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Biology

व्हाइटफ़्लु से एन्डोसोम्बियंट्स के एक्सट्रैक्शन के लिए तरीके Published: June 19, 2017 doi: 10.3791/55809
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Ministry of Agriculture Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogen and Insects, Institute of Insect Sciences, Zhejiang University

Summary

यहां, हम विच्छेदन और निस्पंदन के माध्यम से सफेद पट्टी बामिसिया टैबैसी से एंडोसिंबियनों को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल पेश करते हैं। प्रवर्धन के बाद, डीएनए नमूने बाद के अनुक्रमण और एन्डोसोम्बोनट्स और व्हाइटफ़ीली के बीच पारस्परिकता के अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं।

Abstract

बैक्टीरियल symbionts अपने मेजबान के साथ एक अंतरंग संबंध बनाते हैं और अधिकतर मामलों में होस्ट को फायदे प्रदान करते हैं। जीनोमिक जानकारी उनके होस्ट में बैक्टीरियल सिम्बिनीयल्स के कार्यों और विकास का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। चूंकि इन विट्रो में अधिकतर सिम्बिनीयतों को सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है, जीनोम अनुक्रमण के लिए पर्याप्त मात्रा में बैक्टीरिया को अलग करने के तरीकों बहुत महत्वपूर्ण हैं। व्हाइटप्ले बमेंसिया टैबैसी में , कई एंडोसिंबियन का पता लगाया गया है और कई दृष्टिकोणों के माध्यम से कीटनाशकों के विकास और प्रजनन में महत्व की भविष्यवाणी की गई है। हालांकि, संघों को नियंत्रित करने वाली तंत्र काफी हद तक अनजान बनी हुई है। बाधा आंशिक रूप से इस तथ्य से आती है कि श्वेतपथ में अन्तर्निर्मित बृहदान्त्र, ज्यादातर बैक्टीरियोसाइट्स में संयोजित होते हैं, मेजबान कोशिकाओं से अलग होते हैं। यहां हम मुख्य रूप से विच्छेदन द्वारा whitefly बी टैबैसी से एंडोसम्बियंट्स की पहचान, निष्कर्षण और शुद्धि के लिए एक कदम-दर-चरण प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं।पर और निस्पंदन एंडोसिंबियन नमूने इस पद्धति द्वारा तैयार किए गए हैं, हालांकि अभी भी विभिन्न एंडोसम्बियंट प्रजातियों का मिश्रण, बाद के जीनोम अनुक्रमण के लिए उपयुक्त हैं और बी टैबसी में एंडोसिंबियन के संभावित भूमिकाओं का विश्लेषण कर रहे हैं। इस पद्धति का उपयोग अन्य कीड़ों से एंडोसिंबोनियों को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है।

Introduction

रिश्तेदार होस्ट्स के साथ एक अंतरंग सहजीवी संबंध बनाने वाले बैक्टीरिया, आर्थथोपॉड 1 में व्यापक हैं। एंडोसिंबबियंट्स को मेजबानों के पहलुओं, जैसे पोषण चयापचय, प्रजनन, पर्यावरण के प्रति प्रतिक्रियाओं 2 , 3 , 4 आदि को प्रभावित करने के लिए लगभग सभी विकास चरण 5 में प्रभावित किया गया है। हालांकि, संघों को दबाकर रखने वाला तंत्र अभी भी काफी अज्ञात है। बैक्टीरिया के संभावित कार्यों और भूमिकाओं का अध्ययन करते समय जीनोमिक्स प्राथमिकता और महत्व का होता है कुछ मूलभूत जानकारी, अर्थात् टैक्सोनोमिक स्थिति, कार्यात्मक जीन, चयापचय मार्ग, स्राव सिस्टम, को जीनोम अनुक्रम से अनुमानित किया जा सकता है, जो सहजीवन में symbionts की संभावित भूमिकाओं पर रोशनी डालती है। उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के विकास के साथ, जीवाणु जीनोम की एक बड़ी संख्या अनुक्रमित की गई हैविभिन्न कार्यों से पता चला 6

एन्डोसम्बियंट्स हेमिपटरस में महत्वपूर्ण महत्व हैं, जैसे एफिड्स 7 , बेडबग्स 8 , साइलिनिड 9 , ब्राउन प्लांटहोपर 10 और सीकाडस 11 । उदाहरण के लिए, एफ़िड्स में बाखनेरा , बाध्यता सिम्बिनेटल के रूप में, अफीम जीनोम 12 के जीनों के साथ, आवश्यक अमीनो एसिड बायोसिंथेसिस में शामिल होने का प्रदर्शन किया गया है। इसके अलावा, Buchnera के ट्रांसक्रिप्शनल नियमन भी 13 पता चला है Psyllids में, कारोंलाला अनुक्रमित है और सबसे छोटी जीवाणु जीनोम को 14 बार मिला है। एंडोसिंबबियंट्स के इन सभी लक्षणों को जीनोम अनुक्रमों से आधारित और अनुमानित किया गया है। क्योंकि इन इन्सट्रॉम्बियंट्स को इन विट्रो में संवर्धित नहीं किया जा सकता है, इसलिए कई तरीकों को सैक के लिए पर्याप्त जीवाणुओं को अलग करने के लिए लागू किया गया हैuencing। एफिड्स में, एंडोसम्बियंट्स को सेंट्रीफ्यूगेशन और निस्पंदन के माध्यम से निकाला जाता है, और आगे जीनोमिक और ट्रांस्क्रिप्टोमिक विश्लेषण 5 के अधीन होता है। भूरे रंग के वृक्षारोपण में, एंडोसिम्बियंट्स पूरी कीट जीनोम 10 के साथ अनुक्रमित होते हैं।

व्हाइटफ़ी बी टैब्सी एक प्रजाति का परिसर है जिसमें 35 से अधिक morphologically अप्रभेद्य प्रजातियां (गुप्त प्रजातियां) हैं, जिनमें से दो आक्रामक प्रजातियों ने दुनिया भर में आक्रमण किया है और कृषि उत्पादन को भारी नुकसान पहुंचाया है 15 ध्यान दें, बी टैबसी प्रजातियों के अन्दर अनन्द्यम्बियंट्स ने कीड़ों के विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। तिथि करने के लिए, आठ एन्डोसोम्बियंट्स की पहचान सफेदवट में हुई है , जिसमें दायित्व सिम्बियन , कैंडिडाटस पोर्टिएरा एलेरोदिडेरम और सात माध्यमिक सिम्बिमेंट्स हैमिल्टनला , रिकेट्सिया , आर्सेनफोनीस , कार्डिनियम ,Em> वोलबैकिया, फ्रित्श्चिया और हेमपरफ़ीलास ने 17 , 18 को परिभाषित किया।

पहले वर्णित हेमिपटर के विपरीत, सफ़ेदता बी टैब्सी एक बहुत ही छोटे कीट है जो केवल 1 मिमी लंबाई में है। अधिकांश एन्डोसोम्बियंट्स 1 9 (बैक्टीरियोसाइट्स 1 से युक्त विशेष कोशिकाएं हैं, जिसमें सीम्बोनट्स होते हैं, जो आगे बी टैबसी में जीवाणु बनाते हैं)। इसके अलावा, इन एंडोसिंबों को इन विट्रो में सुसंस्कृत नहीं किया जा सकता है बी टैबसी से एंडोसिंबियंट्स प्राप्त करने का एकमात्र तरीका जीवाणुओं को बाहर निकालना है। हालांकि, विच्छेदन में कठिनाई होती है। सबसे पहले, नाजुक जीवाणु हमेशा सफेदपट्टी के अन्य ऊतकों से जोड़ता है, जो अलग होने के लिए कठिन है। दूसरे, सफ़ेदता का छोटा आकार पर्याप्त जीवाणुओं के अलगाव को सीमित करता है। तीसरा, जीवाणुओं में क्लस्टर एन्डोसोम्बियंट्स, यह जीवाणु की एक प्रजाति को प्राप्त करने के लिए बेहद जटिल है।

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Protocol

1. व्हाईटवेटी पोलिंग एंड क्रिप्टिक प्रजाति पहचान

  1. कपास Gossypium hirsutum (Malvaceae) (cv। Zhe-Mian 1 9 73) पर whitefly प्रजातियों को 27 ± 1 डिग्री सेल्सियस, 70 ± 10% आर्द्रता और 14 घंटे प्रकाश की मानक शर्तों के तहत पिंजरों में बनाए रखें: 10 घंटे अंधेरे शासन।
  2. एक व्यक्तिगत वयस्क सफेदव्यू लीजिए और 30 μL लिसन बफर (10 एमएम ट्रिस, पीएच 8.4, 50 एमएम केसीएल, 0.45% [वाइट / वॉल्यूम] टीवीन -20, 0.2% [वाइट / वॉल्यूम] जिलेटिन, 0.45% [वॉल्यूम / वॉल्यूम] नॉनिडेट पी 40, 60 ग्राम / एमएल प्रोटोनीस कश्मीर)
  3. एक डिग्री सेल्सियस के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर homogenate सेते हैं और फिर 10 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस
    नोट: यदि आवश्यक हो तो 65 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन समय बढ़ाया जा सकता है 100 डिग्री सेल्सियस के ऊष्मायन समय को प्रोटीनसे के कण को ​​निष्क्रिय करने और डीएनए क्षति से बचने के लिए गंभीर रूप से नियंत्रित किया जाना चाहिए।
  4. मिटोकोंड्रियल साइटोक्रोम ऑक्सीडेज आई प्राइमर्स पर आधारित सफ़ेदफ़्लो डीएनए (सेक्शन 1.3 में अधिग्रहण) का उपयोग करते हुए पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) करना।
    सीओआई-एफ: 5'-टीटीजीएटीटीटीटीटीजीजीटीएटीसीसीएएजीटी -3 '
    सीओआई-आर: 5'-टाटैटजीजीकागेट टीजीसीएटीटीजीजीए -3 '
    1. पीसीआर प्रतिक्रियाओं को अंतिम मात्रा में 25 μL युक्त 1 यू Taq डीएनए पोलीमरेज़, 2.5 μL 10x बफर, 0.2 मिमी डीएनटीपी, प्रत्येक प्राइमर के 0.2 मिमी और 2 μL सफेदपन डीएनए युक्त करना।
    2. निम्न पीसीआर प्रक्रिया की शर्तों का प्रयोग करें: प्रारंभिक विकृति 95 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट के लिए, 45 डिग्री (विकृति) के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र, 45 एस (एनीलिंग) के लिए 50 डिग्री सेल्सियस और 1 मिनट (विस्तार) के लिए 72 डिग्री सेल्सियस अधिक विस्तार के लिए 72 डिग्री सेल्सियस पर एक और 10 मिनट।
  5. सुझाए गए प्रोटोकॉल के साथ डीएनए जेल निष्कर्षण किट का उपयोग करके पीसीआर प्रवर्धित उत्पाद को साफ करें।
  6. निर्माता के निर्देश के बाद एक डीएनए नमूना अनुक्रमण प्रणाली के साथ शुद्ध डीएनए नमूनों को अनुक्रमित करें।
  7. श्वेतपथ की गुप्त प्रजातियों की पहचान करने के लिए मूल स्थानीय संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) का उपयोग करके अनुक्रमों का विश्लेषण करें और अन्य विशेषताओं के प्रदूषण से बचेंतों।

2. एंडोसिंबियन पहचान और स्थानीयकरण

  1. श्वेतपथ (पीपीआर नुस्खा अनुभाग 1.4 में वर्णित है, और पीसीआर प्रक्रियाओं और प्राइमरों को तालिका 1 में सूचीबद्ध किया गया है) के भीतर प्रत्येक एंडोसिंबियन के विशिष्ट जीन को बढ़ाना करने के लिए सफेद वायरस डीएनए (चरण 1.3 में प्राप्त) पर पीसीआर करें।
  2. प्रत्येक जीवाणु के विशिष्ट जीन की पहचान करने के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 20 (1% agarose gel, tris-acetate-EDTA बफर, वोल्टेज 5 वी / सेमी) के अनुसार agarose जेल वैद्युतकणसंचलन के लिए प्रवर्धित नमूना विषय।
  3. व्हाइटफ़्लू में जीवाणु प्रजातियों को निर्धारित करने के लिए प्रत्येक बैंड को पुनर्प्राप्त और अनुक्रमित करें (अनुभाग 1.5-1.7 देखें)।
  4. पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल 19 के अनुसार एंडोसम्बियंट्स के स्थान की पहचान करने के लिए सफ़ेद पंखों पर स्वस्थानी संकरण (एफआईएसएच) में प्रतिदीप्ति करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो तो फ्लोरोसेंट जांच की एकाग्रता को बढ़ाएं।
    5. 3. ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर)

    1. 4 घंटे के लिए 2.5% [vol / vol] glutaraldehyde युक्त फ़ॉस्फेट बफर (0.1 एम, पीएच 7.0) में व्हाइटफ़ील्स को विसर्जित करें और ठीक करें।
    2. फॉस्फेट बफर (0.1 एम, पीएच 7.0) में नमूने तीन बार, 15 मिनट प्रत्येक बार धो लें।
    3. फॉस्फेट बफर (0.1 एम, पीएच 7.0) में दो बार नमकों को विसर्जित करें और 2 घंटे के लिए 1% [wt / vol] ओएसओ 4 युक्त करें।
    4. नमूनों को एथेनॉल (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% और 100%) की श्रेणीबद्ध श्रेणी से हर समय 15 मिनट में डिलीऑफ़ करें।
    5. 20 मिनट के लिए 100% एसीटोन में नमूनों को हस्तांतरण और विसर्जित करें।
    6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए 100% एसीटोन और 100% स्पायर राइन (1: 1) के मिश्रण में नमूने रखें।
    7. कमरे के तापमान पर 3 घंटे के लिए 100% एसीटोन और 100% स्पायर राल (1: 3) के मिश्रण के नमूनों को स्थानांतरित करें।
    8. नमूनों को 9% से अधिक के लिए 100% स्पायर राइन (70 डिग्री सेल्सियस से अधिक से अधिक) में विसर्जित करें।
    9. एक सूक्ष्म का उपयोग करके सफ़ेदता के नमूने अनुभागमेरे लिए।
    10. अल्ट्रा-पतली फिल्मों (5.9 मिनट में अधिग्रहीत), 5-10 मिनट के लिए पूर्ण uranyl एसीटेट में विसर्जन करके, और 5-10 मिनट के लिए 50% क्षारीय लीड साइट्रेट में विसर्जन किया गया।
      नोट: खंड 3.1-3.10 में उपयोग किए गए अभिकर्मकों की मात्रा नमूनों पर निर्भर करती है। सुनिश्चित करें कि नमूने अभिकर्मकों में डुबोए जाते हैं।
    11. अधिक उपयोग के लिए बैक्टीरिया के स्थानीयकरण, आकार और आकार का निर्धारण करने के लिए ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (15,000 एक्स) के तहत नमूने देखें (खंड 4.6 देखें)।

    4. व्हाईटवेट जीवाणु विच्छेदन और शुद्धि

    1. माइक्रोस्कोप स्लाइड पर 100 μL का 1x पीबीएस समाधान जोड़ें। कपास की पत्तियों से कुछ 3 या 4 वें अंडार नंफ्स उठाएं और पीबीएस समाधान में विसर्जित करें।
    2. स्टिरिओमिकोरोस्कोप के तहत ठीक कीटनाशक सुइयों का उपयोग करें और बैक्टीरियोमॉप्स को व्हाइटफ़ीली बॉडी से बाहर खींचें।
      1. अप्सरा के एक तरफ धीरे से एक छेद में कटौती, और थोड़ा अन्य प्रेसपक्ष के जीवाणुओं को बाहर जाने के लिए
    3. एक 0.5 μL विंदुक पर एक 20 μL माइक्रोनलोडर (जीवाणु के आकार को पूरा करने के लिए प्रमुख अंत में कटौती के साथ) माउंट करें। माइक्रोबायलोडर में पीबीएस समाधान से व्यक्तिगत जीवाणु निकालें।
    4. जीवाणुओं को जीवाणुओं को पीबीएस समाधान में पिपेट करके और जीवाणुओं को निकालने के द्वारा अन्य व्हाईटफ़िट ऊतकों के प्रदूषण को खत्म करने के लिए जीवाणु धोएं। तीन बार दोहराएं
    5. 1x पीबीएस समाधान के 60 μL युक्त एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में धोया गया जीवाणु को तुरंत विंदित करें।
    6. 5 माइक्रोन फिल्टर झिल्ली के माध्यम से इकट्ठे हुए जीवाणुओं को सिरिंज फ़िल्टर (सफेदटाइट में जीवाणु और जीवाणुओं के नाभिक द्वारा निर्धारित)। फिल्टर झिल्ली के माध्यम से मिश्रित तरल को अच्छी तरह से स्थानांतरित करने के लिए कई बार दोहराएं।
      नोट: प्रवर्धन और अनुक्रमण का बेहतर परिणाम प्राप्त करने के लिए, 100 से अधिक जीवाणुओं को इकट्ठा करें। पहले बैक्टीरिया के नुकसान में कमी के लिए 1x पीबीएस समाधान का उपयोग करके फिल्टर झिल्ली को गीला करेंझिल्ली के लिए बाध्यकारी

    5. एंडोसोम्बोनट जीनोम का प्रवर्धन

    1. कुछ संशोधनों के साथ अनुशंसित प्रोटोकॉल द्वारा डीएनए प्रवर्धन किट का उपयोग करते हुए छानना (मुख्य रूप से सफेदफ़्लू के एंडोसम्बियोन युक्त) बढ़ाएं।
      1. खून या कोशिकाओं से जीनोमिक डीएनए के प्रवर्धन का अनुशंसित प्रोटोकॉल चुनें और बाद के प्रयोग के लिए बफर डी 2 तैयार करें।
      2. सीधे 1.5 μL छानना (खंड 4.6) को अपकेंद्रित्र ट्यूब में जोड़ें, बफर डी 2 के 1.5 μL के बाद और अच्छी तरह से मिलाएं।
      3. 10 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं और स्टॉप सॉल्यूशन के 1.5 μL जोड़ें।
      4. डीएनए पोलीमरेज़ की प्रतिक्रिया बफर और 1 μL के 15 μL जोड़ें और धीरे मिश्रण करें।
      5. मिश्रण 16 डिग्री सेल्सियस के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर, 3 मिनट के बाद 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    2. बीएसी के लिए डिज़ाइन किए गए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके परिष्कृत छानना (सीधे अगर प्रवर्धित नमूनों को पतला हो) पर सीधे पीसीआर करेंटेरेआ जीवाणु प्रजातियों की पुष्टि करने के लिए (देखें खंड 2.1)।
    3. पीसीआर को यह पुष्टि करने के लिए कि क्या पहले से प्रकाशित विधि 21 (पीसीआर नुस्खा अनुभाग 1.4 में वर्णित है) के अनुसार व्हाइटफ़ीली जीन बीटा-एक्टिन और ईएफ 1 प्राइमरों का उपयोग करके मेजबान जीनोम के प्रदूषण की पुष्टि है।

    6. एन्डोसिम्बिनेट मेटैगोनी सिक्वेंसिंग

    1. नमूनों की गुणवत्ता का परीक्षण करने के लिए अनुक्रमण करने से पहले और नमूने अनुक्रमण के लिए मानदंडों को पूरा करते हैं या नहीं, एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर और एक फ्लोरामीटर (निर्माता के निर्देशों के हिसाब से) के लिए प्रपूरित छानने का विषय।
    2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार जीनोम सिक्वेंसर को बढ़ाया विषय।

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Representative Results

बी। टैबै कॉम्प्लेक्स की मध्य पूर्व एशिया माइनर 1 (एमईएएम 1) प्रजातियों को विवरण के लिए यहां एक उदाहरण के रूप में लिया गया था। व्हाइटफ़्लिज़ के सफेद फूलों और कई विकासात्मक चरणों के पालन के लिए कपास, सूती पौधे, वयस्क सफ़लता और 1 सेंट, 2 एनडी और 4 वें अंडरशायर व्हाइटफली (3 वें instar अप्सरा) के साथ चित्रा 1 में दिखाया गया है जैसा कि 4 वें instar अप्सरा के समान दिखता है )। यह स्पष्ट था कि 4 वें instar अप्सरा 1 सेंट और 2 एन डी instar nymphs ( चित्रा 1 ) से बड़ा है। मेमे 1 के भीतर पोर्टिरा और हैमिल्टनला का एफआईएसएच विश्लेषण चित्रा 2 में दिखाया गया है। ये दो एन्डोसोम्बोनट्स सफेदफ़्लू के बैक्टीरियोसाइट्स तक सीमित हैं, और दो जीवाणुओं के ओवरलैपिंग को भी देखा जाता है। चित्रा 3 चित्रा 3 पता चलता है सफेद सफ़ेद के पोर्टिएरा एंडोसिंबियन के ट्रॉन माइक्रोस्कोपी चित्र, जो इंगित करता है कि पोर्टिएरा अपनी सेल की दीवार खो सकता है।

अनुक्रमण के लिए, क्रमशः 200 बीपी और 2,000 बीपी के सम्मिलित आकार के साथ, दो पुस्तकालयों का निर्माण किया गया। अनुक्रमण के बाद, दो पुस्तकालयों क्रमशः 1,626 एमबी और 1302 एमबी कच्चे डेटा का उत्पादन किया। एडेप्टर और डुप्लिकेशन्स के लिए दूषित डेटा को साफ करने के बाद, 1,484 एमबी और 1,21 9 एमबी स्वच्छ डेटा हासिल कर लिया गया। असेंबली को सफलतापूर्वक बाध्यता सिम्बियन, पोर्टियर के लिए एक पूर्ण जीनोम अनुक्रम मिला। इसके अलावा, हैमिल्टनला का मसौदा जीनोम भी प्राप्त किया गया था। दोनों 200 बीपी और 2,000 बीपी पुस्तकालयों पर आधारित विधानसभा के परिणामस्वरूप 138 contigs युग्मित अंत संबंधों के अनुसार, 138 contigs को फिर से 89 स्कॉफल्ड ( टेबल 2 ) में इकट्ठा किया गया था।

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चित्रा 1: इस पेपर में उपयोग की गई संयंत्र-कीट प्रणाली का अवलोकन ( ए ) कपास के पौधों पर सफेद फूलों का पालन किया जाता है ( गोस्पीपियम हर्सुतम सीवी। Zhe-Mian 1793)। ( बी ) एक वयस्क whitefly का दृश्य ( सी ) श्वेतपथ जीवन चक्र में इंस्टर्स अप्सरा के कई विकास चरणों। लाल तीर whitefly के अंडे को संदर्भित करता है; काली तीर whitefly के 1 सेंट instar अप्सरा को संदर्भित करता है; सफेद तीर whitefly के 2 एनएमएम को संदर्भित करता है; नीले तीर whitefly के 4 वें instar अप्सरा को संदर्भित करता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: पोर्शेरा , हम का मछली विश्लेषणआईएमएएम 1 के 4 वें इंस्टर्स एनम्फ में इलटनला पिएरिएरा-विशिष्ट जांच (लाल) साइ 3 से संयुग्मित, हैमिल्टनला- विशिष्ट जांच (हरा) साइरस के साथ चिह्नित थी। स्केल सलाखों = 100 माइक्रोन ( ए ) लाल संकरण संकेत ब्लैक फील्ड के तहत पोर्टिएरा को दर्शाते हैं। ( बी ) ग्रीन संकरण सिग्नल अंधेरे क्षेत्र के तहत हैमिल्टनला का प्रतिनिधित्व करते हैं । ( सी ) पोर्टिरा और हैमिल्टनला अंधेरे क्षेत्र के तहत सिग्नल को मिला दिया। ( डी ) पोंटेरा और हैमिल्टनला उज्ज्वल क्षेत्र के तहत विलय के संकेत। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र तीन
चित्रा 3: ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कॉपी व्हाइटर्टी में पोर्टिएरा की छवि तीर Portiera के स्थान को इंगित करता है स्केल बार = 1 सुक्ष्ममापी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

लक्ष्य सिम्बियन लक्ष्य जीन प्राइमर अनुक्रम (5'-3 ') पीसीआर प्रक्रियाएं संदर्भ
Portiera 16 एस आरआरएनए पोर-एफ: टीजीसीएएजीटीसीजीएजीसीजीजीसीएटीएसीएटी 95 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 60 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 5 चक्र; 27
पोर-आर: एएजीटीटीसीसीसीजीसीसीटीटीएटीजीसीजीटी 9576; सी 1 मिनट, 58 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 30 चक्र;
72 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट
Hamiltonella 16 एस आरआरएनए हाम-एफ: टीजीगटाएएजीटीसीजीजीजीएटीटीटीजीजी 95 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 60 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 5 चक्र; 27
हाम-आर: सीसीसीजीजी जीएएसीएजीटीटीटीटीसीएसीसीजीTAG 95 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 58 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 30 चक्र;
72 डिग्री सेल्सियस 20 मिनट
रिकेटसिआ 16 एस आरआरएनए रिक-एफ: जीसीटीसीएजीएएसीएजीएसीजीसीटीएटीसी 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट; 24
रिक-आर: गागागाएगैक्टक्ट सीजीसी 92 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 58 डिग्रीसी 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस 90 एस, 30 चक्र;
72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
Arsenophonus 23 एस आरआरएनए एआरएस-एफ: CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट; 28
आरएस-आर: जीजीटीसीसीसीसीएजीटीTAG टीजीटीटीएसीसीसीसीएएसी 95 डिग्री सेल्सियस 30 एस, 60.5 डिग्री सेल्सियस 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस 45 एस, 30 चक्र;
72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट
Cardinium 16 एस आरआरएनए कार-एफ: टीएटीटीटीजीटीएएजीसीएसीसीजीजीसी 95 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट 29
कार-आर: जीटीजीजीटीसीएक्टटीएसीसीजीटीटीटीसीजी 92 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 57 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस 90 एस, 30 चक्र;
72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
Wolbachia 16 एस आरआरएनए वोल- F: TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT 94 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट; 30, 31
वोल-आर: गेटगगटटगैटटीटीटीएटीटीजीटी 94 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 55 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 35 चक्र
Fritschea 23 एस आरआरएनए शुक्र-एफ: जीएटीजीसीसीटीटीजीजीसीएटीटीगैगगगांवगागा 95 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट; 32
शुक्र-आर: टीजीजीसीटीसीएटीजीसीएएएजीजीसीए 94 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 64 डिग्री सेल्सियस 1 मिनट, 72 डिग्री सेल्सियस 90 एस, 35 चक्र;
72 डिग्री सेल्सियस 5 मिनट
Hemipteriphilus groEL या- ग्रोएल -F: सीएसीसीवाईएएटीटीएटीएएएगाटाजीजी 94 डिग्री सेल्सियस 3 मिनट; 18
या- ग्रोएल- आर: TAGAARTCCATWCCKCCCATWC 94 डिग्री सेल्सियस 30 एस, 52 डिग्री सेल्सियस 30 एस, 72 डिग्री सेल्सियस 2 मिनट, 34 चक्र;
72 डिग्री सेल्सियस 10 मिनट

तालिका 1: पीसीआर प्राइमर्स और एंडोसिंबयॉंट्स की व्हाइटफ़ेली में प्रक्रियाएं

Portiera Hamiltonella
Contig संख्या 1 138
पाड़ संख्या ए 1 89
कुल लंबाई, बीपी 358,232 1,711,449
N50, बीपी / 118,802
एन 90, बीपी / 16,753
अधिकतम लंबाई, बीपी / 390,511
न्यूनतम लंबाई, बीपी / 503
जीसी सामग्री,% 26.18 39.89
नीचे दी गई सूचनाएं सभी स्कॉफॉल्ड पर आधारित हैं।

सारणी 2: पोर्टिरा और हैमिल्टनला ड्राफ्ट जीनोम की सामान्य विशेषताएं

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

इस अध्ययन के लिए वित्तीय सहायता राष्ट्रीय महत्वपूर्ण अनुसंधान और विकास कार्यक्रम (2016 वाईएफसी 1200601) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (313 9 0421) द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq DNA polymerase Takara R001A including rTaq, 10×Buffer and dNTP
Gel DNA extraction kit Qiagen 28704
DNA sample sequencing system ABI ABI-3730XL
Microtome Leica EM UC7
Transmission electron microscopy Hitachi H-7650 TEM
Stereo microscope Zeiss Stemi 2000-C
20 μL microloader Eppendorf F2771951
Filter holder Millipore SX0001300
Filter membrane filter Millipore SMWP001300 5.0 μm SMWP
REPLI-g UltraFast Mini Kit Qiagen 150033 DNA amlification kit
NanoDrop Thermo Scientific NanoDrop 2000
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Scientific Q33216
Genome Sequencer Illumina Hiseq 2000

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References

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आणविक जीवविज्ञान अंक 124, एंडोसिंबियन जीनोम अनुक्रमण स्थानीयकरण शुद्धि व्हाईटफ़ीई
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Zhu, D. T., Wang, X. R., Ban, F. X., Zou, C., Liu, S. S., Wang, X. W. Methods for the Extraction of Endosymbionts from the Whitefly Bemisia tabaci. J. Vis. Exp. (124), e55809, doi:10.3791/55809 (2017).

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