Vi presenterar en ny metod som använder fotokänsliga block-sampolymerer för effektivare spatiotemporal kontroll av genavstängning utan detekterbara off-target-effekter. Dessutom kan förändringar i genuttryck förutspås med användning av enkla siRNA-frisättningsanalyser och enkel kinetisk modellering.
Nya material och metoder behövs för att bättre kontrollera bindningen vs. frisättning av nukleinsyror för ett brett spektrum av tillämpningar som kräver en exakt reglering av genaktivitet. I synnerhet skulle nya stimuli-responsiva material med förbättrad spatiotemporal kontroll över genuttryck låsa upp översättningsbara plattformar i läkemedelsforskning och regenerativ medicinteknik. Vidare skulle en förbättrad förmåga att kontrollera nukleinsyrafrigörande från material möjliggöra utveckling av strömlinjeformade metoder för att förutsäga nanokarrier effektivitet a priori , vilket leder till snabbare screening av leveransfordon. Här presenterar vi ett protokoll för att förutsäga genavstämningseffektivitet och uppnå spatiotemporal kontroll över genuttryck genom ett modulärt fotoresvarligt nanocarrier-system. Små interfererande RNA (siRNA) komplexeras med mPEG- b- poly (5- (3- (amino) propoxi) -2-nitrobensylmetakrylat) (mPEG- b -P (APNBMA)) polymerer tillRm stabila nanocarriers som kan kontrolleras med ljus för att underlätta avstämd, on / off siRNA-frisättning. Vi skisserar två komplementära analyser med användning av fluorescenskorrelationsspektroskopi och gelelektrofores för korrekt kvantifiering av siRNA-frisättning från lösningar som liknar intracellulära miljöer. Information som erhölls från dessa analyser inkorporerades i en enkel RNA-interferens (RNAi) -kinetisk modell för att förutsäga de dynamiska tystningsresponserna på olika fotostimulansförhållanden. I sin tur möjliggjorde dessa optimerade bestrålningsbetingelser förfining av ett nytt protokoll för spatiotemporalt kontroll av genavstängning. Denna metod kan generera cellulära mönster i genuttryck med cell-till-cellupplösning och inga detekterbara off-target-effekter. Tillsammans erbjuder vårt tillvägagångssätt en lättanvänd metod för att förutsäga dynamiska förändringar i genuttryck och justera siRNA-aktivitet i rymden och tiden. Denna uppsättning analyser kan lätt anpassas för att testa ett stort antal otHennes stimuli-responsiva system för att ta itu med viktiga utmaningar som är relevanta för en mängd applikationer inom biomedicinsk forskning och medicin.
Små störande RNA (siRNA) mediera post-transkriptionell gen tysta genom en katalytisk RNAi väg som är mycket specifik, potent och skräddarsys till praktiskt taget vilken målgen 1. Dessa lovande egenskaper har gjort det möjligt för siRNA-terapeutika att utvecklas i humana kliniska prövningar för behandling av många sjukdomar, inklusive metastatiskt melanom och hemofili 2 , 3 . Men betydande leveransproblem kvarstår som har hindrat översättning 4 . I synnerhet måste leveransfordon vara stabila och skydda siRNA från extracellulär nedbrytning, men frigöra även nyttolasten i cytoplasma 5 . Vidare kräver många RNAi-applikationer förbättrade metoder för att reglera genavstämning i rymden och tid 6 , vilket kommer att minska bieffekterna i siRNA-terapeutika 7 och möjliggöra transformativ aDvanser i applikationer som sträcker sig från cellmikroarrays för läkemedelsupptäckt 8 till modulering av cellsvar i regenerativa byggnadsställningar 9 . Dessa utmaningar lyfter fram behovet av nya material och metoder för att bättre kontrollera bindning mot frisättning i siRNA nanokarrier.
En av de mest lovande strategierna för kontroll av siRNA-frisättning och förbättring av spatiotemporal reglering är användningen av stimuli-responsiva material 10 . Till exempel har en mängd olika biomaterial konstruerats med föränderlig nukleinsyrabindningsaffinitet som svar på förändrad redoxpotential eller pH, eller applicerade magnetfält, ultraljud eller ljus 11 . Även om många av dessa system uppvisar förbättrad kontroll över nukleinsyraaktivitet är användningen av ljus som en utlösare särskilt fördelaktig på grund av dess momentana tidsmässiga respons, exakt rymdupplösning och lätthet av avstämningsförmåga <suP class = "xref"> 12. Vidare har potentialen hos fotokänsliga tekniker för reglering av genuttryck visats av state-of-the-art inducerbara promotor- och optogenetiska regulatorsystem; Dessa system lider emellertid av många utmaningar, inklusive begränsad förmåga att reglera endogena gener, säkerhetshänsyn som immunogenicitet och svårigheter att leverera multikomponentaggregat 13 , 14 , 15 . Foto-responsiva siRNA nanocarrier är idealiska för att övervinna dessa nackdelar och tillhandahålla ett enklare och mer robust tillvägagångssätt för att spatiotemporalt modulera genuttryck 16 , 17 , 18 . Tyvärr förblir metoder för att exakt förutsäga det resulterande proteinknutningsreaktionen elusiva.
En viktig utmaning är att kvantitativa utvärderingar av siRNA-frisläppandet ärSällsynta 19 , 20 , och även när dessa utvärderingar utförs, har de inte kopplats till analyser av siRNA / proteinomsättningsdynamik. Både mängden siRNA som frigörs och dess persistens / livstid är viktiga determinanter för den resulterande genljuddynamiken; Därför är en brist på sådan information en stor avbrytning som utesluter exakt förutsägelse av dosrespons i RNAi 21 . Att ta itu med denna utmaning skulle påskynda formuleringen av lämpliga struktur-funktionsrelationer i nanokarrier och bättre informera biomaterialmönster 22 . Vidare skulle sådana tillvägagångssätt möjliggöra utveckling av effektivare siRNA-doseringsprotokoll. I ett försök att förstå det dynamiska tystnadssvaret har flera grupper undersökt matematiska modeller av RNAi 23 , 24 , 25 . Dessa ramar varLyckad med att ge insikter i siRNA-medierade förändringar i genuttryck och identifiera hastighetsbegränsande steg 26 . Emellertid har dessa modeller endast applicerats på kommersiella genleveranssystem ( t.ex. lipofektamin och polyetylenimin (PEI)) som inte kan kontrolleras siRNA-frisättning, och komplexiteten hos modellerna har allvarligt begränsat deras användbarhet 27 . Dessa brister framhäver ett oupplöst behov av nya material som kan justera justerbart siRNA-utsläpp kombinerat med strömlinjeformade och lättanvända prediktiva kinetiska modeller.
Vår metod behandlar alla dessa utmaningar genom integrering av en ljuskänslig nanocarrierplattform med kopplade metoder för att kvantifiera fri siRNA och modell RNAi-dynamik. I synnerhet övervakas vår plattforms exakt kontrollerade siRNA-frisättning 28 genom två komplementära metoder för att exakt kvantifiera inkapslade vsBunden siRNA. Experimentella data från dessa analyser ingås i en enkel kinetisk modell för att förutsäga genavstämningseffektiviteter a priori 29 . Slutligen utnyttjas nanokärrarnas på / av-natur lätt för att generera cellmönster i genuttryck med rumslig kontroll på celllängdskalan. Således tillhandahåller denna metod en lätt anpassningsbar metod för att styra och förutsäga genavstängning i en mängd olika tillämpningar som skulle gynna spatiotemporal reglering av cellbeteende.
Det finns några steg i den metod som är särskilt kritisk. Vid formulering av nanokarriererna är ordningen för komponenttillägg och blandningshastighet två viktiga parametrar som påverkar effekten 39 . Detta protokoll kräver att den katjoniska komponenten, mPEG- b -P (APNBMA), sättes till den anjoniska komponenten, siRNA, på droppvis sätt under virvelbildning. Beroende på den totala formuleringsvolymen tar denna blandningsprocess 3-6 s. För att testa om nanokarrierema formad…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar National Institute of General Medical Sciences i National Institute of Health (NIH) för ekonomiskt stöd genom ett Institutional Development Award (IDeA) under bidragsnummer P20GM103541 samt bidragsnummer P20GM10344615. Uttalandena häri återspeglar inte NIH: s åsikter. Vi erkänner också Delaware Biotechnology Institute (DBI) och Delaware Economic Development Office (DEDO) för ekonomiskt stöd genom Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) -priset (12A00448).
siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |