Summary

Förutsägande av gensläckning genom spatiotemporal kontroll av siRNA-frisättning från foto-responsiva polymera nanocarriers

Published: July 21, 2017
doi:

Summary

Vi presenterar en ny metod som använder fotokänsliga block-sampolymerer för effektivare spatiotemporal kontroll av genavstängning utan detekterbara off-target-effekter. Dessutom kan förändringar i genuttryck förutspås med användning av enkla siRNA-frisättningsanalyser och enkel kinetisk modellering.

Abstract

Nya material och metoder behövs för att bättre kontrollera bindningen vs. frisättning av nukleinsyror för ett brett spektrum av tillämpningar som kräver en exakt reglering av genaktivitet. I synnerhet skulle nya stimuli-responsiva material med förbättrad spatiotemporal kontroll över genuttryck låsa upp översättningsbara plattformar i läkemedelsforskning och regenerativ medicinteknik. Vidare skulle en förbättrad förmåga att kontrollera nukleinsyrafrigörande från material möjliggöra utveckling av strömlinjeformade metoder för att förutsäga nanokarrier effektivitet a priori , vilket leder till snabbare screening av leveransfordon. Här presenterar vi ett protokoll för att förutsäga genavstämningseffektivitet och uppnå spatiotemporal kontroll över genuttryck genom ett modulärt fotoresvarligt nanocarrier-system. Små interfererande RNA (siRNA) komplexeras med mPEG- b- poly (5- (3- (amino) propoxi) -2-nitrobensylmetakrylat) (mPEG- b -P (APNBMA)) polymerer tillRm stabila nanocarriers som kan kontrolleras med ljus för att underlätta avstämd, on / off siRNA-frisättning. Vi skisserar två komplementära analyser med användning av fluorescenskorrelationsspektroskopi och gelelektrofores för korrekt kvantifiering av siRNA-frisättning från lösningar som liknar intracellulära miljöer. Information som erhölls från dessa analyser inkorporerades i en enkel RNA-interferens (RNAi) -kinetisk modell för att förutsäga de dynamiska tystningsresponserna på olika fotostimulansförhållanden. I sin tur möjliggjorde dessa optimerade bestrålningsbetingelser förfining av ett nytt protokoll för spatiotemporalt kontroll av genavstängning. Denna metod kan generera cellulära mönster i genuttryck med cell-till-cellupplösning och inga detekterbara off-target-effekter. Tillsammans erbjuder vårt tillvägagångssätt en lättanvänd metod för att förutsäga dynamiska förändringar i genuttryck och justera siRNA-aktivitet i rymden och tiden. Denna uppsättning analyser kan lätt anpassas för att testa ett stort antal otHennes stimuli-responsiva system för att ta itu med viktiga utmaningar som är relevanta för en mängd applikationer inom biomedicinsk forskning och medicin.

Introduction

Små störande RNA (siRNA) mediera post-transkriptionell gen tysta genom en katalytisk RNAi väg som är mycket specifik, potent och skräddarsys till praktiskt taget vilken målgen 1. Dessa lovande egenskaper har gjort det möjligt för siRNA-terapeutika att utvecklas i humana kliniska prövningar för behandling av många sjukdomar, inklusive metastatiskt melanom och hemofili 2 , 3 . Men betydande leveransproblem kvarstår som har hindrat översättning 4 . I synnerhet måste leveransfordon vara stabila och skydda siRNA från extracellulär nedbrytning, men frigöra även nyttolasten i cytoplasma 5 . Vidare kräver många RNAi-applikationer förbättrade metoder för att reglera genavstämning i rymden och tid 6 , vilket kommer att minska bieffekterna i siRNA-terapeutika 7 och möjliggöra transformativ aDvanser i applikationer som sträcker sig från cellmikroarrays för läkemedelsupptäckt 8 till modulering av cellsvar i regenerativa byggnadsställningar 9 . Dessa utmaningar lyfter fram behovet av nya material och metoder för att bättre kontrollera bindning mot frisättning i siRNA nanokarrier.

En av de mest lovande strategierna för kontroll av siRNA-frisättning och förbättring av spatiotemporal reglering är användningen av stimuli-responsiva material 10 . Till exempel har en mängd olika biomaterial konstruerats med föränderlig nukleinsyrabindningsaffinitet som svar på förändrad redoxpotential eller pH, eller applicerade magnetfält, ultraljud eller ljus 11 . Även om många av dessa system uppvisar förbättrad kontroll över nukleinsyraaktivitet är användningen av ljus som en utlösare särskilt fördelaktig på grund av dess momentana tidsmässiga respons, exakt rymdupplösning och lätthet av avstämningsförmåga <suP class = "xref"> 12. Vidare har potentialen hos fotokänsliga tekniker för reglering av genuttryck visats av state-of-the-art inducerbara promotor- och optogenetiska regulatorsystem; Dessa system lider emellertid av många utmaningar, inklusive begränsad förmåga att reglera endogena gener, säkerhetshänsyn som immunogenicitet och svårigheter att leverera multikomponentaggregat 13 , 14 , 15 . Foto-responsiva siRNA nanocarrier är idealiska för att övervinna dessa nackdelar och tillhandahålla ett enklare och mer robust tillvägagångssätt för att spatiotemporalt modulera genuttryck 16 , 17 , 18 . Tyvärr förblir metoder för att exakt förutsäga det resulterande proteinknutningsreaktionen elusiva.

En viktig utmaning är att kvantitativa utvärderingar av siRNA-frisläppandet ärSällsynta 19 , 20 , och även när dessa utvärderingar utförs, har de inte kopplats till analyser av siRNA / proteinomsättningsdynamik. Både mängden siRNA som frigörs och dess persistens / livstid är viktiga determinanter för den resulterande genljuddynamiken; Därför är en brist på sådan information en stor avbrytning som utesluter exakt förutsägelse av dosrespons i RNAi 21 . Att ta itu med denna utmaning skulle påskynda formuleringen av lämpliga struktur-funktionsrelationer i nanokarrier och bättre informera biomaterialmönster 22 . Vidare skulle sådana tillvägagångssätt möjliggöra utveckling av effektivare siRNA-doseringsprotokoll. I ett försök att förstå det dynamiska tystnadssvaret har flera grupper undersökt matematiska modeller av RNAi 23 , 24 , 25 . Dessa ramar varLyckad med att ge insikter i siRNA-medierade förändringar i genuttryck och identifiera hastighetsbegränsande steg 26 . Emellertid har dessa modeller endast applicerats på kommersiella genleveranssystem ( t.ex. lipofektamin och polyetylenimin (PEI)) som inte kan kontrolleras siRNA-frisättning, och komplexiteten hos modellerna har allvarligt begränsat deras användbarhet 27 . Dessa brister framhäver ett oupplöst behov av nya material som kan justera justerbart siRNA-utsläpp kombinerat med strömlinjeformade och lättanvända prediktiva kinetiska modeller.

Vår metod behandlar alla dessa utmaningar genom integrering av en ljuskänslig nanocarrierplattform med kopplade metoder för att kvantifiera fri siRNA och modell RNAi-dynamik. I synnerhet övervakas vår plattforms exakt kontrollerade siRNA-frisättning 28 genom två komplementära metoder för att exakt kvantifiera inkapslade vsBunden siRNA. Experimentella data från dessa analyser ingås i en enkel kinetisk modell för att förutsäga genavstämningseffektiviteter a priori 29 . Slutligen utnyttjas nanokärrarnas på / av-natur lätt för att generera cellmönster i genuttryck med rumslig kontroll på celllängdskalan. Således tillhandahåller denna metod en lätt anpassningsbar metod för att styra och förutsäga genavstängning i en mängd olika tillämpningar som skulle gynna spatiotemporal reglering av cellbeteende.

Protocol

1. Formulering av siRNA-nanokarrier Förbered separata lösningar av siRNA och mPEG- b -P (APNBMA) med lika stora volymer utspädd i 20 mM 4- (2-hydroxietyl) piperazin-1-etansulfonsyra (HEPES) buffert vid pH 6,0. Tillsätt siRNA i en koncentration av 32 μg / mL till 20 mM HEPES-lösning. OBS: siRNA var en icke-riktade, universell negativ kontrollsekvens; SiRNA kan emellertid utformas för att rikta sig mot någon gen av intresse. Lös upp mPEG- b -…

Representative Results

Efter formuleringen av nanokarriererna utfördes analyser av siRNA-frisättning för att informera bestrålningsbetingelserna som skall användas vid transfektionerna in vitro . Olika doser av ljus applicerades för bestämning av procenten av siRNA som frisläpptes. Den första analysen användes gelelektrofores för att separera de fria siRNA-molekylerna från siRNA-molekylerna som fortfarande är komplexa / associerade med polymeren. Nanokarrier som inte behandlades med ljus …

Discussion

Det finns några steg i den metod som är särskilt kritisk. Vid formulering av nanokarriererna är ordningen för komponenttillägg och blandningshastighet två viktiga parametrar som påverkar effekten 39 . Detta protokoll kräver att den katjoniska komponenten, mPEG- b -P (APNBMA), sättes till den anjoniska komponenten, siRNA, på droppvis sätt under virvelbildning. Beroende på den totala formuleringsvolymen tar denna blandningsprocess 3-6 s. För att testa om nanokarrierema formad…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna tackar National Institute of General Medical Sciences i National Institute of Health (NIH) för ekonomiskt stöd genom ett Institutional Development Award (IDeA) under bidragsnummer P20GM103541 samt bidragsnummer P20GM10344615. Uttalandena häri återspeglar inte NIH: s åsikter. Vi erkänner också Delaware Biotechnology Institute (DBI) och Delaware Economic Development Office (DEDO) för ekonomiskt stöd genom Bioscience Center for Advanced Technology (Bioscience CAT) -priset (12A00448).

Materials

siRNA Sigma-Aldrich SIC001 non-targeted, universal negative control
mPEG-b-P(APNBMA) synthesized in our lab N/A photo-responsive polymer
HEPES Fisher Scientific BP310-100
sodium dodecyl sulfate  Sigma-Aldrich 436143
rubber gasket McMaster-Carr 3788T21 0.5 mL thick
UV laser  Excelitas Technologies Omnicure S2000 collimating lens and 365 nm filter used
agarose Fisher Scientific BP160-100
ethidium bromide Fisher Scientific BP1302-10
siRNA labelled with Dy547 GE Healthcare Dharmacon, Inc. custom order fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand
microscope slide Fisher Scientific 12-550-A3 pre-cleaned glass
Secure-Seal Spacer Life Technologies S24735 double-sided adhesive
LSM 780  Carl Zeiss N/A confocal microscope
ZEN 2010 Carl Zeiss N/A FCS analysis software
MATLAB MathWorks N/A programming language
NIH/3T3 cells  ATCC ATCC CRL-1658
DMEM Mediatech 10-013-CV growth media
fetal bovine serum Mediatech 35-011-CV heat-inactivated
penicillin-streptomycin Mediatech  30-002-CI
6-well plates Fisher Scientific 08-772-1B
Opti-MEM Life Technologies 11058021 transfection media

References

  1. Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
  2. Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
  3. Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
  4. Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
  5. Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
  6. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
  7. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  8. Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
  9. Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
  10. Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
  11. Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
  12. Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
  13. Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
  14. Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
  15. Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
  16. Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
  17. Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
  18. Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
  19. Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
  20. Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
  21. Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
  22. Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
  23. Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
  24. Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
  25. Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
  26. Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
  27. Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
  28. Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
  29. Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
  30. Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
  31. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
  32. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  33. Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
  34. Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
  35. Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
  36. Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
  37. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  38. Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
  39. Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
  40. Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
  41. Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
  42. Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).

Play Video

Cite This Article
Greco, C. T., Epps, III, T. H., Sullivan, M. O. Predicting Gene Silencing Through the Spatiotemporal Control of siRNA Release from Photo-responsive Polymeric Nanocarriers. J. Vis. Exp. (125), e55803, doi:10.3791/55803 (2017).

View Video