gemaakt met behulp van dit protocol leveren zowel calretinine- als calbindine-positieve interneuronen ( Figuur 4A ) evenals VGLUT positieve excitatoire neuronen en Tbr1-positieve glutamatergische neurale voorloperen ( Figuur 4B ). Gemiddeld hebben we vastgesteld dat 61% van de totale cellen in SFEB's VGLUT positief zijn en 43% zijn Tbr1-positief ( Figuur 4C ). Dit is consistent met andere rapporten met soortgelijke protocollen 21 . Daarnaast kunnen SFEB's onderworpen zijn aan fysiologische analyses zoals het gebruik van levende cellen calciumbeeldenMarkers zoals Fluo-4, om neurale netwerkfunctie in een meer fysiologisch relevante omgeving te waarnemen ( Figuur 5 ). SFEB's kunnen langdurig aan MEA-opnamen worden onderworpen en tonen de ontwikkeling van corticale netwerkniveau-barsten ( Figuur 6 ).
Figuur 1: Schematische uiteenzetting van de vroege stappen bij het voorbereiden van SFEB's. Nadat iPSC's zijn geoogst met behulp van een enzymatische dissociatie, worden ze geplateerd in 96-putjesplaten en gecentrifugeerd bij 163 xg gedurende 3 minuten om snelle aggregatie te veroorzaken. Na 14 dagen in vitro (DIV) celaggregaten kunnen worden overgebracht van 96-putjes platen via breedboring pipetten op 6-putjes platen met celkweekinzet. Klik hier om naar viEen grotere versie van deze figuur.
Figuur 2: Tijdlijn van gemiddelde veranderingen en fasen tijdens SFEB groei en uitbreiding. Nadat SFEB's zijn overgebracht naar inserts, gaan ze onder twee gemiddelde veranderingen om 14 en 28 dagen in vitro (DIV). Ze worden meestal geoogst voor experimenten bij DIV 30, 60 en 90. Boveninvoetjes tonen verschillende fasen in dit proces. Schaalstaven = 1.000 μm (ver links); 1000 μm (DIV 20); 600 μm (DIV 30); 300 μm (single SFEB). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Algemene morfologische karakteristiekenTics van SFEBs die op grond van dit protocol worden opgewekt. ( A ) Typische buitenrand van een SFEB die de voorloper nestin (groen) uitmaakt, de postmittotische neurale marker Tuj1 (rood) en de nucleaire vlek (blauw). ( B ) SFEB's tonen karakteristieke corticale rozetten in zowel de buitenste lagen (links beeld) als binnenste lagen (rechts). Zij drukken zowel voorloper als volwassen neuronale markers uit. ( C ) Een representatieve buitenrand van een SFEB die de buitenste laag / corticale plaatmarkering Brn2 (groen) en de ontwikkelende CGE-marker Couptf2 (rood) uitmaakt. ( D ) SFEB's gemaakt met behulp van dit protocol vertegenwoordigen geventraliseerde neocortische structuren zoals gezien door Pax6 (rode) kleur- en expressmarkeringen die overeenkomen met sommige MGE-oorsprong, zoals Nxk2.1 (rood). Schaalstang = 40 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Beelden van belangrijke neuronale celsoorten in SFEB's. ( A ) Sommige neuronen in SFEB's drukken markers overeen met corticale interneuronen zoals calbindin (groen, links beeld) en calretinine (groen, rechts beeld). ( B ) SFEB's tonen VGLUT-1 positieve glutamatergische neuronen (rood, links beeld) en glutamatergische stamvaders die Tbr1 uitdrukken (rood, rechts beeld). Schaalstang = 40 μm. ( C ) Typische opbrengsten van excitatoire neuronen die VGLUT-1 of Tbr1 uitdrukken (foutbalk = SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Live-Calcium Opnamen. </ Strong> (linker afbeelding) Representatieve buitenkant SFEB behandeld met Fluo-4, een neuronale calcium indicator. Cellen zijn gemarkeerd voor het meten van spontane calcium transiënten (diverse kleurdozen). (Rechts beeld) Geselecteerde cellen die spontane calciumtransiënten aantonen die worden gekenmerkt door rode dozen (bovenste sporen) of groene dozen (onderste sporen). Schaalstang = 40 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Multi-electrode array opnames van SFEB's. (Top) Representatief beeld van SFEB bevestigd aan een MEA plaat (Scale bar = 100 μm). (Midden en onder) SFEB's kunnen over lange tijd op MEA's worden opgenomen en rijping tonen. (Midden en onder; links) Een brede burstkaart van 3 SFEB's op 3 putjes van een 12-putjes MEA-plaat, donkerdere kleuren vertegenwoordigen een hogere totale spijkeractiviteit die tussen dag 30 en dag 90 stijgt. (Midden en bodem; inzetstukken) De cumulatieve activiteitskaart toont een stijging van de piekdichtheid en het gebied van pieken binnen corticale netwerken in SFEB's tussen Dag 30 en dag 90. (midden en onder, rechts) rauwe sporen (bovenste) en heel-well raster plots (onderste) tonen een toename van het aantal spikes en het aantal barsten over de tijd; Indicatief voor sterkere netwerkvorming in SFEB's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Antilichaam | Verdunning | Soorten |
| Nestin | 0,111111111 | Muis |
| Brn-2 | 0,388888.889 | Konijn |
| VGLUT1 | 0,111111111 | Konijn |
| Pax6 | 0.25 | Konijn |
| calretinin | 0,180555556 | Konijn |
| Calbindin | 0,319444444 | Konijn |
| CoupTFII | 0,180555556 | Muis |
| Nkx 2.1 | 0,180555556 | Konijn |
| Tuj1 | 0,388888889 | Kip |
| Reelin | 0,388888889 | Muis |
| Tbr1 | 0,180555556 | Kip |
| NFH | 0.25 | Muis |
Tabel 1: Antilichamen gebruikt in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hier beschreven protocol geeft de voorwaarden om een hiPSC bron te differentiëren in een 3-D structuur die een vroeg stadium van ontwikkeling van de frontale cortex recapituleert. Deze procedure levert structuren op die kunnen worden ondervraagd voor elektrofysiologie, terwijl ze ook voor microscopie vatbaar zijn. De uiteindelijke morfologie van het SFEB lijkt op die van organotypische breinschijfculturen en zorgt voor hoge kwaliteit gedetailleerde confocal beeldvorming. Dit protocol kan SFEB's succesvol genereren uit zowel fibroblast als perifere bloed mononucleaire cel-afgeleide hiPSC's. SFEB's gemaakt uit perifere bloedmononucleaire cel afgeleide hiPSC's vertoont soortgelijke morfologische kenmerken als die welke zijn gemaakt uit fibroblast afgeleide hiPSCs.
Dit proces, zoals andere 3-D-schema's, maakt gebruik van kleine molecuul extracellulaire signalen om de beslissingen van het celschip te begeleiden. Dit wordt gecombineerd met de intrinsieke eigenschappen van het cel-naar-celcontact, waardoor een realistischer omgeving voor net wordt gecreëerdWerkvorming en neuronale functie. Andere rapporten hebben aangetoond dat de juiste combinatie van de extracellulaire signalen van kleine molecules voldoende is voor dergelijke beslissingen in het celgeval, zoals midbrain dopaminergische 8 , 22 en corticale interneuronen 8 , 16 , 23 . Echter, 3-D systemen vertoonden een versnelde rijpingstijd in vergelijking met 2-D equivalenten 5 . Bij voldoende tijd hebben de 3-D culturen een verhoogde rijpheid getoond. Dergelijke kwaliteiten maken sterke argumenten voor het nut van de 3-D platforms, zoals de SFEB. Het extra voordeel van live en hoge kwaliteit microscopie, samen met de flexibiliteit van bronmateriaal, maken dwingende argumenten voor dit protocol.
Daarnaast delen SFEB's gemaakt met dit protocol een aantal overeenkomsten met andere gerapporteerde studies 13 , 24 . Met betrekking tot referentie 24 , prevalent dit protocol en de fysiologische validatie van de neuronen. Bijvoorbeeld, de studies die in referenties 13 , 24 zijn gerapporteerd, gebruiken vergelijkbare versies van dubbele SMAD remming om corticale neuronen af te leiden en een vergelijkbaar deel van glutamatergische neuronen en voorlopers (~ 50%) verkregen. Bovendien, Mariani, J. et al. (Verwijzing 13 ) rapporteer soortgelijke Pax6- en Nestin-kleuring als dit protocol bij een 25-30 dagen tijdspunt. Kwalitatief zijn de vlekkenpatronen voor Brn2 evenals de expressie van GFAP-positieve astrocyten vergelijkbaar met die welke in referentie 24 worden vermeld . Dit protocol heeft echter een aantal voordelen ten opzichte van de twee veelgebruikte organoïde methodologieën. Ten eerste, Mariani, J. et al. 13 rapporteren de ontwikkeling van Dlx positieve interneuronen op dag 50 en conVersterkt alleen door immunostaining methoden. Met behulp van dit protocol produceren Dlx positieve interneuronen op dag 30. Deze interneuronen werden bevestigd als functioneel door single-cel elektrofysiologie en single-cell farmacologische toepassing van GABA 16 . Daarnaast claimen de auteurs van 13 functionele connectiviteit van neuronen, maar het werd alleen bepaald met behulp van kleuring. SFEB's gemaakt met behulp van dit protocol zijn onderworpen aan netwerk-elektrode stimulatie en calciumbeelden om aan te tonen dat ontwikkelende corticale netwerken verbonden en functioneel zijn. Pasca, et al. 24 sectie de aggregaten met behulp van een cryostat om opnames van organoid-achtige structuren te verkrijgen. SFEB's gemaakt met dit protocol hebben geen sectie nodig en kunnen direct opgenomen worden in de inzetstukken 1 . Neuronen opgenomen uit niet-gescheiden SFEB's zijn aangetoond dat ze actiepotenties hebben en remmende postsynaptische potenties na sorteringG 1 , 16 .
SFEB's kunnen gemaakt worden met gebruikmaking van zowel fibroblasten als PBMC's als uitgangsmateriaal. Het is ook mogelijk om andere weefsels te gebruiken die leiden tot hiPSCs (bijv. Tandpulp, voorhuid, urine) 25 , 26 , 27 , hoewel sommige kleine moleculen mogelijk moeten worden gewijzigd om soortgelijke resultaten te verkrijgen. Voor dit protocol is het gebruik van DKK-1 belangrijk bij het rijden van het SFEB naar een geventraliseerd lot 28 . Deze ventralisatie is gedeeltelijk verantwoordelijk voor de differentiatie van interneuronen met CGE-achtige oorsprong 16 . DKK-1 is een duur klein molecuul en daarom kunnen hoge concentraties sonic hedgehog worden gebruikt om DKK-1 in dit protocol te aanvullen. De concentraties voor Wnt-remming via DKK-1 moeten echter empirisch door de eindgebruiker worden bepaald. Daarnaast XAV939, een andere Wnt inhibitoR, kan worden gebruikt om de differentiatie naar een geventraliseerd lot te helpen, hoewel het gebruik van deze remmer weefsel levert dat transcriptie-identiteiten deelt met de MGE 23 .
Bij het ontwikkelen van 3D hiPSC-cultuursystemen zoals de SFEB's beschreven in dit protocol, is het belangrijk om in gedachten te houden dat deze structuren een matige hoeveelheid heterogeniteit van cultuur naar cultuur opleveren. Dit komt mede door de stochastische aard van neuronale differentiatie van iPSCs en door cel-celcontactinitiatie in het SFEB, wat leidt tot spontane intrinsieke zelforganisatie 29 , 30 . Daarom is het belangrijk om de bruikbaarheid van deze techniek te interpreteren in het kader van heterogeniteit. Manieren om de impact van heterogeniteit in dit systeem te minimaliseren, omvatten het creëren van grote aantallen SFEB's zodat ze natuurlijke variatie in het systeem vertegenwoordigen, die streng houden aan de concentratie vanReagentia en het aantal cellen dat aan het begin van elke productiecyclus wordt geplant. Het is cruciaal om te beginnen met schone iPSC-kolonies en om minimale trituratie tijdens de enzymatische dissociatiestap toe te passen tijdens iPSC dissociatie om de levensvatbaarheid van de cellen te verhogen. Cell levensvatbaarheid na trituratie is een belangrijke factor bij het verkrijgen van hoge kwaliteit, consistente SFEB's. Als alternatief voor het oplossen van problemen, kan de levensvatbaarheid na de dissociatie en vóór de centrifugeringsstappen met behulp van trypan blauw worden gecontroleerd, indien nodig. Lewensvatbaarheid en spontane differentiatie kan ook worden aangetast als ROCKi niet correct wordt gebruikt tijdens de vroege dissociatie- en differentiatie stappen. Het gebruik van ROCKi en zijn stapsgewijze afname tijdens de 50% feeds gedurende de eerste 7-10 dagen is cruciaal voor consistente, hoge kwaliteit SFEB's.
Bovendien is het vaak nuttig als een validatie stap om resultaten in 3D SFEB's te controleren met die waargenomen in dezelfde cellijnen die zijn gemaakt met behulp van een monolayer voorbereiding. UnderstaNding hoe de twee systemen elkaar vergeleken binnen elke experimentele cohort is zeer nuttig om de complexiteit van een bepaald ziektemodel te begrijpen. Tenslotte kunnen SFEB's worden gebruikt om celpopulaties te sorteren en te zuiveren met behulp van fluorescerende geactiveerde celsortering voor verdere studie in een meer homogeen 2D monolagsysteem 16 .
Niettemin zijn SFEB's gemaakt met behulp van dit protocol nuttig voor het bestuderen van kleine ontwikkelende corticale schakelingen. Toekomstige toepassingen van deze techniek behelzen multiplexing elektrofysiologische opnamen met high-content benaderingen. Inderdaad, celkamerinzetten worden vervaardigd voor gebruik in 96-putjes plaatformaat. Deze inzetstukken kunnen worden gebruikt met het SFEB-protocol dat hier wordt beschreven in plaats van de 6-bronsinzetstukken. Om schaalbaarheid door deze methode te tonen, zullen SFEB's moeten worden gemaakt met behulp van meerdere lijnen en klonen binnen een bepaalde cohort en moeten worden gescreend op een reeks robuuste cellen gebaseerde analyses om te zoeken naar consistentie wiDunne culturen. Bijvoorbeeld, neuronale cijfers, morfologie en laagontwikkeling kan worden geanalyseerd met behulp van een 96-put formaat. Ideaal gezien dienen cellen gebaseerde assays te worden gecombineerd met een elektrofysiologische analyse met hoge inhoud, zoals het MEA, dat ook schaalbaar is op 96-putjes platen.
Dit SFEB-platform heeft de belofte om de rol van vroege corticale netwerkontwikkeling in neurologische aandoeningen te ontcijferen, met name in gevallen waarin een mogelijke interactie tussen genetica en vroege neurale ontwikkeling bestaat. We hebben aangetoond dat het veel kan worden behandeld als een plakcultuur zoals blijkt uit ratten- en muisstudies. Nuttige toekomstige studies die dit systeem gebruiken, moeten zich concentreren op ontwikkelingscomparatieve anatomie en fysiologie tussen in vivo structuren van de muis en de SFEB. Deze vergelijkende gegevens zouden zeer krachtig zijn bij het ontwikkelen van een echt translatiesysteem voor drug ontdekking en basisonderzoek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
We bedanken Elizabeth Benevides voor het proeflezen van het artikel. Wij danken Drs. John Hussman en Gene Blatt voor hun goede discussies en opmerkingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SFEB Neuronal Differentiation Cell culture Media. Reagents. Components | |||
| STEMdiff Neural Induction Medium (hiPSC Media) | STEMCELL Technologies | 0-5835 | 250 mL |
| PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media) | GlobalStem | GSM-2001 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM1 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 385 mL |
| Knockout Serum Replacement | Invitrogen | 10828028 | 20% 100 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution 10 mM (100x), liquid | Invitrogen | 11140050 | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol (1,000x), liquid | Invitrogen | 21985023 | 900 μL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM2 Media Components | |||
| D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1 | Invitrogen | 10565018 | 500 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| N-2 Supplement (100x), liquid | Invitrogen | 17502048 | 10 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DM3 Media Components | |||
| NEUROBASAL Medium (1x), liquid | Invitrogen | 21103049 | 500 mL |
| B-27 Supplement Minus Vitamin A (50x), liquid | Invitrogen | 12587010 | 10 mL |
| Glutamax 200 mM | Invitrogen | 35050061 | 5 mL |
| Pen/Strep | Invitrogen | 15140122 | 5 mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small Molecules | |||
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 2 μM |
| SB431542 | Stemgent | 04-0010-10 | 1:1,000 (10 μM) |
| Dorsomorphin | Stemgent | 04-0024 | 1 μM |
| LDN-193189 | Stemgent | 04-0074-10 | 250 nM |
| Y27632 (ROCKi) | Stemgent | 04-0012-10 | 10 μM |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant Protiens | |||
| DKK-1 | Peprotech | 120-30 | 200 ng/mL |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Components/Materials | |||
| Cell Culture inserts 0.4 μM, 30mm Diameter | Millicell | PICM0RG50 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | GlobalStem | GSC-6301G | |
| 96 well V bottom w/Lids | Evergreen | 222-8031-01V | |
| StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | ThermoFisher | A1110501 | |
| TritonX-100 | ThermoFisher | 85111 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | 10010023 | 500 mL |
| Normal Donkey Serum | Jackson Labs | 017-000-121 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | ThermoFisher | 11415114 | 500 mL |
| DRAQ5 (Nuclear Marker) | ThermoFisher | 65-0880-96 | |
| MEA Plates | Axion Biosystems | M768-GL1-30Pt200 | |
| 6 well flat bottom | Falcon | 353046 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibody | |||
| Nestin | Millipore | MAB5326 | |
| Brn-2 | Protein tech | 14596-1-AP | |
| VGLUT1 | Synaptic Systems | 135 303 | |
| Pax6 | abcam | ab5790 | |
| Calretinin | abcam | ab702 | |
| Calbindin | abcam | ab11426 | |
| CoupTFII | R&D Systems | PPH714700 | |
| Nkx 2.1 | abcam | ab12650 | |
| Tuj1 | abcam | ab41489 | |
| Reelin | Millipore | MAB5364 | |
| Tbr1 | Millipore | MAB2261 | |
| NFH | Dako | M0762 |
References
- Nestor, M. W., et al. Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks. Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Sasai, Y. Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture. Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).
- Song, S., Abbott, L. F. Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity. Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).
- Pre, D., et al. A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). PLoS One. 9 (7), e103418 (2014).
- Sproul, A. A., et al. Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors. PLoS One. 9 (1), e84547 (2014).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Nicholas, C. R., et al. Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development. Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).
- Cukier, H. N., et al. Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders. Mol Autism. 5 (1), (2014).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Choi, S. H., Tanzi, R. E. iPSCs to the rescue in Alzheimer's research. Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Mariani, J., et al. Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).
- Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease. Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies. Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).
- Nestor, M. W., et al. Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies. Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).
- Nestor, M. W., Hoffman, D. A. Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons. Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).
- Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs. J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).
- Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease. Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).
- Huang, S. M., et al. Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling. Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).
- Kriks, S., et al. Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease. Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).
- Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Yan, X., et al. iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).
- Wang, J., et al. Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions. Stem Cell Res Ther. 6, 223 (2015).
- Kwon, J., et al. Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts. Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency. Stem Cells Int. , 738910 (2012).
- Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics. Sci Rep. 5, 12617 (2015).
