Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

طرق استخراج إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء Published: June 19, 2017 doi: 10.3791/55809
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

Summary

هنا، نقدم بروتوكول لعزل إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء بيميسيا تاباسي من خلال تشريح والترشيح. بعد التضخيم، عينات الحمض النووي هي مناسبة لتسلسل لاحق ودراسة التبادلية بين إندوسيمبيونتس والذبابة البيضاء.

Abstract

تشكل الارتباطات البكتيرية علاقة حميمة مع مضيفيها وتقدم مزايا للمضيفين في معظم الحالات. المعلومات الجينومية أمر بالغ الأهمية لدراسة وظائف وتطور سيمبيونتس البكتيريا في مضيفهم. كما لا يمكن استزراع معظم التعاطف في المختبر ، وأساليب لعزل كمية كافية من البكتيريا لتسلسل الجينوم هي مهمة جدا. في الذبابة البيضاء بيميسيا تاباسي، تم تحديد عدد من إندوسيمبيونتس ويتوقع أن تكون ذات أهمية في تطوير وتكاثر الآفات من خلال نهج متعددة. ومع ذلك، فإن الآلية التي تقوم عليها الجمعيات لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. والعقبة تأتي جزئيا من حقيقة أن إندوسيمبيونتس في الذبابة البيضاء، ومعظمهم من ضبط النفس في البكتيريا، من الصعب فصل من الخلايا المضيفة. نحن هنا تقرير بروتوكول خطوة بخطوة لتحديد واستخراج وتنقية إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء B. تاباسي أساسا عن طريق تشريحعلى والترشيح. عينات إندوسيمبيونت أعدت من قبل هذه الطريقة، على الرغم من أن لا يزال خليط من الأنواع إندوسيمبيونت مختلفة، هي مناسبة لتسلسل الجينوم لاحق وتحليل الأدوار المحتملة لل إندوسيمبيونتس في B. تاباسي. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه الطريقة لعزل إندوسيمبيونتس من الحشرات الأخرى.

Introduction

البكتيريا التي تشكل علاقة تكافلية حميمة مع المضيفين النسبية منتشرة على نطاق واسع في المفصليات 1 . وقد ثبت أن إندوسيمبيونتس تؤثر على جوانب المضيفين، مثل استقلاب التغذية، والاستنساخ، والاستجابات للضغوط البيئية 2 ، 3 ، 4 وما إلى ذلك ، في كل مرحلة تنموية تقريبا 5 . ومع ذلك، فإن الآلية التي تقوم عليها الجمعيات لا تزال غير معروفة إلى حد كبير. علم الجينوم هو من الأولوية والأهمية عند دراسة الوظائف والأدوار المحتملة للبكتيريا. ويمكن الاستدلال على بعض المعلومات الأساسية، أي الحالة التصنيفية، والجينات الوظيفية، ومسارات الأيض، ونظم الإفراز، من تسلسل الجينوم، الذي يلقي الضوء على الأدوار المحتملة للروابط في التعايش. مع تطور تسلسل الإنتاجية العالية، وقد تم تسلسل عدد كبير من الجينومات البكتيرية ثإيث وظائف متنوعة كشفت 6 .

إندوسيمبيونتس هي ذات أهمية حيوية في هيميبتيرانز، مثل المن 7 ، البق 8 ، بسيلدس 9 ، بلانثوبرز البني 10 و السيكادا 11 . على سبيل المثال، وقد أثبتت بوكنيرا في المن، باعتبارها التعاطف الملزم، للمشاركة في الحيوي الحيوي الأحماض الأمينية، جنبا إلى جنب مع الجينات من الجينوم المن 12 . وعلاوة على ذلك، يتم الكشف عن تنظيم النسخي بوكنيرا أيضا 13 . في بسيلديس ، كارسونيلا هو تسلسل وتصنيف أصغر الجينوم البكتيري وجدت من أي وقت مضى 14 . وتستند كل هذه السمات المميزة لل إندوسيمبيونتس وتستدل من تسلسل الجينوم. لأن هذه إندوسيمبيونتس لا يمكن أن تكون مثقف في المختبر ، وقد طبقت عدة نهج لعزل البكتيريا الكافية لمقترضةuencing. في المن، يتم استخراج إندوسيمبيونتس من خلال الطرد المركزي والترشيح، وتخضع لمزيد من التحليل الجيني و ترانسكريبتوميك 5 . في بنهوبرز البني، يتم تسلسل إندوسيمبيونتس جنبا إلى جنب مع الجينوم الحشرة كلها 10 .

الذبابة البيضاء B. تاباسي هو مجمع الأنواع التي تحتوي على أكثر من 35 الأنواع المورفولوجية التي لا يمكن تمييزها (الأنواع الخفية)، من بينها، غزو نوعين الغازية في جميع أنحاء العالم وتسبب ضررا هائلا للإنتاج الزراعي 15 . وتجدر الإشارة إلى أن إندوسيمبيونتس ضمن الأنواع B. تاباسي أظهرت أهمية في تطوير الآفات 16 . حتى الآن، تم تحديد ثمانية إندوسيمبيونتس في الذبابة البيضاء، بما في ذلك التعاطف الملزم، كانديداتوس بورتيرا أيروديداروم، وسبعة تعاطف ثانوي هاميلتونيلا ، ريكيتسيا ، أرسينوفونوس ، كاردينيم ، < إم> ولباشيا، فريتشيا و هيميبتيريفيلوس المعرفة 17 ، 18 .

على عكس هيميبتيرانز وصفها سابقا، الذبابة البيضاء B. تاباسي هو حشرة صغيرة للغاية فقط 1 ملم في الطول. تقتصر معظم إندوسيمبيونتس إلى البكتيريا 19 (الخلايا المتخصصة التي تحتوي على سيمبيونتس، التي تشكل كذلك البكتيريا في B. تاباسي). وبالإضافة إلى ذلك، هذه إندوسيمبيونتس لا يمكن أن تكون مثقف في المختبر . الطريقة الوحيدة للحصول على إندوسيمبيونتس من B. تاباسي هو تشريح البكتيريا خارج. ومع ذلك، هناك صعوبة في تشريح. أولا، البكتيريا الهشة ترتبط دائما مع أنسجة أخرى من الذبابة البيضاء، والتي من الصعب فصل. ثانيا، حجم صغير من الذبابة البيضاء يحد من عزل ما يكفي من البكتيريا. ثالثا، إندوسيمبيونتس الكتلة في البكتيريا، مما يجعل من تعقيد للغاية للحصول على نوع واحد من البكتيريا.

أس = "jove_content"> هنا، نحن الإبلاغ عن بروتوكول بسيط وغير مكلف لعزل إندوسيمبيونتس الذبابة البيضاء لتسلسل ميتاجينوم لاحق. من خلال التشريح، والتنقية والتضخيم، ويمكن الحصول على الحمض النووي كافية إندوسيمبيونت ويمكن تأكيد أنواع البكتيريا. بروتوكول وصفها يمكن استخدامها على نحو مماثل في المفصليات الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الذبابة البيضاء وتربية الأنواع الخفي

  1. الحفاظ على أنواع الذبابة البيضاء على القطن غوسيبيوم هيرسوتم (مالفاسي) (كف زهي-ميان 1973) في أقفاص تحت ظروف قياسية من 27 ± 1 درجة مئوية، و 70 ± 10٪ الرطوبة و 14 ساعة ضوء: 10 ساعة النظام المظلم.
  2. جمع الذبابة البيضاء الفردية والتجانس في 30 ميكرولتر من العازلة تحلل (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.4، 50 ملي بوكل، 0.45٪ [الوزن بالوزن / فول] توين 20، 0.2٪ [وت / فول] الجيلاتين، 0.45٪ [المجلد / فول] نونيديت P 40، 60 جم ​​/ مل بروتين K).
  3. احتضان جناسة في 65 درجة مئوية لمدة 1 ساعة ثم 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: يمكن زيادة وقت الحضانة عند 65 درجة مئوية إذا لزم الأمر. وينبغي أن يكون حاضنة الوقت في 100 درجة مئوية تسيطر عليها بشكل حاسم لإيقاف كاف K البروتين وتجنب تلف الحمض النووي.
  4. أداء تفاعل البوليميراز سلسلة (ير) باستخدام الحمض النووي الذبابة البيضاء (المكتسبة في القسم 1.3) على أساس الميتوكوندريا السيتوكروم أوكسيديز الأول الاشعال.
    كوي-F: 5'-تغاتغتكاتساغاغت-3 '
    كوي-R: 5'-تاتاتغكاغاتغتكاتغا-3 '
    1. أداء تفاعلات ير في الحجم النهائي من 25 ميكرولتر تحتوي على 1 U من البلمرة دنا طق ، 2.5 ميكرولتر العازلة 10X، 0.2 ملي دنتب، 0.2 ملم من كل التمهيدي و 2 ميكرولتر من الحمض النووي الذبابة البيضاء.
    2. استخدام شروط الإجراء ير التالية: تمسخ الأولي 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق تليها 35 دورات من 95 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (تمسخ)، 50 درجة مئوية لمدة 45 ثانية (الصلب) و 72 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة (التمديد) و آخر 10 دقيقة في 72 درجة مئوية لمزيد من التمديد.
  5. تنظيف ير تضخيم المنتج باستخدام مجموعة استخراج هلام الحمض النووي مع البروتوكول الموصى بها.
  6. تسلسل عينات الحمض النووي المنقى مع نظام تسلسل عينة الحمض النووي بعد تعليمات الشركة الصانعة.
  7. تحليل تسلسل باستخدام أداة البحث المحاذاة المحلية الأساسية (بلاست) لتحديد أنواع خفية من الذبابة البيضاء وتجنب تلوث غيرها من سبيسيوفاق.

2. إندوسيمبيونت تحديد والتعريب

  1. أداء ير على الحمض النووي الذبابة البيضاء (المكتسبة في الخطوة 1.3) لتضخيم جينات محددة من كل إندوسيمبيونت داخل الذبابة البيضاء (وصفت وصفة ير في القسم 1.4، وترد إجراءات ير والبادئات في الجدول 1 ).
  2. موضوع العينة تضخيم إلى أغاروس هلام الكهربائي وفقا لبروتوكول نشرت سابقا 20 (1٪ هلام الاغاروز، تريس-أسيتات-إدتا كما العازلة تشغيل، والجهد 5 V / سم) لتحديد الجينات محددة من كل بكتيريا.
  3. استعادة وتسلسل كل فرقة لتحديد الأنواع البكتيرية داخل الذبابة البيضاء (انظر الأقسام 1.5-1.7).
  4. أداء مضان في التهجين الموضعي (فيش) على وايتفليز لتحديد موقع إندوسيمبيونتس وفقا للبروتوكول المنشورة سابقا 19 .
    ملاحظة: زيادة تركيز تحقيقات الفلورسنت إذا لزم الأمر.
    5. 3. انتقال المجهر الإلكتروني (تيم)

    1. تزج وتثبيت ويتفليز في الفوسفات العازلة (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0) التي تحتوي على 2.5٪ [فول / فول] غلوتارالدهيد لمدة 4 ساعات.
    2. غسل العينات في الفوسفات العازلة (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0) ثلاث مرات، 15 دقيقة في كل مرة.
    3. تزج وإصلاح العينات مرة أخرى في العازلة الفوسفات (0.1 M، ودرجة الحموضة 7.0) تحتوي على 1٪ [وت / فول] أوسو 4 لمدة 2 ساعة.
    4. تجفيف العينات من قبل سلسلة متدرجة من الايثانول (30٪، 50٪، 70٪، 80٪، 90٪، 95٪ و 100٪)، 15 دقيقة في كل مرة.
    5. نقل وتزج العينات في الأسيتون 100٪ لمدة 20 دقيقة.
    6. وضع العينات في خليط من الأسيتون 100٪ و 100٪ راتنج سبور (1: 1) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    7. نقل العينات إلى خليط من الأسيتون 100٪ و 100٪ راتنج سبور (1: 3) لمدة 3 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
    8. نقل وتزج العينات في 100٪ الراتنج سبور (المحتضنة في 70 درجة مئوية) لأكثر من 9 ساعة.
    9. قسم عينات الذبابة البيضاء باستخدام مايكروإلي.
    10. وصمة عار الأفلام رقيقة جدا (المكتسبة في القسم 3.9) عن طريق الغمر في خلات اليورانيل المطلق لمدة 5-10 دقيقة، تليها الغمر في 50٪ القلوية الرصاص سيترات لمدة 5-10 دقيقة أخرى.
      ملاحظة: أحجام الكواشف المستخدمة في القسم 3.1-3.10 تعتمد على العينات. تأكد من أن مغمورة العينات في الكواشف.
    11. مراقبة العينات تحت المجهر الإلكتروني انتقال (15،000X) لتحديد توطين وشكل وحجم البكتيريا لمزيد من الاستخدام (انظر القسم 4.6).

    4. الذبابة البيضاء بكتيريوم تشريح وتنقية

    1. إضافة 100 ميكرولتر من حل برنامج تلفزيوني 1X على شريحة المجهر. اختيار بعض الحوريات 3 أو 4 ال إنستار من أوراق القطن وتزجها في حل برنامج تلفزيوني.
    2. استخدام الإبر حشري غرامة تحت ستيريوميكروسكوب وسحب البكتيريا من الجسم الذبابة البيضاء.
      1. قطع بلطف حفرة على جانب واحد من الحورية، والضغط قليلا على الآخرالجانب للسماح للبكتريوميس بها.
    3. جبل 20 ميكرولتر ميكرولتر (مع قطع نهاية الرائدة لتلبية حجم البكتيريا) على ماصة 0.5-10 ميكرولتر. استخراج البكتيريا الفردية من حل برنامج تلفزيوني في ميكرولودر.
    4. غسل البكتيريا للقضاء على تلوث أنسجة الذبابة البيضاء الأخرى عن طريق بيبتينغ البكتيريا في حل برنامج تلفزيوني واستخراج البكتيريا. كرر ثلاث مرات.
    5. ماصة على الفور البكتيريا غسلها في أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على 60 ميكرولتر من حل بس 1X.
    6. المحقنة تصفية البكتيريا تجميعها من خلال غشاء فلتر 5 ميكرون (تحددها أحجام البكتيريا ونواة البكتيريا في الذبابة البيضاء). كرر عدة مرات لنقل السائل المختلط من خلال غشاء فلتر بدقة.
      ملاحظة: لتحقيق نتيجة أفضل من التضخيم والتسلسل، وتجميع أكثر من 100 بكتيريوميس. الرطب غشاء فلتر أولا باستخدام 1X حل برنامج تلفزيوني لتقليل فقدان البكتيرياملزمة للغشاء.

    5. التضخيم من جينوميس إندوسيمبيونت

    1. تضخيم الترشيح (التي تحتوي أساسا على إندوسيمبيونتس الذبابة البيضاء) باستخدام مجموعة تضخيم الحمض النووي من قبل بروتوكول الموصى بها مع بعض التعديل.
      1. اختيار بروتوكول الموصى بها من التضخيم من الحمض النووي الجيني من الدم أو الخلايا وإعداد D2 العازلة لتجربة لاحقة.
      2. إضافة مباشرة 1.5 ميكرولتر من الترشيح (انظر القسم 4.6) إلى أنبوب الطرد المركزي، تليها 1.5 ميكرولتر من العازلة D2 وتخلط جيدا.
      3. احتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة وإضافة 1.5 ميكرولتر من حل التوقف.
      4. إضافة 15 ميكرولتر من المخزن المؤقت التفاعل و 1 ميكرولتر من البلمرة الحمض النووي وتخلط بلطف.
      5. احتضان الخليط في 30 درجة مئوية لمدة 16 ساعة، تليها 3 دقائق عند 65 درجة مئوية.
    2. أداء ير مباشرة على الترشيح تضخيم (تمييع عينات تضخيم إذا لزم الأمر) باستخدام الاشعال محددة مصممة ل باكتيريا لتأكيد أنواع البكتيريا (انظر القسم 2.1).
    3. إجراء ير لتأكيد ما إذا كان هناك تلوث الجينوم المضيف باستخدام الجين الذبابة البيضاء بيتا أكتين و EF1 الاشعال وفقا لطريقة نشرت سابقا 21 (وصف وصف ير في القسم 1.4).

    6. إندوسيمبيونت ميتاجينوم التسلسل

    1. تخضع الترشيح المضخم إلى مقياس الطيف وفلورومتر (وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) قبل التسلسل لاختبار جودة العينات وعما إذا كانت العينات تستوفي معايير التسلسل.
    2. قم بتصنيع المضخم إلى جهاز الجينوم وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد أخذت أنواع الشرق الأوسط آسيا الصغرى 1 (MEAM1) من مجمع B. تاباسي كمثال هنا للتوصيف. ويظهر الشكل رقم 1 قطن لتربية ويتفليز وعدة مراحل تنموية للبيض الأبيض، بما في ذلك نبات القطن والذبابة البيضاء للكبار وحوريات الذبابة البيضاء الأولى والثانية والرابعة (تبدو الحورية الثالثة المستقيمة مشابهة للحوري الرابع من الحورية ). كان من الواضح أن الحورية 4th إنستار هو أكبر من الحوريات 1ST و 2nd إنستار ( الشكل 1 ). ويظهر تحليل فيش من بورتيرا و هاميلتونيلا ضمن MEAM1 في الشكل 2 . ويقتصر هذين إندوسيمبيونتس على البكتيريا من الذبابة البيضاء، ويلاحظ أيضا تداخل البكتيريا اثنين. ويبين الشكل 3 إرسال الكهرباء ترون الصور المجهرية من إندوسيمبيونت بورتيرا من الذبابة البيضاء، مما يدل على أن بورتيرا قد تفقد جدار الخلية.

للتسلسل، تم بناء مكتبتين، مع أحجام إدراج من 200 بي بي و 2،000 بي بي، على التوالي. وبعد التسلسل، ولدت المكتبتان 1،626 ميغابايت و 1،302 ميغابايت من البيانات الخام، على التوالي. بعد تنظيف بيانات التلوث للمهايئات والازدواجية، تم الحصول على 1،484 ميغابايت و 1،219 ميغابايت من البيانات النظيفة. نجحت الجمعية بنجاح في تسلسل الجينوم الكامل للالمتزامسة ، بورتيرا . وبالإضافة إلى ذلك، تم الحصول على مشروع الجينوم من هاميلتونيلا أيضا. وأسفرت الجمعية التي استندت إلى المكتبات التي يبلغ عددها 200 مكتبة ثانوية و 000 2 مكتبة ثانوية عن 138 مقالة. وفقا للعلاقات بين الزوجين، تم تجميع 138 كونتيغس كذلك في 89 السقالات ( الجدول 2 ).

فيجيمج "سرك =" / فيليز / ftp_upload / 55809 / 55809fig1.jpg "/>
الشكل 1: نظرة عامة على نظام الحشرات النباتية المستخدمة في هذه الورقة. ( A ) يربيت النباتات البيضاء على نباتات القطن ( غوسيبيوم هيرسوتم كف . زهي-ميان 1793). ( ب ) عرض الذبابة البيضاء الكبار. ( C ) عدة مراحل إنمائية من الحورية إنستار في دورة الحياة الذبابة البيضاء. السهم الأحمر يشير إلى بيضة الذبابة البيضاء. السهم الأسود يشير إلى 1 حورية إنستار ست الذبابة البيضاء. السهم الأبيض يشير إلى الحورية الثانية 2 من الذبابة البيضاء. السهم الأزرق يشير إلى الحورية 4 إنستار من الذبابة البيضاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: تحليل الأسماك من بورتيرا ، هامإلتونيلا في الحورية 4 إنستار من MEAM1. تم استخدام مسبار خاص بورتيرا (أحمر) مترافق مع CY3، مسبار هاميلتونيلا (أخضر) ملحوظ ب CY5. مقياس الحانات = 100 ميكرون. ( A ) إشارات التهجين الحمراء تمثل بورتيرا تحت حقل مظلم. ( B ) إشارات التهجين الخضراء تمثل هاميلتونيلا تحت حقل مظلم. ( C ) بورتيرا و هاميلتونيلا دمج الإشارات تحت الحقل المظلم. ( D ) بورتيرا و هاميلتونيلا دمج الإشارات تحت حقل مشرق. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: ناقل الإلكترون الصغيرسكوبي صورة، بسبب، بورتيرا، إلى داخل، ويتيفلي . السهم يشير إلى موقع بورتيرا . شريط مقياس = 1 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الهدف سيمبيونت الجين المستهدف تسلسل التمهيدي (5'-3 ') إجراءات ير المراجع
Portiera 16S الريباسي بور-F: تسكاغتكغغكاتكات 95 درجة مئوية 1 دقيقة، 60 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 5 دورات. 27
بور-R: أاغتسكغكتاتغت 9576؛ C 1 دقيقة، 58 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 30 دورات.
72 درجة مئوية 20 دقيقة
Hamiltonella 16S الريباسي هام-F: تغاغتاغكتغاتكتغ 95 درجة مئوية 1 دقيقة، 60 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 5 دورات. 27
هام-R: كغغاكتاكاكغتاغ 95 درجة مئوية 1 دقيقة، 58 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 30 دورات.
72 درجة مئوية 20 دقيقة
كساح 16S الريباسي ريك-F: غتكاغاساككتاتك 95 درجة مئوية 2 دقيقة؛ 24
ريك-R: غاغاغاكتكتكغ 92 درجة مئوية 1 دقيقة، 58 °C 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 90 ثانية، 30 دورات.
72 درجة مئوية 5 دقائق
Arsenophonus 23S الرنا الريباسي أرس-F: غتغاتغاتكاتاغتساا 95 درجة مئوية 5 دقائق؛ 28
أرس-R: غتكتكتاغتغتاكاك 95 و ديغ؛ c 30 s، 60.5 و ديغ؛ c 30 s، 72 و ديغ؛ c 45 s، دورات 30؛
72 درجة مئوية 10 دقيقة
Cardinium 16S الريباسي كار-F: تاكتتاغاتاغاكغك 95 درجة مئوية 2 دقيقة 29
كار-R: غغاتاكاكتاككتسغ 92 ° C 1 دقيقة، 57 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 90 ثانية، 30 دورات.
72 درجة مئوية 5 دقائق
الولبخية 16S الريباسي ول-F: تغتاغكتاتغاتاتاكت 94 درجة مئوية 5 دقائق؛ 30، 31
ول-R: غاتاغاتغاتكاتغت 94 درجة مئوية 1 دقيقة، 55 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 1 دقيقة، 35 دورات
Fritschea 23S الرنا الريباسي الجمعة-F: غاتككتغكاتغاتغاتغاغا 95 درجة مئوية 5 دقائق؛ 32
الجمعة-R: تغتكاتكاتكاغاغا 94 درجة مئوية 1 دقيقة، 64 درجة مئوية 1 دقيقة، 72 درجة مئوية 90 ثانية، 35 دورات.
72 درجة مئوية 5 دقائق
Hemipteriphilus groEL أورغرويل -F: كاكواواتاكتاغاتغ 94 درجة مئوية 3 دقائق؛ 18
أورغرويل -R: تاجارتكاتوككاتوك 94 درجة مئوية 30 ثانية، 52 درجة مئوية 30 ثانية، 72 درجة مئوية 2 دقيقة، 34 دورات.
72 درجة مئوية 10 دقيقة

الجدول 1: الاشعال ير والإجراءات من إندوسيمبيونتس في الذبابة البيضاء.

Portiera Hamiltonella
رقم كونتيغ 1 138
سقالة رقم أ 1 89
الطول الإجمالي، بب 358232 1711449
N50، بب / 118802
N90، بب / 16753
أقصى طول، بب / 390511
دقيقة طول، بب / 503
محتوى غ،٪ 26.18 39.89
(أ) المعلومات الواردة أدناه تستند كلها إلى السقالات.

الجدول 2: الملامح العامة ل بورتيرا وهاملتونيلا مشروع الجينوم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وقدم الدعم المالي لهذه الدراسة من قبل البرنامج الوطني للبحوث والتنمية الرئيسية (2016YFC1200601) والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31390421).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq DNA polymerase Takara R001A including rTaq, 10×Buffer and dNTP
Gel DNA extraction kit Qiagen 28704
DNA sample sequencing system ABI ABI-3730XL
Microtome Leica EM UC7
Transmission electron microscopy Hitachi H-7650 TEM
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
20 μL microloader Eppendorf F2771951
Filter holder Millipore SX0001300
Filter membrane filter Millipore SMWP001300 5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit Qiagen 150033 DNA amlification kit
NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Genome Sequencer Illumina Hiseq 2000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), Interscience. New York. (1967).
  2. Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
  3. Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
  4. Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
  5. Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
  6. Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
  7. Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
  8. Nikoh, N., et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).
  9. Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
  10. Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
  11. Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
  12. Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
  13. Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
  14. Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
  15. De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
  16. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  17. Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
  18. Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
  19. Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
  20. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
  21. Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
  22. Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
  23. Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
  24. Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
  25. Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
  26. Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
  27. Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
  28. Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
  29. Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
  30. O'Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
  31. Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
  32. Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts 'Candidatus Fritschea bemisiae' strain Falk and 'Candidatus Fritschea eriococci' strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).

Tags

البيولوجيا الجزيئية، العدد 124،
طرق استخراج إندوسيمبيونتس من الذبابة البيضاء<em&gt; بيميسيا تاباسي</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, D. T., Wang, X. R., Ban, F. X., … More

Zhu, D. T., Wang, X. R., Ban, F. X., Zou, C., Liu, S. S., Wang, X. W. Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci. J. Vis. Exp. (124), e55809, doi:10.3791/55809 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter