Summary
在这里，我们提出了通过解剖和过滤从粉虱烟粉虱中分离内分泌物的方案。扩增后，DNA样品适用于后续测序和研究内共生与粉虱之间的共生关系。
Abstract
细菌共生体与宿主形成亲密关系，在大多数情况下赋予宿主优势。基因组信息对于研究其宿主细菌共生体的功能和进化至关重要。由于大多数共生体不能在体外培养 ，所以分离足够量的细菌用于基因组测序的方法是非常重要的。在粉虱Bemisia tabaci中 ，已经确定了许多内生子，并且通过多种方法预测害虫的发育和繁殖是重要的。然而，支持协会的机制仍然很大程度上是未知的。障碍部分来自于粉虱中的内分泌物，主要是抑制细菌，难以与宿主细胞分离。在这里我们报告一个主要通过解剖的粉虱B.烟粉虱鉴定，提取和纯化内分泌物的分步骤方案开和过滤。通过该方法制备的内含子样品虽然仍然是不同内分泌物种的混合物，但适用于随后的基因组测序和分析烟粉虱内共生菌的可能作用。这种方法也可用于从其他昆虫中分离内分泌物。
Introduction
与节肢动物形成密切共生关系的细菌广泛存在于节肢动物中。在几乎每个发育阶段5中 ，内分泌已被证明影响宿主的方面，如营养代谢，繁殖，对环境胁迫2,3,4 等的反应。然而，支持协会的机制仍然很大程度上是未知的。研究细菌的潜在功能和作用时，基因组学是重中之重。一些基本信息， 即分类学状态，功能基因，代谢途径，分泌系统，可以从基因组序列推断出来，揭示了共生体在共生中的潜在作用。随着高通量测序的发展，大量的细菌基因组已被测序各种功能揭示6 。
内含子在半ter子中是至关重要的，如蚜虫7 ，臭虫8 ，木虱9 ，褐飞虱10和蝉11 。例如，作为专性共生体的蚜虫中的Buchnera已被证明参与必需氨基酸生物合成，以及来自蚜虫基因组12的基因。此外， Buchnera的转录调控也显示13 。在木麻黄中， 卡桑奈尔被测序，并且是发现的最小的细菌基因组14 。所有这些内含子的标志都是基于基因组序列推断的。由于这些内生子宫内膜不能在体外培养 ，因此已经采用了几种方法来分离足够的细菌uencing。在蚜虫中，通过离心和过滤提取内生子，并进行进一步的基因组和转录组学分析。在褐飞虱中，内共生连同整个昆虫基因组10进行测序。
烟粉虱是一种含有超过35种形态不可区分物种（隐蔽物种）的物种，其中两种入侵物种已经入侵到世界各地，对农业生产造成了巨大的危害15 。值得注意的是， 烟粉虱物种内的内生梭菌在害虫16的发育中已显示出重要性。到目前为止，在粉虱中已经鉴定出8个内含子，其中包括专性共生体， Candidatus Portiera aleyrodidarum和七个次生共生体Hamiltonella，立克次体 ， Arsenophonus ， Cardinium ，Wolbachia， Fritschea和Hemipteriphilus定义为17,18 。
与以前描述的半扁桃不同，粉虱烟粉虱是一只极小的昆虫，长度只有1毫米。大多数内生子体被限制在细菌19 （含有共生体的特殊细胞，其进一步在烟粉虱中形成细菌）。此外，这些内生子宫内膜不能在体外培养 。从烟粉虱获得内生菌的唯一方法是将细菌分解出来。然而，解剖有困难。首先，脆弱的细菌总是与粉虱的其他组织连接，这是很难分离的。其次，粉虱的微小尺寸限制了足够细菌的分离。第三，内生菌群聚集在细菌中，使获得单一种细菌非常复杂。
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Protocol
白蛉饲养和隐蔽物种识别
- 在27±1℃，70±10％湿度和14小时光：10小时黑暗条件的标准条件下，将棉花棉属 （Malvaceae）（马鞭草科）（cv。Zhe-Mian 1973）保存在笼中。
- 收集单个成年粉虱，并在30μL裂解缓冲液（10mM Tris，pH 8.4,50mM KCl，0.45％[wt / vol] Tween-20,0.2％[wt / vol]明胶，0.45％[vol / vol] Nonidet P 40,60g / mL蛋白酶K）。
- 将匀浆在65℃孵育1小时，然后100℃孵育10分钟。
注意：如有必要，可以增加65℃的孵育时间。应严格控制100℃下的孵育时间，以充分灭活蛋白酶K并避免DNA损伤。 - 基于线粒体细胞色素氧化酶I引物，使用粉虱DNA（在1.3节获得）进行聚合酶链反应（PCR）。
COI-F：5'-TTGATTTTTTGGTCATCCAGAAGT-3'
COI-R：5'-TAATATGGCAGATTAGTGCATTGGA-3'- 进行PCR反应，最终体积为25μL，含有1U Taq DNA聚合酶，2.5μL10x Buffer，0.2 mM dNTP，0.2 mM各引物和2μL粉虱DNA。
- 使用以下PCR程序条件：初始变性95℃3分钟，然后35个循环，95℃45秒（变性），50℃45秒（退火）和72℃1分钟（延伸）35个循环;在72℃另外10分钟进一步延伸。
- 使用推荐的方案使用DNA凝胶提取试剂盒清洗PCR扩增产物。
- 按照制造商的说明，用DNA样品测序系统对纯化的DNA样品进行顺序。
- 使用基本局部比对搜索工具（BLAST）分析序列，以识别粉虱的隐蔽物种，避免其他物种的污染ES。
内分泌鉴定和定位
- 对粉虱DNA（步骤1.3获得）进行PCR，以扩增粉虱内每个内生子的特异性基因（PCR配方在1.4节中描述，PCR程序和引物列于表1 ）。
- 根据先前发布的方案20 （1％琼脂糖凝胶，Tris-乙酸盐-EDTA作为运行缓冲液，电压为5V / cm）使扩增的样品进行琼脂糖凝胶电泳，以鉴定每种细菌的特异性基因。
- 恢复和序列每个条带以确定粉虱内的细菌种类（见第1.5-1.7节）。
- 在粉虱上进行荧光原位杂交（FISH），以根据先前发布的方案19来识别内共生菌的位置。
注意：如有必要，增加荧光探针的浓度。 透射电子显微镜（TEM） - 将含有2.5％[vol / vol]戊二醛的磷酸盐缓冲液（0.1M，pH 7.0）中的粉虱浸泡并固定4小时。
- 在磷酸盐缓冲液（0.1M，pH7.0）中洗涤样品三次，每次15分钟。
- 在含有1％[wt / vol] OsO 4的磷酸盐缓冲液（0.1M，pH7.0）中沉淀并固定样品2小时。
- 通过一系列乙醇（30％，50％，70％，80％，90％，95％和100％），每次15分钟使样品脱水。
- 将样品转移并浸入100％丙酮中20分钟。
- 将样品在100％丙酮和100％Spurr树脂（1：1）的混合物中放置1小时。
- 将样品转移到100％丙酮和100％Spurr树脂（1:3）的混合物中3小时。
- 将样品转移并浸入100％Spurr树脂（在70℃下孵育）超过9小时。
- 通过使用微型部分粉虱样品对我来说。
- 通过浸渍在绝对醋酸铀酰中5-10分钟，然后浸入50％碱性柠檬酸铅另外5-10分钟，将超薄膜（在3.9节中获得）染色。
注意：第3.1-3.10节中使用的试剂的体积取决于样品。确保样品浸入试剂中。 - 观察透射电子显微镜（15,000X）下的样品，以确定进一步使用的细菌的定位，形状和大小（见第4.6节）。
- 在显微镜载玻片上加入100μL1x PBS溶液。从棉花叶中挑一些3或4龄的若虫，并将其浸入PBS溶液中。
- 在立体显微镜下使用精细的昆虫针，从粉虱身上拉出细菌。
- 在若虫的一边轻轻切开一个洞，轻轻按一下一边让细菌出来。
- 在0.5-10μL移液管上装入20μL微型加载器（前端切割以满足细菌大小）。将各种细菌从PBS溶液中提取到微型加载器中。
- 洗涤细菌以通过将细菌吸移到PBS溶液中并提取细菌来消除其他粉虱组织的污染。重复三次。
- 立即将洗涤的细菌移至含有60μL1x PBS溶液的离心管中。
- 注射器通过5μm滤膜过滤组装的细菌（由粉虱中的细菌和细菌核的大小确定）。重复多次，彻底移动混合液通过过滤膜。
注意：为了获得更好的扩增和测序结果，组装超过100个细菌。首先通过使用1×PBS溶液来过滤膜以减少细菌的损失结合膜。 - 使用推荐的方案，使用DNA扩增试剂盒扩增滤液（主要含有粉虱的内共生体），并进行一些修改。
- 选择从血液或细胞中扩增基因组DNA的推荐方案，并制备缓冲液D2用于随后的实验。
- 直接向离心管中加入1.5μL滤液（见第4.6节），然后加入1.5μLBuffer D2，充分混匀。
- 在冰上孵育10分钟，并加入1.5μL的终止溶液。
- 加入15μL反应缓冲液和1μLDNA聚合酶，轻轻混匀。
- 将混合物在30℃下孵育16小时，然后在65℃下孵育3分钟。
- 在扩增的滤液上直接进行PCR（如果需要，稀释扩增的样品），使用专门为bac设计的特异性引物teria来确认细菌种类（见2.1节）。
- 根据先前发表的方法21 ，使用粉虱基因β-肌动蛋白和EF1引物进行PCR以确认是否存在宿主基因组的污染（PCR配方在1.4节中描述）。
- 在测序前将扩增的滤液置于分光光度计和荧光计（根据制造商的说明书），以测试样品的质量以及样品是否符合测序标准。
- 根据制造商的说明书将其扩增至基因组测序仪。
白蛉细菌解剖和纯化
内分泌基因组的扩增
Endosymbiont Metagenome测序
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Representative Results
以烟草烟草复合体的中东亚洲1号（MEAM1）为例进行说明。用于饲养粉虱的棉花和几个发育阶段的粉虱显示在图1中，包括棉花植物，成年粉虱和粉虱的第1， 第 2和第 4龄的若虫（3龄的若虫似乎与第4龄若虫相似） ）。显然，第4龄若虫比第1龄和第2龄的若虫大（ 图1 ）。 MEAM1中Portiera和Hamiltonella的 FISH分析如图2所示 。这两个内共生体被限制在粉虱的细菌细胞中，也观察到两种细菌的重叠。 图3显示了传输电路白蛉的Portiera endosymbiont的tron显微镜图像，这表明Portiera可能会失去其细胞壁。
对于测序，构建了两个分别为200bp和2,000bp的插入片段的文库。测序后，两个文库分别生成1,626 Mb和1,302 Mb的原始数据。清理适配器和重复的污染数据后，获得了1,484 Mb和1,219 Mb的清洁数据。该组合成功地导致了专有共生体Portiera的完整基因组序列。此外，还获得了Hamiltonella的基因组草案。基于200bp和2,000bp文库的组合产生了138个重叠群。根据配对关系，将138个重叠群进一步组装成89个支架（ 表2 ）。
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图1：本文使用的植物 - 昆虫系统概述。 （ A ）白花在棉花植物（ Gossypium hirsutum cv。Zhe -Mian 1793）上饲养。 （ B ）成年粉虱的看法。 （ C ）粉虱生命周期中若虫的若虫发育阶段。红箭指的是粉虱的蛋;黑色箭头指粉虱的第一龄若虫;白色箭头指粉虱的第二只若虫;蓝色箭头指粉虱的第 4龄若虫。 请点击此处查看此图的较大版本。
图2： Portiera ， Ham的 FISH分析il ella in in。。。。。。。。。 使用缀合有Cy3的Portiera特异性探针（红色），用Cy5标记的Hamiltonella特异性探针（绿色）。刻度棒=100μm。 （ A ）红色杂交信号代表黑暗场下的Portiera 。 （ B ）绿色杂交信号表示黑暗场下的Hamiltonella 。 （ C ） Portiera和Hamiltonella在暗场下合并信号。 （ D ） Portiera和Hamiltonella在明场合并信号。 请点击此处查看此图的较大版本。
图3：透射电子微风笛在白蛉的图像。箭头表示Portiera的位置。比例尺= 1μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
| 目标共生体 | 靶基因 | 引物序列（5'-3'） | PCR程序 | 参考 | ||
| Portiera | 16S rRNA | Por-F：TGCAAGTCGAGCGGCATCAT | 95℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟，5次循环; | 27 | ||
| Por-R：AAAGTTCCCGCCTTATGCGT | 9576; C 1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，30个循环; | |||||
| 72℃20分钟 | ||||||
| Hamiltonella | 16S rRNA | Ham-F：TGAGTAAAGTCTGGGAATCTGG | 95℃1分钟，60℃1分钟，72℃1分钟，5次循环; | 27 | ||
| Ham-R：CCCGGGAACGTATTCACCGTAG | 95℃1分钟，58℃1分钟，72℃1分钟，30个循环; | |||||
| 72℃20分钟 | ||||||
| 立克次体 | 16S rRNA | Ric-F：GCTCAGAACGAACGCTATC | 95℃2分钟; | 24 | ||
| Ric-R：GAAGGAAAGCATCTCTGC | 92°C 1分钟，58°C 1分钟，72℃90秒，30个循环; | |||||
| 72℃5分钟 | ||||||
| Arsenophonus | 23S rRNA | Ars-F：CGTTTGATGAATTCATAGTCAAA | 95℃5分钟; | 28 | ||
| Ars-R：GGTCCTCCAGTTAGTGTTACCCAAC | 95℃30秒，60.5℃30秒，72℃45秒，30个循环; | |||||
| 72℃10分钟 | ||||||
| Cardinium | 16S rRNA | Car-F：TACTGTAAGAATAAGCACCGGC | 95℃2分钟 | 29 | ||
| Car-R：GTGGATCACTTAACGCTTTCG | 92℃1分钟，57℃1分钟，72℃90秒，30个循环; | |||||
| 72℃5分钟 | ||||||
| 沃尔巴克氏体 | 16S rRNA | Wol-F：TTGTAGCCTGCTATGGTATAACT | 94℃5分钟; | 30，31 | ||
| Wol-R：GAATAGGTATGATTTTCATGT | 94℃1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，35个循环 | |||||
| Fritschea | 23S rRNA | Fri-F：GATGCCTTGGCATTGATAGGCGATGAAGGA | 95℃5分钟; | 32 | ||
| Fri-R：TGGCTCATCATGCAAAAGGCA | 94℃1分钟，64℃1分钟，72℃90秒，35个循环; | |||||
| 72℃5分钟 | ||||||
| Hemipteriphilus | groEL基因 | OR- groEL -F：CACCWAAAATTACTAAAGATGG | 94℃3分钟; | 18 | ||
| OR- groEL -R：TAGAARTCCATWCCKCCCATWC | 94℃30秒，52℃30秒，72℃2分钟，34个循环; | |||||
| 72℃10分钟 | ||||||
表1：粉虱中内含子的PCR引物和程序。
| Portiera | Hamiltonella | |
| Contig号码 | 1 | 138 |
| 脚手架号a | 1 | 89 |
| 总长度，bp | 358232 | 1711449 |
| N50，bp | / | 118802 |
| N90，bp | / | 16753 |
| 最大长度，bp | / | 390511 |
| 最小长度，bp | / | 503 |
| GC含量，％ | 26.18 | 39.89 |
| 以下介绍的信息均基于脚手架。 | ||
表2： Portiera 和 Hamiltonella 基因组的 一般特征 。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
本研究的财政支持由国家重点研究发展计划（2016YFC1200601）和国家自然科学基金（31390421）提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
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