Predicando silenciamento de genes através do controle Spatiotemporal da liberação de siRNA de Nanocarriers poliméricos com fotos
Summary
Apresentamos um novo método que usa copolímeros de blocos foto-responsivos para um controle spatiotemporal mais eficiente do silenciamento gênico sem efeitos detectáveis fora do alvo. Além disso, as mudanças na expressão gênica podem ser previstas usando ensaios diretos de liberação de siRNA e modelagem cinética simples.
Abstract
São necessários novos materiais e métodos para controlar melhor a ligação e a liberação de ácidos nucleicos para uma ampla gama de aplicações que requerem uma regulação precisa da atividade gênica. Em particular, os novos materiais responsivos aos estímulos com controle espaciotemporal melhorado sobre a expressão gênica destravam plataformas traduzíveis em tecnologias de descoberta de drogas e medicina regenerativa. Além disso, uma capacidade aprimorada para controlar a liberação de ácido nucleico a partir de materiais permitiria o desenvolvimento de métodos simplificados para prever a eficácia do nanocarrier a priori , levando a triagem acelerada dos veículos de entrega. Aqui, apresentamos um protocolo para prever a eficiência de silenciamento gênico e alcançar o controle espaciotemporal sobre a expressão gênica através de um sistema nanocarrier modificador fotossensível modular. O pequeno ARN de interferência (siRNA) é complexado com mPEG- b- poli (metacrilato de 5- (3- (amino) propoxi) -2-nitrobenzilo) (mPEG- b- P (APNBMA)) paraRm estabilidade nanocarriers que podem ser controlados com luz para facilitar sintonizável, on / off siRNA libertação. Descrevemos dois ensaios complementares que utilizam espectroscopia de correlação de fluorescência e eletroforese em gel para a quantificação precisa da liberação de siRNA a partir de soluções que imitam ambientes intracelulares. As informações obtidas a partir desses ensaios foram incorporadas em um modelo cinético simples de RNAi (RNAi) para prever as respostas de silenciamento dinâmico a várias condições de fotoestimulação. Por sua vez, essas condições de irradiação otimizadas permitiram o refinamento de um novo protocolo para controle espacial controlando o silenciamento gênico. Este método pode gerar padrões celulares na expressão de genes com resolução célula a célula e sem efeitos detectáveis fora do alvo. Em conjunto, nossa abordagem oferece um método fácil de usar para prever mudanças dinâmicas na expressão gênica e controlar com precisão a atividade de siRNA no espaço e no tempo. Este conjunto de ensaios pode ser facilmente adaptado para testar uma grande variedade de otSeus sistemas responsivos ao estímulo para abordar os principais desafios pertinentes a uma multiplicidade de aplicações em pesquisa biomédica e medicina.
Introduction
Os pequenos ARNs de interferência (siRNAs) medeiam o silenciamento de genes pós-transcrição através de uma via de RNAi catalítica que é altamente específica, potente e adaptada a praticamente qualquer gene alvo 1 . Essas características promissoras permitiram que a terapia com siRNA avançasse em ensaios clínicos em humanos para o tratamento de numerosas doenças, incluindo melanoma metastático e hemofilia 2 , 3 . No entanto, persistem persistentes problemas de entrega que prejudicaram a tradução 4 . Em particular, os veículos de entrega devem permanecer estáveis e proteger siRNAs de degradação extracelular, mas também liberar a carga útil no citoplasma 5 . Além disso, muitas aplicações de RNAi requerem métodos aprimorados para regular o silenciamento de genes no espaço e no tempo 6 , o que reduzirá os efeitos colaterais na terapêutica com siRNA 7 e possibilitará transformar aDvances em aplicações que vão desde microarrays celulares para a descoberta de drogas 8 até a modulação de respostas celulares em andaimes regenerativos 9 . Esses desafios destacam a necessidade de novos materiais e métodos para controlar melhor a ligação e a liberação nos nanocarriers de siRNA.
Uma das estratégias mais promissoras para controlar a liberação de siRNA e melhorar a regulação espaciotemporal é o uso de materiais sensíveis ao estímulo 10 . Por exemplo, uma grande variedade de biomateriais foram projetados com afinidade de ligação de ácido nucleico variável em resposta ao potencial redox ou pH alterado, ou campos magnéticos aplicados, ultra-som ou luz 11 . Embora muitos desses sistemas demonstrem um controle melhorado sobre a atividade do ácido nucleico, o uso da luz como gatilho é particularmente vantajoso devido à sua resposta temporal instantânea, resolução espacial precisa e facilidade de afinação <suP class = "xref"> 12. Além disso, o potencial das tecnologias sensíveis à foto para a regulação da expressão gênica foi demonstrado por sistemas de regulação induzível induciável e sistemas reguladores optogênicos de última geração; No entanto, esses sistemas sofrem de inúmeros desafios, incluindo capacidades limitadas para regular genes endógenos, preocupações de segurança, como imunogenicidade e dificuldades na entrega de conjuntos de componentes múltiplos 13 , 14 , 15 . Photo-responsive siRNA nanocarriers são ideais para superar essas desvantagens e proporcionar uma abordagem mais simples e mais robusta para spatiotemporally modular a expressão de genes 16 , 17 , 18 . Infelizmente, métodos para prever com precisão a resposta resultante da redução de proteína permanecem difíceis.
Um desafio fundamental é que as avaliações quantitativas da liberação de siRNA sãoRaro 19 , 20 , e mesmo quando essas avaliações são realizadas, elas não foram acopladas a análises da dinâmica de rotação de siRNA / proteína. Tanto a quantidade de siRNA liberada quanto a persistência / vida são determinantes importantes da dinâmica de silenciamento de genes resultante; Daí, a falta de tal informação é uma grande desconexão que impede uma previsão precisa de dose-resposta no RNAi 21 . Dirigir-se a este desafio agilizaria a formulação das relações estrutura-função apropriadas em nanocarriers e melhor informará os projetos de biomateriais 22 . Além disso, tais abordagens permitiriam o desenvolvimento de protocolos de dosagem de siARN mais eficazes. Na tentativa de entender a resposta dinamizante ao silenciamento, vários grupos investigaram modelos matemáticos de RNAi 23 , 24 , 25 . Esses quadros foramBem sucedido em fornecer informações sobre as mudanças mediadas pelo siRNA na expressão gênica e na identificação das etapas de limitação de taxa 26 . No entanto, esses modelos foram aplicados apenas aos sistemas comerciais de administração de genes ( por exemplo , Lipofectamina e polietilenimina (PEI)) que não são capazes de liberação de siRNA controlada e a complexidade dos modelos limitou severamente sua utilidade 27 . Essas deficiências destacam uma necessidade insatisfeita de novos materiais capazes de obter uma versão de siRNA sintonizável, combinada com modelos cinéticos preditivos simplificados e fáceis de usar.
Nosso método aborda todos esses desafios através da integração de uma plataforma de nanocarrier sensível à luz com métodos acoplados para quantificar siRNA e dinâmica de RNAi de modelo. Em particular, o lançamento de siRNA precisamente controlado da nossa plataforma 28 é monitorado por dois métodos complementares para quantificar com precisão encapsulado vs.SiRNA ligado. Os dados experimentais desses ensaios são inseridos em um modelo cinético simples para prever as eficiências de silenciamento de genes a priori 29 . Finalmente, a natureza on / off dos nanocarriers é facilmente explorada para gerar padrões de células na expressão gênica com controle espacial na escala de comprimento celular. Assim, este método fornece um método facilmente adaptável para controlar e prever o silenciamento de genes em uma variedade de aplicações que se beneficiarão da regulação espaciotemporal do comportamento celular.
Protocol
Representative Results
Discussion
Existem alguns passos no método que são particularmente críticos. Ao formular os nanocarriers, a ordem de adição de componentes e velocidade de mistura são dois parâmetros importantes que influenciam a eficácia 39 . Este protocolo requer que o componente catiónico, mPEG- b- P (APNBMA), seja adicionado ao componente aniónico, siARN, de forma gota a gota enquanto se agita com vortex. Dependendo do volume total da formulação, este processo de mistura leva 3-6 s. Para testar se o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) pelo apoio financeiro através de um Prêmio de Desenvolvimento Institucional (IDeA) sob o número de concessão P20GM103541, bem como o número de concessão P20GM10344615. As declarações aqui contidas não refletem as opiniões do NIH. Também reconhecemos o Delaware Biotechnology Institute (DBI) eo Delaware Economic Development Office (DEDO) para apoio financeiro através do prêmio Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) (12A00448).
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
References
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
- Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
- Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
- Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
- Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
- Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
- Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
- Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
- Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
- Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
- Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
- Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
- Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
- Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
- Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
- Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
- Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
- Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
- Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
- Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
- Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
- Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
- Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).
