我们提出了一种新方法，该方法利用光响应性嵌段共聚物实现高效的时间和空间基因沉默控制，且未检测到脱靶效应。此外，通过简单的siRNA释放实验和简化的动力学建模即可预测基因表达的变化。
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摘要
摘要
需要新的材料和方法来更好地控制结合过程 与 用于需要精确调控基因活性的多种应用中核酸的释放。特别是，具有改进的空间和时间控制能力的新型响应性材料将为药物发现和再生医学技术提供可转化的平台。此外，增强对材料中核酸释放的控制能力，将有助于开发简化的预测纳米载体功效的方法 先验的，从而加快递送载体的筛选。本文介绍了一种通过模块化光响应纳米载体系统预测基因沉默效率并实现基因表达时空控制的实验方案。小干扰RNA（siRNA）与mPEG-b-聚(5-(3-(氨基)丙氧基)-2-硝基苄基甲基丙烯酸酯) (mPEG-b-（APNBMA）聚合物形成稳定的纳米载体，可通过光调控实现可调的、开关式siRNA释放。我们提出了两种互补的检测方法，分别采用荧光相关光谱和凝胶电泳，用于精确量化模拟细胞内环境溶液中siRNA的释放情况。这些检测所获得的信息被整合到一个简化的RNA干扰（RNAi）动力学模型中，以预测在不同光刺激条件下基因沉默的动态响应。基于此，优化的照射条件进一步完善了一种用于时空控制基因沉默的新方案。该方法可实现单细胞分辨率的基因表达空间模式调控，且未检测到脱靶效应。综上所述，本方法提供了一种易于使用的策略，用于预测基因表达的动态变化，并在时间和空间上精确调控siRNA活性。这一系列检测方法可便捷地推广应用于测试多种其他刺激响应系统，以应对生物医学研究和临床医学中广泛存在的关键挑战。
引言
小干扰RNA（siRNAs）通过一种催化性RNA干扰通路介导转录后基因沉默，该通路具有高度特异性、高效性，并可针对几乎任何目的基因进行定制。1这些有前景的特性已推动siRNA疗法进入针对多种疾病（包括转移性黑色素瘤和血友病）的人体临床试验阶段。2,3然而，仍然存在显著的递送问题，阻碍了其转化应用4特别是递送载体必须保持稳定，并保护siRNA免受细胞外降解，同时还能将有效载荷释放到细胞质中5此外，许多RNAi应用需要更优的方法来在空间和时间上调控基因沉默6，这将减少siRNA治疗中的副作用7 并推动从用于药物发现的细胞微阵列到各类应用的变革性进展8 用于调控再生支架中的细胞反应9这些挑战凸显了开发新材料和新方法以更好地控制结合的必要性 与 siRNA 纳米载体中的释放
控制siRNA释放并增强时空调控的最有前景的策略之一是使用刺激响应性材料10。例如，已有多种生物材料....
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方案
1. siRNA 纳米载体的制备
- 分别配制等体积的 siRNA 和 mPEG-b-P(APNBMA) 溶液，用 pH 6.0 的 20 mM 4-(2-羟乙基)哌嗪-1-乙磺酸 (HEPES) 缓冲液稀释。
- 将 siRNA 加入 20 mM HEPES 溶液中，使其终浓度为 32 µg/mL。
注：本实验所用 siRNA 为非靶向性通用阴性对照序列；但也可根据需要设计为针对任何目的基因的 siRNA。 - 将 mPEG-b-P(APNBMA) 聚合物溶解于 20 mM HEPES 溶液中。加入适量 mPEG-b-P(APNBMA)，配制成 220 µg/mL 的溶液，使 N/P 比值（N 代表 mPEG-b-P(APNBMA) 上的胺基，P 代表 siRNA 上的磷酸基团）为 4。
注：mPEG-b-P(APNBMA) 聚合物的合成方法已在其他文献中报道30。
- 将 siRNA 加入 20 mM HEPES 溶液中，使其终浓度为 32 µg/mL。
- 在涡旋振荡器上轻轻混匀的同时，将 mPEG-b-P(APNBMA) 溶液逐滴加入等体积的 siRNA 溶液中。加完聚合物后继续涡旋振荡 30 秒。将样品置于室温避光条件下孵育 30 分钟。
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结果
纳米载体构建完成后，进行了siRNA释放实验，以确定后续实验中所采用的辐照条件 体外 转染实验中，采用不同剂量的光照以确定siRNA的释放百分比。第一项检测利用凝胶电泳将游离的siRNA分子与仍与聚合物结合/复合的siRNA分子分离。未经光照处理的纳米载体保持稳定，未释放任何siRNA。随着照射时间的延长，游离siRNA条带的荧光强度逐渐增强。通过图像分析软件对条带强度进行定量分析显示，经20分钟光照后，约有15%的siRNA被释放。
第二项siRNA释放实验采用FCS检测溶液中自由扩散的siRNA分子所占百分比。未暴露于光照的纳米载体样品的基线计数率与空白缓冲液对照样品相同，表明其中不存在游离siRNA。随着照射时间延长，基线计数率升高。计算得到的游离siRNA百分比与凝胶电泳测得的结果一致。通常，两种技术的测量结果在误差范围内相符（经Student's t检验，p >0.05），且表明siRNA释放百分比在照射时间超过20分.......
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讨论
该方法中有几个步骤尤为关键。在制备纳米载体时，组分添加顺序和混合速度是影响其效能的两个重要参数39。本方案要求将阳离子组分 mPEG-b-P(APNBMA) 在涡旋振荡条件下逐滴加入阴离子组分 siRNA 中。根据总体积的不同，该混合过程通常持续 3–6 秒。为检测纳米载体是否成功形成，可采用动态光散射等技术测定其粒径分布。当 N/P 比值为 4 时，mPEG-b-P(APNBMA)/siRNA 纳米载体的平均直径约为 140 nm，多分散系数约为 0.228。此外，可通过调节 N/P 比值获得不同尺寸和稳定性的聚合物复合物。本研究中选择 N/P 比值为 4，因为这是能够实现溴化乙锭染色完全阻滞和消除的最低比值。
该方法中的另一个关键参数是在siRNA释放实验中向纳米载体溶液中添加SDS。SDS是一种阴离子表面活性剂，用于更好地模拟含有高浓度脂质膜和多阴离子的细胞内环境29,
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢美国国立卫生研究院（NIH）下属的国家普通医学科学研究所通过资助号为 P20GM103541 的机构发展奖（IDeA）以及资助号为 P20GM10344615 的项目提供的资金支持。本文所述内容并不代表 NIH 的观点。我们还感谢特拉华生物技术研究所（DBI）和特拉华州经济发展办公室（DEDO）通过生物科学先进技术中心（Bioscience CAT）奖项（编号：12A00448）提供的资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | 非靶向通用阴性对照 |
| mPEG-b-P(APNBMA) | 本实验室合成 | N/A | 光响应性聚合物 |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| 橡胶垫圈 | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL 厚 |
| 紫外激光器 | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | 使用准直透镜和 365 nm 滤光片 |
| 琼脂糖 | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| 溴化乙锭 | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| 标记 Dy547 的 siRNA | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | 定制订单 | 荧光染料连接于正义链 5’ 端 |
| 显微镜载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-A3 | 预清洁玻璃 |
| Secure-Seal 间隔片 | Life Technologies | S24735 | 双面粘合 |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | 共聚焦显微镜 |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS 分析软件 |
| MATLAB | MathWorks | N/A | 编程语言 |
| NIH/3T3 细胞 | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | 生长培养基 |
| 胎牛血清 | Mediatech | 35-011-CV | 热灭活 |
| 青霉素-链霉素 | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6 孔板 | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | 转染培养基 |
参考文献
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (20....
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