Fotoğrafa Duyarlı Polimerik Nanokarbonlardan SiRNA Salınımının Spatiotemporal Kontrolü ile Gen Silenceresinin Öngörülmesi
Summary
Saptanabilir hedef dışı etkiler olmaksızın gen susturulmasının daha verimli dağılma zamanı kontrolü için foto-tepki blok kopolimerleri kullanan yeni bir yöntem sunuyoruz. Ek olarak, gen ekspresyonundaki değişiklikler basit siRNA salım deneyleri ve basit kinetik modelleme kullanılarak tahmin edilebilir.
Abstract
Yeni malzemeler ve yöntemler iyi gen aktivitesi kontrol gerektiren uygulamalarda geniş bir nükleik asitlerin serbest bırakılması genel bağlanma kontrol etmek için ihtiyaç vardır. Özellikle, gen ekspresyonu üzerine geliştirilmiş spyatemporal kontrol ile yeni uyarı-tepki veren malzemeler, ilaç keşfi ve rejeneratif tıp teknolojilerinde çevrilebilir platformların kilidini açacaktır. Dahası, nükleik asit salınımını kontrol eden gelişmiş bir yetenek, materyallerin nano taşıyıcı etkinliğini önceden tahmin etmede aerodinamik yöntemlerin geliştirilmesini sağlayarak, teslimat araçlarının hızlandırılmış taramasına neden olabilir. Burada, gen susturucu etkinliklerini tahmin etmek ve modüler bir foto-tepki veren nanocarrier sistemi vasıtasıyla gen ekspresyonu üzerine spatiotemporal kontrol sağlamak için bir protokol sunuyoruz. Küçük müdahale edici RNA (siRNA) mPEG- b -poli (5- (3- (amino) propoksi) -2-nitrobenzil metakrilat) (mPEG- b -P (APNBMA)) fo polimerler ile kompleks haline getirilirAyarlanabilir, açma / kapama siRNA'yı serbest bırakmak için ışıkla kontrol edilebilen rm kararlı nanokarbonlar. Floresan korelasyon spektroskopisi ve jel elektroforezini kullanarak, hücre içi ortamları taklit eden solüsyondan alınan siRNA salınımının doğru bir şekilde hesaplanması için iki tamamlayıcı analizin ana hatlarını çiziyoruz. Bu tahlilden elde edilen bilgiler, çeşitli ışık uyarı koşullarına karşı dinamik susturma tepkilerini öngörmek için basit bir RNA girişim (RNAi) kinetik modeline dahil edildi. Buna göre, optimize edilmiş ışınlama koşulları, spesifik olmayan gen sessizliğini kontrol etmek için yeni bir protokolün arıtılmasına izin verdi. Bu yöntem, hücre-hücre çözünürlüğü ve belirlenemeyen hedef dışı etkileri olmayan gen ekspresyonunda hücresel modeller üretebilir. Birlikte ele alındığında, yaklaşımımız gen ifadesinde dinamik değişiklikleri tahmin etmek ve mekanda ve zaman zarfında siRNA etkinliğini tam olarak kontrol etmek için kullanımı kolay bir yöntem sunmaktadır. Bu test seti çok çeşitli otBiyomedikal araştırma ve tıbbında çok sayıda uygulamayla ilgili temel zorlukları gidermek için uyarıcı tepkisel sistemler.
Introduction
Az yer kaplayan RNA'lar (siRNA'lar), son derece spesifik, güçlü ve hemen hemen her hedef gen 1 için uyarlanabilir bir katalitik RNAi yolu ile transkripsiyon sonrası gen susturulmasına aracılık eder. Bu umut verici özellikler, siRNA terapötiklerinin insan klinik çalışmalarında metastatik melanom ve hemofili 2 , 3 dahil birçok hastalığın tedavisinde ilerlemesine imkân sağladı. Bununla birlikte, önemli dağıtım sorunları devam etmektedir 4 çeviri engelledi. Özellikle, nakil araçları istikrarlı kalmalı ve siRNA'ları hücre dışı bozulmadan korumalı, aynı zamanda sitoplazmada 5 yükü serbest bırakmalıdır. Dahası, birçok RNAi uygulaması siRNA terapötiklerinin 7 yan etkilerini azaltacak ve dönüştürücü a'yı etkinleştiren, gen silencingini uzayda ve zamanda 6 düzenlemeye yönelik gelişmiş yöntemler gerektirir.İlaç keşfi 8 için hücre mikroarray'lerinden rejeneratif iskelelerde hücre tepkilerinin modülasyonuna kadar uzanan uygulamalardaki gelişmeler 9 . Bu zorluklar siRNA nano taşıyıcılar içinde serbest bırakılması vs bağlayıcı yeni malzemeler ve daha iyi kontrol yöntemlerine duyulan ihtiyacı vurgulamaktadır.
SiRNA salınımını kontrol etmek ve spatiotemporal regülasyonu arttırmak için en umut verici stratejilerden biri uyarana cevap veren materyallerin kullanılmasıdır 10 . Örneğin, değiştirilmiş redoks potansiyeli veya pH, ya da uygulanan manyetik alanlar, ultrason ya da ışık 11'e yanıt olarak değişebilir nükleik asit bağlanma afinitesi ile çok çeşitli biyomalzemeler geliştirilmiştir. Bu sistemlerin birçoğu nükleik asit aktivitesi üzerinde gelişmiş kontrol sağladığına rağmen, ışığın tetikleyici olarak kullanılması, ani geçici tepki, hassas mekansal çözünürlük ve ayarlanabilirlik kolaylığı nedeniyle özellikle avantajlıdır <suP class = "xref"> 12. Dahası, gen ekspresyonunu düzenleyen foto-duyarlı teknolojilerin potansiyeli, en modern teşvik edici promotör ve optogenetik düzenleyici sistemler tarafından gösterilmiştir; Bununla birlikte, bu sistemler, sınırlı endojen genleri düzenleyen kapasitelerin böyle immünojenisite gibi güvenlik kaygıları ve çok bileşenli tertibatları 13, 14, 15 teslim zorluklar dahil olmak üzere çeşitli zorluklar çeker. Foto-duyarlı siRNA nanokarbonları, bu dezavantajların üstesinden gelmek ve gen ekspresyonunu spesifik olarak modüle etmek için daha basit ve daha sağlam bir yaklaşım sağlamak için idealdir ( 16 , 17 , 18) . Ne yazık ki, ortaya çıkan protein knockdown tepkisini doğru bir şekilde öngörmeye yönelik yöntemler kaçınılmaz kalmaktadır.
Kilit bir zorluk, siRNA salımının kantitatif değerlendirilmesidirBu değerlendirmeler yapılmaktadır bile az 19, 20, ve, bu da siRNA / protein devir dinamiklerinin analizlere bağlanmış edilmemiştir. Hem salınan siRNA miktarı hem de kalıcılığı / ömrü, ortaya çıkan gen susturucu dinamiklerinde önemli belirleyicilerdir; Dolayısıyla, böyle bir bilginin eksikliği, RNAi 21'deki doz yanıtının doğru şekilde tahmin edilmesine engel olan önemli bir bağlantı kesitidir. Bu zorluğun çözülmesi, nanocarrier'lerde uygun yapı-fonksiyon ilişkilerinin formülasyonunu hızlandıracak ve biyomateryal tasarımları daha iyi bilgilendirecektir 22 . Dahası, bu gibi yaklaşımlar, daha etkin siRNA dozlama protokollerinin geliştirilmesini mümkün kılabilir. Dinamik susturma tepkisini anlama girişiminde, birkaç grup RNAi 23 , 24 , 25'in matematiksel modellerini araştırdı. Bu çerçeveler;Gen ekspresyonunda siRNA aracılığındaki değişikliklere ilişkin görüş sunma ve hızı sınırlayan aşamaları tanımlama konusunda başarılı olma 26 . Bununla birlikte, bu modeller kontrol siRNA salım yeteneğine sahip değildir ticari gen iletim sistemleri (örneğin, Lipofektamin ve polietilenimin (PEI)) tatbik edilmiştir, ve model karmaşıklık, faydalarını büyük ölçüde 27 sınırlıdır. Bu eksiklikler, hassas ve ayarlanabilir kinetik modellerle birlikte hassas ayarlanabilir siRNA salınımı yapabilen yeni malzemeler için karşılanmamış bir gereksinimi vurguluyor.
Metodumuz, serbest siRNA ve model RNAi dinamiklerini nicelleştirmek için ışığa duyarlı bir nanocarrier platformunun birleştirilmiş yöntemlerle bütünleştirilmesiyle bu zorlukların hepsini ele alır. Özellikle, platformumuzun tam olarak kontrol edilen siRNA salınımı 28 , kapsüllenmiş ve karşılanmamış miktarları doğru bir şekilde ölçmek için iki tamamlayıcı yöntemle izlenirBağlı siRNA. Bu tahlillerden elde edilen deneysel veriler, a priori 29 gen sessizleştirme etkinliklerini tahmin etmek için basit bir kinetik modele girilmektedir. Son olarak, nanocarrierlerin açık / kapalı doğası, hücresel uzunluk ölçeğinde uzamsal kontrolle gen ifadesinde hücre kalıpları oluşturmak için kolayca sömürülmektedir. Bu nedenle, bu yöntem, hücre davranışının zaman-zamanlı düzenlenmesinden fayda sağlayacak çeşitli uygulamalarda gen susturulmasını kontrol etmek ve tahmin etmek için kolayca adapte edilebilir bir yöntem sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metotta özellikle kritik olan birkaç adım vardır. Nanokarbonları formüle ederken, bileşen ekleme ve karıştırma hızı sırası, etkinliği etkileyen iki önemli parametredir 39 . Bu protokol, katyonik bileşen olan mPEG- b- P'nin (APNBMA) anyonik bileşene, siRNA'ya vorteks yaparken damla damla eklenmesini gerektirir. Toplam formülasyon hacmine bağlı olarak, bu karıştırma işlemi 3-6 s sürer. Nanokarbonların düzgün şekilde oluşturulup oluşturulmadığını …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, P20GM103541 hibenin yanı sıra P20GM10344615 hibe numarası altında bir Kurumsal Gelişim Ödülü (IDeA) aracılığıyla maddi destek için Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Sağlık Bilimleri Enstitüsüne (NIH) teşekkür ederler. Buradaki ifadeler NIH'nin görüşlerini yansıtmamaktadır. Ayrıca, İleri Teknoloji Biyosistem Merkezi (Bioscience CAT) ödülü (12A00448) aracılığıyla maddi destek için Delaware Biyoteknoloji Enstitüsü'nü (DBI) ve Delaware Ekonomik Kalkınma Ofisi'ni (DEDO) kabul ediyoruz.
Materials
| siRNA | Sigma-Aldrich | SIC001 | non-targeted, universal negative control |
| mPEG-b-P(APNBMA) | synthesized in our lab | N/A | photo-responsive polymer |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-100 | |
| sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | 436143 | |
| rubber gasket | McMaster-Carr | 3788T21 | 0.5 mL thick |
| UV laser | Excelitas Technologies | Omnicure S2000 | collimating lens and 365 nm filter used |
| agarose | Fisher Scientific | BP160-100 | |
| ethidium bromide | Fisher Scientific | BP1302-10 | |
| siRNA labelled with Dy547 | GE Healthcare Dharmacon, Inc. | custom order | fluorophore conjugated to 5’ end of sense strand |
| microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-A3 | pre-cleaned glass |
| Secure-Seal Spacer | Life Technologies | S24735 | double-sided adhesive |
| LSM 780 | Carl Zeiss | N/A | confocal microscope |
| ZEN 2010 | Carl Zeiss | N/A | FCS analysis software |
| MATLAB | MathWorks | N/A | programming language |
| NIH/3T3 cells | ATCC | ATCC CRL-1658 | |
| DMEM | Mediatech | 10-013-CV | growth media |
| fetal bovine serum | Mediatech | 35-011-CV | heat-inactivated |
| penicillin-streptomycin | Mediatech | 30-002-CI | |
| 6-well plates | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 11058021 | transfection media |
References
- Forbes, D. C., Peppas, N. A. Oral delivery of small RNA and DNA. J Control Release. 162 (2), 438-445 (2012).
- Davis, M. E., et al. Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles. Nature. 464 (7291), 1067-1070 (2010).
- Bouchie, A. Companies in footrace to deliver RNAi. Nat Biotechnol. 30 (12), 1154-1157 (2012).
- Burke, P. A., Pun, S. H., Reineke, T. M. Advancing Polymeric Delivery Systems Amidst a Nucleic Acid Therapy Renaissance. ACS Macro Lett. 2 (10), 928-934 (2013).
- Gooding, M., Browne, L. P., Quinteiro, F. M., Selwood, D. L. siRNA Delivery: From Lipids to Cell-penetrating Peptides and Their Mimics. Chem Biol Drug Des. 80 (6), 787-809 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nat Chem Biol. 10 (3), 196-202 (2014).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nat Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Ziauddin, J., Sabatini, D. M. Microarrays of cells expressing defined cDNAs. Nature. 411 (6833), 107-110 (2001).
- Saltzman, W. M., Olbricht, W. L. Building drug delivery into tissue engineering. Nat Rev Drug Discov. 1 (3), 177-186 (2002).
- Mura, S., Nicolas, J., Couvreur, P. Stimuli-responsive nanocarriers for drug delivery. Nat Mater. 12 (11), 991-1003 (2013).
- Shim, M. S., Kwon, Y. J. Stimuli-responsive polymers and nanomaterials for gene delivery and imaging applications. Adv Drug Delivery Rev. 64 (11), 1046-1058 (2012).
- Kelley, E. G., Albert, J. N. L., Sullivan, M. O., Epps, T. H. Stimuli-responsive copolymer solution and surface assemblies for biomedical applications. Chem Soc Rev. 42 (17), 7057-7071 (2013).
- Weber, W., Fussenegger, M. Emerging biomedical applications of synthetic biology. Nat Rev Genet. 13 (1), 21-35 (2012).
- Konermann, S., et al. Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Nature. 500 (7463), 472-476 (2013).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nat Biotechnol. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Huschka, R., et al. Gene Silencing by Gold Nanoshell-Mediated Delivery and Laser-Triggered Release of Antisense Oligonucleotide and siRNA. ACS Nano. 6 (9), 7681-7691 (2012).
- Li, H. -. J., Wang, H. -. X., Sun, C. -. Y., Du, J. -. Z., Wang, J. Shell-detachable nanoparticles based on a light-responsive amphiphile for enhanced siRNA delivery. R Soc Chem Adv. 4 (4), 1961-1964 (2014).
- Braun, G. B., et al. Laser-Activated Gene Silencing via Gold Nanoshell-siRNA Conjugates. ACS Nano. 3 (7), 2007-2015 (2009).
- Gilleron, J., et al. Image-based analysis of lipid nanoparticle-mediated siRNA delivery, intracellular trafficking and endosomal escape. Nat Biotechnol. 31 (7), 638-646 (2013).
- Wittrup, A., et al. Visualizing lipid-formulated siRNA release from endosomes and target gene knockdown. Nat Biotechnol. 33 (8), 870-876 (2015).
- Roth, C. M. Quantitative measurements and rational materials design for intracellular delivery of oligonucleotides. Biotechnol Prog. 24 (1), 23-28 (2008).
- Mao, S., et al. Influence of polyethylene glycol chain length on the physicochemical and biological properties of poly(ethylene imine)-graft-poly(ethylene glycol) block copolymer/SiRNA polyplexes. Bioconjugate Chem. 17 (5), 1209-1218 (2006).
- Raab, R. M., Stephanopoulos, G. Dynamics of gene silencing by RNA interference. Biotechnol Bioeng. 88 (1), 121-132 (2004).
- Cuccato, G., et al. Modeling RNA interference in mammalian cells. BMC Systems Biology. 5, 1 (2011).
- Varga, C. M., Hong, K., Lauffenburger, D. A. Quantitative analysis of synthetic gene delivery vector design properties. Mol Ther. 4 (5), 438-446 (2001).
- Chen, H. H., et al. Quantitative comparison of intracellular unpacking kinetics of polyplexes by a model constructed from quantum Dot-FRET. Mol Ther. 16 (2), 324-332 (2008).
- Bartlett, D. W., Davis, M. E. Insights into the kinetics of siRNA-mediated gene silencing from live-cell and live-animal bioluminescent imaging. Nucleic Acids Res. 34 (1), 322-333 (2006).
- Foster, A. A., Greco, C. T., Green, M. D., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Light-Mediated Activation of siRNA Release in Diblock Copolymer Assemblies for Controlled Gene Silencing. Adv Healthc Mater. 4 (5), 760-770 (2015).
- Greco, C. T., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Mechanistic Design of Polymer Nanocarriers to Spatiotemporally Control Gene Silencing. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1582-1594 (2016).
- Green, M. D., et al. Catch and release: photocleavable cationic diblock copolymers as a potential platform for nucleic acid delivery. Polym Chem. 5 (19), 5535-5541 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments. J Vis Exp. (62), e3923 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Marquer, C., Leveque-Fort, S., Potier, M. C. Determination of Lipid Raft Partitioning of Fluorescently-tagged Probes in Living Cells by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS). J Vis Exp. (62), (2012).
- Staaf, E., Bagawath-Singh, S., Johansson, S. Molecular Diffusion in Plasma Membranes of Primary Lymphocytes Measured by Fluorescence Correlation Spectroscopy. J Vis Exp. (120), e54756 (2017).
- Buyens, K., et al. Monitoring the disassembly of siRNA polyplexes in serum is crucial for predicting their biological efficacy. J Control Release. 141 (1), 38-41 (2010).
- Eden, E., et al. Proteome Half-Life Dynamics in Living Human Cells. Science. 331 (6018), 764-768 (2011).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad. Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. Continuous Fluorescence Monitoring of Rapid Cycle DNA Amplification. Biotechniques. 54 (6), 314-320 (2013).
- Cho, S. K., Dang, C., Wang, X., Ragan, R., Kwon, Y. J. Mixing-sequence-dependent nucleic acid complexation and gene transfer efficiency by polyethylenimine. Biomater Sci. 3 (7), 1124-1133 (2015).
- Liu, Y. M., Reineke, T. M. Poly(glycoamidoamine)s for gene delivery: Stability of polyplexes and efficacy with cardiomyoblast cells. Bioconjugate Chem. 17 (1), 101-108 (2006).
- Schwanhausser, B., et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).
- Greco, C. T., Muir, V. G., Epps, T. H., Sullivan, M. O. Efficient tuning of siRNA dose response by combining mixed polymer nanocarriers with simple kinetic modeling. Acta Biomater. 50, 407-416 (2017).
